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Immunology and Infection

मल्टीपैमीटर ऑप्टोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म का उपयोग करके कैल्शियम आई आमद और एचआईवी-1 संक्रमण का एकल-सेल लक्षण वर्णन

Published: May 18, 2021 doi: 10.3791/62632
Automatic Translation
1, 2, 3,4, 2, 1
1Department of Medicine, Division of Infectious Diseases, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Department of Genetics and Genomic Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, Icahn Institute of Data Science and Genomic Technology, 3Black Family Stem Cell Institute, Department of Genetics and Genomic Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, Icahn Institute of Data Science and Genomic Technology, 4Sema4, a Mount Sinai venture

Summary

यहां, हम एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जिसमें एक नैनोफ्लुइडिक डिवाइस पर तीव्र घटनाओं और उत्पादक एचआईवी-1 संक्रमण के लिए एकल कोशिकाओं की निगरानी की जाती है। इमेजिंग डेटा वायरस-होस्ट रिसेप्टर इंटरैक्शन और सिग्नलिंग पाथवे डायनामिक्स को परिभाषित करता है। यह नैनोफ्लुइडिक हाई-थ्रूपुट देशांतर एकल-कोशिका संस्कृति और इमेजिंग के लिए सिग्नलिंग काइनेटिक्स और आणविक बातचीत का अध्ययन करने के लिए पहली विधि है।

Abstract

एचआईवी-1 एक पुराने संक्रमण का कारण बनता है जो दुनिया भर में 37 मिलियन से अधिक लोगों को प्रभावित करता है। मानव इम्यूनोडेफिशिएंसी वायरस (एचआईवी) के साथ रहने वाले लोग एंटीरेट्रोवाइरल थेरेपी के बावजूद पुरानी सूजन से संबंधित कोमोर्बिडिटी का अनुभव करते हैं। हालांकि, इन भड़काऊ सिग्नलिंग को पूरी तरह से विशेषता नहीं दी गई है। सेलुलर सिग्नलिंग घटनाओं और डाउनस्ट्रीम जीन अभिव्यक्ति की सक्रियता पर प्रारंभिक प्रवेश घटनाओं की भूमिका एकल कोशिका स्तर पर कब्जा नहीं किया गया है । यहां लेखक एक ऐसी विधि का वर्णन करते हैं जो लाइव-सेल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के सिद्धांतों को एक स्वचालित एकल-सेल प्लेटफॉर्म पर लागू करती है जो उपयोगकर्ता-अनुकूलित समय पाठ्यक्रमों पर संस्कृतियों और छवियों की कोशिकाओं को संसाधित करती है, जिससे गतिशील सेलुलर प्रक्रियाओं के उच्च-थ्रूपुट विश्लेषण की अनुमति होती है। यह परख जल्दी घटनाओं की एकल कोशिका लाइव फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी को ट्रैक कर सकती है जो तुरंत एचआईवी-1 संक्रमण का पालन करती है, विशेष रूप से कैल्शियम की आमद जो वायरस के संपर्क में आती है और फ्लोरोसेंट रिपोर्टर वायरस का उपयोग करके उत्पादक संक्रमण के विकास के साथ होती है। एमटी-4 कोशिकाओं को कैल्शियम के प्रति संवेदनशील डाई से भरा जाता है और एक नैनोफ्लुइडिक डिवाइस पर अलग कलम में सुसंस्कृत किया जाता है। सुसंस्कृत कोशिकाएं एचआईवी-1 रिपोर्टर वायरस (एचआईवी-1 एनएलसीआई) से संक्रमित होती हैं । नैनोफ्लुइडिक डिवाइस के ऊपर स्थित एक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप तीव्र एचआईवी-1 एक्सपोजर के बाद 8-मिनट के समय पाठ्यक्रम पर कैल्शियम की आमद को मापता है। एचआईवी-1 उत्पादक संक्रमण एक 4 दिन के अंतराल पर उन ही कोशिकाओं में मापा जाता है । इन समय पाठ्यक्रमों से इमेजिंग डेटा वायरस-मेजबान रिसेप्टर इंटरैक्शन और सिग्नलिंग मार्ग गतिशीलता को परिभाषित करने के लिए विश्लेषण किया जाता है। लेखक एकल-सेल छंटाई, संस्कृति, इमेजिंग और सॉफ्टवेयर स्वचालन में सक्षम उपन्यास ऑप्टोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म का उपयोग करके पारंपरिक इमेजिंग विधियों के लिए एक एकीकृत, स्केलेबल विकल्प प्रस्तुत करते हैं। यह परख विभिन्न परिस्थितियों में घटनाओं की गतिज को माप सकती है, जिसमें कोशिका प्रकार, एगोनिस्ट या विरोधी प्रभाव शामिल हैं, जबकि मापदंडों की एक सरणी को मापने के लिए। यह नैनोफ्लुइडिक हाई-थ्रूपुट देशांतर एकल-कोशिका संस्कृति और इमेजिंग के लिए पहली स्थापित विधि है: इस तकनीक को सेलुलर सिग्नलिंग काइनेटिक्स और गतिशील आणविक बातचीत का अध्ययन करने के लिए मोटे तौर पर अनुकूलित किया जा सकता है।

Introduction

पुरानी सूजन एचआईवी से जुड़ी प्रारंभिक रुग्णता और मृत्यु दर का एक प्रमुख कारण है1,2,3. ऐसे कई तंत्र हैं जिनके कारण एचआईवी भड़काऊ संकेतों को सक्रिय कर सकता है, और हाल के साक्ष्य एचआईवी प्रवेश में पी 2एक्स रिसेप्टर्स के लिए एक भूमिका का सुझाव देते हैं जो कैल्शियम-गेटिंग एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) रिसेप्टर्स3,4,5,6,7,8,9,10हैं। प्यूरिनेर्जिक रिसेप्टर्स (पी2Xआर) का पी2एक्स उपप्रकार इस सूजन के महत्वपूर्ण सुविधाप्रदाताओं हो सकता है। हालांकि, एचआईवी-P2XR इंटरैक्शन के आणविक तंत्र काफी हद तक अज्ञात हैं और जल्दी और देर से एचआईवी-1 वायरल जीवन चक्र चरणों को प्रभावित कर सकते हैं। एचआईवी से जुड़े पुरानी सूजन ड्राइविंग रास्तों और काइनेटिक्स को परिभाषित एचआईवी के साथ लोगों के लिए उपचार के विकल्प को आगे बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण है ।

यह आकलन करने के लिए कि क्या एचआईवी-1 सीधे P2X रिसेप्टर्स, P2XR सक्रियण और एचआईवी-1 संक्रमण को समानांतर रूप से मापा जाना चाहिए । P2XR गतिविधि और एचआईवी-1 संक्रमण के परख स्वतंत्र रूप से स्थापित किया गया है: सेलुलर कैल्शियम बाढ़ P2XR सक्रियण का एक संकेतक है, और एचआईवी-1 उत्पादक संक्रमण आरएनए बहुतायत द्वारा निर्धारित किया जा सकता है । फ्लोरेसेंस का पता लगाना फ्लोरो-4 कैल्शियम-सेंसिटिव डाई के साथ संभव है, और एचआईवी-1 संक्रमण की कल्पना म्हेरी फ्लोरोसेंट रिपोर्टर वायरसएचआईवी-एनएलसीआई 11,12,13,14, 15के साथ की जा सकती है।

क्योंकि P2X सक्रियण (तीव्र सेलुलर कैल्शियम आमद) और एचआईवी-1 संक्रमण (एचआईवी-1 आरएनए संश्लेषण) के ये संकेतक विभिन्न टाइमस्केल (मिनट बनाम दिन) पर होते हैं, इसमें एक उच्च थ्रूपुट विधि का अभाव है जो P2XR सक्रियण और एचआईवी-1 संक्रमण के युग्मित विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। प्रवाह साइटोमेट्री जैसी मानक उच्च-थ्रूपुट प्रयोगात्मक तकनीकें जनसंख्या विश्लेषण के लिए अनुमति देती हैं, लेकिन एकल कोशिकाओं में तीव्र और देशांतर घटनाओं के बीच संबंधों का आकलन नहीं कर सकतीं। वैकल्पिक रूप से, मानक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के साथ एकल-सेल इमेजिंग कम थ्रूपुट है। ये प्रयोगात्मक सीमाएं सीधे तीव्र और देशांतर सेलुलर घटनाओं के बीच संघों को मापने के लिए उपन्यास, उच्च-थ्रूपुट तकनीकों की आवश्यकता प्रस्तुत करती हैं।

वर्णित एक ऑप्टोफ्लुइडिक सिस्टम एक उपन्यास मंच है जो एकल-कोशिका छंटाई और अलगाव, संस्कृति, इमेजिंग और सॉफ्टवेयरस्वचालन16, 17,18,19में सक्षम है। यह प्रणाली पारंपरिक इमेजिंग विधियों की सीमाओं के लिए एक एकीकृत, उच्च थ्रूपुट विकल्प प्रस्तुत करती है। बीकन प्लेटफॉर्म में कार्बन डाइऑक्साइड (सीओ2)और तापमान नियंत्रित इनक्यूबेटर होता है जो चिप पर निहित कोशिकाओं का समर्थन करता है। चिप में फोटोसेंसिटिव ट्रांजिस्टर होते हैं जो लक्षित प्रकाश के जवाब में विद्युत ढाल उत्पन्न करते हैं। इसके परिणामस्वरूप डाइइलोथ्रोपोरेटिक बल का उपयोग नैनोफ्लुइडिक चिप में व्यक्तिगत कोशिकाओं को वांछित क्षेत्रों में ले जाने के लिए किया जाता है। कोशिकाओं को चिप पर कलम में हल किया जाता है, जो व्यक्तिगत कोशिकाओं को शारीरिक रूप से अलग करने के लिए एक बाधा प्रदान करते हैं । चिप भर में विकास मीडिया के निरंतर laminar प्रवाह कलम से सेल प्रवास रोकता है, जबकि पोषक तत्वों और प्रयोग विशिष्ट अभिकर्मकों के छोटे कण प्रसार के लिए अनुमति देता है । एक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप चिप के ऊपर बैठता है। सॉफ्टवेयर स्वचालन का उपयोग उपयोगकर्ता-निर्दिष्ट समय बिंदु पर चिप की छवियों को कैप्चर करने के लिए किया जाता है।

सभी सेल लक्षण वर्णन एकल सेल चयन और हेरफेर के लिए एक ऑप्टोफ्लुइड सिस्टम का उपयोग करके किया गया था। इस प्रणाली में एकीकृत यांत्रिक, माइक्रोफ्लुइडिक और ऑप्टिकल घटक होते हैं जो एकल-कोशिका हेरफेर, परख, संस्कृति और इमेजिंग को सक्षम करते हैं। कोशिकाओं को डिस्पोजेबल नैनोफ्लुइडिक डिवाइस पर लोड और सुसंस्कृत किया जाता है जिसमें 3,500 व्यक्तिगत कक्ष (कलम) होते हैं, प्रत्येक उप-नैनोलीटर मात्रा रखने में सक्षम होता है। कोशिकाओं को प्रकाश-प्रेरित डाइइलेक्टोफोरेटिक "पिंजरों" का उपयोग करके कलम के भीतर तैनात किया जा सकता है और तापमान के तहत सुसंस्कृत-और सीओ2-नियंत्रितस्थितियों । माइक्रोफ्लुइडिक्स सेल कल्चर या ड्रग ट्रीटमेंट के लिए चिप पर मीडिया या बफ़र्स के परफ्यूजन की इजाजत देते हैं । एक एक्ट्यूएटेड सुई इनक्यूबेटेड और बंद अच्छी प्लेटों से कोशिकाओं के आयात और निर्यात के लिए अनुमति देता है। चिप क्षेत्र को सेलुलर फेनोटाइप या कार्यात्मक विश्लेषण की विशेषता के लिए ब्राइटफील्ड और फ्लोरोसेंट चैनलों (डीएपीआई, फिटसी, टेड, या Cy5 सहित) में 4x या 10x आवर्धन पर चित्रित किया जा सकता है। पूरी प्रणाली सॉफ्टवेयर का उपयोग करके स्वचालित है जिसका उपयोग प्रीडिजाइन किए गए वर्कफ़्लो या कस्टम प्रयोगों के लिए किया जा सकता है।

एचआईवी-1 संक्रमण और P2XR के बीच संबंधों का अध्ययन किया गया है, लेकिन समानांतर में इन बातचीत को सीधे चित्रित करने के लिए एक उच्च थ्रूपुट प्रक्रिया की सूचना नहीं दी गई है । यहां, लेखकों को एक पद्धति का वर्णन करने के लिए तीव्र कैल्शियम बाढ़ और बाद में एचआईवी-1 एकल कोशिका के स्तर पर उत्पादक संक्रमण ट्रैकिंग के माध्यम से एचआईवी-P2XR बातचीत का अध्ययन । विशेष रूप से, यह एक उपन्यास उपकरण स्थापित करता है जो एकल कोशिकाओं में कई लक्ष्यों के प्रत्यक्ष, उच्च-थ्रूपुट, देशांतर माप की अनुमति देता है।

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Protocol

1. इमेजिंग के लिए कोशिकाओं की तैयारी

  1. ताजा Fluo-4 AM लोडिंग समाधान तैयार करें: 100x केंद्रित डिटर्जेंट सॉल्वेंट के 25 माइक्रोन जोड़ें, फिर 1.5 एमएल ट्यूब में 1000x AM फ्लू-4 एएम 1000x का 2.5 माइक्रोन जोड़ें। भंवर मिश्रण करने के लिए।
  2. लोडिंग समाधान में संस्कृति मीडिया के पिपेट 2.5 एमएल और मिश्रण करने के लिए उलटा। प्रकाश से रक्षा करें।
  3. 3 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर सेंट्रलाइज 2 x 106 मीट्रिक टन-4 कोशिकाएं।
  4. मीडिया को हटाएं और तैयार फ्लूो-4 एएम लोडिंग सॉल्यूशन के 2 एमएल में पैलेट को रीसस्लपेंड करें। प्रकाश से रक्षा करें।
  5. पिपेट ने कोशिकाओं को 35 मिमी पेट्री डिश में फिर से निलंबित कर दिया। 15-30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, फिर कमरे के तापमान पर अतिरिक्त 15-30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  6. सेल निलंबन को एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें। 3 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर सेंट्रलाइज कोशिकाएं और लोडिंग समाधान से मिलकर सुपरनेंट को हटा दें।
  7. कल्चर मीडियम के 1 एमएल में पिपिंग करके सेल पेलेट को रीसुड करें और 3 मिनट तक 500 एक्स जी पर सेंट्रलाइज करें।
  8. 2 x 106 कोशिकाओं/एमएल (न्यूनतम 50 माइक्रोन) की एकाग्रता पर संस्कृति माध्यम में पाइपिंग करके सेल पेलेट को फिर से रीसुस्ल करें। प्रकाश से रक्षा करें।

2. ऑप्टोफ्लुइडिक सिस्टम तैयार करना, सेल लोडिंग और सेल पेनिंग

  1. वेटिंग सॉल्यूशन के साथ एक चिप तैयार करें, जो सेल पेनिंग की सुविधा देती है।
    1. ऐसा करने के लिए, एक नई ऑप्टोफ्लुइडिक चिप के साथ उपकरण पर गीला समाधान के 2 एमएल और डीआई पानी के 50 एमएल युक्त अपकेंद्रित्र ट्यूब लोड करें और गीले चिप फ़ंक्शन को चलाएं। यह फंक्शन सिस्टम फ्लूइडिक्स के जरिए वेटटिंग सॉल्यूशन के साथ चिप को अपने आप फ्लड करेगा, चिप को 50, डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करेगा और चिप को 3 बार पानी से फ्लश कर देगा।
    2. एक बार पानी फ्लशिंग किया जाता है, संस्कृति मीडिया के २५० μL के 3 चक्र के साथ चिप फ्लश ।
  2. चिप चैनलों से चिपके कोशिकाओं की संभावना को कम करने के लिए लोडिंग से पहले 1:100 एफ-127 डिटर्जेंट सॉल्यूट के साथ चरण 1.8 से सेल निलंबन को पूरक करें।
  3. 5 माइक्रोन सेल पैकेज वॉल्यूम के लिए लोड ऑपरेशन और स्मॉल वॉल्यूम आयात का उपयोग करके 1.5 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब से कोशिकाओं को आयात करने के लिए साधन निर्यात सुई का उपयोग करें।
  4. 4.3 वी और 5 माइक्रोन/एस पिंजरे की गति के एक अनुकूलित ऑप्टोइलेक्ट्रॉनिक पोजिशनिंग (ओईपी) वोल्टेज का उपयोग करके पेन कोशिकाएं। पेनिंग ओईपी का उपयोग करके होती है। ऑटोपेन फ़ंक्शन का उपयोग करके पेनिंग को पूरा करें, जो एकल कोशिकाओं को स्वचालित करेगा, उन्हें ओईपी पिंजरे से घेर लेगा, और उन्हें पास के पेन में ले जाएगा। यदि रुचि की कोशिकाएं ऑटो-पेनिंग का पालन करती रहती हैं, तो लक्ष्य कोशिकाओं (माउस क्लिक के साथ) और एक गंतव्य पेन (बाद में माउस क्लिक के साथ) का चयन करने के लिए मैनुअल पेन फ़ंक्शन का उपयोग करें।
  5. एक बार पेनिंग पूरा हो जाने के बाद (या तो जब ऑटोपेन फ़ंक्शन पूरा हो जाता है या जब लिखे कोशिकाओं की वांछित संख्या प्राप्त हो जाती है), तो चिप से किसी भी शेष अपूरित कोशिका को साफ करने के लिए संस्कृति मीडिया के 250 माइक्रोन के 3 चक्रों के साथ चिप को फ्लश करें।

3. सिंगल-सेल संक्रमण और कार्यात्मक इमेजिंग

  1. कोशिकाओं को लिखने के बाद, बेसलाइन फ्लोरो-4, रीचेरी और ऑटोफ्लोरेसेंस को मापने के लिए फिटसी, टेक्सास रेड और डीएपीआई चैनलों में कोशिकाओं की फ्लोरोसेंट छवियां प्राप्त करें।
  2. निर्यात सुई के माध्यम से चिप में निलंबन को धीरे-धीरे पाइपिंग करके एचआईवी-1 एनएल-सीआई प्रति 2 x 10 6 कोशिकाओं के 13 एनजी की एकाग्रता पर माइक्रोचिप मेंएचआईवी-1 को संचार करें।
  3. एचआईवी-1 के अलावा के तुरंत बाद, 10-मिनट समय पाठ्यक्रम पर फिटसी और डीएपीआई चैनलों में बार-बार छवियां प्राप्त करें।
  4. 1-, 2-, 3-, और 4 दिनों के बाद संक्रमण (डीपीआई) पर टेक्सास रेड और DAPI चैनलों में छवियां प्राप्त करें।

4. फिजी सॉफ्टवेयर के साथ एकल सेल कार्यात्मक इमेजिंग डेटा का विश्लेषण

  1. ब्याज के प्रत्येक इमेजिंग चैनल में हर समय बिंदु पर, फिजी पॉइंट चयन उपकरण और प्रत्येक सेल के फ्लोरो-4, रीचेरी और ऑटोफ्लोरेसेंस संकेतों को मापने के लिए माप कार्य का उपयोग करें। इसके साथ ही प्रत्येक कोशिका युक्त पेन और चिप के मतलब फ्लोरेसेंस तीव्रता (एमएफआई) की गणना करके पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस को मापें।
  2. एक क्षेत्र चयन में एमएफआई को खोजने और सेल फ्लोरेसेंस मूल्य से इस मूल्य को घटाने के लिए उपाय फ़ंक्शन का उपयोग करके पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस और ऑटोफ्लोरेसेंस के लिए नियंत्रण।
  3. प्रत्येक चिप छवि की पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस को सामान्य करें: प्रत्येक क्षेत्र में चिप के एमएफआई को मापें। फिर अन्य सभी चिप एमएफआई मापों से कम से कम पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस के साथ चिप के एमएफआई को घटाएं।
  4. प्रत्येक सेल युक्त कलम की पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस को सामान्य करें: प्रत्येक सेल के पेन के एमएफआई को प्रत्येक क्षेत्र में मापें। फिर प्रत्येक क्षेत्र के लिए सेल के कच्चे एमएफआई से इस मूल्य को घटाना।
  5. सेल ऑटोफ्लोरेसेंस के लिए नियंत्रण: दिन 0 और दिन 4 DAPI MFI प्रत्येक सेल के दिन 0 और दिन 4 mCherry MFIs से घटाना।

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Representative Results

चित्रा 1 फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के माध्यम से प्राप्त चिप और कच्चे इमेजिंग डेटा के प्रारूप को दिखाता है। रीचेरी माप के माध्यम से असंक्रमित और संक्रमित कोशिकाओं की पहचान और क्लस्टरिंग चित्र 2में दिखाई गई है । इन समूहों का विश्लेषण चित्रा 3में कैल्शियम प्रवाह काइनेटिक्स के लिए किया जाता है, जो एचआईवी संक्रमित कोशिकाओं में कैल्शियम की शुरुआती आमद को दर्शाता है । चित्रा 4 कैल्शियम की आमद और 20एमएचरी फ्लोरेसेंस के बीच एक महत्वपूर्ण सकारात्मक संबंध दिखाता है ।

Figure 1
चित्रा 1:चिप लोडिंग और कच्चे इमेजिंग डेटा। ऑप्टो-इलेक्ट्रोपोजिशनिंग(ए)का उपयोग करके चिप पर कलम में कोशिकाओं को लोड करने की योजनाबद्धताएं। 8.5 मिनट के समय पाठ्यक्रम(बी)पर फिटसी चैनल में फ्लूओ-4 कैल्शियम-सेंसिटिव डाई का पता लगाकर कैल्शियम की आमद की मात्रा निर्धारित की जाती है। एचआईवी-1 उत्पादक संक्रमण टेक्सास रेड चैनल(सी)में mCherry रिपोर्टर वायरस एचआईवी एनएल-सीआई का पता लगाकर 4 दिन के समय के कोर्स पर मापा जाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:प्रतिनिधि एचआईवी संक्रमित कोशिकाओं को 4 दिन में mCherry संकेतों के लिए सकारात्मक 4 संक्रमण के बाद । एमटी-4 कोशिकाएं ऑप्टोफलिडिक प्लेटफॉर्म पर रीचेरी रिपोर्टर वायरस एचआईवी-1 एनएल-सीआई से संक्रमित थीं और रीचेरी सिग्नल को 4 दिन बाद संक्रमण (डीपीआई) मापा गया था । 4 डीपीआई में 40,000 एमएफआई (जहां एक स्पष्ट ब्रेकपॉइंट नोट किया गया था) में रीचेरी > सिग्नल में बदलाव के साथ कोशिकाओं को "रीचेरी-उच्च" आबादी में संकुलित किया गया था; एमएचरी फ्लोरेसेंस <40,000 एमएफआई में बदलाव वाली कोशिकाओं को "रीचेरी-कम" आबादी में संकुल किया गया था। सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर का उपयोग 0 और 4 डीपीआई पर रीचेरी फ्लोरेसेंस के औसत मूल्यों को प्लॉट करने के लिए किया गया था। 4 डीपीआई में सांख्यिकीय महत्व का अर्थ (mCherry-high=50235 MFI; mCherry-low=25017 MFI; p<0.000001) के एक अकर्चुरी टी-टेस्ट का उपयोग करके मापा गया था । *=p<0.05, **=p<0.01, ***=p<0.001 कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3:प्रतिनिधि एचआईवी संक्रमित कोशिकाओं में कैल्शियम की शुरुआती आमद की उच्च दर होती है। एमटी-4 कोशिकाएं ऑप्टोफलुइडिक प्लेटफॉर्म पर रीचेरी रिपोर्टर वायरस एचआईवी-1 एनएल-सीआई से संक्रमित थीं । इंट्रासेलुलर कैल्शियम को 9 मिनट के समय के पाठ्यक्रम पर बार-बार फ्लोरो-4 फ्लोरेसेंस द्वारा मापा गया था। सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर का उपयोग रीचेरी-उच्च और रीचेरी-कम सेल क्लस्टर के मतलब फ्लू-4 मूल्यों को प्लॉट करने के लिए किया गया था। सांख्यिकीय महत्व हर समय बिंदु पर unpaired टी परीक्षणों का उपयोग कर मापा गया था । *=p<0.05, **=p<0.01, ***=p<0.001. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4:रीचेरी-पॉजिटिव कोशिकाओं में प्रतिनिधि इंट्रासेलुलर कैल्शियम फ्लक्स अधिक। एमटी-4 कोशिकाएं एमचेरी रिपोर्टर वायरस एचआईवी-1 एनएल-सीआई से संक्रमित थीं । इंट्रासेलुलर कैल्शियम को फ्लूो-4 फ्लोरेसेंस 9 मिनट के बाद संक्रमण द्वारा मापा गया था, और रीचेरी को संक्रमण के बाद 4 दिन मापा गया था। सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर के साथ एक साधारण रैखिक प्रतिगमन किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

एकल कोशिकाओं में कैल्शियम की आमद और एचआईवी-1 उत्पादक संक्रमण के बीच संबंधों का अध्ययन करने के लिए वर्णित पद्धति को अन्य पीड़ावादियों या ब्याज के विरोधी के जवाब में इंट्रासेलुलर कैल्शियम काइनेटिक्स का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इमेजिंग के लिए कोशिकाओं की तैयारी सरल, न्यूनतम समय-गहन है, और अभिकर्मक व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले निर्माताओं से सुविधाजनक किट में उपलब्ध हैं। फ्लू-4-आधारित कैल्शियम माप साहित्य में अच्छी तरह से वर्णित है, और एचआईवी-1 को इस मंच पर अध्ययन करने के लिए अन्य वायरस या रुचि के यौगिकों के लिए आसानी से प्रतिस्थापित किया जा सकता है। विभिन्न सेल प्रकार और संस्कृति माध्यमों का उपयोग किया जा सकता है। वैकल्पिक या अतिरिक्त फ्लोरेसेंस चैनलों का समर्थन किया जाता है, और कई फ्लोरोफोरस को एक साथ या क्रमिक रूप से चित्रित किया जा सकता है।

इसके अतिरिक्त, प्रक्रिया को देशांतर समय पाठ्यक्रमों में फ्लोरोफोर-लेबल वाली घटनाओं का अध्ययन करने के लिए व्यापक रूप से अनुकूलित किया जा सकता है। प्रवाह साइटोमेट्री जैसे मानक उच्च-थ्रूपुट विधियां, समय पाठ्यक्रमों के साथ असतत घटनाओं के युग्मित अध्ययन के लिए अनुमति नहीं देती हैं। फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के माध्यम से पारंपरिक एकल-सेल इमेजिंग थ्रूपुट, देखने के क्षेत्रों में सेल माइग्रेशन और गहन समय आवश्यकताओं द्वारा सीमित है। उच्च-थ्रूपुट और स्वचालित एकल-कोशिका संस्कृति के साथ फ्लोरेसेंस इमेजिंग के संयोजन से, यह विधि प्रासंगिक आणविक गतिज, सीक्वेल और लघु और दीर्घकालिक दोनों समय अंतराल पर बातचीत की स्पष्टता के लिए अनुमति देती है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि प्रत्येक आवेदन के लिए सॉफ्टवेयर और छवि विश्लेषण अनुकूलन महत्वपूर्ण है।

माइक्रोस्कोप ब्राइटफील्ड और Cy5, टेक्सास रेड, फिटसी, और DAPI फ्लोरेसेंसचैनलों 16से सुसज्जित है । उपलब्ध आवर्धन 4x और 10x हैं। यह विधि वर्तमान में अधिक कई फ्लोरेसेंस मापदंडों या अधिक आवर्धन की आवश्यकता वाली जांच के लिए उपयुक्त नहीं है। रुचि के यौगिकों कि सेल जोखिम के लिए चिप में संचार किया जाएगा प्रसार प्रदर्शित करने के लिए कलम में प्रवेश और कोशिकाओं तक पहुंचने चाहिए । एक बीकन उपकरण के लिए उपयोग जांचकर्ताओं के लिए एक लागत बाधा पैदा कर सकता है ।

ऑप्टोफ्लुइडिक सिस्टम में एक विस्तृत स्कैनिंग और सिलाई की क्षमता है। चिप पर ऑप्टिकल छंटाई में सेल प्रकार के आधार पर एक उच्च दक्षता चर है, लेकिन स्वचालित छंटाई दक्षता 80-90% के बीच है, और मैनुअल छंटाई उस दक्षता को 100% तक बढ़ा सकती है। प्रत्येक चिप 3,500 कोशिकाओं को समायोजित कर सकती है, और समानांतर वर्कफ़्लो के साथ चार चिप्स को एक साथ चलाया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप उच्च स्केलेबिलिटी होती है। जबकि इमेजिंग वर्कफ़्लो मैनुअल इमेज विश्लेषण द्वारा सूचित किया जाता है, सिस्टम में हाल के अपडेट इसे स्वचालित करने की अनुमति देते हैं। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि यहां दिखाए गए डेटा छवि सीमा विश्लेषण की सीमाओं के भीतर प्रतिनिधि हैं, और छवि विश्लेषण के अनुकूलन और स्वचालितीकरण के परिणामस्वरूप एचआईवी-1 उत्पादक संक्रमण के संकेत के रूप में कैल्शियम की आमद और रीचेरी सिग्नल दोनों के अधिक संवेदनशील उपाय होने की संभावना है।

वर्णित प्रोटोकॉल एमटी-4 कोशिकाओं और एचआईवी-1 का उपयोग करके स्थापित किया गया था जैसा कि पहले7,21,22वर्णित था। प्रोटोकॉल को अन्य सेल लाइनों या ब्याज के फ्लोरोसेंट लक्ष्यों में अनुकूल बनाते समय, अनुकूलन और सत्यापन की आवश्यकता होती है। फ्लू-4 एफफ्लक्स की काइनेटिक्स सेल लाइन-निर्भर है, इसलिए सेल टाइप-स्पेसिफिक डाई रिटेंशन की पुष्टि कम से कम अगर इच्छित कैल्शियम इमेजिंग टाइम कोर्स के लिए की जानी चाहिए। इस ऑप्टोफ्लुइडिक डिवाइस पर डाई रिटेंशन और एगोनिस्ट प्रतिक्रिया का सत्यापन 10 माइक्रोन आयनोमाइसिन युक्त विकास माध्यम के साथ चिप पर कोशिकाओं का इलाज करके पूरा किया जा सकता है, जो फिटसी चैनल में शक्तिशाली सेलुलर कैल्शियम आमद और फ्लोर-4 सिग्नल को प्रेरित करना चाहिए। कोशिकाओं को उचित एकाग्रता और प्रसार सुनिश्चित करने के लिए चिप में संचार करने के लिए किसी भी पीड़ावादियों/विरोधी के लिए इसी तरह के नियंत्रण और सत्यापन आयोजित किए जाने चाहिए । एकल कोशिका विश्लेषण के लिए, कोशिकाओं को कलम में व्यक्तिगत कोशिकाओं की छंटाई की सुविधा के लिए एक एकल कोशिका निलंबन के रूप में तैयार किया जाना चाहिए । पारंपरिक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी की तरह, फ्लोरेसेंस एक्सपोजर समय और मापा गया समय अंक ब्याज के प्रत्येक संबंधित लक्ष्य के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए।

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Disclosures

आर.पी.एस. सेमा4 के कर्मचारी हैं। अन्य लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

हम डॉ बेंजामिन चेन के साथ वैज्ञानिक चर्चाओं के लिए आभारी हैं । इस काम को K08AI120806 (THS), R01DA052255 (THS और KB), और R21AI152833 (THS और KB) द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 Beacon Optofluidic System Berkeley Lights
 Fetal Bovine Serum Gibco
 FIJI Open-source software PMID: 22743772, 22930834
 Fluo-4 Calcium Imaging Kit Thermo Fisher  F10489
 HIV-1 NLCINL4-3 Laboratory of Benjamin Chen PMID: 28148796
 Hyclone Pennecillin Streptomycin solution GE Healthcare Life sciences  SV30010
 MT-4 cells NIH AIDS Reagent  ARP-120
 OptoSelect 3500 chip Berkeley Lights
 Pipettor Tips Denville Scientific  P3020-CPS
 Prism 9.0.0 GraphPad
 RPMI-1640 Medium Sigma-Aldrich  R8758
Serological Pipettes Fisher Brand  13-678-11E
Tissue Culture Hood Various models
T75 flasks Corning 3073

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 171 उच्च भर में ऑप्टोफ्लुइडिक लाइव-सेल इमेजिंग एचआईवी संक्रमण कैल्शियम प्रवाह प्यूरिनेर्गिक रिसेप्टर
मल्टीपैमीटर ऑप्टोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म का उपयोग करके कैल्शियम आई आमद और एचआईवी-1 संक्रमण का एकल-सेल लक्षण वर्णन
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Freeman, T., Andreou, C., Sebra, R.… More

Freeman, T., Andreou, C., Sebra, R. P., Beaumont, K. G., Swartz, T. H. Single-Cell Characterization of Calcium Influx and HIV-1 Infection using a Multiparameter Optofluidic Platform. J. Vis. Exp. (171), e62632, doi:10.3791/62632 (2021).

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