Summary
Ici, nous présentons un protocole dans lequel les cellules individuelles sont surveillées pour les événements aigus et l’infection productive par le VIH-1 sur un dispositif nanofluidique. Les données d’imagerie définissent les interactions virus-récepteur hôte et la dynamique de la voie de signalisation. Il s’agit de la première méthode de culture et d’imagerie unicellulaires longitudinales nanofluidiques à haut débit pour étudier la cinétique de signalisation et les interactions moléculaires.
Abstract
Le VIH-1 provoque une infection chronique qui touche plus de 37 millions de personnes dans le monde. Les personnes vivant avec le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) éprouvent une comorbidité liée à l’inflammation chronique malgré le traitement antirétroviral. Cependant, ces signalisations inflammatoires n’ont pas été entièrement caractérisées. Le rôle des événements d’entrée précoce sur l’activation des événements de signalisation cellulaire et l’expression des gènes en aval n’a pas été capturé au niveau unicellulaire. Ici, les auteurs décrivent une méthode qui applique les principes de la microscopie à fluorescence à cellules vivantes à une plate-forme unicellulaire automatisée qui cultures et images des cellules sur des cours de temps personnalisés par l’utilisateur, permettant une analyse à haut débit des processus cellulaires dynamiques. Ce test permet de suivre la microscopie à fluorescence vivante unicellulaire des événements précoces qui suivent immédiatement l’infection par le VIH-1, notamment l’afflux de calcium qui accompagne l’exposition au virus et le développement d’une infection productive à l’aide d’un virus rapporteur fluorescent. Les cellules MT-4 sont chargées d’un colorant sensible au calcium et cultivées dans des enclos isolés sur un dispositif nanofluidique. Les cellules cultivées sont infectées par un virus rapporteur du VIH-1 (NLCI VIH-1). Un microscope à fluorescence placé au-dessus du dispositif nanofluidique mesure l’afflux de calcium sur une trajectoire de temps de 8 minutes après une exposition aiguë au VIH-1. L’infection productive par le VIH-1 est mesurée dans ces mêmes cellules sur une période de 4 jours. Les données d’imagerie de ces cours de temps sont analysées pour définir les interactions virus-récepteur hôte et la dynamique de la voie de signalisation. Les auteurs présentent une alternative intégrée et évolutive aux méthodes d’imagerie traditionnelles à l’aide d’une nouvelle plate-forme optofluidique capable de trier, de culture, d’imagerie et d’automatisation logicielle unicellulaires. Ce test peut mesurer la cinétique des événements dans diverses conditions, y compris le type de cellule, l’agoniste ou l’effet antagoniste, tout en mesurant un éventail de paramètres. Il s’agit de la première méthode établie pour la culture et l’imagerie unicellulaires longitudinales nanofluidiques à haut débit : cette technique peut être largement adaptée pour étudier la cinétique de signalisation cellulaire et les interactions moléculaires dynamiques.
Introduction
L’inflammation chronique est l’une des principales causes de morbidité précoce et de mortalité associées au VIH1,2,3. Il existe de multiples mécanismes par lesquels le VIH peut activer la signalisation inflammatoire, et des preuves récentes suggèrent un rôle pour les récepteurs P2X dans l’entrée du VIH qui sont des récepteurs d’adénosine triphosphate (ATP)3,4,5,6,7,8,9,10. Le sous-type P2X des récepteurs purinergiques (P2XR) peut être des facilitateurs importants de cette inflammation. Cependant, les mécanismes moléculaires des interactions VIH-P2XR sont largement inconnus et peuvent avoir une incidence sur les étapes précoces et tardives du cycle de vie viral du VIH-1. Il est essentiel de définir les voies et la cinétique à l’origine de l’inflammation chronique associée au VIH pour faire progresser les options de traitement pour les personnes vivant avec le VIH.
Pour évaluer si le VIH-1 angoisse directement les récepteurs P2X, l’activation du P2XR et l’infection par le VIH-1 doivent être mesurées en parallèle. Des tests d’activité P2XR et d’infection par le VIH-1 ont été établis indépendamment : l’afflux cellulaire de calcium est un indicateur de l’activation du P2XR, et l’infection productive par le VIH-1 peut être quantifiée par l’abondance de l’ARN. La détection de fluorescence de l’afflux de calcium est possible avec le colorant sensible au calcium Fluo-4, et l’infection par le VIH-1 peut être visualisée avec le virus rapporteur fluorescent mCherry HIV-NLCI11,12,13,14,15.
Étant donné que ces indicateurs d’activation du P2X (afflux cellulaire aigu de calcium) et d’infection par le VIH-1 (synthèse de l’ARN du VIH-1) se produisent sur différentes échelles de temps (minutes par rapport aux jours), il manque une méthode à haut débit qui permet une analyse appariée de l’activation du P2XR et de l’infection par le VIH-1. Les techniques expérimentales standard à haut débit, telles que la cytométrie en flux, permettent l’analyse de la population, mais ne peuvent pas évaluer la relation entre les événements aigus et longitudinaux dans les cellules individuelles. Alternativement, l’imagerie unicellulaire avec microscopie à fluorescence standard est à faible débit. Ces limites expérimentales présentent un besoin de nouvelles techniques à haut débit pour mesurer directement les associations entre les événements cellulaires aigus et longitudinaux.
Un système optofluidique décrit est une nouvelle plate-forme capable de tri et d’isolation unicellulaires, de culture, d’imagerie et d’automatisation logicielle16,17,18,19. Ce système présente une alternative intégrée et à haut débit aux limites des méthodes d’imagerie traditionnelles. La plate-forme Beacon se compose d’un incubateur de dioxyde de carbone (CO2)et à température contrôlée qui prend en charge les cellules contenues dans une puce. La puce possède des transistors photosensibles qui génèrent un gradient électrique en réponse à la lumière ciblée. Cette force dielectrophorétique résultante est utilisée pour déplacer des cellules individuelles à travers la puce nanofluidique vers les régions souhaitées. Les cellules sont triées dans des stylos sur la puce, qui constituent une barrière pour isoler physiquement les cellules individuelles. Le flux laminaire continu des milieux de croissance à travers la puce empêche la migration cellulaire des stylos tout en permettant la diffusion de petites particules de nutriments et de réactifs spécifiques à l’expérience. Un microscope à fluorescence se trouve au-dessus de la puce. L’automatisation logicielle est utilisée pour capturer des images de la puce au point de temps spécifié par l’utilisateur.
Toute la caractérisation de cellules a été exécutée utilisant un système optofluidic pour la sélection et la manipulation de simple-cellule. Ce système se compose de composants mécaniques, microfluidiques et optiques intégrés qui permettent la manipulation, le dosage, la culture et l’imagerie unicellulaires. Les cellules sont chargées et cultivées sur le dispositif nanofluidique jetable composé de 3 500 chambres individuelles (stylos), chacune capable de contenir un volume sub-nanolittre. Les cellules peuvent être positionnées dans des enclos à l’aide de « cages » dielectrophorétiques induites par la lumière et cultivées dans des conditions contrôlées par la température et le CO2. La microfluidique permet la perfusion de milieux ou de tampons sur la puce pour la culture cellulaire ou le traitement médicamenteux. Une aiguille actionnée permet l’importation et l’exportation de cellules à partir de plaques de puits incubées et obturées. La zone de la puce peut être iluminée à un grossissement 4x ou 10x dans des canaux lumineux et fluorescents (y compris DAPI, FITC, TRed ou Cy5) pour caractériser les phénotypes cellulaires ou l’analyse fonctionnelle. L’ensemble du système est automatisé à l’aide d’un logiciel qui peut être utilisé pour des flux de travail prédéfinis ou des expériences personnalisées.
Des relations entre l’infection par le VIH-1 et le P2XR ont été étudiées, mais aucune procédure à haut débit n’a été signalée pour caractériser directement ces interactions en parallèle. Ici, les auteurs décrivent une méthodologie pour étudier les interactions VIH-P2XR en suivant l’afflux aigu de calcium et l’infection productive subséquente au VIH-1 au niveau unicellulaire. Il s’agit notamment d’un nouvel outil qui permet une mesure longitudinale directe et à haut débit de plusieurs cibles dans des cellules individuelles.
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Protocol
1. Préparation des cellules pour l’imagerie
- Préparer une solution fraîche de chargement fluo-4 AM : Ajouter 25 μL de solvant détergent concentré 100x, puis ajouter 2,5 μL de Fluo-4 AM 1000x à un tube de 1,5 mL. Vortex à mélanger.
- Pipeter 2,5 mL de milieu de culture dans la solution de chargement et inverser pour mélanger. Protéger de la lumière.
- Centrifuger 2 x 106 cellules MT-4 à 500 x g pendant 3 min.
- Retirer le milieu et ressusciter la pastille dans 2 mL de la solution de chargement fluo-4 AM préparée. Protéger de la lumière.
- Pipette remettait les cellules dans une boîte de Pétri de 35 mm. Incuber à 37 °C pendant 15-30 min, puis incuber pendant 15-30 min supplémentaires à température ambiante.
- Transférer la suspension cellulaire dans un tube de centrifugation. Centrifuger les cellules à 500 x g pendant 3 min et éliminer le surnageant constitué par la solution de chargement.
- Ressusciter le culot cellulaire par pipetage dans 1 mL du milieu de culture et centrifuger à 500 x g pendant 3 min pour laver.
- Ressusciter le culot cellulaire par pipetage dans le milieu de culture à une concentration de 2 x 106 cellules/mL (minimum 50 μL). Protéger de la lumière.
2. Préparation du système optofluidique, chargement des cellules et penning des cellules
- Préparez une puce avec la solution mouillante, ce qui facilite l’enclos des cellules.
- Pour ce faire, chargez des tubes centrifuges contenant 2 mL de solution mouillante et 50 mL d’eau DI sur l’instrument avec une nouvelle puce optofluidique et exécutez la fonction Wet Chip. Cette fonction va automatiquement inonder la puce avec la solution mouillante à travers la fluidique du système, incuber la puce à 50, °C et rincer la puce avec de l’eau 3 fois.
- Une fois le rinçage à l’eau terminé, rincez la puce avec 3 cycles de 250 μL de milieu de culture.
- Compléter la suspension cellulaire de l’étape 1.8 avec un soluté détergent F-127 1:100 avant le chargement pour réduire la probabilité que les cellules collent aux canaux de la puce.
- Utilisez l’aiguille d’exportation de l’instrument pour importer des cellules à partir d’un tube de centrifugation de 1,5 mL à l’aide de l’opération de charge et de l’importation à petit volume pour un volume d’emballage de cellules de 5 μL.
- Cellules de stylo utilisant une tension de positionnement optoélectronique (OEP) optimisée de 4,3 V et une vitesse de cage de 5 μm/s. Penning se produit à l’aide de OEP. Accomplissez la penning à l’aide de la fonction Autopen, qui détectera automatiquement les cellules individuelles, les entourera d’une cage OEP et les déplacera dans un stylet à proximité. Si les cellules d’intérêt restent après la saisie automatique, utilisez la fonction Stylet manuel pour sélectionner les cellules cibles (avec un clic de souris) et un stylet de destination (avec un clic de souris ultérieur).
- Une fois la penning terminée (soit lorsque la fonction Autopen est terminée, soit lorsque le nombre souhaité de cellules pennées a été atteint), videz la puce avec 3 cycles de 250 μL de milieu de culture pour éliminer toute cellule nonpenned restante de la puce.
3. Infection unicellulaire et imagerie fonctionnelle
- Après avoir penning des cellules, obtenir des images fluorescentes des cellules dans fitc, Texas Red, et DAPI canaux pour mesurer la ligne de base Fluo-4, mCherry, et autofluorescence.
- Infuser le VIH-1 dans la micropuce à une concentration de 13 ng de VIH-1 NL-CI par 2 x 106 cellules en canalisant lentement la suspension dans la puce à travers l’aiguille d’exportation.
- Immédiatement après l’ajout du VIH-1, obtenez à plusieurs reprises des images dans les canaux FITC et DAPI sur une durée de 10 minutes.
- Obtenez des images dans les canaux Texas Red et DAPI à 1, 2, 3 et 4 jours après l’infection (DPI).
4. Analyse des données d’imagerie fonctionnelle unicellulaire avec le logiciel FIJI
- À chaque point temporel de chaque canal d’imagerie d’intérêt, utilisez l’outil FIJI Point Selection et la fonction Measure pour mesurer les signaux Fluo-4, mCherry et autofluorescence de chaque cellule. Mesurer simultanément la fluorescence de fond en calculant l’intensité de fluorescence moyenne (IFM) du stylo et de la puce contenant chaque cellule.
- Contrôlez la fluorescence et l’autofluorescence de fond à l’aide de la fonction Measure pour rechercher l’IMF dans une sélection de région et en soustrayant cette valeur de la valeur de fluorescence cellulaire.
- Normaliser la fluorescence de fond de chaque image de puce: Mesurer l’IMF de la puce dans chaque champ. Ensuite, soustrayez l’IFM de la puce avec la fluorescence de fond la plus faible de toutes les autres mesures de l’IFM de la puce.
- Normaliser la fluorescence de fond de chaque stylo contenant des cellules : mesurez l’IFM du stylo de chaque cellule dans chaque champ de vision. Soustrayez ensuite cette valeur de l’IFM brute de la cellule pour chaque champ.
- Contrôle de l’autofluorescence cellulaire: Soustrayez le jour 0 et le jour 4 DAPI MFI de chaque cellule du jour 0 et du jour 4 mCherry MFIs.
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Representative Results
La figure 1 illustre le format de la puce et des données d’imagerie brutes acquises par le microscope à fluorescence. L’identification et le regroupement des cellules non infectées et infectées par mesure mCherry sont illustrés à la figure 2. Ces grappes sont analysées pour la cinétique d’afflux de calcium dans la figure 3, qui démontre l’afflux précoce de calcium dans les cellules infectées par le VIH. La figure 4 montre une corrélation positive significative entre l’afflux de calcium et la fluorescence mCherry 20.
Figure 1: Chargement des puces et données d’imagerie brutes. Schémas de chargement de cellules dans des stylos sur la puce à l’aide de l’opto-électropositionnement (A). L’afflux de calcium est quantifié en détectant le colorant sensible au calcium Fluo-4 dans le canal FITC sur un cours de temps de 8,5 minutes(B). L’infection productive par le VIH-1 est mesurée sur une période de 4 jours en détectant le virus rapporteur mCherry HIV NL-CI dans le canal Texas Red (C). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Cellules représentatives infectées par le VIH positives pour les signaux mCherry au jour 4 suivant l’infection. Les cellules MT-4 ont été infectées par le virus rapporteur mCherry HIV-1 NL-CI sur la plate-forme optofluidique, et le signal mCherry a été mesuré 4 jours après l’infection (dpi). Les cellules avec un changement de signal mCherry >40 000 MFI (où un point d’arrêt clair a été noté) à 4 dpi ont été regroupées dans la population « mCherry-high »; Des cellules avec un changement de fluorescence de mCherry <40.000 MFI ont été groupées dans la population de « mCherry-bas ». Un logiciel statistique a été utilisé pour tracer les valeurs moyennes de la fluorescence mCherry à 0 et 4 dpi. La signification statistique à 4 dpi a été mesurée à l’aide d’un test t non apparié des moyennes (mCherry-high= 50235 MFI; mCherry-low= 25017 MFI; p<0.000001). *=p<0.05, **=p<0.01, ***=p<0.001 Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Cellules représentatives infectées par le VIH ayant des taux élevés d’afflux précoce de calcium. Les cellules MT-4 ont été infectées par le virus rapporteur mCherry HIV-1 NL-CI sur la plateforme optofluidique. Le calcium intracellulaire a été mesuré par la fluorescence Fluo-4 à plusieurs reprises au-dessus d’un cours de temps de 9 minutes. Un logiciel statistique a été utilisé pour tracer les valeurs fluo-4 moyennes des grappes de cellules mCherry-high et mCherry-low. La signification statistique a été mesurée à l’aide de tests t non appariés à chaque point temporel. *=p<0.05, **=p<0.01, ***=p<0.001. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Flux de calcium intracellulaire représentatif plus élevé dans les cellules mCherry-positives. Les cellules MT-4 ont été infectées par le virus rapporteur mCherry HIV-1 NL-CI. Le calcium intracellulaire a été mesuré par la pote-infection de la minute fluo-4 de fluorescence 9, et mCherry a été mesuré pendant 4 jours poteau-infection. Une régression linéaire simple a été réalisée avec un logiciel statistique. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
La méthodologie décrite pour étudier la relation entre l’afflux de calcium et l’infection productive par le VIH-1 dans les cellules individuelles peut être adaptée pour étudier la cinétique du calcium intracellulaire en réponse à d’autres agonistes ou antagonistes d’intérêt. La préparation des cellules pour l’imagerie est simple, peu chronophage, et les réactifs sont disponibles dans des kits pratiques de fabricants largement utilisés. La mesure du calcium à base de fluo-4 est bien décrite dans la littérature, et le VIH-1 peut facilement être substitué à d’autres virus ou composés d’intérêt à étudier sur cette plateforme. Différents types de cellules et milieux de culture peuvent être utilisés. Des canaux de fluorescence alternatifs ou supplémentaires sont pris en charge, et plusieurs fluorophores peuvent être es imageés simultanément ou séquentiellement.
De plus, la procédure peut être largement adaptée pour étudier les événements marqués par les fluorophores dans des cours de temps longitudinaux. Les méthodes standard à haut débit, telles que la cytométrie en flux, ne permettent pas l’étude appariée d’événements discrets au fil du temps. L’imagerie unicellulaire traditionnelle par microscopie à fluorescence est limitée par le débit, la migration cellulaire entre les champs de vision et les exigences de temps intensif. En combinant l’imagerie par fluorescence avec une culture unicellulaire automatisée et à haut débit, cette méthode permet d’élucider la cinétique moléculaire pertinente, les séquelles et les interactions à court et à long terme. Il est important de noter que l’optimisation des logiciels et de l’analyse d’images est essentielle pour chaque application.
Le microscope est équipé de brightfield et de canaux de fluorescence Cy5, Texas Red, FITC et DAPI16. Les grossissements disponibles sont 4x et 10x. Cette méthode n’est actuellement pas adaptée aux investigations nécessitant des paramètres de fluorescence plus nombreux ou des grossissements plus importants. Les composés d’intérêt qui seront infusés dans la puce pour l’exposition cellulaire doivent présenter une diffusion pour entrer dans les stylos et atteindre les cellules. L’accès à un instrument Beacon peut constituer un obstacle financier pour les enquêteurs.
Le système optofluidique a une large capacité de balayage et de couture. Le tri optique sur la puce a une variable à haut rendement selon le type de cellule, mais l’efficacité de tri automatique est comprise entre 80 et 90%, et le tri manuel peut augmenter cette efficacité à 100%. Chaque puce peut accueillir 3 500 cellules et quatre puces peuvent être exécutées simultanément, avec un flux de travail parallèle, ce qui entraîne une grande évolutivité. Bien que le flux de travail d’imagerie soit signalé par analyse d’image manuelle, des mises à jour plus récentes du système permettent d’automatiser cela. Il est important de noter que les données présentées ici sont représentatives dans les limites de l’analyse des seuils d’image, et que l’optimisation et l’automatisation de l’analyse d’image sont susceptibles d’entraîner des mesures plus sensibles de l’afflux de calcium et du signal mCherry comme indicatifs de l’infection productive par le VIH-1.
Le protocole décrit a été établi en utilisant les cellules MT-4 et le VIH-1 comme décrit précédemment7,21,22. Lors de l’adaptation du protocole à d’autres lignées cellulaires ou cibles fluorescentes d’intérêt, l’optimisation et la validation sont nécessaires. La cinétique de l’efflux Fluo-4 dépend de la lignée cellulaire, de sorte que la rétention spécifique au type de cellule du colorant devrait être confirmée pour durer au moins si l’imagerie calcique prévue s’allance. La validation de la rétention du colorant et de la réponse agoniste sur ce dispositif optofluidique peut être complétée en traitant les cellules sur la puce avec le milieu de croissance contenant 10 μM d’ionomycine, ce qui devrait induire un puissant afflux cellulaire de calcium et un signal Fluo-4 dans le canal FITC. Des contrôles et des validations similaires devraient être effectués pour que tous les agonistes ou antagonistes soient infusés dans la puce afin d’assurer une concentration et une diffusion appropriées aux cellules. Pour l’analyse unicellulaire, les cellules doivent être préparées sous la forme d’une suspension unicellulaire afin de faciliter le tri des cellules individuelles dans des stylos. Comme la microscopie à fluorescence traditionnelle, les temps d’exposition à la fluorescence et les points de temps mesurés doivent être optimisés pour chaque cible d’intérêt respective.
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Disclosures
R.P.S. est un employé de Sema4. Les autres auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Nous sommes reconnaissants des discussions scientifiques avec le Dr Benjamin Chen. Ces travaux ont été financés par K08AI120806 (THS), R01DA052255 (THS et KB) et R21AI152833 (THS et KB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Beacon Optofluidic System | Berkeley Lights | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | ||
| FIJI | Open-source software | PMID: 22743772, 22930834 | |
| Fluo-4 Calcium Imaging Kit | Thermo Fisher | F10489 | |
| HIV-1 NLCINL4-3 | Laboratory of Benjamin Chen | PMID: 28148796 | |
| Hyclone Pennecillin Streptomycin solution | GE Healthcare Life sciences | SV30010 | |
| MT-4 cells | NIH AIDS Reagent | ARP-120 | |
| OptoSelect 3500 chip | Berkeley Lights | ||
| Pipettor Tips | Denville Scientific | P3020-CPS | |
| Prism 9.0.0 | GraphPad | ||
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Serological Pipettes | Fisher Brand | 13-678-11E | |
| Tissue Culture Hood | Various models | ||
| T75 flasks | Corning | 3073 |
References
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