Summary
Her præsenterer vi en protokol, hvor enkelte celler overvåges for akutte hændelser og produktiv HIV-1-infektion på en nanofluidisk enhed. Billeddata definerer virusværtsreceptorinteraktioner og signalvejsdynamik. Dette er den første metode til nanofluidic high-throughput langsgående enkeltcellekultur og billeddannelse til at studere signalering af kinetik og molekylære interaktioner.
Abstract
HIV-1 forårsager en kronisk infektion, der påvirker mere end 37 millioner mennesker verden over. Mennesker, der lever med human immundefekt virus (HIV) oplever comorbiditet relateret til kronisk inflammation på trods af antiretroviral behandling. Disse inflammatoriske signalering er dog ikke fuldt karakteriseret. Den tidlige indgangsrolle ved aktivering af cellulære signalhændelser og downstream-genekspression er ikke blevet fanget på enkeltcelleniveau. Her beskriver forfatterne en metode, der anvender principper for live-celle fluorescensmikroskopi til en automatiseret enkeltcelleplatform, der kulturer og billeder celler over brugertilpassede tidskurser, hvilket giver mulighed for analyse af dynamiske cellulære processer med høj gennemløb. Denne analyse kan spore encellet levende fluorescensmikroskopi af tidlige hændelser, der umiddelbart følger hiv-1-infektion, især tilstrømningen af calcium, der ledsager eksponering for virussen og udvikling af produktiv infektion ved hjælp af en fluorescerende reportervirus. MT-4 celler er fyldt med et calciumfølsomt farvestof og dyrket i isolerede penne på en nanofluidisk enhed. De dyrkede celler er inficeret med en HIV-1 reporter virus (HIV-1 NLCI). Et fluorescensmikroskop placeret over den nanofluidiske enhed måler calciumtilstrømningen over et 8-minutters tidsforløb efter akut HIV-1-eksponering. HIV-1 produktiv infektion måles i de samme celler over en 4-dages interval. Billeddata fra disse tidskurser analyseres for at definere virus-host receptor interaktioner og signaleringsvej dynamik. Forfatterne præsenterer et integreret, skalerbart alternativ til traditionelle billeddannelsesmetoder ved hjælp af en ny optofluidic platform, der er i stand til enkeltcellesortering, dyrkning, billeddannelse og softwareautomatisering. Denne analyse kan måle kinetik af begivenheder under forskellige forhold, herunder celletype, agonist eller antagonistisk effekt, mens du måler en række parametre. Dette er den første etablerede metode til nanofluidic high-throughput langsgående enkeltcellekultur og billeddannelse: Denne teknik kan tilpasses bredt til at studere cellulære signalering kinetik og dynamiske molekylære interaktioner.
Introduction
Kronisk inflammation er en førende årsag til HIV-associerede tidlige sygelighed ogdødelighed 1,2,3. Der er flere mekanismer, hvor hiv kan aktivere inflammatorisk signalering, og de seneste beviser tyder på en rolle for P2X receptorer i HIV indrejse, som er calcium-gating adenosin triphosphat (ATP) receptorer3,4,5,6,7,8,9,10. P2X-undertypen af purinergiske receptorer (P2XR) kan være vigtige facilitatorer af denne betændelse. Men de molekylære mekanismer i HIV-P2XR interaktioner er stort set ukendt og kan påvirke tidligt og sent HIV-1 viral livscyklus trin. Definition af veje og kinetik kørsel HIV-associeret kronisk inflammation er afgørende for at fremme behandlingsmuligheder for mennesker med HIV.
For at vurdere, om HIV-1 direkte agonizes P2X receptorer, P2XR aktivering og HIV-1 infektion skal måles parallelt. Assays af P2XR aktivitet og HIV-1 infektion er blevet uafhængigt etableret: Cellular calcium tilstrømning er en indikator for P2XR aktivering, og HIV-1 produktiv infektion kan kvantificeres ved RNA overflod. Fluorescens påvisning af calcium tilstrømning er muligt med Fluo-4 calcium-følsomme farvestof, og HIV-1 infektion kan visualiseres med mCherry fluorescerende reporter virus HIV-NLCI11,12,13,14,15.
Da disse indikatorer for P2X-aktivering (akut cellulær calciumtilstrømning) og HIV-1-infektion (HIV-1 RNA-syntese) forekommer på forskellige tidshorisonter (minutter versus dage), mangler der en høj overførselsmetode, der giver mulighed for parret analyse af P2XR-aktivering og HIV-1-infektion. Eksperimentelle teknikker med høj gennemløb, såsom flowcytometri, giver mulighed for befolkningsanalysen, men kan ikke vurdere forholdet mellem akutte og langsgående hændelser i enkelte celler. Alternativt er enkeltcellebilleddannelse med standard fluorescensmikroskopi lav gennemløb. Disse eksperimentelle begrænsninger udgør et behov for nye, høj-throughput teknikker til at måle sammenhænge mellem akutte og langsgående cellulære begivenheder direkte.
Et optofluidisk system, der beskrives, er en ny platform, der er i stand til enkeltcellesortering og isolation, dyrkning, billedbehandling og softwareautomatisering16,17,18,19. Dette system præsenterer et integreret, højgennemstrømningsalternativ til begrænsningerne i traditionelle billeddannelsesmetoder. Beacon-platformen består af en kuldioxid (CO2)og temperaturstyret inkubator, der understøtter celler indeholdt på en chip. Chippen har lysfølsomme transistorer, der genererer en elektrisk gradient som reaktion på målrettet lys. Denne resulterende dilektrophoretiske kraft bruges til at flytte individuelle celler over den nanofluidiske chip til de ønskede regioner. Celler sorteres i kuglepenne på chippen, hvilket giver en barriere for at isolere individuelle celler fysisk. Kontinuerlig laminar strøm af vækstmedier i hele chippen forhindrer celle migration fra penne og samtidig give mulighed for små-partikel diffusion af næringsstoffer og eksperiment-specifikke reagenser. Et fluorescensmikroskop sidder over chippen. Softwareautomatisering bruges til at tage billeder af chippen på det brugerdefinerede tidspunkt.
Al cellekarakterisering blev udført ved hjælp af et optofluidisk system til markering og manipulation af en enkelt celle. Dette system består af integrerede mekaniske, mikrofluidiske og optiske komponenter, der muliggør enkeltcellemanipulation, analyse, kultur og billeddannelse. Cellerne lastes og dyrkes på den engangs nanofluidiske enhed bestående af 3.500 individuelle kamre (kuglepenne), der hver især er i stand til at holde sub-nanolitervolumen. Celler kan placeres i kuglepenne ved hjælp af lysinducerede dielektrotrophoretiske "bure" og dyrkes under temperatur- og CO2-kontrolleredeforhold. Mikrofluidics tillader perfusion af medier eller buffere på chippen til cellekultur eller lægemiddelbehandling. En aktiveret nål giver mulighed for import og eksport af celler fra inkuberede og lukkede brøndplader. Chipområdet kan afbildes ved 4x eller 10x forstørrelse i brightfield- og fluorescerende kanaler (herunder DAPI, FITC, TRed eller Cy5) for at karakterisere cellulære fænotyper eller funktionel analyse. Hele systemet automatiseres ved hjælp af software, der kan bruges til foruddefinerede arbejdsgange eller brugerdefinerede eksperimenter.
Forholdet mellem HIV-1-infektion og P2XR er blevet undersøgt, men der er ikke rapporteret om en højoverførselsprocedure, der direkte karakteriserer disse interaktioner parallelt. Her beskriver forfatterne en metode til at studere HIV-P2XR-interaktioner gennem sporing af akut calciumtilstrømning og efterfølgende HIV-1-produktiv infektion på enkeltcelleniveau. Dette etablerer især et nyt værktøj, der giver mulighed for direkte, høj gennemstrømning, langsgående måling af flere mål i enkelte celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse af celler til billeddannelse
- Forbered frisk Fluo-4 AM-læsseopløsning: Der tilsættes 25 μL 100x koncentreret opløsningsmiddel til vaskemiddel, og tilsæt derefter 2,5 μL Fluo-4 AM 1000x til et 1,5 ml rør. Vortex at blande.
- Pipette 2,5 ml kulturmedier ind i læsseopløsningen og inverter for at blande. Beskyt mod lys.
- Centrifuge 2 x 106 MT-4 celler ved 500 x g i 3 min.
- Fjern medier og genbrug pellet i 2 ml af den forberedte Fluo-4 AM lasteopløsning. Beskyt mod lys.
- Pipette resuspended celler i en 35 mm Petri parabol. Inkuber ved 37 °C i 15-30 min, og inkuber derefter i yderligere 15-30 minutter ved stuetemperatur.
- Overfør celleaffjedringen til et centrifugerør. Centrifugeceller ved 500 x g i 3 min. og fjern supernatanten bestående af læsseopløsningen.
- Resuspend cellepillen ved pipetter i 1 mL af dyrkningsmediet og centrifuge ved 500 x g i 3 minutter for at vaske.
- Cellepellet opsansættes igen ved pipettering i dyrkningsmediet i en koncentration på 2 x 106 celler/mL (mindst 50 μL). Beskyt mod lys.
2. Optofluidic systemforberedelse, cellebelastning og cellespempler
- Forbered en chip med betændt opløsning, hvilket letter celle penning.
- For at gøre dette skal du læsse centrifugerør, der indeholder 2 ml befugtningsopløsning og 50 ml DI-vand, på instrumentet med en ny optofluidic chip og køre funktionen Våd chip. Denne funktion vil automatisk oversvømme chippen med bevæbningsopløsningen gennem systemvæsken, inkubere chippen ved 50, °C og skylle chippen med vand 3 gange.
- Når vandskylningen er færdig, skylles chippen med 3 cyklusser på 250 μL dyrkningsmedier.
- Tillæg celleophænget fra trin 1.8 med 1:100 F-127 vaskemiddelsolute før belastningen for at reducere sandsynligheden for, at celler klæber til spånkanalerne.
- Brug instrumenteksportnålen til at importere celler fra et 1,5 mL centrifugerør ved hjælp af belastningsoperationen og lille volumenimport for et 5 μL cellepakkevolumen.
- Penneceller med en optimeret optoelektronisk positioneringsspænding (OEP) på 4,3 V og 5 μm/s burhastighed. Penning sker ved hjælp af OEP. Udføre penning ved hjælp af Autopen-funktionen, som automatisk vil definere enkelte celler, omgive dem med et OEP-bur og flytte dem ind i en nærliggende pen. Hvis der stadig er celler af interesse efter automatisk penning, skal du bruge funktionen Manuel pen til at markere målceller (med et museklik) og en destinationspen (med et efterfølgende museklik).
- Når penning er færdig (enten når Autopen-funktionen er fuldført, eller når det ønskede antal skrevne celler er opnået), skylles chippen med 3 cyklusser på 250 μL dyrkningsmedier for at fjerne eventuelle resterende celler, der ikke er brugt, fra chippen.
3. Enkeltcelleinfektion og funktionel billeddannelse
- Når du har skrevet celler, skal du hente fluorescerende billeder af celler i FITC-, Texas Red- og DAPI-kanaler for at måle de oprindelige Fluo-4-, mCherry- og autofluorescens.
- Indgyde HIV-1 i mikrochippen i en koncentration på 13 ng hiv-1 NL-CI pr 2 x 106 celler ved langsomt pipetter suspensionen i chippen gennem eksport nålen.
- Umiddelbart efter HIV-1-tilføjelsen får du gentagne gange billeder i FITC- og DAPI-kanalerne over et 10-minutters tidskursus.
- Få billeder i Texas Red- og DAPI-kanalerne ved 1-, 2-, 3- og 4-dages post-infektion (DPI).
4. Analyse af encellede funktionelle billeddata med FIJI-software
- På hvert tidspunkt i hver billedkanal af interesse skal du bruge FIJI Point Selection-værktøjet og funktionen Målpunkt til at måle hver celles Fluo-4-, mCherry- og autofluorescenssignaler. Samtidig måle baggrunden fluorescens ved at beregne den gennemsnitlige fluorescens intensitet (MFI) af pennen og chip, der indeholder hver celle.
- Kontrol for baggrundslyscens og autofluorescens ved hjælp af funktionen Målpunkt til at finde MFI'en i et områdevalg og trække denne værdi fra cellefluorescensværdien.
- Normaliser baggrundsfluorescensen for hvert chipbillede: Mål chippens MFI i hvert felt. Træk derefter MFI'en for chippen med mindst baggrundsfluorescens fra alle andre chip MFI-målinger.
- Normaliser baggrundslysheden for hver celleholdig pen: Mål MFI'en for hver celles pen i hvert synsfelt. Træk derefter denne værdi fra cellens rå MFI for hvert felt.
- Kontrol for cellens autofluorescens: Træk dag 0 og dag 4 DAPI MFI fra hver celle fra dag 0 og dag 4 mCherry MFI' er.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 illustrerer formatet af de chip- og råbilleddata, der er opnået gennem fluorescensmikroskopet. Identifikation og klyngedannelse af uinficerede og inficerede celler via mCherry-måling er vist i figur 2. Disse klynger analyseres for calciumtilstrømning kinetik i figur 3, som viser tidlig calciumtilstrømning i HIV-inficerede celler. Figur 4 viser en signifikant positiv sammenhæng mellem calciumtilstrømning og mCherry-fluorescens 20.
Figur 1: Chipbelastning og rå billeddata. Skemaer til indlæsning af celler i penne på chippen ved hjælp af opto-elektropositionering (A). Calciumtilstrømningen kvantificeres ved at detektere det calciumfølsomme farvestof Fluo-4 i FITC-kanalen over et 8,5 minutters tidsforløb (B). HIV-1 produktiv infektion måles over en 4-dages tidsforløb ved at opdage mCherry reporter virus HIV NL-CI i Texas Red kanal (C). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Repræsentative HIV-inficerede celler, der er positive for mCherry-signaler på dag 4 efter infektionen. MT-4 celler blev inficeret med mCherry reporter virus HIV-1 NL-CI på optofluidic platform, og mCherry signal blev målt 4 dage efter infektion (dpi). Celler med en ændring i mCherry signal > 40.000 MFI (hvor et klart breakpoint blev bemærket) på 4 dpi blev grupperet i "mCherry-høj" befolkning; celler med en ændring i mCherry fluorescens < 40.000 MFI blev grupperet i "mCherry-lav" befolkning. Statistisk software blev brugt til at plotte middelværdierne for mCherry fluorescens på 0 og 4 dpi. Statistisk signifikans ved 4 dpi blev målt ved hjælp af en uparret t-test af midlerne (mCherry-high=50235 MFI; mCherry-low=25017 MFI; p<0.000001). *=p<0.05, **=p<0.01, ***=p<0.001 Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Repræsentative HIV-inficerede celler med en høj grad af tidlig calciumtilstrømning. MT-4 celler blev inficeret med mCherry reporter virus HIV-1 NL-CI på optofluidic platform. Intracellulær calcium blev målt ved Fluo-4 fluorescens gentagne gange over en 9-minutters tidsforløb. Statistisk software blev brugt til at plotte de gennemsnitlige Fluo-4 værdier af mCherry-høj og mCherry-lav celle klynger. Statistisk signifikans blev målt ved hjælp af uparrede t-tests på hvert tidspunkt. *=p<0,05, **=p<0,01, ***=p<0,001. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4:Repræsentativ intracellulær calciumflux højere i mCherry-positive celler. MT-4 celler blev inficeret med mCherry reporter virus HIV-1 NL-CI. Intracellulær calcium blev målt ved Fluo-4 fluorescens 9 min efter infektion, og mCherry blev målt 4 dage efter infektion. En simpel lineær regression blev udført med statistisk software. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den beskrevne metode til at undersøge forholdet mellem calcium tilstrømning og HIV-1 produktiv infektion i enkeltceller kan tilpasses til at studere intracellulære calcium kinetik som reaktion på andre agonister eller antagonister af interesse. Forberedelsen af celler til billeddannelse er enkel, minimalt tidskrævende, og reagenser fås i praktiske kits fra udbredte producenter. Fluo-4-baseret calciummåling er godt beskrevet i litteraturen, og HIV-1 kan let erstatte andre vira eller forbindelser af interesse for at studere på denne platform. Forskellige celletyper og kulturmedier kan bruges. Alternative eller yderligere fluorescenskanaler understøttes, og flere fluorophorer kan afbildes samtidigt eller sekventielt.
Derudover kan proceduren i vid udstrækning tilpasses til at studere fluorophore-mærkede begivenheder i tidsseriekurser. Standard metoder med høj gennemløb, såsom flowcytometri, giver ikke mulighed for den parrede undersøgelse af diskrete begivenheder over tidskurser. Traditionel enkeltcellebilleddannelse gennem fluorescensmikroskopi er begrænset af overførselshastighed, cellemigrering på tværs af synsfelter og intensive tidskrav. Ved at kombinere fluorescensbilleddannelse med højgennemstrømning og automatiseret enkeltcellekultur giver denne metode mulighed for belysning af relevante molekylære kinetik, efterfølgere og interaktioner med både kort- og langsigtede tidsintervaller. Det er vigtigt at bemærke, at software- og billedanalyseoptimering er kritisk for hvert program.
Mikroskopet er udstyret med brightfield og Cy5, Texas Red, FITC og DAPI fluorescenskanaler16. Tilgængelige forstørrelser er 4x og 10x. Denne metode er i øjeblikket ikke egnet til undersøgelser, der kræver flere fluorescensparametre eller større forstørrelser. Forbindelser af interesse, der vil blive infunderet i chippen for celleeksponering skal udvise diffusion at indtaste kuglepenne og nå celler. Adgang til et Beacon-instrument kan udgøre en omkostningsbarriere for efterforskerne.
Det optofluidiske system har en bred scannings- og syningsevne. Den optiske sortering på chippen har en højeffektiv variabel afhængigt af celletype, men automatisk sorteringseffektivitet er mellem 80-90%, og manuel sortering kan øge denne effektivitet til 100%. Hver chip kan rumme 3.500 celler, og fire chips kan køres samtidigt med en parallel arbejdsgang, hvilket resulterer i høj skalerbarhed. Mens billedarbejdsgangen rapporteres ved manuel billedanalyse, giver nyere opdateringer i systemet mulighed for at automatisere dette. Det er vigtigt at bemærke, at de data, der vises her, er repræsentative inden for begrænsningerne af billedtærskelanalyse, og optimering og automatisering af billedanalyse vil sandsynligvis resultere i mere følsomme målinger af både calciumtilstrømning og mCherry-signal som tegn på HIV-1 produktiv infektion.
Den beskrevne protokol blev oprettet ved hjælp af MT-4-celler og HIV-1 som tidligere beskrevet7,21,22. Når protokollen tilpasses andre cellelinjer eller fluorescerende mål af interesse, kræves optimering og validering. Kinetik af Fluo-4 efflux er celle linje-afhængige, så cellen type-specifikke farvestof fastholdelse bør bekræftes at vare mindst hvis den påtænkte calcium imaging tidsforløb. Validering af farvestudent og agonistisk respons på denne optofluidiske enhed kan fuldføres ved at behandle celler på chippen med vækstmediet, der indeholder 10 μM ionomycin, hvilket skulle fremkalde potent cellulær calciumtilstrømning og Fluo-4-signal i FITC-kanalen. Lignende kontroller og valideringer bør udføres for eventuelle agonister/antagonister, der skal infunderes i chippen for at sikre korrekt koncentration og diffusion til celler. Til enkeltcelleanalyse skal celler fremstilles som en enkeltcellet suspension for at lette sorteringen af individuelle celler i penne. Ligesom traditionel fluorescensmikroskopi bør fluorescenseksponeringstider og målte tidspunkter optimeres til hvert af de respektive mål af interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
R.P.S. er ansat i Sema4. De andre forfattere har ingen interessekonflikter at afsløre.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for de videnskabelige drøftelser med Dr. Benjamin Chen. Dette arbejde blev finansieret af K08AI120806 (THS), R01DA052255 (THS og KB) og R21AI152833 (THS og KB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Beacon Optofluidic System | Berkeley Lights | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | ||
| FIJI | Open-source software | PMID: 22743772, 22930834 | |
| Fluo-4 Calcium Imaging Kit | Thermo Fisher | F10489 | |
| HIV-1 NLCINL4-3 | Laboratory of Benjamin Chen | PMID: 28148796 | |
| Hyclone Pennecillin Streptomycin solution | GE Healthcare Life sciences | SV30010 | |
| MT-4 cells | NIH AIDS Reagent | ARP-120 | |
| OptoSelect 3500 chip | Berkeley Lights | ||
| Pipettor Tips | Denville Scientific | P3020-CPS | |
| Prism 9.0.0 | GraphPad | ||
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Serological Pipettes | Fisher Brand | 13-678-11E | |
| Tissue Culture Hood | Various models | ||
| T75 flasks | Corning | 3073 |
References
- Aberg, J. A. Aging, inflammation, and HIV infection. Topics in Antiviral Medicine. 20 (3), 101-105 (2012).
- Deeks, S. G., Tracy, R., Douek, D. C. Systemic effects of inflammation on health during chronic HIV infection. Immunity. 39 (4), 633-645 (2013).
- Swartz, T. H., Dubyak, G. R., Chen, B. K. Purinergic receptors: Key mediators of HIV-1 infection and inflammation. Fromtiers in Immunology. 6, 585 (2015).
- Giroud, C., Marin, M., Hammonds, J., Spearman, P., Melikyan, G. B. P2X1 receptor antagonists inhibit HIV-1 fusion by blocking virus-coreceptor interactions. Journal of Virology. 89 (18), 9368-9382 (2015).
- Hazleton, J. E., Berman, J. W., Eugenin, E. A. Purinergic receptors are required for HIV-1 infection of primary human macrophages. Journal of Immunology. 188 (9), 4488-4495 (2012).
- Marin, M., et al. High-throughput HIV-cell fusion assay for discovery of virus entry inhibitors. Assay and Drug Development Technology. 13 (3), 155-166 (2015).
- Soare, A. Y., et al. P2X Antagonists inhibit HIV-1 productive infection and inflammatory cytokines interleukin-10 (IL-10) and IL-1β in a human tonsil explant model. Journal of Virology. 93 (1), 01186 (2019).
- Sorrell, M. E., Hauser, K. F. Ligand-gated purinergic receptors regulate HIV-1 Tat and morphine related neurotoxicity in primary mouse striatal neuron-glia co-cultures. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (2), 233-244 (2014).
- Swartz, T. H., Esposito, A. M., Durham, N. D., Hartmann, B. M., Chen, B. K. P2X-selective purinergic antagonists are strong inhibitors of HIV-1 fusion during both cell-to-cell and cell-free infection. Journal of Virology. 88 (19), 11504-11515 (2014).
- Soare, A. Y., et al. P2RX7 at the host-pathogen interface of infectious diseases. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 85 (1), (2021).
- Chen, P., Hübner, W., Spinelli, M. A., Chen, B. K. Predominant mode of human immunodeficiency virus transfer between T cells is mediated by sustained Env-dependent neutralization-resistant virological synapses. Journal of Virology. 81 (22), 12582-12595 (2007).
- Dale, B. M., et al. Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion. Cell Host Microbe. 10 (6), 551-562 (2011).
- Gee, K. R., et al. Chemical and physiological characterization of fluo-4 Ca(2+)-indicator dyes. Cell Calcium. 27 (2), 97-106 (2000).
- He, M. L., Zemkova, H., Koshimizu, T. A., Tomić, M., Stojilkovic, S. S. Intracellular calcium measurements as a method in studies on activity of purinergic P2X receptor channels. American Journal of Physiology and Cell Physiology. 285 (2), 467-479 (2003).
- Li, H., Zony, C., Chen, P., Chen, B. K. Reduced potency and incomplete neutralization of broadly neutralizing antibodies against cell-to-cell transmission of HIV-1 with transmitted founder envs. Journal of Virology. 91 (9), 02425 (2017).
- Beaumont, K. G., et al. Multiparameter cell characterization using nanofluidic technology facilitates real-time phenotypic and genotypic elucidation of intratumor heterogeneity. bioRxiv. , 457010 (2018).
- Le, K., et al. Assuring clonality on the beacon digital cell line development platform. Biotechnology Journal. 15 (1), 1900247 (2020).
- Mocciaro, A., et al. Light-activated cell identification and sorting (LACIS) for selection of edited clones on a nanofluidic device. Communications in Biology. 1, 41 (2018).
- Winters, A., et al. Rapid single B cell antibody discovery using nanopens and structured light. MAbs. 11 (6), 1025-1035 (2019).
- Wu, N., Nishioka, W. K., Derecki, N. C., Maher, M. P. High-throughput-compatible assays using a genetically-encoded calcium indicator. Science Reports. 9 (1), 12692 (2019).
- Esposito, A. M., et al. A high-throughput cre-lox activated viral membrane fusion assay to identify inhibitors of HIV-1 viral membrane fusion. Journal of Visualized Experiments. (138), e58074 (2018).
- Soare, A. Y., et al. P2X1 selective antagonists block HIV-1 infection through inhibition of envelope conformation-dependent fusion. Journal of Virology. 94 (6), 01622 (2020).
