Summary
Aqui, apresentamos um protocolo no qual células únicas são monitoradas para eventos agudos e infecção produtiva pelo HIV-1 em um dispositivo nanofluido. Os dados de imagem definem interações entre receptores de receptores de vírus e dinâmicas de caminhos de sinalização. Este é o primeiro método para a cultura e imagem longitudinal de alta produtividade para estudar a cinética e as interações moleculares.
Abstract
O HIV-1 causa uma infecção crônica que afeta mais de 37 milhões de pessoas em todo o mundo. Pessoas vivendo com o vírus da imunodeficiência humana (HIV) experimentam comorbidade relacionada à inflamação crônica, apesar da terapia antirretroviral. No entanto, essas sinalizações inflamatórias não foram totalmente caracterizadas. O papel dos eventos de entrada precoce na ativação de eventos de sinalização celular e expressão genética a jusante não foi capturado no nível de célula única. Aqui, os autores descrevem um método que aplica princípios da microscopia de fluorescência de células vivas a uma plataforma automatizada de células únicas que culturas e células de imagens ao longo de cursos de tempo personalizados pelo usuário, permitindo a análise de alto rendimento de processos celulares dinâmicos. Este ensaio pode rastrear a microscopia de fluorescência ao vivo unicelular de eventos precoces que seguem imediatamente a infecção pelo HIV-1, notadamente o fluxo de cálcio que acompanha a exposição ao vírus e o desenvolvimento de infecção produtiva usando um vírus repórter fluorescente. As células MT-4 são carregadas com um corante sensível ao cálcio e cultivadas em canetas isoladas em um dispositivo nanofluido. As células cultivadas estão infectadas com um vírus repórter HIV-1 (HIV-1 NLCI). Um microscópio de fluorescência posicionado acima do dispositivo nanofluido mede o fluxo de cálcio ao longo de um curso de tempo de 8 minutos após a exposição aguda ao HIV-1. A infecção produtiva do HIV-1 é medida nessas mesmas células durante um intervalo de 4 dias. Os dados de imagem desses cursos de tempo são analisados para definir interações receptoras de receptores de vírus e dinâmicas de caminhos de sinalização. Os autores apresentam uma alternativa integrada e escalável aos métodos tradicionais de imagem usando uma nova plataforma optofluidic capaz de classificação unicelular, cultivo, imagem e automação de software. Este ensaio pode medir a cinética dos eventos em várias condições, incluindo tipo de célula, efeito agonista ou antagonista, enquanto mede uma série de parâmetros. Este é o primeiro método estabelecido para a cultura e imagem longitudinal de alta produtividade de alta throughput: Esta técnica pode ser amplamente adaptada para estudar cinética de sinalização celular e interações moleculares dinâmicas.
Introduction
A inflamação crônica é uma das principais causas de morbidades precoces associadas ao HIV e mortalidade1,2,3. Existem múltiplos mecanismos pelos quais o HIV pode ativar a sinalização inflamatória, e evidências recentes sugerem um papel para os receptores P2X na entrada do HIV que são receptores de adenosina triptosfato de adenosina (ATP) de cálcio3,4,5,6,7,8,9,10. O subtipo P2X de receptores purinérgicos (P2XR) pode ser importante facilitador desta inflamação. No entanto, os mecanismos moleculares das interações HIV-P2XR são amplamente desconhecidos e podem impactar as etapas do ciclo de vida viral do HIV-1. Definir os caminhos e cinéticas que conduzem a inflamação crônica associada ao HIV é fundamental para o avanço das opções de tratamento para pessoas com HIV.
Para avaliar se o HIV-1 agoniza diretamente os receptores P2X, a ativação P2XR e a infecção pelo HIV-1 devem ser medidos em paralelo. Ensaios da atividade P2XR e infecção pelo HIV-1 foram estabelecidos de forma independente: o fluxo de cálcio celular é um indicador da ativação P2XR, e a infecção produtiva pelo HIV-1 pode ser quantificada pela abundância de RNA. A detecção de fluorescência do fluxo de cálcio é possível com o corante sensível ao cálcio Fluo-4, e a infecção pelo HIV-1 pode ser visualizada com o vírus mCherry fluorescente HIV-NLCI11,12,13,14,15.
Como esses indicadores de ativação P2X (fluxo de cálcio celular agudo) e infecção pelo HIV-1 (síntese de RNA HIV-1) ocorrem em diferentes escalas de tempo (minutos versus dias), falta um método de alta produtividade que permita a análise emparelhada da ativação P2XR e da infecção pelo HIV-1. Técnicas experimentais padrão de alto rendimento, como a citometria de fluxo, permitem a análise populacional, mas não podem avaliar a relação entre eventos agudos e longitudinais em células únicas. Alternativamente, a imagem unicelular com microscopia de fluorescência padrão é de baixa produtividade. Essas limitações experimentais apresentam a necessidade de novas técnicas de alta produtividade para medir associações entre eventos celulares agudos e longitudinais diretamente.
Um sistema optofluido descrito é uma nova plataforma capaz de triagem e isolamento unicelulares, culminando, imagem e automação de software16,17,18,19. Este sistema apresenta uma alternativa integrada e de alto rendimento às limitações dos métodos tradicionais de imagem. A plataforma Beacon consiste em um dióxido de carbono (CO2) e uma incubadora controlada pela temperatura que suporta células contidas em um chip. O chip possui transistores fotosensíveis que geram um gradiente elétrico em resposta à luz direcionada. Esta força dielectrophoretic resultante é usada para mover células individuais através do chip nanofluido para as regiões desejadas. As células são classificadas em canetas no chip, que fornecem uma barreira para isolar células individuais fisicamente. O fluxo contínuo de mídia de crescimento em todo o chip impede a migração celular das canetas, permitindo a difusão de pequenas partículas de nutrientes e reagentes específicos do experimento. Um microscópio de fluorescência fica acima do chip. A automação de software é usada para capturar imagens do chip no ponto de tempo especificado pelo usuário.
Toda a caracterização celular foi realizada utilizando-se um sistema optofluido para seleção e manipulação de células únicas. Este sistema consiste em componentes mecânicos, microfluidos e ópticos integrados que permitem manipulação de células únicas, ensaio, cultura e imagem. As células são carregadas e cultivadas no dispositivo nanofluido descartável composto por 3.500 câmaras individuais (canetas), cada uma capaz de segurar volume sub-nanolílito. As células podem ser posicionadas dentro de canetas usando "gaiolas" dielectrophoretic induzidas pela luz e cultivadas sob condições controladas por temperatura e CO2. Os microfluidos permitem a perfusão de mídia ou buffers no chip para cultura celular ou tratamento medicamentoso. Uma agulha acionada permite a importação e exportação de células de placas de poços incubadas e fechadas. A área do chip pode ser visualizada em ampliação de 4x ou 10x em canais brightfield e fluorescentes (incluindo DAPI, FITC, TRed ou Cy5) para caracterizar fenótipos celulares ou análise funcional. Todo o sistema é automatizado usando software que pode ser usado para fluxos de trabalho pré-projetados ou experimentos personalizados.
Foram estudadas relações entre a infecção pelo HIV-1 e o P2XR, mas não foi relatado um procedimento de alto rendimento para caracterizar diretamente essas interações em paralelo. Aqui, os autores descrevem uma metodologia para estudar as interações HIV-P2XR através do rastreamento do fluxo agudo de cálcio e da infecção produtiva subsequente do HIV-1 no nível unicelular. Notavelmente, isso estabelece uma nova ferramenta que permite a medição direta, de alto rendimento e longitudinal de múltiplos alvos em células únicas.
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Protocol
1. Preparação de células para imagem
- Prepare a solução de carregamento Fluo-4 AM fresca: Adicione 25 μL de solvente concentrado de detergente de 100x e adicione 2,5 μL de Fluo-4 AM 1000x a um tubo de 1,5 mL. Vórtice para misturar.
- Pipeta 2,5 mL de mídia cultural na solução de carregamento e inverter para misturar. Proteja-se contra a luz.
- Centrífuga 2 x 106 células MT-4 a 500 x g por 3 min.
- Remova a mídia e resuspense a pelota em 2 mL da solução de carregamento Fluo-4 AM preparada. Proteja-se contra a luz.
- Células resuspended pipeta em uma placa de Petri de 35 mm. Incubar a 37 °C por 15-30 min, depois incubar por mais 15-30 min em temperatura ambiente.
- Transfira a suspensão da célula para um tubo de centrífuga. Centrífugas a 500 x g por 3 min e removam o supernascedor consistindo da solução de carregamento.
- Resuspengue a pelota celular pipetando em 1 mL do meio de cultura e centrífuga a 500 x g por 3 min para lavar.
- Resuspend a pelota celular por pipetação no meio de cultura a uma concentração de 2 x 106 células/mL (mínimo 50 μL). Proteja-se contra a luz.
2. Preparação do sistema optofluídico, carregamento de células e penning de células
- Prepare um chip com a solução de molhar, que facilita a escrita celular.
- Para isso, carregue tubos de centrífugas contendo 2 mL de solução de molhar e 50 mL de água DI no instrumento com um novo chip optofluídico e execute a função Chip Molhado. Esta função inundará automaticamente o chip com a solução de molhar através da fluidez do sistema, incubará o chip a 50, °C e lavará o chip com água 3 vezes.
- Uma vez feito o flushing de água, lave o chip com 3 ciclos de 250 μL de mídia cultural.
- Suplemente a suspensão celular da etapa 1.8 com 1:100 F-127 detergente soluto antes do carregamento para reduzir a probabilidade de as células grudando nos canais do chip.
- Use a agulha de exportação de instrumentos para importar células de um tubo de centrífuga de 1,5 mL usando a operação de carga e importação de pequeno volume para um volume de embalagem de célula de 5 μL.
- Células de caneta utilizando uma tensão de posicionamento optoeletrônico otimizada (OEP) de velocidade de gaiola de 4,3 V e 5 μm/s. A penning ocorre usando OEP. Realize a escrita usando a função Autopen, que irá autodetectar células únicas, cercá-las com uma gaiola OEP e movê-las para uma caneta próxima. Se as células de interesse permanecerem após a escrita automática, use a função caneta Manual para selecionar células-alvo (com um clique do mouse) e uma caneta de destino (com um clique subsequente do mouse).
- Uma vez que a escrita esteja completa (quando a função Autopen for concluída ou quando o número desejado de células escritas tiver sido atingido), lave o chip com 3 ciclos de 250 μL de mídia cultural para limpar qualquer célula não suspensa restante do chip.
3. Infecção de células únicas e imagem funcional
- Depois de escrever células, obtenha imagens fluorescentes de células nos canais FITC, Texas Red e DAPI para medir a linha de base Fluo-4, mCherry e autofluorescência.
- Infundir HIV-1 no microchip a uma concentração de 13 ng de HIV-1 NL-CI por 2 x 106 células, canalizar lentamente a suspensão para dentro do chip através da agulha de exportação.
- Imediatamente após a adição do HIV-1, obtenha repetidamente imagens nos canais FITC e DAPI ao longo de um curso de tempo de 10 minutos.
- Obtenha imagens nos canais Texas Red e DAPI em 1-, 2,3 e 4 dias pós-infecção (DPI).
4. Análise de dados de imagem funcional unicelulares com software FIJI
- Em cada momento em cada canal de imagem de interesse, use a ferramenta fiji point selection e a função Measure para medir os sinais fluo-4, mCherry e autofluorescência de cada célula. Meça simultaneamente a fluorescência de fundo calculando a intensidade média de fluorescência (IME) da caneta e do chip contendo cada célula.
- Controle para a fluorescência de fundo e autofluorescência usando a função Medida para encontrar o MFI em uma Seleção de Região e subtraindo esse valor do valor da fluorescência celular.
- Normalize a fluorescência de fundo de cada imagem do chip: Meça o MFI do chip em cada campo. Em seguida, subtraia o MFI do chip com a menor fluorescência de fundo de todas as outras medidas de MFI do chip.
- Normalize a fluorescência de fundo de cada caneta contendo células: meça o IMfi da caneta de cada célula em cada campo de visão. Em seguida, subtraia esse valor do MFI bruto da célula para cada campo.
- Controle para a autofluorescência celular: Subtraia o dia 0 e o dia 4 DAPI MFI de cada célula do dia 0 e dia 4 mCherry MFIs.
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Representative Results
A Figura 1 ilustra o formato do chip e dados de imagem bruta adquiridos através do microscópio de fluorescência. A identificação e agrupamento de células não infectadas e infectadas através da medição mCherry são mostradas na Figura 2. Esses aglomerados são analisados para cinética de influxo de cálcio na Figura 3,o que demonstra o fluxo precoce de cálcio em células infectadas pelo HIV. A Figura 4 mostra uma correlação positiva significativa entre o fluxo de cálcio e a fluorescência mCherry 20.
Figura 1: Carregamento de chips e dados de imagem bruta. Esquemas de células de carregamento em canetas no chip usando opto-eletroposicionamento(A). O fluxo de cálcio é quantificado pela detecção do corante sensível ao cálcio Fluo-4 no canal FITC ao longo de um curso de tempo de 8,5 min(B). A infecção produtiva pelo HIV-1 é medida ao longo de um curso de 4 dias, detectando o vírus mCherry reporter HIV NL-CI no canal Texas Red(C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Células representativas infectadas pelo HIV positivas para sinais mCherry no 4º dia pós-infecção. As células MT-4 foram infectadas com o vírus mCherry reporter HIV-1 NL-CI na plataforma optofluida, e o sinal mCherry foi medido 4 dias após a infecção (dpi). Células com uma mudança no sinal mCherry >40.000 MFI (onde um ponto de interrupção claro foi notado) a 4 dpi foram agrupadas na população "mCherry-high"; células com uma mudança na fluorescência mCherry <40.000 MFI foram agrupadas na população "mCherry-low". O software estatístico foi utilizado para traçar os valores médios da fluorescência mCherry em 0 e 4 dpi. A significância estatística em 4 dpi foi medida utilizando-se um t-test não verificado dos meios (mCherry-high=50235 MFI; mCherry-low=25017 MFI; p<0,000001). *=p<0,05, **=p<0,01, ***=p<0.001 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Células representativas infectadas pelo HIV com altas taxas de influxo precoce de cálcio. As células MT-4 foram infectadas com o vírus mCherry reporter HIV-1 NL-CI na plataforma otofluidica. O cálcio intracelular foi medido por fluorescência Fluo-4 repetidamente durante um curso de tempo de 9 min. O software estatístico foi usado para traçar os valores médios fluo-4 dos aglomerados de células mCherry-high e mCherry-low. A significância estatística foi medida por meio de testes t não pagos em cada ponto de tempo. *=p<0,05, **=p<0,01, ***=p<0,001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Fluxo de cálcio intracelular representativo maior em células mCherry-positivo. As células MT-4 foram infectadas com o vírus mCherry reporter HIV-1 NL-CI. O cálcio intracelular foi medido pela fluorescência Fluo-4 9 min pós-infecção, e mCherry foi medido 4 dias após a infecção. Foi realizada uma simples regressão linear com software estatístico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A metodologia descrita para estudar a relação entre o fluxo de cálcio e a infecção produtiva pelo HIV-1 em células únicas pode ser adaptada para estudar cinética de cálcio intracelular em resposta a outros agonistas ou antagonistas de interesse. A preparação de células para imagens é simples, minimamente intensiva em tempo, e os reagentes estão disponíveis em kits convenientes de fabricantes amplamente utilizados. A medição de cálcio à base de fluo-4 é bem descrita na literatura, e o HIV-1 pode ser facilmente substituído por outros vírus ou compostos de interesse para estudar nesta plataforma. Diferentes tipos de células e meios de cultura podem ser usados. Canais alternativos ou adicionais de fluorescência são suportados, e vários fluoroforos podem ser visualizados simultaneamente ou sequencialmente.
Além disso, o procedimento pode ser amplamente adaptado para estudar eventos com rótulo fluoroforeiro em cursos de tempo longitudinal. Métodos padrão de alto rendimento, como a citometria de fluxo, não permitem o estudo emparelhado de eventos discretos ao longo do tempo. A imagem unicelular tradicional através da microscopia de fluorescência é limitada pelo throughput, migração celular entre campos de visão e requisitos intensivos de tempo. Ao combinar imagens de fluorescência com cultura unicelular automatizada de alta produtividade e automatizada, este método permite a elucidação de cinética molecular relevante, sequelas e interações em intervalos de tempo de curto e longo prazo. É importante notar que a otimização de software e análise de imagem é fundamental para cada aplicativo.
O microscópio é equipado com canais de fluorescência Brightfield e Cy5, Texas Red, FITC e DAPI16. As ampliações disponíveis são 4x e 10x. Este método não é atualmente adequado para investigações que requerem mais numerosos parâmetros de fluorescência ou ampliações maiores. Compostos de interesse que serão infundidos no chip para a exposição celular devem exibir difusão para entrar em canetas e alcançar células. O acesso a um instrumento Beacon pode representar uma barreira de custos para os investigadores.
O sistema optofluido tem uma ampla capacidade de digitalização e costura. A classificação óptica no chip tem uma variável de alta eficiência dependendo do tipo de célula, mas a eficiência automática de classificação está entre 80-90%, e a classificação manual pode aumentar essa eficiência para 100%. Cada chip pode acomodar 3.500 células, e quatro chips podem ser executados simultaneamente, com um fluxo de trabalho paralelo, resultando em alta escalabilidade. Embora o fluxo de trabalho de imagem seja relatado por análise manual de imagens, atualizações mais recentes no sistema permitem automatizar isso. É importante notar que os dados aqui apresentados são representativos dentro das limitações da análise do limiar de imagem, e a otimização e automatização da análise de imagem provavelmente resultarão em medidas mais sensíveis tanto do fluxo de cálcio quanto do sinal mCherry como indicativos da infecção produtiva pelo HIV-1.
O protocolo descrito foi estabelecido utilizando células MT-4 e HIV-1 como descrito anteriormente7,21,22. Ao adaptar o protocolo a outras linhas celulares ou alvos fluorescentes de interesse, é necessária otimização e validação. A cinética do Fluo-4 efflux é dependente da linha celular, de modo que a retenção de corante específica do tipo celular deve ser confirmada para durar pelo menos se o curso de tempo de imagem de cálcio pretendido. A validação da retenção de corantes e a resposta agonista neste dispositivo optofluido pode ser completada tratando células no chip com o meio de crescimento contendo ionomicina de 10 μM, o que deve induzir potente fluxo de cálcio celular e sinal Fluo-4 no canal FITC. Controles e validações semelhantes devem ser conduzidos para que quaisquer agonistas/antagonistas sejam infundidos no chip para garantir a concentração e difusão adequadas às células. Para análise unicelular, as células devem ser preparadas como uma suspensão unicelular para facilitar a classificação de células individuais em canetas. Como a microscopia tradicional de fluorescência, os tempos de exposição à fluorescência e os pontos de tempo medidos devem ser otimizados para cada alvo de interesse.
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Disclosures
R.P.S. é um empregado da Sema4. Os outros autores não têm conflitos de interesse para divulgar.
Acknowledgments
Somos gratos pelas discussões científicas com o Dr. Benjamin Chen. Este trabalho foi financiado por K08AI120806 (THS), R01DA052255 (THS e KB) e R21AI152833 (THS e KB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Beacon Optofluidic System | Berkeley Lights | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | ||
| FIJI | Open-source software | PMID: 22743772, 22930834 | |
| Fluo-4 Calcium Imaging Kit | Thermo Fisher | F10489 | |
| HIV-1 NLCINL4-3 | Laboratory of Benjamin Chen | PMID: 28148796 | |
| Hyclone Pennecillin Streptomycin solution | GE Healthcare Life sciences | SV30010 | |
| MT-4 cells | NIH AIDS Reagent | ARP-120 | |
| OptoSelect 3500 chip | Berkeley Lights | ||
| Pipettor Tips | Denville Scientific | P3020-CPS | |
| Prism 9.0.0 | GraphPad | ||
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Serological Pipettes | Fisher Brand | 13-678-11E | |
| Tissue Culture Hood | Various models | ||
| T75 flasks | Corning | 3073 |
References
- Aberg, J. A. Aging, inflammation, and HIV infection. Topics in Antiviral Medicine. 20 (3), 101-105 (2012).
- Deeks, S. G., Tracy, R., Douek, D. C. Systemic effects of inflammation on health during chronic HIV infection. Immunity. 39 (4), 633-645 (2013).
- Swartz, T. H., Dubyak, G. R., Chen, B. K. Purinergic receptors: Key mediators of HIV-1 infection and inflammation. Fromtiers in Immunology. 6, 585 (2015).
- Giroud, C., Marin, M., Hammonds, J., Spearman, P., Melikyan, G. B. P2X1 receptor antagonists inhibit HIV-1 fusion by blocking virus-coreceptor interactions. Journal of Virology. 89 (18), 9368-9382 (2015).
- Hazleton, J. E., Berman, J. W., Eugenin, E. A. Purinergic receptors are required for HIV-1 infection of primary human macrophages. Journal of Immunology. 188 (9), 4488-4495 (2012).
- Marin, M., et al. High-throughput HIV-cell fusion assay for discovery of virus entry inhibitors. Assay and Drug Development Technology. 13 (3), 155-166 (2015).
- Soare, A. Y., et al. P2X Antagonists inhibit HIV-1 productive infection and inflammatory cytokines interleukin-10 (IL-10) and IL-1β in a human tonsil explant model. Journal of Virology. 93 (1), 01186 (2019).
- Sorrell, M. E., Hauser, K. F. Ligand-gated purinergic receptors regulate HIV-1 Tat and morphine related neurotoxicity in primary mouse striatal neuron-glia co-cultures. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (2), 233-244 (2014).
- Swartz, T. H., Esposito, A. M., Durham, N. D., Hartmann, B. M., Chen, B. K. P2X-selective purinergic antagonists are strong inhibitors of HIV-1 fusion during both cell-to-cell and cell-free infection. Journal of Virology. 88 (19), 11504-11515 (2014).
- Soare, A. Y., et al. P2RX7 at the host-pathogen interface of infectious diseases. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 85 (1), (2021).
- Chen, P., Hübner, W., Spinelli, M. A., Chen, B. K. Predominant mode of human immunodeficiency virus transfer between T cells is mediated by sustained Env-dependent neutralization-resistant virological synapses. Journal of Virology. 81 (22), 12582-12595 (2007).
- Dale, B. M., et al. Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion. Cell Host Microbe. 10 (6), 551-562 (2011).
- Gee, K. R., et al. Chemical and physiological characterization of fluo-4 Ca(2+)-indicator dyes. Cell Calcium. 27 (2), 97-106 (2000).
- He, M. L., Zemkova, H., Koshimizu, T. A., Tomić, M., Stojilkovic, S. S. Intracellular calcium measurements as a method in studies on activity of purinergic P2X receptor channels. American Journal of Physiology and Cell Physiology. 285 (2), 467-479 (2003).
- Li, H., Zony, C., Chen, P., Chen, B. K. Reduced potency and incomplete neutralization of broadly neutralizing antibodies against cell-to-cell transmission of HIV-1 with transmitted founder envs. Journal of Virology. 91 (9), 02425 (2017).
- Beaumont, K. G., et al. Multiparameter cell characterization using nanofluidic technology facilitates real-time phenotypic and genotypic elucidation of intratumor heterogeneity. bioRxiv. , 457010 (2018).
- Le, K., et al. Assuring clonality on the beacon digital cell line development platform. Biotechnology Journal. 15 (1), 1900247 (2020).
- Mocciaro, A., et al. Light-activated cell identification and sorting (LACIS) for selection of edited clones on a nanofluidic device. Communications in Biology. 1, 41 (2018).
- Winters, A., et al. Rapid single B cell antibody discovery using nanopens and structured light. MAbs. 11 (6), 1025-1035 (2019).
- Wu, N., Nishioka, W. K., Derecki, N. C., Maher, M. P. High-throughput-compatible assays using a genetically-encoded calcium indicator. Science Reports. 9 (1), 12692 (2019).
- Esposito, A. M., et al. A high-throughput cre-lox activated viral membrane fusion assay to identify inhibitors of HIV-1 viral membrane fusion. Journal of Visualized Experiments. (138), e58074 (2018).
- Soare, A. Y., et al. P2X1 selective antagonists block HIV-1 infection through inhibition of envelope conformation-dependent fusion. Journal of Virology. 94 (6), 01622 (2020).
