Summary
Qui, presentiamo un protocollo in cui le singole cellule vengono monitorate per eventi acuti e infezioni produttive da HIV-1 su un dispositivo nanofluidico. I dati di imaging definiscono le interazioni del recettore virus-host e la dinamica del percorso di segnalazione. Questo è il primo metodo per la coltura e l'imaging longitudinali a singola cellula ad alta produttività nanofluidica per studiare la cinetica segnalante e le interazioni molecolari.
Abstract
L'HIV-1 causa un'infezione cronica che colpisce più di 37 milioni di persone in tutto il mondo. Le persone che vivono con il virus dell'immunodeficienza umana (HIV) sperimentano comorbilità correlata all'infiammazione cronica nonostante la terapia antiretrovirale. Tuttavia, questi segnali infiammatori non sono stati completamente caratterizzati. Il ruolo degli eventi di ingresso precoce sull'attivazione degli eventi di segnalazione cellulare e sull'espressione genica a valle non è stato catturato a livello di singola cellula. Qui gli autori descrivono un metodo che applica i principi della microscopia a fluorescenza a cellule vive a una piattaforma automatizzata a cella singola che colture e immagini le cellule rispetto ai corsi di tempo personalizzati dall'utente, consentendo l'analisi ad alta produttività dei processi cellulari dinamici. Questo saggio può tracciare la microscopia a fluorescenza viva a singola cellula dei primi eventi che seguono immediatamente l'infezione da HIV-1, in particolare l'afflusso di calcio che accompagna l'esposizione al virus e lo sviluppo di infezioni produttive utilizzando un virus reporter fluorescente. Le cellule MT-4 sono caricate con un colorante sensibile al calcio e coltivate in penne isolate su un dispositivo nanofluidico. Le cellule coltivate sono infettate da un virus reporter HIV-1 (HIV-1 NLCI). Un microscopio a fluorescenza posizionato sopra il dispositivo nanofluidico misura l'afflusso di calcio su un decorso di 8 minuti dopo l'esposizione acuta all'HIV-1. L'infezione produttiva dell'HIV-1 viene misurata in quelle stesse cellule per un intervallo di 4 giorni. I dati di imaging di questi corsi di tempo vengono analizzati per definire le interazioni del recettore virus-host e la dinamica del percorso di segnalazione. Gli autori presentano un'alternativa integrata e scalabile ai metodi di imaging tradizionali utilizzando una nuova piattaforma optofluidica in grado di smistamento, 1500, imaging e automazione del software a cella singola. Questo saggio può misurare la cinetica degli eventi in varie condizioni, tra cui il tipo di cellula, l'agonista o l'effetto antagonista, misurando al contempo una serie di parametri. Questo è il primo metodo stabilito per la coltura e l'imaging longitudinali a singola cellula ad alta produttività nanofluidica: questa tecnica può essere ampiamente adattata per studiare la cinetica di segnalazione cellulare e le interazioni molecolari dinamiche.
Introduction
L'infiammazione cronica è una delle principali cause di morbilità precoce associata all'HIV emortalità 1,2,3. Esistono diversi meccanismi in base ai quali l'HIV può attivare la segnalazione infiammatoria, e recenti prove suggeriscono un ruolo per i recettori P2X nell'ingresso dell'HIV che sono recettori del trifosfato di adenosina (ATP) che gatingcalcio 3,4,5,6,7,8,9,10. Il sottotipo P2X dei recettori purinergici (P2XR) può essere importante facilitatore di questa infiammazione. Tuttavia, i meccanismi molecolari delle interazioni HIV-P2XR sono in gran parte sconosciuti e possono avere un impatto sulle fasi del ciclo di vita virale dell'HIV-1 precoce e tardivo. Definire i percorsi e la cinetica che guidano l'infiammazione cronica associata all'HIV è fondamentale per far avanzare le opzioni di trattamento per le persone con HIV.
Per valutare se l'HIV-1 agonizza direttamente i recettori P2X, l'attivazione P2XR e l'infezione da HIV-1 devono essere misurate in parallelo. I test sull'attività P2XR e sull'infezione da HIV-1 sono stati stabiliti in modo indipendente: l'afflusso di calcio cellulare è un indicatore dell'attivazione P2XR e l'infezione produttiva dell'HIV-1 può essere quantificata dall'abbondanza di RNA. Il rilevamento della fluorescenza dell'afflusso di calcio è possibile con il colorante sensibile al calcio Fluo-4 e l'infezione da HIV-1 può essere visualizzato con il virus reporter fluorescente mCherry HIV-NLCI11,12,13,14,15.
Poiché questi indicatori di attivazione P2X (afflusso acuto di calcio cellulare) e infezione da HIV-1 (sintesi dell'RNA HIV-1) si verificano su scale temporali diverse (minuti contro giorni), manca un metodo ad alta produttività che consenta un'analisi accoppiata dell'attivazione P2XR e dell'infezione da HIV-1. Le tecniche sperimentali standard ad alta produttività, come la citometria del flusso, consentono l'analisi della popolazione ma non possono valutare la relazione tra eventi acuti e longitudinali in singole cellule. In alternativa, l'imaging a cella singola con microscopia a fluorescenza standard è a bassa produttività. Questi limiti sperimentali presentano la necessità di nuove tecniche ad alta produttività per misurare direttamente le associazioni tra eventi cellulari acuti e longitudinali.
Un sistema optofluidico descritto è una nuova piattaforma in grado di smistamento e isolamento a cella singola, 15, imaging e automazione software16,17,18,19. Questo sistema presenta un'alternativa integrata ad alta produttività ai limiti dei metodi di imaging tradizionali. La piattaforma Beacon è costituita da un'anidride carbonica (CO2)e un incubatore a temperatura controllata che supporta le cellule contenute in un chip. Il chip possiede transistor fotosensibili che generano un gradiente elettrico in risposta alla luce mirata. Questa forza dielettroforetica risultante è usata per spostare singole cellule attraverso il chip nanofluidico nelle regioni desiderate. Le cellule sono ordinate in penne sul chip, che forniscono una barriera per isolare fisicamente le singole cellule. Il flusso laminare continuo dei mezzi di crescita in tutto il chip impedisce la migrazione cellulare dalle penne, consentendo al contempo la diffusione di piccole particelle di nutrienti e reagenti specifici dell'esperimento. Un microscopio a fluorescenza si trova sopra il chip. L'automazione del software viene utilizzata per acquisire immagini del chip nel punto di tempo specificato dall'utente.
Tutta la caratterizzazione delle celle è stata eseguita utilizzando un sistema optofluidico per la selezione e la manipolazione a cella singola. Questo sistema è costituito da componenti meccanici, microfluidici e ottici integrati che consentono la manipolazione, il dosaggio, la coltura e l'imaging a cella singola. Le cellule vengono caricate e coltivate sul dispositivo nanofluidico usa e getta costituito da 3.500 camere singole (penne), ognuna in grado di contenere volume sub-nanoliter. Le cellule possono essere posizionate all'interno di penne utilizzando "gabbie" dielettroforetiche indotte dalla luce e coltivate in condizioni controllate da temperatura e CO2. Le microfluidica consentono la perfusione di supporti o tamponi sul chip per la coltura cellulare o il trattamento farmacologico. Un ago azionato consente l'importazione e l'esportazione di cellule da piastre di pozzo incubate e tappate. L'area del chip può essere immagine con ingrandimento 4x o 10x in canali fluorescenti e a campo luminoso (inclusi DAPI, FITC, TRed o Cy5) per caratterizzare fenotipi cellulari o analisi funzionali. L'intero sistema è automatizzato utilizzando software che può essere utilizzato per flussi di lavoro predesignati o esperimenti personalizzati.
Sono state studiate le relazioni tra l'infezione da HIV-1 e la P2XR, ma non è stata riportata una procedura ad alta produttività per caratterizzare direttamente queste interazioni in parallelo. Qui, gli autori descrivono una metodologia per studiare le interazioni HIV-P2XR attraverso il monitoraggio dell'afflusso acuto di calcio e della successiva infezione produttiva dell'HIV-1 a livello di singola cellula. In particolare, questo stabilisce un nuovo strumento che consente la misurazione longitudinale diretta, ad alta produttività e longitudinale di più bersagli in singole celle.
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Protocol
1. Preparazione di cellule per l'imaging
- Preparare la soluzione di carico Fluo-4 AM fresca: Aggiungere 25 μL di solvente detergente concentrato 100x, quindi aggiungere 2,5 μL di Fluo-4 AM 1000x a un tubo da 1,5 ml. Vortice da mescolare.
- Pipetta 2,5 mL di mezzi di coltura nella soluzione di carico e invertire la miscela. Proteggere dalla luce.
- Centrifuga 2 x 106 cellule MT-4 a 500 x g per 3 min.
- Rimuovere i mezzi e rimosogliere il pellet in 2 mL della soluzione di carico Fluo-4 AM preparata. Proteggere dalla luce.
- Pipetta risospense le cellule in una piastra di Petri da 35 mm. Incubare a 37 °C per 15-30 minuti, quindi incubare per altri 15-30 minuti a temperatura ambiente.
- Trasferire la sospensione cellulare in un tubo di centrifuga. Centrifugare le celle a 500 x g per 3 min e rimuovere il supernatante costituito dalla soluzione di carico.
- Rimorsi il pellet cellulare con pipettando in 1 mL del mezzo di coltura e centrifugando a 500 x g per 3 minuti da lavare.
- Rimorsiva il pellet cellulare con pipettando nel mezzo di coltura ad una concentrazione di 2 x 106 celle/mL (minimo 50 μL). Proteggere dalla luce.
2. Preparazione del sistema optofluidico, caricamento delle celle e penning cellulare
- Preparare un chip con la soluzione di bagnatura, che facilita la scrittura cellulare.
- Per fare questo, caricare tubi di centrifuga contenenti 2 ml di soluzione bagnante e 50 ml di acqua DI sullo strumento con un nuovo chip optofluidico ed eseguire la funzione Wet Chip. Questa funzione inonderà automaticamente il chip con la soluzione di bagnatura attraverso la fluidic del sistema, incuba il chip a 50, °C e scarica il truciolo con acqua 3 volte.
- Una volta fatto lo scarico dell'acqua, sciacquare il chip con 3 cicli di 250 μL di mezzi di coltura.
- Integrare la sospensione cellulare dal passaggio 1.8 con soluto detergente 1:100 F-127 prima del caricamento per ridurre la probabilità che le cellule si attacchino ai canali del chip.
- Utilizzare l'ago di esportazione dello strumento per importare celle da un tubo di centrifuga da 1,5 ml utilizzando l'operazione load e small volume import per un volume del pacchetto di celle da 5 μL.
- Celle a penna che utilizzano una tensione ottimizzata di posizionamento optoelettronico (OEP) di 4,3 V e 5 μm/s di velocità della gabbia. La scrittura avviene utilizzando OEP. Esegui la scrittura usando la funzione Autopen, che seleziona automaticamente singole celle, le circonda con una gabbia OEP e le sposta in una penna vicina. Se le celle di interesse rimangono in seguito alla scrittura automatica, utilizzare la funzione penna manuale per selezionare le celle di destinazione (con un clic del mouse) e una penna di destinazione (con un clic successivo del mouse).
- Una volta completato il penning (quando la funzione Autopen viene completata o quando è stato raggiunto il numero desiderato di celle penned), sciacquare il chip con 3 cicli di 250 μL di mezzi di coltura per cancellare qualsiasi cella nonpenata rimanente dal chip.
3. Infezione a una cellula e imaging funzionale
- Dopo aver scritto le celle, ottenere immagini fluorescenti di cellule nei canali FITC, Texas Red e DAPI per misurare la fluo-4 basale, la mCherry e l'autofluorescenza.
- Infondere l'HIV-1 nel microchip ad una concentrazione di 13 ng di HIV-1 NL-CI per 2 x 106 cellule infilando lentamente la sospensione nel chip attraverso l'ago da esportazione.
- Immediatamente dopo l'aggiunta dell'HIV-1, ottenere ripetutamente immagini nei canali FITC e DAPI su un corso di 10 minuti.
- Ottenere immagini nei canali Texas Red e DAPI a 1, 2, 3 e 4 giorni dopo l'infezione (DPI).
4. Analisi dei dati di imaging funzionale a cella singola con il software FIJI
- In ogni punto di tempo di ogni canale di imaging di interesse, utilizzare lo strumento FIJI Point Selection e la funzione Measure per misurare i segnali Fluo-4, mCherry e autofluorescenza di ogni cella. Misurare simultaneamente la fluorescenza di fondo calcolando l'intensità media della fluorescenza (IFM) della penna e del chip contenenti ogni cella.
- Controllare la fluorescenza di fondo e l'autofluorescenza utilizzando la funzione Misura per trovare la IFM in una selezione regione e sottraendo questo valore dal valore di fluorescenza cellulare.
- Normalizzare la fluorescenza di sfondo di ogni immagine del chip: misurare la IFM del chip in ogni campo. Quindi sottrarre le IFM del chip con la minima fluorescenza di fondo da tutte le altre misurazioni MFI del chip.
- Normalizzare la fluorescenza di fondo di ogni penna contenente celle: misurare l'IFM della penna di ogni cella in ogni campo visivo. Quindi sottrarre questo valore dalla IFM non elaborati della cella per ogni campo.
- Controllo per l'autofluorescenza cellulare: sottrarre le IFM DAPI giorno 0 e giorno 4 di ogni cella dal giorno 0 e dal giorno 4 mMFry.
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Representative Results
La figura 1 illustra il formato dei dati di imaging grezzo e del chip acquisiti attraverso il microscopio a fluorescenza. L'identificazione e il raggruppamento di cellule non infette e infette mediante misurazione mCherry sono mostrati nella figura 2. Questi ammassi vengono analizzati per la cinetica dell'afflusso di calcio nella figura 3, che dimostra l'afflusso precoce di calcio nelle cellule infettate dall'HIV. La figura 4 mostra una significativa correlazione positiva tra l'afflusso di calcio e la fluorescenza 20.
Figura 1: Caricamento di chip e dati grezzi sull'imaging. Schemi di caricamento delle celle nelle penne del chip mediante opto-elettroposizionamento (A). L'afflusso di calcio viene quantificato rilevando il colorante sensibile al calcio Fluo-4 nel canale FITC su un percorso di 8,5 minuti(B). L'infezione produttiva dell'HIV-1 viene misurata in un corso di 4 giorni rilevando il virus del reporter mCherry HIV NL-CI nel canale Texas Red (C). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Cellule rappresentative infettate da HIV positive per i segnali mCherry al giorno 4 dopo l'infezione. Le cellule MT-4 sono state infettate dal virus mCherry reporter HIV-1 NL-CI sulla piattaforma optofluidica, e il segnale mCherry è stato misurato 4 giorni dopo l'infezione (dpi). Le cellule con un cambiamento nel segnale mCherry >40.000 IFM (dove è stato notato un chiaro punto di interruzione) a 4 dpi sono state raggruppate nella popolazione "mCherry-high"; le cellule con un cambiamento nella fluorescenza mCherry <40.000 IFM sono state raggruppate nella popolazione "mCherry-low". Il software statistico è stato utilizzato per tracciare i valori medi della fluorescenza mCherry a 0 e 4 dpi. La significatività statistica a 4 dpi è stata misurata utilizzando un test t non accoppiato dei mezzi (mCherry-high=50235 MFI; mCherry-low=25017 IFM; p<0.000001). *=p<0,05, **=p<0,01, ***=p<0,001 Fare clic qui per visualizzare una versione più ampia di questa figura.
Figura 3: Cellule rappresentative infettate da HIV con alti tassi di afflusso precoce di calcio. Le cellule MT-4 sono state infettate dal virus mCherry reporter HIV-1 NL-CI sulla piattaforma optofluidica. Il calcio intracellulare è stato misurato ripetutamente con fluorescenza Fluo-4 su un corso di 9 minuti. Il software statistico è stato utilizzato per tracciare i valori medi Fluo-4 dei cluster di celle mCherry-high e mCherry-low. La significatività statistica è stata misurata utilizzando test t non accoppiati in ogni punto di tempo. *=p<0,05, **=p<0,01, ***=p<0,001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Flusso rappresentativo intracellulare di calcio più elevato nelle cellule positive. Le cellule MT-4 sono state infettate dal virus mCherry reporter HIV-1 NL-CI. Il calcio intracellulare è stato misurato dalla fluorescenza Fluo-4 9 min dopo l'infezione e mCherry è stato misurato 4 giorni dopo l'infezione. Una semplice regressione lineare è stata eseguita con software statistico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La metodologia descritta per studiare la relazione tra l'afflusso di calcio e l'infezione produttiva dell'HIV-1 in singole cellule può essere adattata per studiare la cinetica del calcio intracellulare in risposta ad altri agonisti o antagonisti di interesse. La preparazione delle celle per l'imaging è semplice, minimamente richiede molto tempo e i reagenti sono disponibili in comodi kit di produttori ampiamente utilizzati. La misurazione del calcio a base di Fluo-4 è ben descritta in letteratura e l'HIV-1 può essere facilmente sostituito con altri virus o composti di interesse da studiare su questa piattaforma. È possibile utilizzare diversi tipi di cellule e mezzi di coltura. Sono supportati canali di fluorescenza alternativi o aggiuntivi e più fluorofori possono essere immagini contemporaneamente o in sequenza.
Inoltre, la procedura può essere ampiamente adattata per studiare eventi etichettati al fluoroforo in corsi di tempo longitudinali. I metodi standard ad alta produttività, come la citometria a flusso, non consentono lo studio accoppiato di eventi discreti nel tempo. L'imaging tradizionale a singola cella attraverso la microscopia a fluorescenza è limitato dalla velocità effettiva, dalla migrazione cellulare attraverso i campi visivo e dai requisiti di tempo intensivo. Combinando l'imaging a fluorescenza con una coltura a singola cella ad alta produttività e automatizzata, questo metodo consente la spiegazione della cinetica molecolare pertinente, delle sequele e delle interazioni a intervalli di tempo sia a breve che a lungo termine. È importante notare che l'ottimizzazione del software e dell'analisi delle immagini è fondamentale per ogni applicazione.
Il microscopio è dotato di canali di fluorescenza Cy5, Texas Red, FITC e DAPI16. Gli ingrandimenti disponibili sono 4x e 10x. Questo metodo non è attualmente adatto per indagini che richiedono parametri di fluorescenza più numerosi o ingrandimenti maggiori. I composti di interesse che verranno infusi nel chip per l'esposizione cellulare devono mostrare diffusione per entrare nelle penne e raggiungere le cellule. L'accesso a uno strumento Beacon può rappresentare una barriera ai costi per gli investigatori.
Il sistema optofluidico ha un'ampia capacità di scansione e cucitura. Lo smistamento ottico sul chip ha una variabile ad alta efficienza a seconda del tipo di cella, ma l'efficienza di smistamento automatico è compresa tra l'80 e il 90%, e lo smistamento manuale può aumentare tale efficienza al 100%. Ogni chip può ospitare 3.500 celle e quattro chip possono essere eseguiti contemporaneamente, con un flusso di lavoro parallelo, con conseguente elevata scalabilità. Mentre il flusso di lavoro di imaging è riportato dall'analisi manuale delle immagini, gli aggiornamenti più recenti nel sistema consentono di automatizzarlo. È importante notare che i dati qui mostrati sono rappresentativi entro i limiti dell'analisi della soglia dell'immagine, e l'ottimizzazione e l'automazione dell'analisi delle immagini possono comportare misure più sensibili sia dell'afflusso di calcio che del segnale mCherry come indicativo dell'infezione produttiva dell'HIV-1.
Il protocollo descritto è stato stabilito utilizzando cellule MT-4 e HIV-1 come descrittoin precedenza 7,21,22. Quando si adatta il protocollo ad altre linee cellulari o obiettivi fluorescenti di interesse, sono necessarie ottimizzazione e convalida. La cinetica dell'efflusso Fluo-4 dipende dalla linea cellulare, quindi la ritenzione di colorante specifica del tipo cellulare deve essere confermata per durare almeno se il decorso del tempo di imaging del calcio previsto. La convalida della ritenzione di colorante e della risposta agonista su questo dispositivo optofluidico può essere completata trattando le cellule sul chip con il mezzo di crescita contenente ionomicina 10 μM, che dovrebbe indurre un potente afflusso di calcio cellulare e segnale Fluo-4 nel canale FITC. Controlli e convalide simili dovrebbero essere effettuati affinché eventuali agonisti/antagonisti siano infusi nel chip per garantire una corretta concentrazione e diffusione alle cellule. Per l'analisi a cella singola, le celle devono essere preparate come sospensione a cella singola per facilitare lo smistamento delle singole celle in penne. Come la microscopia a fluorescenza tradizionale, i tempi di esposizione alla fluorescenza e i punti di tempo misurati dovrebbero essere ottimizzati in base a ciascun obiettivo di interesse.
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Disclosures
R.P.S. è un dipendente di Sema4. Gli altri autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Acknowledgments
Siamo grati per le discussioni scientifiche con il dottor Benjamin Chen. Questo lavoro è stato finanziato da K08AI120806 (THS), R01DA052255 (THS e KB) e R21AI152833 (THS e KB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Beacon Optofluidic System | Berkeley Lights | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | ||
| FIJI | Open-source software | PMID: 22743772, 22930834 | |
| Fluo-4 Calcium Imaging Kit | Thermo Fisher | F10489 | |
| HIV-1 NLCINL4-3 | Laboratory of Benjamin Chen | PMID: 28148796 | |
| Hyclone Pennecillin Streptomycin solution | GE Healthcare Life sciences | SV30010 | |
| MT-4 cells | NIH AIDS Reagent | ARP-120 | |
| OptoSelect 3500 chip | Berkeley Lights | ||
| Pipettor Tips | Denville Scientific | P3020-CPS | |
| Prism 9.0.0 | GraphPad | ||
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Serological Pipettes | Fisher Brand | 13-678-11E | |
| Tissue Culture Hood | Various models | ||
| T75 flasks | Corning | 3073 |
References
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