Summary
Her presenterer vi en protokoll der enkeltceller overvåkes for akutte hendelser og produktiv HIV-1-infeksjon på en nanofluidisk enhet. Bildedata definerer interaksjoner mellom virusvertsreseptorer og signalveidynamikk. Dette er den første metoden for nanofluidisk høygjennomstrømning langsgående encellet kultur og avbildning for å studere signalkinetikk og molekylære interaksjoner.
Abstract
HIV-1 forårsaker en kronisk infeksjon som rammer mer enn 37 millioner mennesker over hele verden. Personer som lever med humant immunsviktvirus (HIV) opplever komorbiditet relatert til kronisk betennelse til tross for antiretroviral behandling. Imidlertid har disse inflammatoriske signalene ikke blitt fullstendig karakterisert. Rollen til tidlige inngangshendelser om aktivering av cellulære signalhendelser og nedstrøms genuttrykk er ikke fanget opp på encellet nivå. Her beskriver forfatterne en metode som anvender prinsipper for levende celle fluorescensmikroskopi til en automatisert encellet plattform som kulturer og bildeceller over brukertilpassede tidskurs, noe som muliggjør høy gjennomstrømningsanalyse av dynamiske cellulære prosesser. Denne analysen kan spore encellet levende fluorescensmikroskopi av tidlige hendelser som umiddelbart følger HIV-1-infeksjon, spesielt tilstrømningen av kalsium som følger med eksponering for viruset og utvikling av produktiv infeksjon ved hjelp av et fluorescerende reportervirus. MT-4 celler er lastet med kalsiumfølsomt fargestoff og dyrket i isolerte penner på en nanofluidisk enhet. De kultiverte cellene er infisert med et HIV-1-reportervirus (HIV-1 NLCI). Et fluorescensmikroskop plassert over nanofluidisk enhet måler kalsiumtilstrømning over et 8-minutters tidsforløp etter akutt HIV-1-eksponering. HIV-1 produktiv infeksjon måles i de samme cellene over et 4-dagers intervall. Bildedata fra disse tidskursene analyseres for å definere interaksjoner mellom virusvertsreseptorer og signalveidynamikk. Forfatterne presenterer et integrert, skalerbart alternativ til tradisjonelle bildemetoder ved hjelp av en ny optofluidisk plattform som er i stand til encellet sortering, kulturing, avbildning og programvareautomatisering. Denne analysen kan måle kinetikken til hendelser under ulike forhold, inkludert celletype, agonist eller antagonistisk effekt, mens du måler en rekke parametere. Dette er den første etablerte metoden for nanofluidisk høygjennomstrømning langsgående encellet kultur og avbildning: Denne teknikken kan tilpasses bredt for å studere cellulær signaleringskinetikk og dynamiske molekylære interaksjoner.
Introduction
Kronisk betennelse er en ledende årsak til HIV-assosierte tidlige sykeligheter ogdødelighet 1,2,3. Det finnes flere mekanismer der HIV kan aktivere inflammatorisk signalering, og nyere bevis tyder på en rolle for P2X-reseptorene i HIV-oppføring som er kalsium-gating adenosin triphosfat (ATP)reseptorer 3,4,5,6,7,8,9,10. P2X-undertypen av purinergiske reseptorer (P2XR) kan være viktige tilretteleggere for denne betennelsen. Imidlertid er de molekylære mekanismene for HIV-P2XR-interaksjoner i stor grad ukjente og kan påvirke tidlige og sene HIV-1 virale livssyklustrinn. Å definere veier og kinetikk som driver HIV-assosiert kronisk betennelse er avgjørende for å fremme behandlingstilbud for personer med HIV.
For å vurdere om HIV-1 direkte plager P2X-reseptorer, må P2XR-aktivering og HIV-1-infeksjon måles parallelt. Analyser av P2XR-aktivitet og HIV-1-infeksjon er uavhengig etablert: Cellulær kalsiumtilstrømning er en indikator på P2XR-aktivering, og HIV-1 produktiv infeksjon kan kvantifiseres av RNA-overflod. Fluorescensdeteksjon av kalsiumtilstrømning er mulig med Fluo-4 kalsiumsensitiv fargestoff, og HIV-1-infeksjon kan visualiseres med mCherry fluorescerende reportervirus HIV-NLCI11,12,13,14,15.
Fordi disse indikatorene for P2X-aktivering (akutt cellulær kalsiumtilstrømning) og HIV-1-infeksjon (HIV-1 RNA-syntese) forekommer på forskjellige tidsskalaer (minutter kontra dager), mangler det en høy gjennomstrømningsmetode som muliggjør sammenkoblet analyse av P2XR-aktivering og HIV-1-infeksjon. Standard eksperimentelle teknikker med høy gjennomstrømning, for eksempel strømningscytometri, tillater populasjonsanalysen, men kan ikke vurdere forholdet mellom akutte og langsgående hendelser i enkeltceller. Alternativt er encellet avbildning med standard fluorescensmikroskopi lav gjennomstrømning. Disse eksperimentelle begrensningene gir et behov for nye teknikker med høy gjennomstrømning for å måle assosiasjoner mellom akutte og langsgående cellulære hendelser direkte.
Et optofluidisk system som beskrives er en ny plattform som kan sortere og isolere enkeltceller, kultivering, bildebehandling og programvareautomatisering16,17,18,19. Dette systemet presenterer et integrert, høygjennomstrømningsalternativ til begrensningene ved tradisjonelle avbildningsmetoder. Beacon-plattformen består av et karbondioksid (CO2) og temperaturkontrollert inkubator som støtter celler som finnes på en brikke. Brikken har lysfølsomme transistorer som genererer en elektrisk gradient som svar på målrettet lys. Denne resulterende dielektrophoretiske kraften brukes til å flytte individuelle celler over nanofluidisk chip til de ønskede områdene. Celler sorteres i penner på brikken, noe som gir en barriere for å isolere individuelle celler fysisk. Kontinuerlig laminær strøm av vekstmedier gjennom hele brikken forhindrer cellemigrering fra pennene samtidig som det muliggjør småpartikkeldiffusjon av næringsstoffer og eksperimentspesifikke reagenser. Et fluorescensmikroskop sitter over brikken. Programvareautomatisering brukes til å ta bilder av brikken på det brukerangitte tidspunktet.
All cellekarakterisering ble utført ved hjelp av et optofluidisk system for enkeltcellet utvalg og manipulering. Dette systemet består av integrerte mekaniske, mikrofluidiske og optiske komponenter som muliggjør encellet manipulering, analyse, kultur og avbildning. Celler lastes og dyrkes på den engangs nanofluidiske enheten som består av 3500 individuelle kamre (penner), som hver er i stand til å holde sub-nanolitervolum. Celler kan plasseres i penner ved hjelp av lysinduserte dielektrophoretiske "bur" og dyrkes under temperatur- og CO2-kontrollerteforhold. Mikrofluidene tillater perfusjon av medier eller buffere på brikken for cellekultur eller narkotikabehandling. En aktivert nål gjør det mulig å importere og eksportere celler fra inkuberte og lukkede brønnplater. Sponområdet kan avbildes ved 4x eller 10x forstørrelse i brightfield og fluorescerende kanaler (inkludert DAPI, FITC, TRed eller Cy5) for å karakterisere cellulære fenotyper eller funksjonell analyse. Hele systemet automatiseres ved hjelp av programvare som kan brukes til forhåndsutformede arbeidsflyter eller egendefinerte eksperimenter.
Sammenhenger mellom HIV-1-infeksjon og P2XR er studert, men det er ikke rapportert en høy gjennomstrømningsprosedyre for å direkte karakterisere disse interaksjonene parallelt. Her beskriver forfatterne en metodikk for å studere HIV-P2XR-interaksjoner gjennom sporing av akutt kalsiumtilstrømning og påfølgende HIV-1-produktiv infeksjon på encellet nivå. Spesielt etablerer dette et nytt verktøy som muliggjør direkte, høy gjennomstrømning, langsgående måling av flere mål i enkeltceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse av celler for avbildning
- Forbered fersk Fluo-4 AM lasteløsning: Tilsett 25 μL 100x konsentrert vaskemiddelløsningsmiddel, tilsett deretter 2,5 μL Fluo-4 AM 1000x til et 1,5 ml rør. Virvel å blande.
- Pipette 2,5 ml kulturmedier inn i lasteløsningen og inverter for å blande. Beskyttes mot lys.
- Sentrifuge 2 x 106 MT-4 celler ved 500 x g i 3 min.
- Fjern media og resuspend pellet i 2 ml av den tilberedte Fluo-4 AM lasteløsningen. Beskyttes mot lys.
- Pipette resuspended celler i en 35 mm Petri tallerken. Inkuber ved 37 °C i 15-30 min, og inkuber deretter i ytterligere 15-30 minutter ved romtemperatur.
- Overfør cellefjæringen til et sentrifugerør. Sentrifuger celler på 500 x g i 3 min og fjern supernatanten som består av lasteløsningen.
- Resuspend cellepellet ved pipettering i 1 ml av kulturmediet og sentrifugering ved 500 x g i 3 minutter å vaske.
- Resuspend cellepellet ved pipettering i kulturmediet i en konsentrasjon på 2 x 106 celler / ml (minimum 50 μL). Beskyttes mot lys.
2. Optofluidisk systemforberedelse, cellelasting og cellemerking
- Forbered en brikke med fuktløsningen, noe som letter cellemerking.
- For å gjøre dette, last sentrifugerør som inneholder 2 ml fuktløsning og 50 ml DI-vann på instrumentet med en ny optofluidisk brikke og kjør Wet Chip-funksjonen. Denne funksjonen vil automatisk oversvømme brikken med fukteløsningen gjennom systemvæskene, inkubere brikken ved 50, ° C og skylle brikken med vann 3 ganger.
- Når vannspylingen er ferdig, skyll brikken med 3 sykluser på 250 μL kulturmedier.
- Suppler cellefjæringen fra trinn 1.8 med 1:100 F-127 vaskemiddelløsning før lasting for å redusere sannsynligheten for at celler holder seg til sponkanalene.
- Bruk instrumenteksportnålen til å importere celler fra et 1,5 ml sentrifugerør ved hjelp av lastoperasjonen og liten volumimport for et 5 μL cellepakkevolum.
- Pennceller som bruker en optimalisert optoelektronisk posisjoneringsspenning (OEP) på 4,3 V og 5 μm/s merdhastighet. Penning skjer ved hjelp av OEP. Utfør penning ved hjelp av Autopen-funksjonen, som automatisk vil sette sammen enkeltceller, omgi dem med et OEP-bur og flytte dem inn i en penn i nærheten. Hvis det fortsatt er flere celler etter automatisk penning, bruker du manuell pennefunksjon til å merke målceller (med museklikk) og en målpenn (med et etterfølgende museklikk).
- Når penningen er fullført (enten når Autopen-funksjonen er fullført eller når ønsket antall pennede celler er oppnådd), skyll brikken med 3 sykluser på 250 μL kulturmedier for å fjerne eventuelle gjenværende unpennede celler fra brikken.
3. Encellet infeksjon og funksjonell avbildning
- Etter å ha skrevet celler, få fluorescerende bilder av celler i FITC- og Texas Red- og DAPI-kanaler for å måle baseline Fluo-4, mCherry og autofluorescence.
- Tilsett HIV-1 i mikrochipen i en konsentrasjon på 13 ng HIV-1 NL-CI per 2 x 106 celler ved å sakte pipetter suspensjonen inn i brikken gjennom eksportnålen.
- Umiddelbart etter HIV-1-tillegg, få gjentatte ganger bilder i FITC- og DAPI-kanalene over et 10-minutters tidsforløp.
- Få bilder i Texas Red- og DAPI-kanalene ved 1-, 2-, 3- og 4-dagers etterinfeksjon (DPI).
4. Analyse av enkeltcellede funksjonelle bildedata med FIJI-programvare
- På hvert tidspunkt i hver bildekanal du er interessert i, bruker du FIJI Point Selection-verktøyet og Mål-funksjonen til å måle hver celles Fluo-4-, mCherry- og autofluorescence-signaler. Mål samtidig bakgrunnsfluorescensen ved å beregne gjennomsnittlig fluorescensintensitet (MFI) på pennen og brikken som inneholder hver celle.
- Kontroll for fluorescens og autofluorescens i bakgrunnen ved å bruke Mål-funksjonen til å finne MFI i et regionvalg og trekke denne verdien fra cellefluorescensverdien.
- Normaliser bakgrunnsfluorescensen til hvert brikkebilde: Mål MFI på brikken i hvert felt. Trekk deretter MFI på brikken med minst bakgrunnsfluorescens fra alle andre chip MFI-målinger.
- Normaliser bakgrunnsfluorescensen til hver celleholdige penn: Mål MFI for hver cellepenn i hvert synsfelt. Trekk deretter denne verdien fra cellens rå MFI for hvert felt.
- Kontroll for celledisfluorescens: Trekk fra dag 0 og dag 4 DAPI MFI for hver celle fra dag 0 og dag 4 mCherry MFIer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 illustrerer formatet på brikken og råavbildningsdata som er samlet inn gjennom fluorescensmikroskopet. Identifisering og klyngering av uinfiserte og infiserte celler via mCherry-måling vises i figur 2. Disse klyngene analyseres for kalsiumtilstrømningskinetikk i figur 3, som viser tidlig kalsiumtilstrømning i HIV-infiserte celler. Figur 4 viser en signifikant positiv sammenheng mellom kalsiumtilstrømning og mCherry fluorescens 20.
Figur 1: Chip lasting og rå bildedata. Skjemaer for å laste celler inn i penner på brikken ved hjelp av opto-elektroposisjonering (A). Kalsiumtilstrømning kvantifiseres ved å oppdage det kalsiumfølsomme fargestoffet Fluo-4 i FITC-kanalen over et tidskurs på 8,5 minutter (B). HIV-1 produktiv infeksjon måles over et 4-dagers tidskurs ved å oppdage mCherry reporterviruset HIV NL-CI i Texas Red channel (C). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representative HIV-infiserte celler positive for mCherry signalerat dag 4 etter infeksjon. MT-4 celler ble infisert med mCherry reportervirus hiv-1 NL-CI på den optofluidiske plattformen, og mCherry signal ble målt 4 dager etter infeksjon (dpi). Celler med en endring i mCherry-signalet > 40 000 MFI (der et klart avbruddspunkt ble notert) på 4 dpi ble gruppert i den "mCherry-høye" befolkningen; celler med en endring i mCherry fluorescens < 40,000 MFI ble gruppert inn i "mCherry-lav" populasjonen. Statistisk programvare ble brukt til å plotte gjennomsnittsverdiene til mCherry fluorescens ved 0 og 4 dpi. Statistisk signifikans ved 4 ppt ble målt ved hjelp av en uparret t-test av midlene (mCherry-high=50235 MFI; mCherry-low=25017 MFI; p<0.000001). *=p<0,05, **=p<0,01, ***=p<0,001 Klikk her for å vise en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representative HIV-infiserte celler med høy forekomst av tidlig kalsiumtilstrømning. MT-4 celler ble smittet med mCherry reportervirus hiv-1 NL-CI på den optofluidiske plattformen. Intracellulært kalsium ble målt ved Fluo-4 fluorescens gjentatte ganger over et 9-minutters tidsforløp. Statistisk programvare ble brukt til å plotte gjennomsnittlige Fluo-4 verdier av mCherry-høy og mCherry-low celle klynger. Statistisk signifikans ble målt ved hjelp av ubetalte t-tester på hvert tidspunkt. *=p<0,05, **=p<0,01, ***=p<0,001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representativ intracellulær kalsiumfluks høyere i mCherry-positive celler. MT-4 celler ble smittet med mCherry reportervirus hiv-1 NL-CI. Intracellulært kalsium ble målt ved Fluo-4 fluorescens 9 min etter infeksjon, og mCherry ble målt 4 dager etter infeksjon. En enkel lineær regresjon ble utført med statistisk programvare. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den beskrevne metodikken for å studere forholdet mellom kalsiumtilstrømning og HIV-1 produktiv infeksjon i enkeltceller kan tilpasses for å studere intracellulær kalsiumkinetikk som svar på andre agonister eller antagonister av interesse. Utarbeidelsen av celler for avbildning er enkel, minimalt tidkrevende, og reagenser er tilgjengelige i praktiske sett fra mye brukte produsenter. Fluo-4-basert kalsiummåling er godt beskrevet i litteraturen, og HIV-1 kan lett erstattes med andre virus eller forbindelser av interesse for å studere på denne plattformen. Ulike celletyper og kulturmedier kan brukes. Alternative eller ekstra fluorescenskanaler støttes, og flere fluoroforer kan avbildes samtidig eller sekvensielt.
I tillegg kan prosedyren tilpasses bredt for å studere fluorofor-merkede hendelser i langsgående tidskurs. Standard høygjennomstrømningsmetoder, for eksempel strømningscytometri, tillater ikke den sammenkoblede studien av diskrete hendelser over tidskurs. Tradisjonell encellet avbildning gjennom fluorescensmikroskopi er begrenset av gjennomstrømning, cellemigrering på tvers av synsfelt og intensive tidskrav. Ved å kombinere fluorescensavbildning med høy gjennomstrømning og automatisert encellet kultur, muliggjør denne metoden belysning av relevante molekylære kinetikker, oppfølgere og interaksjoner ved både kort- og langsiktige tidsintervaller. Det er viktig å merke seg at optimalisering av programvare- og bildeanalyse er kritisk for hvert program.
Mikroskopet er utstyrt med brightfield og Cy5, Texas Red, FITC og DAPI fluorescenskanaler16. Tilgjengelige forstørrelser er 4x og 10x. Denne metoden er for tiden ikke egnet for undersøkelser som krever flere fluorescensparametere eller større forstørrelser. Forbindelser av interesse som vil bli infundert i brikken for celleeksponeringen, må vise diffusjon for å komme inn i penner og nå celler. Tilgang til et Beacon-instrument kan utgjøre en kostnadsbarriere for etterforskere.
Det optofluidiske systemet har en bred skanne- og sømevne. Den optiske sorteringen på brikken har en høyeffektiv variabel avhengig av celletype, men automatisk sorteringseffektivitet er mellom 80-90%, og manuell sortering kan øke effektiviteten til 100%. Hver brikke har plass til 3500 celler, og fire sjetonger kan kjøres samtidig, med en parallell arbeidsflyt, noe som resulterer i høy skalerbarhet. Mens bildearbeidsflyten rapporteres ved manuell bildeanalyse, tillater nyere oppdateringer i systemet automatisering av dette. Det er viktig å merke seg at dataene som vises her er representative innenfor begrensningene for bildeterskelanalyse, og optimalisering og automatisering av bildeanalyse vil sannsynligvis resultere i mer sensitive mål på både kalsiumtilstrømning og mCherry-signal som indikerer HIV-1 produktiv infeksjon.
Den beskrevne protokollen ble etablert ved hjelp av MT-4 celler og HIV-1 som tidligere beskrevet7,21,22. Ved tilpasning av protokollen til andre cellelinjer eller fluorescerende mål av interesse, er det nødvendig med optimalisering og validering. Kinetikken til Fluo-4 efflux er cellelinjeavhengig, så celletypespesifikk fargestoffretensjon bør bekreftes å vare minst hvis det tiltenkte kalsiumavbildningstidsforløpet. Validering av fargestoffretensjon og agonistisk respons på denne optofluidiske enheten kan fullføres ved å behandle celler på brikken med vekstmediet som inneholder 10 μM ionomycin, som skal indusere potent cellulær kalsiumtilstrømning og Fluo-4-signal i FITC-kanalen. Lignende kontroller og valideringer bør utføres for at eventuelle agonister /antagonister skal infunderes i brikken for å sikre riktig konsentrasjon og diffusjon til celler. For encellet analyse bør celler utarbeides som en encellet suspensjon for å lette sorteringen av individuelle celler i penner. Som tradisjonell fluorescensmikroskopi bør fluorescenseksponeringstider og målte tidspunkter optimaliseres til hvert respektive mål av interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
R.P.S. er ansatt i Sema4. De andre forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.
Acknowledgments
Vi er takknemlige for de vitenskapelige diskusjonene med Dr. Benjamin Chen. Dette arbeidet ble finansiert av K08AI120806 (THS), R01DA052255 (THS og KB) og R21AI152833 (THS og KB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Beacon Optofluidic System | Berkeley Lights | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | ||
| FIJI | Open-source software | PMID: 22743772, 22930834 | |
| Fluo-4 Calcium Imaging Kit | Thermo Fisher | F10489 | |
| HIV-1 NLCINL4-3 | Laboratory of Benjamin Chen | PMID: 28148796 | |
| Hyclone Pennecillin Streptomycin solution | GE Healthcare Life sciences | SV30010 | |
| MT-4 cells | NIH AIDS Reagent | ARP-120 | |
| OptoSelect 3500 chip | Berkeley Lights | ||
| Pipettor Tips | Denville Scientific | P3020-CPS | |
| Prism 9.0.0 | GraphPad | ||
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Serological Pipettes | Fisher Brand | 13-678-11E | |
| Tissue Culture Hood | Various models | ||
| T75 flasks | Corning | 3073 |
References
- Aberg, J. A. Aging, inflammation, and HIV infection. Topics in Antiviral Medicine. 20 (3), 101-105 (2012).
- Deeks, S. G., Tracy, R., Douek, D. C. Systemic effects of inflammation on health during chronic HIV infection. Immunity. 39 (4), 633-645 (2013).
- Swartz, T. H., Dubyak, G. R., Chen, B. K. Purinergic receptors: Key mediators of HIV-1 infection and inflammation. Fromtiers in Immunology. 6, 585 (2015).
- Giroud, C., Marin, M., Hammonds, J., Spearman, P., Melikyan, G. B. P2X1 receptor antagonists inhibit HIV-1 fusion by blocking virus-coreceptor interactions. Journal of Virology. 89 (18), 9368-9382 (2015).
- Hazleton, J. E., Berman, J. W., Eugenin, E. A. Purinergic receptors are required for HIV-1 infection of primary human macrophages. Journal of Immunology. 188 (9), 4488-4495 (2012).
- Marin, M., et al. High-throughput HIV-cell fusion assay for discovery of virus entry inhibitors. Assay and Drug Development Technology. 13 (3), 155-166 (2015).
- Soare, A. Y., et al. P2X Antagonists inhibit HIV-1 productive infection and inflammatory cytokines interleukin-10 (IL-10) and IL-1β in a human tonsil explant model. Journal of Virology. 93 (1), 01186 (2019).
- Sorrell, M. E., Hauser, K. F. Ligand-gated purinergic receptors regulate HIV-1 Tat and morphine related neurotoxicity in primary mouse striatal neuron-glia co-cultures. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (2), 233-244 (2014).
- Swartz, T. H., Esposito, A. M., Durham, N. D., Hartmann, B. M., Chen, B. K. P2X-selective purinergic antagonists are strong inhibitors of HIV-1 fusion during both cell-to-cell and cell-free infection. Journal of Virology. 88 (19), 11504-11515 (2014).
- Soare, A. Y., et al. P2RX7 at the host-pathogen interface of infectious diseases. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 85 (1), (2021).
- Chen, P., Hübner, W., Spinelli, M. A., Chen, B. K. Predominant mode of human immunodeficiency virus transfer between T cells is mediated by sustained Env-dependent neutralization-resistant virological synapses. Journal of Virology. 81 (22), 12582-12595 (2007).
- Dale, B. M., et al. Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion. Cell Host Microbe. 10 (6), 551-562 (2011).
- Gee, K. R., et al. Chemical and physiological characterization of fluo-4 Ca(2+)-indicator dyes. Cell Calcium. 27 (2), 97-106 (2000).
- He, M. L., Zemkova, H., Koshimizu, T. A., Tomić, M., Stojilkovic, S. S. Intracellular calcium measurements as a method in studies on activity of purinergic P2X receptor channels. American Journal of Physiology and Cell Physiology. 285 (2), 467-479 (2003).
- Li, H., Zony, C., Chen, P., Chen, B. K. Reduced potency and incomplete neutralization of broadly neutralizing antibodies against cell-to-cell transmission of HIV-1 with transmitted founder envs. Journal of Virology. 91 (9), 02425 (2017).
- Beaumont, K. G., et al. Multiparameter cell characterization using nanofluidic technology facilitates real-time phenotypic and genotypic elucidation of intratumor heterogeneity. bioRxiv. , 457010 (2018).
- Le, K., et al. Assuring clonality on the beacon digital cell line development platform. Biotechnology Journal. 15 (1), 1900247 (2020).
- Mocciaro, A., et al. Light-activated cell identification and sorting (LACIS) for selection of edited clones on a nanofluidic device. Communications in Biology. 1, 41 (2018).
- Winters, A., et al. Rapid single B cell antibody discovery using nanopens and structured light. MAbs. 11 (6), 1025-1035 (2019).
- Wu, N., Nishioka, W. K., Derecki, N. C., Maher, M. P. High-throughput-compatible assays using a genetically-encoded calcium indicator. Science Reports. 9 (1), 12692 (2019).
- Esposito, A. M., et al. A high-throughput cre-lox activated viral membrane fusion assay to identify inhibitors of HIV-1 viral membrane fusion. Journal of Visualized Experiments. (138), e58074 (2018).
- Soare, A. Y., et al. P2X1 selective antagonists block HIV-1 infection through inhibition of envelope conformation-dependent fusion. Journal of Virology. 94 (6), 01622 (2020).
