Summary
ここでは、単一の細胞が急性事象およびナノ流体装置上の生産的なHIV-1感染を監視するプロトコルを提示する。イメージングデータは、ウイルスと宿主の受容体相互作用とシグナル伝達経路のダイナミクスを定義します。これは、ナノ流体ハイスループット縦単細胞培養およびイメージングにおけるシグナリング動態と分子相互作用を研究する最初の方法です。
Abstract
HIV-1は、世界中で3700万人以上の人々に影響を与える慢性感染症を引き起こします。ヒト免疫不全ウイルス(HIV)を持つ人々は、抗レトロウイルス療法にもかかわらず、慢性炎症に関連する併存疾患を経験する。しかしながら、これらの炎症シグナル伝達は十分に特徴付けられていない。細胞シグナル伝達事象および下流遺伝子発現の活性化に関する早期参入事象の役割は、単細胞レベルでは捉えられてはいません。ここでは、ライブ細胞蛍光顕微鏡の原理を、ユーザーがカスタマイズした時間コースを介して細胞を培養および画像化する自動単細胞プラットフォームに適用する方法について述べ、動的細胞プロセスのハイスループット分析を可能にする。このアッセイは、HIV-1感染直後の初期の事象、特にウイルスへの暴露に伴うカルシウムの流入、および蛍光レポーターウイルスを用いた生産的感染の発症の単細胞生蛍光顕微鏡を追跡することができる。MT-4細胞はカルシウム感受性染料を装填し、ナノ流体装置上の単離されたペンで培養される。培養細胞はHIV-1レポーターウイルス(HIV-1 NLCI)に感染している。ナノ流体装置の上に位置する蛍光顕微鏡は、急性HIV-1曝露後の8分の時間経過でカルシウムの流入を測定する。HIV-1生産的な感染は、4日間にわたって同じ細胞で測定される。これらの時間コースからの画像データを分析して、ウイルス宿主受容体相互作用およびシグナル伝達経路ダイナミクスを定義する。著者らは、単一細胞の選別、培養、イメージング、およびソフトウェア自動化が可能な新しい光流体プラットフォームを使用して、従来のイメージング法に代わる統合的でスケーラブルな代替手段を提示する。このアッセイは、パラメータの配列を測定しながら、細胞の種類、アゴニスト、またはアンタゴニスト効果を含む様々な条件下での事象の運動を測定することができます。これは、ナノ流体ハイスループット縦単細胞培養およびイメージングのための最初の確立された方法です:この技術は、細胞シグナル伝達動態と動的分子相互作用を研究するために広く適応することができます。
Introduction
慢性炎症は、HIV関連の早期罹患率および死亡率1、2、3の主要な原因である。HIVが炎症シグナルを活性化する複数のメカニズムがあり、最近の証拠は、カルシウム腺三リン酸(ATP)受容体であるHIVエントリにおけるP2X受容体の役割を示唆している3、4、5、6、7、8、9、10。P2Xサブタイプのプリナージック受容体(P2XR)は、この炎症の重要な促進役とすることができる。しかし、HIV-P2XR相互作用の分子メカニズムはほとんど知られておらず、HIV-1ウイルスの初期および後期のライフサイクルステップに影響を与える可能性があります。HIV関連慢性炎症を引き起こす経路と運動学を定義することは、HIV患者の治療オプションを進める上で極めて重要である。
HIV-1がP2X受容体を直接苦しめるかどうかを評価するには、P2XR活性化およびHIV-1感染を並行して測定する必要があります。P2XR活性とHIV-1感染のアッセイは独立して確立されています:細胞カルシウム流入はP2XR活性化の指標であり、HIV-1の生産的な感染はRNAの豊富さによって定量することができます。カルシウム流入の蛍光検出は、Fluo-4カルシウム感受性色素で可能であり、そして、HIV-1感染は、mCherry蛍光レポーターウイルスHIV-NLCI11、12、13、14、15で可視化することができる。
P2X活性化(急性細胞カルシウム流入)およびHIV-1感染(HIV-1 RNA合成)のこれらの指標は、異なるタイムスケール(分対日)に発生するため、P2XR活性化とHIV-1感染のペア分析を可能にする高スループットの方法が欠けている。フローサイトメトリーなどの標準的なハイスループット実験技術では、集団分析が可能ですが、単一細胞の急性事象と縦断事象の関係を評価することはできません。あるいは、標準的な蛍光顕微鏡による単細胞イメージングは、低スループットである。これらの実験的な制限は、急性細胞事象と縦断細胞事象との関連性を直接測定するための新しいハイスループット技術の必要性を示す。
記述される光流体システムは、単一細胞の選別および単一細胞の分離、培養、イメージング、およびソフトウェアオートメーション16、17、18、19を可能にする新しいプラットフォームである。このシステムは、従来のイメージング方法の制限に代わる、統合されたハイスループットの代替手段を提供します。ビーコンプラットフォームは、チップに含まれる細胞をサポートする二酸化炭素(CO2)と温度制御インキュベーターで構成されています。チップは、ターゲット光に応答して電気勾配を生成する感光トランジスタを有する。この結果得られる二電気泳動力は、個々の細胞をナノ流体チップを越えて所望の領域に移動させるために使用される。細胞はチップ上のペンに分類され、個々の細胞を物理的に分離する障壁を提供します。チップ全体の成長媒体の連続的な層流は、栄養素および実験特異的試薬の小粒子拡散を可能にしながら、ペンからの細胞の移動を防ぐ。蛍光顕微鏡はチップの上に座っています。ソフトウェアオートメーションは、ユーザー指定のタイムポイントでチップのイメージをキャプチャするために使用されます。
全ての細胞特性評価は、単一細胞選択および操作のための検体系を用いて行った。このシステムは、単一細胞操作、アッセイ、培養、イメージングを可能にする、機械的、マイクロ流体、光学的なコンポーネントの統合から成ります。細胞は、3,500個の個々のチャンバー(ペン)からなる使い捨てのナノ流体デバイス上にロードされ、培養され、それぞれがサブナノリットル体積を保持することができる。細胞は、光誘発性双電気泳動「ケージ」を使用してペン内に配置し、温度およびCO2制御条件下で培養することができる。マイクロ流体は細胞培養または薬物治療のためのチップ上の媒体または緩衝液の灌流を可能にする。作動した針は、インキュベートおよびシャッター付きウェルプレートからの細胞の輸出入を可能にする。チップ領域は、明視野および蛍光チャネル(DAPI、FITC、TRed、Cy5を含む)で4倍または10倍の倍率で画像化して、細胞のフェノタイプまたは機能解析を特徴付けることができます。システム全体は、設計済みのワークフローやカスタム実験に使用できるソフトウェアを使用して自動化されています。
HIV-1感染とP2XRの関係は検討されているが、これらの相互作用を並行して直接特徴付けるためのハイスループットの手順は報告されていない。ここでは、急性カルシウム流入とその後のHIV-1生産的感染を単細胞レベルで追跡することでHIV-P2XR相互作用を研究する方法論を説明する。特に、これは単一細胞内の複数のターゲットの直接的で高スループット、縦方向の測定を可能にする新しいツールを確立する。
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Protocol
1. イメージング用細胞の調製
- フレッシュフルー-4 AM負荷溶液を準備する:100倍の濃縮洗剤溶剤25μLを加え、1.5 mLチューブに2.5 μLのFluo-4 AM 1000xを加えます。混ぜる渦。
- 培養液のピペット2.5mLをローディング溶液に入れ、混入する。光から守る。
- 遠心分離機 2 x 106 MT-4 細胞で 500 x g 3 分間.
- 培地を取り外し、準備したFluo-4 AM負荷溶液の2mLでペレットを再び懸濁します。光から守る。
- ピペットは細胞を35mmペトリ皿に再懸濁した。37°Cで15〜30分間インキュベートし、室温でさらに15〜30分間インキュベートします。
- 細胞懸濁液を遠心分離管に移します。遠心分離細胞を500xgで3分間、ローディング液からなる上清を除去した。
- 培養培地の1mLにピペット化し、遠心分離機を500xgで洗浄して3分間再懸濁する。
- 培養培地中で2 x 106 細胞/mL(最小50μL)の濃度でピペット処理して細胞ペレットを再懸濁する。光から守る。
2. 検体系の調製、細胞の負荷、および細胞ペニング
- 細胞ペニングを容易にする湿潤液でチップを準備します。
- これを行うには、2 mLの湿潤溶液と50 mLのDI水を含む遠心管を新しい光流体チップを使用して機器にロードし、 ウェットチップ 機能を実行します。この機能は、システムの流体を介して自動的に湿潤溶液でチップをフラッディングし、チップを50°Cでインキュベートし、チップを水で3回洗い流します。
- 水の洗い流しが完了したら、250 μL の培養培地を 3 サイクルでチップを洗浄します。
- ステップ1.8のセル懸濁液を1:100 F-127洗剤溶質でローディング前に補い、細胞がチップチャネルに付着する可能性を低減します。
- 5 μLのセルパッケージボリュームの 荷重 操作と 小容量インポート を使用して、1.5 mL遠心管から細胞をインポートするには、装置のエクスポート針を使用します。
- 4.3 Vおよび5 μm/sケージ速度の最適化された光電子測位(OEP)電圧を使用したペンセル。ペニングは OEP を使用して発生します。単一セルを自動検出し、OEPケージで囲み、近くのペンに移動する Autopen 関数を使用してペニングを実行します。目的のセルが自動ペニングに続く場合は、 手動ペン 機能を使用してターゲットセルを選択し(マウスクリックで)、ターゲットペン(マウスクリックで)を選択します。
- ペニングが完了したら( オートペン 機能が完了したとき、または所望の数のペニングされた細胞が達成された場合)、250 μLの培養培地の3サイクルでチップをフラッシュして、残りの無ペンセルをチップから取り除きます。
3. 単細胞感染と機能的イメージング
- 細胞をペニングした後、FITC、テキサスレッド、およびDAPIチャネルの細胞の蛍光画像を取得し、ベースラインFluo-4、mCherry、および自己蛍光を測定します。
- HIV-1を2 x 106 細胞あたり13ngの濃度のマイクロチップに注入し、徐々に切り株を輸出針を通してチップにピペットします。
- HIV-1添加直後、FITCおよびDAPIチャネル内の画像を10分のタイムコースで繰り返し取得します。
- テキサスレッドおよびDAPIチャンネルで、感染後1日間、2日、3日、4日間の画像を取得します。
4. フィジーソフトウェアによる単一細胞機能イメージングデータの解析
- 対象の各イメージングチャネルの各時点で、フィジー ポイント選択 ツールと 測定 機能を使用して、各セルのFluo-4、mCherry、および自己蛍光信号を測定します。各セルを含むペンとチップの平均蛍光強度(MFI)を算出することにより、バックグラウンド蛍光を同時に測定します。
- Measure関数を使用して領域選択内の MFI を検索し、この値を細胞の蛍光値から減算することにより、バックグラウンド蛍光と自己蛍光を制御します。
- 各チップ画像のバックグラウンド蛍光を正規化する:各分野のチップのMFIを測定します。次に、他のすべてのチップMFI測定から最も低いバックグラウンド蛍光を持つチップのMFIを差し引きます。
- 各細胞含有ペンのバックグラウンド蛍光を正規化する:各視野における各細胞のペンのMFIを測定する。次に、各フィールドのセルの未加工の MFI からこの値を減算します。
- 細胞自家蛍光の制御:各セルの日0および日4 DAPI MFIを0日目および4日目mCherry MFiから差し引きます。
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Representative Results
図1は、蛍光顕微鏡を介して取得したチップおよび生撮像データの形式を示す。mCherry測定による未感染細胞および感染細胞の同定とクラスタリングを 図2に示す。これらのクラスターは、HIV感染細胞における初期のカルシウム流入を示す 図3のカルシウム流入動態について分析される。 図4 は、カルシウム流入とmCherry蛍光 20との間の有意な正の相関を示す。
図1:チップローディングと生撮像データ オプトエレクトロポジションを使用してチップ上のペンにセルをロードする回路図 (A)カルシウム流入は、FITCチャネル中のFluo-4カルシウム感受性色素を8.5分の時間経過(B)で検出することによって定量化される。HIV-1生産的な感染は、テキサスレッドチャンネル(C)でmCherryレポーターウイルスHIV NL-CIを検出することによって、4日間のコースで測定されます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:感染後4日目のmCherryシグナルに陽性の代表的なHIV感染細胞。 MT-4細胞は、検体流体プラットフォーム上でmCherryレポーターウイルスHIV-1 NL-CIに感染し、mCherryシグナルは感染後4日間(dpi)を測定した。4 dpi で mCherry 信号> 40,000 MFI (明確なブレークポイントが示された) の変化を持つセルは、「mCherry-high」の集団に集積されました。mCherry蛍光度<40,000 MFIの変化を有する細胞は、「mCherry-low」集団に集結した。統計ソフトウェアは、0および4dpiでmCherry蛍光の平均値をプロットするために使用された。4 dpiでの統計的有意性は、平均の非対t検定(mCherry-high=50235 MFI;mCherry-low=25017 MFI;p<0.000001)を用いて測定した。*=p<0.05, **=p<0.01, ***=p<0.001 この図の大きなバージョンを表示するにはここをクリックしてください。
図3: 初期カルシウム流入率が高い代表的なHIV感染細胞 MT-4細胞は、検体系プラットフォーム上でmCherryレポーターウイルスHIV-1 NL-CIに感染した。細胞内カルシウムは、9分の時間経過で蛍光4蛍光により繰り返し測定した。統計ソフトウェアは、mCherry-highおよびmCherry-low-low細胞クラスターの平均Fluo-4値をプロットするために使用されました。統計的有意性は、各時点で対t検定を使用して測定した。*=p<0.05, **=p<0.01, ***=p<0.001. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:mCherry陽性細胞において代表的な細胞内カルシウムフラックスが高い。 MT-4細胞は、mCherryレポーターウイルスHIV-1 NL-CIに感染した。細胞内カルシウムをFluo-4蛍光9分感染後測定し、感染後4日間測定した。単純な線形回帰は、統計ソフトウェアで実行されました。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
単一細胞におけるカルシウム流入とHIV-1生産的感染との関係を研究する記述された方法論は、他のアゴニストまたは関心のあるアンタゴニストに応答して細胞内カルシウム運動薬を研究するために適応することができる。イメージング用の細胞の調製は、簡単で、時間のかかる負担が最小限であり、試薬は広く使用されているメーカーの便利なキットで入手可能です。Fluo-4ベースのカルシウム測定は文献でよく記載されており、HIV-1は他のウイルスまたは関心のある化合物に簡単に置き換えてこのプラットフォームで研究することができます。異なる細胞タイプおよび培養培地を用いることができる。代替または追加の蛍光チャネルがサポートされ、複数の蛍光体を同時または順次に画像化することができる。
さらに、この手順は、縦方向の時間コースで蛍光色素標識イベントを研究するために広く適応することができる。フローサイトメトリーなどの標準的なハイスループットメソッドでは、時間経過経過による離散イベントのペアスタディは許可されません。蛍光顕微鏡による従来の単細胞イメージングは、スループット、視野間の細胞移動、および集中的な時間要件によって制限されます。この方法は、蛍光イメージングとハイスループットおよび自動化された単一細胞培養を組み合わせることで、関連する分子運動、後遺症、および相互作用を短期および長期の両方の時間間隔で解明することができます。ソフトウェアと画像解析の最適化は、アプリケーションごとに重要であることに注意してください。
顕微鏡は、明視野およびCy5、テキサスレッド、FITCおよびDAPI蛍光チャネル16が装備されている。利用可能な倍率は4xと10倍です。この方法は、現在、より多くの蛍光パラメータまたはより大きな倍率を必要とする調査には適していません。細胞暴露のためにチップに注入される目的の化合物は、ペンに入り、細胞に到達するための拡散を示さなければならない。ビーコン機器へのアクセスは、調査官にコスト障壁をもたらす可能性があります。
検体系は、幅広いスキャンとステッチング能力を有する。チップ上の光学的な選別は、セルの種類によって高効率の可変性を有するが、自動ソート効率は80〜90%の間であり、手動ソートは、その効率を100%に増加させることができる。各チップは3,500個のセルを収容でき、4つのチップを同時に実行でき、並列ワークフローで高い拡張性を実現します。イメージングワークフローは手動での画像解析によって報告されますが、システムの最新の更新により、この自動化が可能になります。ここで示すデータは画像閾値解析の限界内で代表的であり、画像解析の最適化と自動化は、HIV-1生産的な感染を示すカルシウム流入とmCherry信号の両方のより敏感な尺度をもたらす可能性があることに注意することが重要です。
記載されたプロトコルは、前に述べたようにMT-4細胞およびHIV-1を用いて確立した7、21、22。プロトコルを他の細胞株または目的の蛍光ターゲットに適応させる場合、最適化と検証が必要です。Fluo-4の動眼は細胞系依存性であるため、細胞型特異的な色素保持は、意図したカルシウムイメージング時間の経過に応じて、少なくとも持続することを確認する必要があります。この光流体デバイス上の色素保持とアゴニスト応答の検証は、10 μMイオノマイシンを含む成長培地でチップ上の細胞を処理することによって完了することができ、これはFITCチャネルで強力な細胞カルシウム流入およびFluo-4シグナルを誘導する必要があります。同様のコントロールと検証は、細胞への適切な濃度と拡散を確実にするために、任意のアゴニスト/アンタゴニストがチップに注入されるように行われるべきです。単細胞分析の場合、細胞は、個々の細胞をペンに分法できるように、単細胞懸濁液として調製する必要があります。従来の蛍光顕微鏡と同様に、蛍光暴露時間と測定された時点は、対象とするそれぞれのターゲットに最適化する必要があります。
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Disclosures
R.P.S.はSema4の従業員です。他の著者は開示する利益相反を持っていません。
Acknowledgments
ベンジャミン・チェン博士との科学的な議論に感謝しています。この作品は、K08AI120806(THS)、R01DA052255(THSおよびKB)、R21AI152833(THSおよびKB)によって資金提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Beacon Optofluidic System | Berkeley Lights | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | ||
| FIJI | Open-source software | PMID: 22743772, 22930834 | |
| Fluo-4 Calcium Imaging Kit | Thermo Fisher | F10489 | |
| HIV-1 NLCINL4-3 | Laboratory of Benjamin Chen | PMID: 28148796 | |
| Hyclone Pennecillin Streptomycin solution | GE Healthcare Life sciences | SV30010 | |
| MT-4 cells | NIH AIDS Reagent | ARP-120 | |
| OptoSelect 3500 chip | Berkeley Lights | ||
| Pipettor Tips | Denville Scientific | P3020-CPS | |
| Prism 9.0.0 | GraphPad | ||
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Serological Pipettes | Fisher Brand | 13-678-11E | |
| Tissue Culture Hood | Various models | ||
| T75 flasks | Corning | 3073 |
References
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