Summary
Hier stellen wir ein Protokoll vor, in dem einzelne Zellen auf akute Ereignisse und produktive HIV-1-Infektionen auf einem nanofluidischen Gerät überwacht werden. Bildgebende Daten definieren Virus-Wirt-Rezeptor-Interaktionen und Signalwegdynamik. Dies ist die erste Methode für nanofluidische Hochdurchsatz-Längskultur und Bildgebung von Einzelzellen, um Signalkinetik und molekulare Wechselwirkungen zu untersuchen.
Abstract
HIV-1 verursacht eine chronische Infektion, von der weltweit mehr als 37 Millionen Menschen betroffen sind. Menschen, die mit dem humanen Immundefizienzvirus (HIV) leben, erleben trotz antiretroviraler Therapie eine Komorbidität im Zusammenhang mit chronischen Entzündungen. Diese entzündlichen Signale wurden jedoch nicht vollständig charakterisiert. Die Rolle von Früheintrittsereignissen bei der Aktivierung zellulärer Signalereignisse und der nachgelagerten Genexpression wurde auf Einzelzellebene nicht erfasst. Hier beschreiben die Autoren eine Methode, die Prinzipien der Lebendzellfluoreszenzmikroskopie auf eine automatisierte Einzelzellplattform anwendet, die Zellen über benutzerspezifische Zeitkurse kulturiert und abbildet, was eine Hochdurchsatzanalyse dynamischer zellulärer Prozesse ermöglicht. Dieser Assay kann die einzellige Live-Fluoreszenzmikroskopie von frühen Ereignissen verfolgen, die unmittelbar auf eine HIV-1-Infektion folgen, insbesondere den Zustrom von Kalzium, der mit der Exposition gegenüber dem Virus einhergeht, und die Entwicklung einer produktiven Infektion mit einem fluoreszierenden Reportervirus. MT-4-Zellen werden mit einem kalziumempfindlichen Farbstoff beladen und in isolierten Pens auf einem nanofluidischen Gerät kultiviert. Die kultivierten Zellen sind mit einem HIV-1-Reportervirus (HIV-1 NLCI) infiziert. Ein Fluoreszenzmikroskop, das über dem nanofluidischen Gerät positioniert ist, misst den Kalziumzustrom über einen Zeitraum von 8 Minuten nach akuter HIV-1-Exposition. Die HIV-1-produktive Infektion wird in denselben Zellen über ein 4-Tage-Intervall gemessen. Bildgebende Daten aus diesen Zeitverläufen werden analysiert, um Virus-Wirt-Rezeptor-Interaktionen und Signalwegdynamik zu definieren. Die Autoren präsentieren eine integrierte, skalierbare Alternative zu herkömmlichen Bildgebungsmethoden mit einer neuartigen optofluidischen Plattform, die in der Lage ist, Einzelzellensortierung, Kultivierung, Bildgebung und Softwareautomatisierung zu ermöglichen. Dieser Assay kann die Kinetik von Ereignissen unter verschiedenen Bedingungen messen, einschließlich Zelltyp, Agonist oder Antagonisteneffekt, während er eine Reihe von Parametern misst. Dies ist die erste etablierte Methode für nanofluidische Hochdurchsatz-Längskultur und Bildgebung: Diese Technik kann breit angepasst werden, um zelluläre Signalkinetik und dynamische molekulare Wechselwirkungen zu untersuchen.
Introduction
Chronische Entzündungen sind eine der Hauptursachen für HIV-assoziierte frühe Morbiditäten und Mortalität1,2,3. Es gibt mehrere Mechanismen, durch die HIV entzündliche Signale aktivieren kann, und neuere Beweise deuten auf eine Rolle für die P2X-Rezeptoren beim HIV-Eintritt hin, die Calcium-gating Adenosintriphosphat (ATP)-Rezeptorensind 3,4,5,6,7,8,9,10. Der P2X-Subtyp der purinergen Rezeptoren (P2XR) kann wichtige Vermittler dieser Entzündung sein. Die molekularen Mechanismen der HIV-P2XR-Interaktionen sind jedoch weitgehend unbekannt und können sich auf frühe und späte Schritte des viralen HIV-1-Lebenszyklus auswirken. Die Definition der Wege und Kinetik, die HIV-assoziierte chronische Entzündungen antreiben, ist entscheidend für die Weiterentwicklung der Behandlungsmöglichkeiten für Menschen mit HIV.
Um zu beurteilen, ob HIV-1 P2X-Rezeptoren direkt quälisiert, müssen P2XR-Aktivierung und HIV-1-Infektion parallel gemessen werden. Assays der P2XR-Aktivität und der HIV-1-Infektion wurden unabhängig voneinander etabliert: Der zelluläre Kalziumzustrom ist ein Indikator für die P2XR-Aktivierung, und die HIV-1-produktive Infektion kann durch RNA-Häufigkeit quantifiziert werden. Der Fluoreszenznachweis von Kalziumzustrom ist mit dem calciumempfindlichen Farbstoff Fluo-4 möglich, und eine HIV-1-Infektion kann mit dem mCherry Fluoreszenz-Reportervirus HIV-NLCI11,12,13,14,15visualisiert werden .
Da diese Indikatoren für die P2X-Aktivierung (akuter zellulärer Kalziumzustrom) und die HIV-1-Infektion (HIV-1-RNA-Synthese) auf unterschiedlichen Zeitskalen (Minuten versus Tage) auftreten, fehlt eine Hochdurchsatzmethode, die eine gepaarte Analyse der P2XR-Aktivierung und der HIV-1-Infektion ermöglicht. Experimentelle Standardtechniken mit hohem Durchsatz, wie die Durchflusszytometrie, ermöglichen die Populationsanalyse, können jedoch den Zusammenhang zwischen akuten und longitudinalen Ereignissen in einzelnen Zellen nicht beurteilen. Alternativ ist die Einzelzellbildgebung mit Standard-Fluoreszenzmikroskopie ein niedriger Durchsatz. Diese experimentellen Einschränkungen erfordern neuartige Hochdurchsatztechniken, um Assoziationen zwischen akuten und longitudinalen zellulären Ereignissen direkt zu messen.
Ein beschriebenes optofluidisches System ist eine neuartige Plattform, die in der Lage ist, Einzelzellensortierung und -isolierung, Kultivierung, Bildgebung und Softwareautomatisierung16,17,18,19zu verwenden. Dieses System stellt eine integrierte Alternative mit hohem Durchsatz zu den Einschränkungen herkömmlicher bildgebender Verfahren dar. Die Beacon-Plattform besteht aus einem Kohlendioxid (CO2)und einem temperaturgesteuerten Inkubator, der die auf einem Chip enthaltenen Zellen unterstützt. Der Chip besitzt lichtempfindliche Transistoren, die als Reaktion auf gezieltes Licht einen elektrischen Gradienten erzeugen. Diese resultierende dielektrophoretische Kraft wird genutzt, um einzelne Zellen über den nanofluidischen Chip in die gewünschten Regionen zu bewegen. Die Zellen werden auf dem Chip in Stifte sortiert, die eine Barriere darstellen, um einzelne Zellen physisch zu isolieren. Ein kontinuierlicher laminarer Fluss von Wachstumsmedien im gesamten Chip verhindert die Zellmigration aus den Pens und ermöglicht gleichzeitig die Diffusion von Nährstoffen und experimentspezifischen Reagenzien mit kleinen Partikeln. Über dem Chip sitzt ein Fluoreszenzmikroskop. Software-Automatisierung wird verwendet, um Bilder des Chips zum benutzerdefinierten Zeitpunkt zu erfassen.
Die gesamte Zellcharakterisierung wurde mit einem optofluidischen System zur Einzelzellselektion und -manipulation durchgeführt. Dieses System besteht aus integrierten mechanischen, mikrofluidischen und optischen Komponenten, die Einzelzellmanipulation, Assay, Kultur und Bildgebung ermöglichen. Die Zellen werden auf das nanofluidische Einweggerät geladen und kultiviert, das aus 3.500 einzelnen Kammern (Pens) besteht, die jeweils ein Sub-Nanoliter-Volumen halten können. Zellen können in Pens mit lichtinduzierten dielektrophoretischen "Käfigen" positioniert und unter temperatur- und CO2-kontrollierten Bedingungenkultiviert werden. Die Mikrofluidik ermöglicht die Perfusion von Medien oder Puffern auf dem Chip zur Zellkultur oder medikamentösen Behandlung. Eine betätigte Nadel ermöglicht den Import und Export von Zellen aus inkubierten und geschlossenen Brunnenplatten. Der Chipbereich kann bei 4- oder 10-facher Vergrößerung in Hellfeld- und Fluoreszenzkanälen (einschließlich DAPI, FITC, TRed oder Cy5) abgebildet werden, um zelluläre Phänotypen oder Funktionsanalysen zu charakterisieren. Das gesamte System wird mithilfe von Software automatisiert, die für vorgefertigte Workflows oder benutzerdefinierte Experimente verwendet werden kann.
Beziehungen zwischen HIV-1-Infektion und P2XR wurden untersucht, aber ein Hochdurchsatzverfahren zur direkten Charakterisierung dieser Wechselwirkungen parallel wurde nicht berichtet. Hier beschreiben die Autoren eine Methodik zur Untersuchung von HIV-P2XR-Interaktionen durch Verfolgung des akuten Kalziumzustroms und der anschließenden HIV-1-produktiven Infektion auf Einzelzellebene. Insbesondere etabliert dies ein neuartiges Werkzeug, das eine direkte Längsmessung mehrerer Ziele in einzelnen Zellen mit hohem Durchsatz ermöglicht.
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Protocol
1. Vorbereitung der Zellen für die Bildgebung
- Bereiten Sie eine frische Fluo-4 AM-Ladelösung vor: Fügen Sie 25 μL 100x konzentriertes Reinigungsmittellösungsmittel hinzu und fügen Sie dann 2,5 μL Fluo-4 AM 1000x in ein 1,5 ml Röhrchen hinzu. Wirbel zum Mischen.
- 2,5 ml Nährmedien in die Ladelösung pipetten und zum Mischen invertieren. Vor Licht schützen.
- Zentrifuge 2 x 106 MT-4 Zellen bei 500 x g für 3 min.
- Entfernen Sie das Medium und entfernen Sie das Pellet in 2 ml der vorbereiteten Fluo-4 AM-Ladelösung. Vor Licht schützen.
- Pipette resuspendierte Zellen in eine 35 mm Petrischale. Bei 37 °C 15-30 min inkubieren und dann weitere 15-30 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Die Zellsuspension in ein Zentrifugenrohr überführen. Zentrifugenzellen bei 500 x g für 3 min und entfernen Sie den Überstand bestehend aus der Ladelösung.
- Das Zellpellet durch Pipettieren in 1 ml des Kulturmediums wieder aufregen und bei 500 x g zentrifugieren, um 3 min zu waschen.
- Das Zellpellet wird durch Pipettieren im Kulturmedium in einer Konzentration von 2 x 106 Zellen/ml (mindestens 50 μL) wieder aufgebraucht. Vor Licht schützen.
2. Optofluidische Systemvorbereitung, Zellbeladung und Zellmisting
- Bereiten Sie einen Chip mit der Benetzungslösung vor, der das Zellpfing erleichtert.
- Laden Sie dazu Zentrifugenröhrchen mit 2 mL Benetzungslösung und 50 mL DI-Wasser mit einem neuen optofluidischen Chip auf das Instrument und führen Sie die Wet-Chip-Funktion aus. Diese Funktion flutt den Chip automatisch mit der Benetzungslösung durch die Systemfluidik, inkubiert den Chip bei 50° C und spült den Chip 3 mal mit Wasser.
- Sobald die Wasserspülung abgeschlossen ist, spülen Sie den Chip mit 3 Zyklen von 250 μL Nährmedien.
- Ergänzen Sie die Zellsuspension aus Schritt 1.8 mit 1:100 F-127 Reinigungsmittel gelöstem Reinigungsmittel vor der Beladung, um die Wahrscheinlichkeit zu verringern, dass Zellen an den Chipkanälen haften.
- Verwenden Sie die Instrumentenexportnadel, um Zellen aus einem 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen mit dem Load-Vorgang und dem Small Volume Import für ein 5 μL-Zellpaketvolumen zu importieren.
- Stiftzellen mit einer optimierten optoelektronischen Positionierspannung (OEP) von 4,3 V und 5 μm/s Käfiggeschwindigkeit. Penning erfolgt mit OEP. Führen Sie das Schreiben mit der Autopen-Funktion durch, die einzelne Zellen automatisch erkennt, sie mit einem OEP-Käfig umgibt und sie in einen nahe gelegenen Stift bewegt. Wenn nach dem automatischen Schreiben noch interessante Zellen übrig bleiben, verwenden Sie die Funktion Manueller Stift, um Zielzellen (mit einem Mausklick) und einen Zielstift (mit einem anschließenden Mausklick) auszuwählen.
- Sobald das Penning abgeschlossen ist (entweder wenn die Autopen-Funktion abgeschlossen ist oder wenn die gewünschte Anzahl von gepferchten Zellen erreicht wurde), spülen Sie den Chip mit 3 Zyklen von 250 μL Nährmedien, um alle verbleibenden nicht gepennten Zellen vom Chip zu befreien.
3. Einzelzellinfektion und funktionelle Bildgebung
- Nach dem Penning von Zellen erhalten Sie fluoreszierende Bilder von Zellen in FITC-, Texas Red- und DAPI-Kanälen, um die Ausgangswerte Fluo-4, mCherry und Autofluoreszenz zu messen.
- Infundieren Sie HIV-1 in einer Konzentration von 13 ng HIV-1 NL-CI pro 2 x 106 Zellen in den Mikrochip, indem Sie die Suspension langsam durch die Exportnadel in den Chip pipettieren.
- Unmittelbar nach der HIV-1-Zugabe erhalten Sie wiederholt Bilder in den FITC- und DAPI-Kanälen über einen 10-minütigen Zeitverlauf.
- Erhalten Sie Bilder in den Texas Red- und DAPI-Kanälen 1-, 2-, 3- und 4-Tage-Post-Infektion (DPI).
4. Analyse von einzelligen funktionellen Bildgebungsdaten mit der FIJI-Software
- Verwenden Sie zu jedem Zeitpunkt in jedem interessierenden Bildgebungskanal das FIJI Point Selection-Tool und die Measure-Funktion, um die Fluo-4-, mCherry- und Autofluoreszenzsignale jeder Zelle zu messen. Messen Sie gleichzeitig die Hintergrundfluoreszenz, indem Sie die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) des Pens und Chips berechnen, der jede Zelle enthält.
- Steuern Sie die Hintergrundfluoreszenz und Autofluoreszenz, indem Sie die Measure-Funktion verwenden, um das MFI in einer Regionsauswahl zu finden und diesen Wert vom Zellfluoreszenzwert zu subtrahieren.
- Normalisieren Sie die Hintergrundfluoreszenz jedes Chipbildes: Messen Sie die MFI des Chips in jedem Feld. Subtrahieren Sie dann das MFI des Chips mit der geringsten Hintergrundfluoreszenz von allen anderen Chip-MFI-Messungen.
- Normalisieren Sie die Hintergrundfluoreszenz jedes zellhaltigen Stifts: Messen Sie die MFI des Stifts jeder Zelle in jedem Sichtfeld. Subtrahieren Sie dann diesen Wert vom rohen MFI der Zelle für jedes Feld.
- Kontrolle für die Zellautofluoreszenz: Subtrahieren Sie den Tag 0 und Tag 4 DAPI MFI jeder Zelle von den Tag 0 und Tag 4 mCherry MFIs.
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Representative Results
Abbildung 1 zeigt das Format des Chips und die mit dem Fluoreszenzmikroskop erfassten Rohdaten. Die Identifizierung und Clusterung von nicht infizierten und infizierten Zellen mittels mCherry-Messung ist in Abbildung 2 dargestellt. Diese Cluster werden in Abbildung 3auf Kalziumzuflusskinetik analysiert, die einen frühen Kalziumzustrom in HIV-infizierten Zellen zeigt. Abbildung 4 zeigt eine signifikante positive Korrelation zwischen Calciumzufluss und mCherry-Fluoreszenz 20.
Abbildung 1:Chipladen und Bilddaten. Schematische Darstellung der Ladezellen in Stifte auf dem Chip mittels Optoelektropositionierung (A). Der Kalziumzustrom wird quantifiziert, indem der calciumempfindliche Farbstoff Fluo-4 im FITC-Kanal über einen 8,5-minütigen Zeitverlauf ( B ) nachgewiesenwird. Die HIV-1-produktive Infektion wird über einen Zeitraum von 4 Tagen gemessen, indem das mCherry-Reportervirus HIV NL-CI im Texas Red Channel ( C ) nachgewiesenwird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Repräsentative HIV-infizierte Zellen, die am Tag 4 nach der Infektion positiv auf mCherry-Signale getestet wurden. MT-4-Zellen wurden mit dem mCherry-Reportervirus HIV-1 NL-CI auf der optofluidischen Plattform infiziert, und das mCherry-Signal wurde 4 Tage nach der Infektion (dpi) gemessen. Zellen mit einer Änderung des mCherry-Signals >40.000 MFI (wobei ein klarer Haltepunkt festgestellt wurde) bei 4 dpi wurden in die "mCherry-high" -Population gruppiert; Zellen mit einer Veränderung der mCherry-Fluoreszenz <40.000 MFI wurden in die "mCherry-low" -Population geclustert. Statistische Software wurde verwendet, um die Mittelwerte der mCherry-Fluoreszenz bei 0 und 4 dpi zu zeichnen. Die statistische Signifikanz bei 4 dpi wurde mit einem ungepaarten t-Test der Mittelwerte gemessen (mCherry-high=50235 MFI; mCherry-low=25017 MFI; p<0,000001). *=p<0.05, **=p<0.01, ***=p<0.001 Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Repräsentative HIV-infizierte Zellen mit hohen Raten von frühem Kalziumzustrom. MT-4-Zellen wurden auf der optofluidischen Plattform mit dem mCherry-Reportervirus HIV-1 NL-CI infiziert. Intrazelluläres Kalzium wurde durch Fluo-4-Fluoreszenz wiederholt über einen 9-minütigen Zeitverlauf gemessen. Statistische Software wurde verwendet, um die mittleren Fluo-4-Werte der mCherry-high- und mCherry-low-Zellcluster zu zeichnen. Die statistische Signifikanz wurde mit ungepaarten t-Tests zu jedem Zeitpunkt gemessen. *=p<0,05, **=p<0,01, ***=p<0,001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Repräsentativer intrazellulärer Kalziumfluss höher in mCherry-positiven Zellen. MT-4-Zellen wurden mit dem mCherry-Reportervirus HIV-1 NL-CI infiziert. Intrazelluläres Kalzium wurde 9 Minuten nach der Infektion durch Fluo-4-Fluoreszenz und mCherry 4 Tage nach der Infektion gemessen. Eine einfache lineare Regression wurde mit statistischer Software durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die beschriebene Methodik zur Untersuchung der Beziehung zwischen Kalziumzustrom und HIV-1-produktiver Infektion in einzelnen Zellen kann angepasst werden, um die intrazelluläre Kalziumkinetik als Reaktion auf andere Agonisten oder Antagonisten von Interesse zu untersuchen. Die Vorbereitung der Zellen für die Bildgebung ist einfach, minimal zeitintensiv und Reagenzien sind in praktischen Kits von weit verbreiteten Herstellern erhältlich. Die Calciummessung auf Fluo-4-Basis ist in der Literatur gut beschrieben, und HIV-1 kann leicht durch andere Viren oder Verbindungen ersetzt werden, die auf dieser Plattform untersucht werden können. Es können verschiedene Zelltypen und Kulturmedien verwendet werden. Alternative oder zusätzliche Fluoreszenzkanäle werden unterstützt, und mehrere Fluorophore können gleichzeitig oder nacheinander abgebildet werden.
Darüber hinaus kann das Verfahren weitgehend angepasst werden, um Fluorophor-markierte Ereignisse in longitudinalen Zeitverläufen zu untersuchen. Standardmethoden mit hohem Durchsatz, wie die Durchflusszytometrie, erlauben keine gepaarte Untersuchung diskreter Ereignisse im Laufe der Zeit. Die herkömmliche Einzelzellbildgebung durch Fluoreszenzmikroskopie ist durch Durchsatz, Zellmigration über Sichtfelder und intensiven Zeitaufwand begrenzt. Durch die Kombination von Fluoreszenzbildgebung mit Hochdurchsatz und automatisierter Einzelzellkultur ermöglicht diese Methode die Aufklärung relevanter molekularer Kinetik, Folgeerscheinungen und Wechselwirkungen in kurz- und langfristigen Zeitintervallen. Es ist wichtig zu beachten, dass die Optimierung von Software und Bildanalyse für jede Anwendung von entscheidender Bedeutung ist.
Das Mikroskop ist mit Hellfeld- und Cy5-, Texas Red-, FITC- und DAPI-Fluoreszenzkanälen16ausgestattet. Verfügbare Vergrößerungen sind 4x und 10x. Diese Methode eignet sich derzeit nicht für Untersuchungen, die zahlreichere Fluoreszenzparameter oder größere Vergrößerungen erfordern. Verbindungen von Interesse, die für die Zellexposition in den Chip infundiert werden, müssen eine Diffusion aufweisen, um in Stifte zu gelangen und Zellen zu erreichen. Der Zugang zu einem Beacon-Instrument kann für ermittler ein Kostenhindernis darstellen.
Das optofluidische System verfügt über eine breite Scan- und Stitching-Fähigkeit. Die optische Sortierung auf dem Chip hat je nach Zelltyp eine hocheffiziente Variable, aber die automatische Sortiereffizienz liegt zwischen 80-90%, und die manuelle Sortierung kann diese Effizienz auf 100% erhöhen. Jeder Chip kann 3.500 Zellen aufnehmen, und vier Chips können gleichzeitig mit einem parallelen Workflow ausgeführt werden, was zu einer hohen Skalierbarkeit führt. Während der Imaging-Workflow durch manuelle Bildanalyse gemeldet wird, ermöglichen neuere Updates im System eine Automatisierung. Es ist wichtig zu beachten, dass die hier gezeigten Daten innerhalb der Grenzen der Bildschwellenanalyse repräsentativ sind und die Optimierung und Automatisierung der Bildanalyse wahrscheinlich zu empfindlicheren Messungen sowohl des Kalziumzustroms als auch des mCherry-Signals führen wird, was auf eine HIV-1-produktive Infektion hinweist.
Das beschriebene Protokoll wurde unter Verwendung von MT-4-Zellen und HIV-1 wie zuvor beschrieben7,21,22erstellt. Bei der Anpassung des Protokolls an andere Zelllinien oder fluoreszierende Ziele von Interesse sind Optimierung und Validierung erforderlich. Die Kinetik des Fluo-4-Effluxes ist zelllinienabhängig, so dass die zelltypspezifische Farbstoffretention bestätigt werden sollte, um zumindest dann anhält, wenn die beabsichtigte Calcium-Bildgebung zeitlich verstrichen ist. Die Validierung der Farbstoffretention und der Agonistenreaktion auf diesem optofluidischen Gerät kann durch die Behandlung von Zellen auf dem Chip mit dem Wachstumsmedium abgeschlossen werden, das 10 μM Ionomycin enthält, das einen starken zellulären Kalziumzufluss und das Fluo-4-Signal im FITC-Kanal induzieren sollte. Ähnliche Kontrollen und Validierungen sollten für alle Agonisten/Antagonisten durchgeführt werden, die in den Chip infundiert werden sollen, um die richtige Konzentration und Diffusion zu den Zellen zu gewährleisten. Für die Einzelzellanalyse sollten Zellen als Einzelzellsuspension vorbereitet werden, um die Sortierung einzelner Zellen in Stifte zu erleichtern. Wie bei der herkömmlichen Fluoreszenzmikroskopie sollten die gemessenen Fluoreszenz-Expositionszeiten und -zeitpunkte für jedes jeweilige Ziel von Interesse optimiert werden.
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Disclosures
R.P.S. ist Mitarbeiter von Sema4. Die anderen Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Wir sind dankbar für die wissenschaftlichen Gespräche mit Dr. Benjamin Chen. Diese Arbeit wurde von K08AI120806 (THS), R01DA052255 (THS und KB) und R21AI152833 (THS und KB) finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Beacon Optofluidic System | Berkeley Lights | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | ||
| FIJI | Open-source software | PMID: 22743772, 22930834 | |
| Fluo-4 Calcium Imaging Kit | Thermo Fisher | F10489 | |
| HIV-1 NLCINL4-3 | Laboratory of Benjamin Chen | PMID: 28148796 | |
| Hyclone Pennecillin Streptomycin solution | GE Healthcare Life sciences | SV30010 | |
| MT-4 cells | NIH AIDS Reagent | ARP-120 | |
| OptoSelect 3500 chip | Berkeley Lights | ||
| Pipettor Tips | Denville Scientific | P3020-CPS | |
| Prism 9.0.0 | GraphPad | ||
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Serological Pipettes | Fisher Brand | 13-678-11E | |
| Tissue Culture Hood | Various models | ||
| T75 flasks | Corning | 3073 |
References
- Aberg, J. A. Aging, inflammation, and HIV infection. Topics in Antiviral Medicine. 20 (3), 101-105 (2012).
- Deeks, S. G., Tracy, R., Douek, D. C. Systemic effects of inflammation on health during chronic HIV infection. Immunity. 39 (4), 633-645 (2013).
- Swartz, T. H., Dubyak, G. R., Chen, B. K. Purinergic receptors: Key mediators of HIV-1 infection and inflammation. Fromtiers in Immunology. 6, 585 (2015).
- Giroud, C., Marin, M., Hammonds, J., Spearman, P., Melikyan, G. B. P2X1 receptor antagonists inhibit HIV-1 fusion by blocking virus-coreceptor interactions. Journal of Virology. 89 (18), 9368-9382 (2015).
- Hazleton, J. E., Berman, J. W., Eugenin, E. A. Purinergic receptors are required for HIV-1 infection of primary human macrophages. Journal of Immunology. 188 (9), 4488-4495 (2012).
- Marin, M., et al. High-throughput HIV-cell fusion assay for discovery of virus entry inhibitors. Assay and Drug Development Technology. 13 (3), 155-166 (2015).
- Soare, A. Y., et al. P2X Antagonists inhibit HIV-1 productive infection and inflammatory cytokines interleukin-10 (IL-10) and IL-1β in a human tonsil explant model. Journal of Virology. 93 (1), 01186 (2019).
- Sorrell, M. E., Hauser, K. F. Ligand-gated purinergic receptors regulate HIV-1 Tat and morphine related neurotoxicity in primary mouse striatal neuron-glia co-cultures. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (2), 233-244 (2014).
- Swartz, T. H., Esposito, A. M., Durham, N. D., Hartmann, B. M., Chen, B. K. P2X-selective purinergic antagonists are strong inhibitors of HIV-1 fusion during both cell-to-cell and cell-free infection. Journal of Virology. 88 (19), 11504-11515 (2014).
- Soare, A. Y., et al. P2RX7 at the host-pathogen interface of infectious diseases. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 85 (1), (2021).
- Chen, P., Hübner, W., Spinelli, M. A., Chen, B. K. Predominant mode of human immunodeficiency virus transfer between T cells is mediated by sustained Env-dependent neutralization-resistant virological synapses. Journal of Virology. 81 (22), 12582-12595 (2007).
- Dale, B. M., et al. Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion. Cell Host Microbe. 10 (6), 551-562 (2011).
- Gee, K. R., et al. Chemical and physiological characterization of fluo-4 Ca(2+)-indicator dyes. Cell Calcium. 27 (2), 97-106 (2000).
- He, M. L., Zemkova, H., Koshimizu, T. A., Tomić, M., Stojilkovic, S. S. Intracellular calcium measurements as a method in studies on activity of purinergic P2X receptor channels. American Journal of Physiology and Cell Physiology. 285 (2), 467-479 (2003).
- Li, H., Zony, C., Chen, P., Chen, B. K. Reduced potency and incomplete neutralization of broadly neutralizing antibodies against cell-to-cell transmission of HIV-1 with transmitted founder envs. Journal of Virology. 91 (9), 02425 (2017).
- Beaumont, K. G., et al. Multiparameter cell characterization using nanofluidic technology facilitates real-time phenotypic and genotypic elucidation of intratumor heterogeneity. bioRxiv. , 457010 (2018).
- Le, K., et al. Assuring clonality on the beacon digital cell line development platform. Biotechnology Journal. 15 (1), 1900247 (2020).
- Mocciaro, A., et al. Light-activated cell identification and sorting (LACIS) for selection of edited clones on a nanofluidic device. Communications in Biology. 1, 41 (2018).
- Winters, A., et al. Rapid single B cell antibody discovery using nanopens and structured light. MAbs. 11 (6), 1025-1035 (2019).
- Wu, N., Nishioka, W. K., Derecki, N. C., Maher, M. P. High-throughput-compatible assays using a genetically-encoded calcium indicator. Science Reports. 9 (1), 12692 (2019).
- Esposito, A. M., et al. A high-throughput cre-lox activated viral membrane fusion assay to identify inhibitors of HIV-1 viral membrane fusion. Journal of Visualized Experiments. (138), e58074 (2018).
- Soare, A. Y., et al. P2X1 selective antagonists block HIV-1 infection through inhibition of envelope conformation-dependent fusion. Journal of Virology. 94 (6), 01622 (2020).
