Summary
Här presenterar vi ett protokoll där enstaka celler övervakas för akuta händelser och produktiv HIV-1-infektion på en nanofluidisk enhet. Bilddata definierar interaktioner mellan virusvärdreceptorer och signalvägsdynamik. Detta är den första metoden för nanofluidisk hög genomströmnings longitudinell encellig kultur och avbildning för att studera signaleringsk kinetik och molekylära interaktioner.
Abstract
HIV-1 orsakar en kronisk infektion som drabbar mer än 37 miljoner människor över hela världen. Personer som lever med humant immunbristvirus (HIV) upplever komorbiditet relaterad till kronisk inflammation trots antiretroviral behandling. Dessa inflammatoriska signalering har dock inte helt karakteriserats. Rollen av tidiga inträde händelser på aktivering av cellulära signalering händelser och nedströms gen uttryck har inte fångats på encellig nivå. Här beskriver författarna en metod som tillämpar principer för live-cell fluorescensmikroskopi till en automatiserad encellig plattform som kulturer och avbildar celler över användaranpassade tidskurser, vilket möjliggör analys av dynamiska cellulära processer med hög genomströmning. Denna analys kan spåra encellig levande fluorescensmikroskopi av tidiga händelser som omedelbart följer HIV-1-infektion, särskilt tillströmningen av kalcium som åtföljer exponering för viruset och utvecklingen av produktiv infektion med hjälp av ett fluorescerande reportervirus. MT-4-celler är laddade med ett kalciumkänsligt färgämne och odlas i isolerade pennor på en nanofluidisk enhet. De odlade cellerna är infekterade med ett HIV-1-reportervirus (HIV-1 NLCI). Ett fluorescensmikroskop placerat ovanför den nanofluidiska enheten mäter kalciumtillströmningen under en 8-minuters tidskurs efter akut HIV-1-exponering. HIV-1 produktiv infektion mäts i samma celler under ett 4-dagars intervall. Bilddata från dessa tidskurser analyseras för att definiera virus-värdreceptorinteraktioner och signalvägsdynamik. Författarna presenterar ett integrerat, skalbart alternativ till traditionella bildframställningsmetoder med hjälp av en ny optofluidisk plattform som kan sortera, odla, avbilda och automatisera programvara. Denna analys kan mäta kinetiken för händelser under olika förhållanden, inklusive celltyp, agonist eller antagonisteffekt, samtidigt som en rad parametrar mäts. Detta är den första etablerade metoden för nanofluidisk hög genomströmning längsgående encellig kultur och avbildning: Denna teknik kan i stort sett anpassas för att studera cellulära signalering kinetik och dynamiska molekylära interaktioner.
Introduction
Kronisk inflammation är en ledande orsak till HIV-associerade tidiga sjukligheter ochdödlighet 1,2,3. Det finns flera mekanismer där HIV kan aktivera inflammatorisk signalering, och nya bevis tyder på en roll för P2X-receptorerna i HIV-ingång som är kalcium-gating adenosin triphosphate (ATP) receptorer3,4,5,6,7,8,9,10. P2X subtyp av purinergic receptorer (P2XR) kan vara viktiga facilitatorer av denna inflammation. De molekylära mekanismerna i HIV-P2XR interaktioner är dock till stor del okända och kan påverka tidiga och sena HIV-1 virala livscykelsteg. Att definiera de vägar och kinetik som driver hiv-associerade kroniska inflammationer är avgörande för att främja behandlingsalternativ för personer med HIV.
För att bedöma om HIV-1 direkt våndas P2X-receptorer måste P2XR-aktivering och HIV-1-infektion mätas parallellt. Analyser av P2XR-aktivitet och HIV-1-infektion har oberoende fastställts: Cellulär kalciumtillströmning är en indikator på P2XR-aktivering, och HIV- 1-produktiv infektion kan kvantifieras av RNA överflöd. Fluorescensdetektering av kalciumtillströmning är möjlig med Fluo-4 kalciumkänsligt färgämne, och HIV-1-infektion kan visualiseras med mCherry fluorescerande reportervirus HIV-NLCI11,12,13,14,15.
Eftersom dessa indikatorer för P2X aktivering (akut cellulär kalcium tillströmning) och HIV-1 infektion (HIV-1 RNA syntes) förekommer på olika tidsskalor (minuter mot dagar), saknar det en hög genomströmningsmetod som möjliggör parisk analys av P2XR aktivering och HIV-1 infektion. Standard experimentella tekniker med hög genomströmning, såsom flödescytometri, möjliggör populationsanalysen men kan inte bedöma sambandet mellan akuta och longitudinella händelser i enstaka celler. Alternativt är encellig avbildning med standard fluorescensmikroskopi låg genomströmning. Dessa experimentella begränsningar utgör ett behov av nya, hög genomströmningstekniker för att mäta associationer mellan akuta och longitudinella cellulära händelser direkt.
Ett optofluidiskt system som beskrivs är en ny plattform som kan sortera och isolera en cell, odling, bildbehandling och programvaruautomation16,17,18,19. Detta system presenterar ett integrerat, hög genomströmningsalternativ till begränsningarna för traditionella avbildningsmetoder. Beacon-plattformen består av en koldioxid (CO2)och temperaturstyrd inkubator som stöder celler som finns på ett chip. Chipet har ljuskänsliga transistorer som genererar en elektrisk lutning som svar på riktat ljus. Denna resulterande dielektrofatiska kraft används för att flytta enskilda celler över det nanofluidiska chipet till önskade regioner. Celler sorteras i pennor på chipet, vilket ger en barriär för att isolera enskilda celler fysiskt. Kontinuerligt laminärt flöde av tillväxtmedier i hela chipet förhindrar cellmigration från pennorna samtidigt som det möjliggör småpartikeldiffusion av näringsämnen och experimentspecifika reagenser. Ett fluorescensmikroskop sitter ovanför chippet. Programvaruautomatisering används för att ta bilder av chipet vid den användarspecificerade tidpunkten.
All cell karakterisering utfördes med hjälp av ett optofluidic system för encellig markering och manipulering. Detta system består av integrerade mekaniska, mikrofluidiska och optiska komponenter som möjliggör encellig manipulering, analys, kultur och avbildning. Cellerna laddas och odlas på den nanofluidiska engångsanordningen som består av 3 500 enskilda kammare (pennor), som var och en kan hålla undernanolitervolym. Celler kan placeras i pennor med ljusinducerade dielektrofatiska "burar" och odlas under temperatur- och CO2-kontrolleradeförhållanden. Mikrofluidik tillåter perfusion av media eller buffertar på chipet för cellkultur eller läkemedelsbehandling. En aktiverad nål möjliggör import och export av celler från inkuberade och stängda brunnsplattor. Chipområdet kan avbildas vid 4x eller 10x förstoring i brightfield och fluorescerande kanaler (inklusive DAPI, FITC, TRed eller Cy5) för att karakterisera cellulära fenotyper eller funktionell analys. Hela systemet automatiseras med hjälp av programvara som kan användas för fördesignade arbetsflöden eller anpassade experiment.
Samband mellan HIV-1 infektion och P2XR har studerats, men en hög genomströmning förfarande för att direkt karakterisera dessa interaktioner parallellt har inte rapporterats. Här beskriver författarna en metodik för att studera HIV-P2XR interaktioner genom att spåra akut kalcium tillströmning och efterföljande HIV-1 produktiv infektion på encellsnivå. Detta etablerar särskilt ett nytt verktyg som möjliggör direkt, hög genomströmning, longitudinell mätning av flera mål i enstaka celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av celler för avbildning
- Bered färsk Fluo-4 AM lastlösning: Tillsätt 25 μL 100x koncentrerat rengöringsmedelsmedel och tillsätt sedan 2,5 μL Fluo-4 AM 1000x till ett 1,5 ml-rör. Virvel att blanda.
- Pipett 2,5 ml odlingsmedia i lastlösningen och inverterad att blanda. Skydda mot ljus.
- Centrifugera 2 x 106 MT-4 celler vid 500 x g i 3 min.
- Ta bort media och sätt tillbaka pelleten i 2 ml av den beredda Fluo-4 AM-lastlösningen. Skydda mot ljus.
- Pipett återanvände celler i en 35 mm Petri-skål. Inkubera vid 37 °C i 15-30 min och inkubera sedan i ytterligare 15-30 minuter vid rumstemperatur.
- Överför cellfjädringen till ett centrifugeringsrör. Centrifugceller vid 500 x g i 3 min och ta bort supernaten som består av lastlösningen.
- Återanvänd cellpelleten genom att pipetting i 1 ml av odlingsmediet och centrifugera vid 500 x g i 3 minuter för att tvätta.
- Återanvänd cellpelleten genom pipetting i odlingsmediet vid en koncentration av 2 x 106 celler/ml (minst 50 μL). Skydda mot ljus.
2. Optofluidisk systemberedning, cellbelastning och cell penning
- Förbered ett chip med våtlösningen, vilket underlättar cell penning.
- För att göra detta, ladda centrifugerör som innehåller 2 ml våtlösning och 50 ml DI-vatten på instrumentet med ett nytt optofluidiskt chip och kör funktionen Vått chip. Denna funktion kommer automatiskt att översvämma chipet med våtlösningen genom systemvätskan, inkubera chipet vid 50° C och spola chipet med vatten 3 gånger.
- När vattenspolningen är klar, spola chipet med 3 cykler på 250 μL kulturmedia.
- Komplettera cellfjädringen från steg 1.8 med 1:100 F-127 tvättmedel solut innan lastningen för att minska sannolikheten för att celler fastnar på spånkanalerna.
- Använd instrumentexportnålen för att importera celler från ett 1,5 ml centrifugeringsrör med hjälp av lastoperationen och liten volymimport för en 5 μL-cellförpackningsvolym.
- Pennceller med en optimerad optoelektronisk positioneringsspänning (OEP) på 4,3 V och 5 μm/s burhastighet. Penning förekommer med OEP. Utför penning med funktionen Autopen, som automatiskt kommer att neddyka enstaka celler, omge dem med en OEP-bur och flytta dem till en närliggande penna. Om celler av intresse fortsätter att följa automatisk penning använder du pennfunktionen Manuell för att markera målceller (med ett musklick) och en målpenna (med efterföljande musklick).
- När penning är klar (antingen när Autopen-funktionen är klar eller när önskat antal pennade celler har uppnåtts), spola chipet med 3 cykler på 250 μL odlingsmedier för att rensa eventuell återstående oanvänd cell från chipet.
3. Encellig infektion och funktionell avbildning
- Efter penningceller, få fluorescerande bilder av celler i FITC, Texas Red och DAPI kanaler för att mäta baslinjen Fluo-4, mCherry och autofluorescens.
- Ingjut HIV-1 i mikrochipet vid en koncentration av 13 ng HIV- 1 NL-CI per 2 x 106 celler genom att långsamt leda suspensionen i chipet genom exportnålen.
- Omedelbart efter HIV-1-tillägg, få upprepade gånger bilder i FITC- och DAPI-kanalerna under en 10-minuters tidskurs.
- Få bilder i Texas Red- och DAPI-kanalerna vid 1-, 2-, 3- och 4-dagars post-infection (DPI).
4. Analys av encelliga funktionella bilddata med FIJI-programvara
- Vid varje tidpunkt i varje bildkanal av intresse, använd FIJI Point Selection-verktyget och funktionen Mått för att mäta varje cells Fluo-4-, mCherry- och autofluorescenssignaler. Mät samtidigt bakgrundsfluorescensen genom att beräkna den genomsnittliga fluorescensintensiteten (MFI) för pennan och chipet som innehåller varje cell.
- Styr för bakgrundsfluorescensen och autofluorescensen genom att använda funktionen Mått för att hitta MFI i en regionval och subtrahera det här värdet från cellfluorescensvärdet.
- Normalisera bakgrundsfluorescensen för varje chipbild: Mät chipens MFI i varje fält. Subtrahera sedan chipet MFI med minst bakgrundsfluorescens från alla andra MFI-mätningar.
- Normalisera bakgrundsfluorescensen för varje cellinnehållande penna: mät MFI för varje cells penna i varje synfält. Subtrahera sedan det här värdet från cellens råa MFI för varje fält.
- Kontroll för cellen autofluorescens: Subtrahera dag 0 och dag 4 DAPI MFI för varje cell från dag 0 och dag 4 mCherry MMFIs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 illustrerar formatet på chipet och rådata som förvärvats genom fluorescensmikroskopet. Identifiering och klustring av oinfekterade och infekterade celler via mCherry-mätning visas i figur 2. Dessa kluster analyseras för kalciumtillströmningskinetik i figur 3, vilket visar tidig kalciumtillströmning i HIV-infekterade celler. Figur 4 visar ett signifikant positivt samband mellan kalciumtillströmning och mCherry fluorescens 20.
Figur 1:Spånbelastning och rådata. Ritningar över lastning av celler i pennor på chipet med optoelektropositionering (A). Kalciumtillströmningen kvantifieras genom att fluo-4 kalciumkänsligt färgämne i FITC-kanalen detekteras under en 8,5-minuters tidskurs (B). HIV-1 produktiv infektion mäts över en 4-dagars tidskurs genom att upptäcka mCherry reporter virus HIV NL-CI i Texas Red Channel (C). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Representativa HIV-infekterade celler positiva för mCherry signaler på dag 4 efter infektion. MT-4 celler var smittade med mCherry reporter virus HIV-1 NL-CI på optofluidic plattformen, och mCherry signal mättes 4 dagar efter infektion (dpi). Celler med en förändring i mCherry signal >40,000 MFI (där en tydlig brytpunkt noterades) vid 4 dpi grupperades i den "mCherry-höga" befolkningen; celler med en förändring i mCherry fluorescens <40,000 MFI grupperades i "mCherry-låg" befolkningen. Statistisk programvara användes för att plotta medelvärdena för mCherry fluorescens vid 0 och 4 dpi. Statistisk signifikans vid 4 dpi mättes med hjälp av ett oparat t-test av medlen (mCherry-high=50235 MFI; mCherry-low=25017 MFI; p<0.000001). *=p<0.05, **=p<0.01, ***=p<0.001 Klicka här för att se en större version av den här siffran.
Figur 3: Representativa HIV-infekterade celler med hög grad av tidig kalciumtillströmning. MT-4 celler var smittade med mCherry reporter virus HIV-1 NL-CI på optofluidic plattformen. Intracellulärt kalcium mättes av Fluo-4 fluorescens upprepade gånger under en 9-minuters tid kurs. Statistisk programvara användes för att plotta de genomsnittliga Fluo-4 värdena för mCherry-höga och mCherry-låga cell kluster. Statistisk signifikans mättes med hjälp av oparerade t-tester vid varje tidpunkt. *=p<0,05, **=p<0,01, ***=p<0,001. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: Representativt intracellulärt kalciumflöde högre i mCherrypositiva celler. MT-4 celler var smittade med mCherry reporter virus HIV-1 NL-CI. Intracellulärt kalcium mättes med Fluo-4 fluorescens 9 min post-infektion, och mCherry mättes 4 dagar efter infektion. En enkel linjär regression utfördes med statistisk programvara. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den beskrivna metoden för att studera sambandet mellan kalciumtillströmning och HIV- 1-produktiv infektion i enstaka celler kan anpassas för att studera intracellulär kalciumkinetik som svar på andra agonister eller antagonister av intresse. Beredningen av celler för avbildning är enkel, minimalt tidsintensiv, och reagenser finns i praktiska kit från allmänt använda tillverkare. Fluo-4-baserad kalciummätning är väl beskriven i litteraturen, och HIV-1 kan enkelt ersätta andra virus eller föreningar av intresse för att studera på denna plattform. Olika celltyper och odlingsmedium kan användas. Alternativa eller ytterligare fluorescenskanaler stöds, och flera fluorforer kan avbildas samtidigt eller sekventiellt.
Dessutom kan förfarandet anpassas i stor utsträckning för att studera fluoroformärkta händelser i longitudinella tidskurser. Standardmetoder för hög genomströmning, såsom flödescytometri, tillåter inte parat studier av diskreta händelser över tidskurser. Traditionell encellig avbildning genom fluorescensmikroskopi begränsas av dataflöde, cellmigrering över synfält och intensiva tidskrav. Genom att kombinera fluorescensavbildning med hög genomströmning och automatiserad encellig kultur möjliggör denna metod klargörande av relevant molekylär kinetik, och följdbehandling och interaktioner med både kort- och långsiktiga tidsintervall. Det är viktigt att notera att optimering av programvara och bild analys är avgörande för varje applikation.
Mikroskopet är utrustat med brightfield och Cy5, Texas Red, FITC och DAPI fluorescenskanaler16. Tillgängliga förstoringar är 4x och 10x. Denna metod är för närvarande inte lämplig för undersökningar som kräver fler talrika fluorescensparametrar eller större förstoringar. Föreningar av intresse som kommer att infunderas i chipet för cellexponeringen måste uppvisa diffusion för att komma in i pennor och nå celler. Tillgång till ett Beacon-instrument kan utgöra ett kostnadshinder för utredare.
Det optofluidiska systemet har en bred skannings- och sömnadsförmåga. Den optiska sorteringen på chipet har en högeffektiv variabel beroende på celltyp, men automatisk sorteringseffektivitet är mellan 80-90%, och manuell sortering kan öka den effektiviteten till 100%. Varje chip rymmer 3 500 celler och fyra chips kan köras samtidigt, med ett parallellt arbetsflöde, vilket resulterar i hög skalbarhet. Medan avbildningsarbetsflödet rapporteras av manuell avbildnings analys, tillåter nyare uppdateringar i systemet att automatisera detta. Det är viktigt att notera att de data som visas här är representativa inom begränsningarna för bildtröskelanalys, och optimering och automatisering av bildanalys kommer sannolikt att resultera i känsligare åtgärder för både kalciumtillströmning och mCherry-signal som ett tecken på hiv-1-produktiv infektion.
Det beskrivna protokollet upprättades med MT-4 celler och HIV-1 som tidigarebeskrivits 7,21,22. Vid anpassning av protokollet till andra cellinjer eller fluorescerande mål av intresse krävs optimering och validering. Kinetiken för Fluo-4-utflödet är celllinjeberoende, så den celltypspecifika färgretentionen bör bekräftas vara minst om den avsedda kalciumavbildningstiden. Validering av färgretention och agonistiskt svar på denna optofluidiska enhet kan slutföras genom behandling av celler på chipet med tillväxtmediet som innehåller 10 μM jonomycin, vilket bör inducera potent cellulär kalciumtillströmning och Fluo-4-signal i FITC-kanalen. Liknande kontroller och valideringar bör utföras för att eventuella agonister/antagonister ska infunderas i chippet för att säkerställa korrekt koncentration och diffusion till celler. För encellsanalys bör celler beredas som en encellig suspension för att underlätta sortering av enskilda celler i pennor. Liksom traditionell fluorescensmikroskopi bör fluorescensexponeringstider och uppmätta tidpunkter optimeras till respektive intressemål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
R.P.S. är anställd av Sema4. De andra författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Vi är tacksamma för de vetenskapliga diskussionerna med dr Benjamin Chen. Detta arbete finansierades av K08AI120806 (THS), R01DA052255 (THS och KB) och R21AI152833 (THS och KB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Beacon Optofluidic System | Berkeley Lights | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | ||
| FIJI | Open-source software | PMID: 22743772, 22930834 | |
| Fluo-4 Calcium Imaging Kit | Thermo Fisher | F10489 | |
| HIV-1 NLCINL4-3 | Laboratory of Benjamin Chen | PMID: 28148796 | |
| Hyclone Pennecillin Streptomycin solution | GE Healthcare Life sciences | SV30010 | |
| MT-4 cells | NIH AIDS Reagent | ARP-120 | |
| OptoSelect 3500 chip | Berkeley Lights | ||
| Pipettor Tips | Denville Scientific | P3020-CPS | |
| Prism 9.0.0 | GraphPad | ||
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Serological Pipettes | Fisher Brand | 13-678-11E | |
| Tissue Culture Hood | Various models | ||
| T75 flasks | Corning | 3073 |
References
- Aberg, J. A. Aging, inflammation, and HIV infection. Topics in Antiviral Medicine. 20 (3), 101-105 (2012).
- Deeks, S. G., Tracy, R., Douek, D. C. Systemic effects of inflammation on health during chronic HIV infection. Immunity. 39 (4), 633-645 (2013).
- Swartz, T. H., Dubyak, G. R., Chen, B. K. Purinergic receptors: Key mediators of HIV-1 infection and inflammation. Fromtiers in Immunology. 6, 585 (2015).
- Giroud, C., Marin, M., Hammonds, J., Spearman, P., Melikyan, G. B. P2X1 receptor antagonists inhibit HIV-1 fusion by blocking virus-coreceptor interactions. Journal of Virology. 89 (18), 9368-9382 (2015).
- Hazleton, J. E., Berman, J. W., Eugenin, E. A. Purinergic receptors are required for HIV-1 infection of primary human macrophages. Journal of Immunology. 188 (9), 4488-4495 (2012).
- Marin, M., et al. High-throughput HIV-cell fusion assay for discovery of virus entry inhibitors. Assay and Drug Development Technology. 13 (3), 155-166 (2015).
- Soare, A. Y., et al. P2X Antagonists inhibit HIV-1 productive infection and inflammatory cytokines interleukin-10 (IL-10) and IL-1β in a human tonsil explant model. Journal of Virology. 93 (1), 01186 (2019).
- Sorrell, M. E., Hauser, K. F. Ligand-gated purinergic receptors regulate HIV-1 Tat and morphine related neurotoxicity in primary mouse striatal neuron-glia co-cultures. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (2), 233-244 (2014).
- Swartz, T. H., Esposito, A. M., Durham, N. D., Hartmann, B. M., Chen, B. K. P2X-selective purinergic antagonists are strong inhibitors of HIV-1 fusion during both cell-to-cell and cell-free infection. Journal of Virology. 88 (19), 11504-11515 (2014).
- Soare, A. Y., et al. P2RX7 at the host-pathogen interface of infectious diseases. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 85 (1), (2021).
- Chen, P., Hübner, W., Spinelli, M. A., Chen, B. K. Predominant mode of human immunodeficiency virus transfer between T cells is mediated by sustained Env-dependent neutralization-resistant virological synapses. Journal of Virology. 81 (22), 12582-12595 (2007).
- Dale, B. M., et al. Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion. Cell Host Microbe. 10 (6), 551-562 (2011).
- Gee, K. R., et al. Chemical and physiological characterization of fluo-4 Ca(2+)-indicator dyes. Cell Calcium. 27 (2), 97-106 (2000).
- He, M. L., Zemkova, H., Koshimizu, T. A., Tomić, M., Stojilkovic, S. S. Intracellular calcium measurements as a method in studies on activity of purinergic P2X receptor channels. American Journal of Physiology and Cell Physiology. 285 (2), 467-479 (2003).
- Li, H., Zony, C., Chen, P., Chen, B. K. Reduced potency and incomplete neutralization of broadly neutralizing antibodies against cell-to-cell transmission of HIV-1 with transmitted founder envs. Journal of Virology. 91 (9), 02425 (2017).
- Beaumont, K. G., et al. Multiparameter cell characterization using nanofluidic technology facilitates real-time phenotypic and genotypic elucidation of intratumor heterogeneity. bioRxiv. , 457010 (2018).
- Le, K., et al. Assuring clonality on the beacon digital cell line development platform. Biotechnology Journal. 15 (1), 1900247 (2020).
- Mocciaro, A., et al. Light-activated cell identification and sorting (LACIS) for selection of edited clones on a nanofluidic device. Communications in Biology. 1, 41 (2018).
- Winters, A., et al. Rapid single B cell antibody discovery using nanopens and structured light. MAbs. 11 (6), 1025-1035 (2019).
- Wu, N., Nishioka, W. K., Derecki, N. C., Maher, M. P. High-throughput-compatible assays using a genetically-encoded calcium indicator. Science Reports. 9 (1), 12692 (2019).
- Esposito, A. M., et al. A high-throughput cre-lox activated viral membrane fusion assay to identify inhibitors of HIV-1 viral membrane fusion. Journal of Visualized Experiments. (138), e58074 (2018).
- Soare, A. Y., et al. P2X1 selective antagonists block HIV-1 infection through inhibition of envelope conformation-dependent fusion. Journal of Virology. 94 (6), 01622 (2020).
