Summary
Burada, nanoakışkan bir cihazda akut olaylar ve üretken HIV-1 enfeksiyonu için tek hücrelerin izlendiği bir protokol sunuyoruz. Görüntüleme verileri virüs konakçısı reseptör etkileşimlerini ve sinyal yolu dinamiklerini tanımlar. Bu, nanoakışkan yüksek verimli boyuna tek hücreli kültür ve görüntülemenin sinyal kinetik ve moleküler etkileşimleri incelemek için ilk yöntemidir.
Abstract
HIV-1, dünya çapında 37 milyondan fazla insanı etkileyen kronik bir enfeksiyona neden olur. İnsan immün yetmezlik virüsü (HIV) ile yaşayan insanlar antiretroviral tedaviye rağmen kronik inflamasyona bağlı komorbidiite yaşarlar. Bununla birlikte, bu enflamatuar sinyalizasyon tam olarak karakterize edilmiştir. Hücresel sinyal olaylarının aktivasyonu ve aşağı akış gen ekspresyasyonunda erken giriş olaylarının rolü tek hücre düzeyinde yakalanmamıştır. Burada yazarlar, canlı hücre floresan mikroskopisi ilkelerini, hücreleri kullanıcı tarafından özelleştirilmiş zaman kursları üzerinden kültürleyen ve dinamik hücresel süreçlerin yüksek verimli analizine izin veren otomatik bir tek hücreli platforma uygulayan bir yöntemi açıklar. Bu test, HIV-1 enfeksiyonunu hemen takip eden erken olayların tek hücreli canlı floresan mikroskopisini, özellikle virüse maruz kalmaya eşlik eden kalsiyum akınını ve floresan bir muhabir virüsü kullanarak üretken enfeksiyonun gelişmesini izleyebilir. MT-4 hücreleri kalsiyuma duyarlı bir boya ile yüklenir ve nanoakışkan bir cihazda izole kalemlerde kültürlenir. Kültürlü hücrelere HIV-1 muhabir virüsü (HIV-1 NLCI) bulaşır. Nanoakışkan cihazın üzerine yerleştirilmiş bir floresan mikroskobu, akut HIV-1 maruziyetini takiben 8 dakikalık bir zaman diliminde kalsiyum akınını ölçer. HIV-1 üretken enfeksiyonu aynı hücrelerde 4 günlük aralıklarla ölçülür. Bu zaman derslerinden elde edilen görüntüleme verileri, virüs konakçısı reseptör etkileşimlerini ve sinyal yolu dinamiklerini tanımlamak için analiz edilir. Yazarlar, tek hücreli sıralama, kültleştirme, görüntüleme ve yazılım otomasyonu yapabilen yeni bir optofluidik platform kullanarak geleneksel görüntüleme yöntemlerine entegre, ölçeklenebilir bir alternatif sunarlar. Bu tahlil, bir dizi parametreyi ölçerken hücre tipi, agonist veya antagonist etki de dahil olmak üzere çeşitli koşullar altında olayların kinetiğini ölçebilir. Bu, nanoakışkan yüksek verimli boyuna tek hücreli kültür ve görüntüleme için ilk kurulan yöntemdir: Bu teknik, hücresel sinyal kinetiği ve dinamik moleküler etkileşimleri incelemek için geniş ölçüde uyarlanabilir.
Introduction
Kronik inflamasyon HIV ile ilişkili erken morbiditelerin ve mortalitenin önde gelen bir nedenidir1,2,3. HIV'in enflamatuar sinyali aktive edebildiği birden fazla mekanizma vardır ve son kanıtlar, HIV girişinde kalsiyum-gating adenozin trifosfat (ATP) reseptörleri 3 , 4 , 5 , 6,7 ,8,9,10olan P2X reseptörleri için bir rol olduğunu göstermektedir. Pürinerjik reseptörlerin (P2XR) P2X alt tipi bu iltihabın önemli kolaylaştırıcıları olabilir. Bununla birlikte, HIV-P2XR etkileşimlerinin moleküler mekanizmaları büyük ölçüde bilinmemektedir ve erken ve geç HIV-1 viral yaşam döngüsü adımlarını etkileyebilir. HIV ile ilişkili kronik inflamasyonu yönlendiren yolların ve kinetiklerin tanımlanması, HIV'li insanlar için tedavi seçeneklerinin ilerlemesi için kritik öneme sahiptir.
HIV-1'in P2X reseptörlerini doğrudan acıtırıp acıtmadığını değerlendirmek için P2XR aktivasyonu ve HIV-1 enfeksiyonu paralel olarak ölçülmelidir. P2XR aktivitesi ve HIV-1 enfeksiyonu tahlilleri bağımsız olarak belirlenmiştir: Hücresel kalsiyum akını P2XR aktivasyonunun bir göstergesidir ve HIV-1 üretken enfeksiyonu RNA bolluğu ile ölçülebilir. Fluo-4 kalsiyuma duyarlı boya ile kalsiyum akınının floresan tespiti mümkündür ve HIV-1 enfeksiyonu mCherry floresan muhabir virüsü HIV-NLCI11 , 12,13,14,15ile görselleştirilebilir.
P2X aktivasyonu (akut hücresel kalsiyum akını) ve HIV-1 enfeksiyonu (HIV-1 RNA sentezi) bu göstergeleri farklı zaman ölçeklerinde (dakikalara karşı günler) ortaya çıktığı için, P2XR aktivasyonu ve HIV-1 enfeksiyonunun eşleştirilmiş analizine izin veren yüksek verimli bir yöntem yoktur. Akış sitometrisi gibi standart yüksek verimli deneysel teknikler popülasyon analizine izin verir, ancak tek hücrelerde akut ve boyuna olaylar arasındaki ilişkiyi değerlendiremez. Alternatif olarak, standart floresan mikroskopi ile tek hücreli görüntüleme düşük verimdir. Bu deneysel sınırlamalar, akut ve boyuna hücresel olaylar arasındaki ilişkileri doğrudan ölçmek için yeni, yüksek verimli tekniklere ihtiyaç duymaktadır.
Açıklanan optofluidik sistem, tek hücreli sıralama ve izolasyon, kültleştirme, görüntüleme ve yazılım otomasyonu16 , 17,18,19. Bu sistem, geleneksel görüntüleme yöntemlerinin sınırlamalarına entegre, yüksek verimli bir alternatif sunar. Beacon platformu, bir çipin içerdiği hücreleri destekleyen bir karbondioksit (CO2)ve sıcaklık kontrollü inkübatörden oluşur. Çip, hedeflenen ışığa yanıt olarak elektriksel bir gradyan üreten ışığa duyarlı transistörlere sahiptir. Elde edilen bu dielektrofotik kuvvet, nanoakışkan çip boyunca tek tek hücreleri istenen bölgelere taşımak için kullanılır. Hücreler, tek tek hücreleri fiziksel olarak izole etmek için bir bariyer sağlayan çip üzerindeki kalemlere sıralanır. Çip boyunca sürekli laminer büyüme ortamı akışı, kalemlerden hücre göçlerini önlerken, besin maddelerinin ve deneye özgü reaktiflerin küçük parçacıklı difüzyonunu sağlar. Bir floresan mikroskobu çipin üzerinde bulunur. Yazılım otomasyonu, çipin görüntülerini kullanıcı tarafından belirtilen zaman noktasında yakalamak için kullanılır.
Tüm hücre karakterizasyonu, tek hücreli seçim ve manipülasyon için optofluidik bir sistem kullanılarak gerçekleştirildi. Bu sistem, tek hücreli manipülasyon, tahlil, kültür ve görüntüleme sağlayan entegre mekanik, mikroakışkan ve optik bileşenlerden oluşur. Hücreler, her biri alt nanoliter hacmini tutabilen 3.500 ayrı odadan (kalem) oluşan tek kullanımlık nanoakışkan cihaza yüklenir ve kültürlenir. Hücreler, hafif kaynaklı dielektrofoetik "kafesler" kullanılarak kalemlere yerleştirilecek ve sıcaklık ve CO2kontrollü koşullar altında kültürlenebilir. Mikroakışkanlar, hücre kültürü veya ilaç tedavisi için çip üzerindeki medya veya tamponların perfüzyonunu izin eder. Aktüasyonlu bir iğne, inkübe ve kepenkli kuyu plakalarından hücrelerin ithal ve ihracatına izin verir. Çip alanı, hücresel fenotipleri veya fonksiyonel analizi karakterize etmek için parlak alan ve floresan kanallarda (DAPI, FITC, TRed veya Cy5 dahil) 4x veya 10x büyütmede görüntülenebilir. Tüm sistem, önceden tasarlanmış iş akışları veya özel denemeler için kullanılabilecek yazılım kullanılarak otomatikleştirilmiştir.
HIV-1 enfeksiyonu ve P2XR arasındaki ilişkiler incelenmiştir, ancak bu etkileşimleri paralel olarak doğrudan karakterize etmek için yüksek verimli bir prosedür bildirilmemiştir. Burada yazarlar, akut kalsiyum akınını ve ardından hiv-1 üretken enfeksiyonunu tek hücre düzeyinde izleyerek HIV-P2XR etkileşimlerini incelemek için bir metodolojiyi açıklarlar. Özellikle, bu, tek hücrelerdeki birden fazla hedefin doğrudan, yüksek verimli, uzunlamasına ölçülmesine izin veren yeni bir araç oluşturur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hücrelerin görüntüleme için hazırlanması
- Taze Fluo-4 yükleme solüsyonu hazırlayın: 25 μL 100x konsantre deterjan çözücü ekleyin, ardından 1,5 mL'lik bir tüpe 2,5 μL Fluo-4 1000x ekleyin. Karıştırmak için girdap.
- Pipet 2.5 mL kültür ortamı yükleme çözeltisine ve karıştırmak için ters çevirin. Işıktan kork.
- Santrifüj 2 x 106 MT-4 hücre 500 x g'da 3 dakika boyunca.
- Ortamı çıkarın ve peletin hazırlanan Fluo-4 yükleme çözeltisinin 2 mL'sinde yeniden kullanın. Işıktan kork.
- Pipet hücreleri 35 mm Petri kabına yeniden biriktirdi. 37 °C'de 15-30 dakika kuluçkaya yatırın, ardından oda sıcaklığında 15-30 dakika daha kuluçkaya yatırın.
- Hücre süspansiyonu bir santrifüj tüpüne aktarın. 500 x g'daki hücreleri 3 dakika boyunca santrifüjlayın ve yükleme çözeltisi oluşan süpernatantı çıkarın.
- Hücre peletini kültür ortamının 1 mL'sinde pipetleme ve 3 dakika boyunca 500 x g'da santrifüj ile yeniden yıkayın.
- Hücre peletini kültür ortamında 2 x 106 hücre/mL (minimum 50 μL) konsantrasyonda pipetleme ile yeniden biriktirin. Işıktan kork.
2. Optofluidik sistem hazırlama, hücre yükleme ve hücre peneleme
- Hücre penelatmalarını kolaylaştıran ıslatma çözeltisi ile bir çip hazırlayın.
- Bunu yapmak için, 2 mL ıslatma çözeltisi ve 50 mL DI suyu içeren santrifüj tüplerini yeni bir optofluidik çip ile cihaza yükleyin ve Islak Talaş işlevini çalıştırın. Bu işlev, çipi sistem akışkanları aracılığıyla ıslatma çözeltisiyle otomatik olarak sular altında kalır, çipi 50° C'de kuluçkaya yatırır ve çipi 3 kez suyla temizler.
- Su yıkama yapıldıktan sonra, çipi 250 μL'lik 3 döngü kültür ortamıyla yıkayın.
- Hücrelerin çip kanallarına yapışma olasılığını azaltmak için hücre süspansiyonunun 1:100 F-127 deterjanı ile 1:100 F-127 deterjanla 1.8 adımından takviye edin.
- 5 μL hücre paketi hacmi için Yük işlemini ve Küçük Hacimli İthalat'ı kullanarak 1,5 mL santrifüj tüpünden hücre ithal etmek için cihaz dışa aktarma iğnesini kullanın.
- 4,3 V ve 5 μm/s kafes hızında optimize edilmiş optoelektronik konumlandırma (OEP) voltajı kullanan kalem hücreleri. Penning OEP kullanılarak gerçekleşir. Tek hücreleri otomatik olarak algılayacak, bir OEP kafesi ile çevreleyecek ve yakındaki bir kaleme taşıyacak Autopen işlevini kullanarak penelamayı gerçekleştirin. İlgi çekici hücreler otomatik kaleme almanın ardından kalırsa, hedef hücreleri (fare tıklatmayla) ve hedef kalemi (sonraki fare tıklatmayla) seçmek için El ile kalem işlevini kullanın.
- Penning tamamlandıktan sonra (Autopen işlevi tamamlandığında veya istenen sayıda kaleme alınmış hücreye sahip olduğunda), kalan herhangi bir unpenned hücreyi yongadan temizlemek için çipi 250 μL'lik 3 döngü kültür ortamıyla yıkayın.
3. Tek hücreli enfeksiyon ve fonksiyonel görüntüleme
- Hücreleri kaleme aldıktan sonra, temel Fluo-4, mCherry ve otofluoresansı ölçmek için FITC, Texas Red ve DAPI kanallarındaki hücrelerin floresan görüntülerini elde edin.
- Süspansiyonu ihracat iğnesi aracılığıyla yavaşça çipe pipetleterek 2 x 10 6 hücre başına 13 ng HIV-1NL-CI konsantrasyonunda mikroçip içine HIV-1 demleyin.
- HIV-1 ilavesinin hemen ardından FITC ve DAPI kanallarında 10 dakikalık bir zaman diliminde tekrar tekrar görüntü elde edin.
- Teksas Kırmızısı ve DAPI kanallarında 1, 2, 3 ve 4 günlük enfeksiyon sonrası (DPI) görüntüler elde edin.
4. Fiji yazılımı ile tek hücreli fonksiyonel görüntüleme verilerinin analizi
- İlgi çekici her görüntüleme kanalında her zaman noktasında, her hücrenin Fluo-4, mCherry ve otomatik mağazascence sinyallerini ölçmek için FIJI Nokta Seçimi aracını ve Ölçü işlevini kullanın. Aynı anda her hücreyi içeren kalemin ve çipin ortalama floresan yoğunluğunu (MFI) hesaplayarak arka plan floresanını ölçün.
- Bölge Seçiminde MFI'yi bulmak için Ölçü işlevini kullanarak ve bu değeri hücre floresan değerinden çıkararak arka plan floresan ve otofluoresansı denetimi.
- Her yonga görüntüsünün arka plan floresanını normalleştirin: Her alanda çipin MFI'sını ölçün. Ardından, çipin MFI'sını diğer tüm yonga MFI ölçümlerinden en az arka plan floresanıyla çıkarın.
- Hücre içeren her kalemin arka plan floresanını normalleştirin: her görüş alanında her hücrenin kaleminin MFI'sını ölçün. Ardından, bu değeri her alan için hücrenin ham MFI'sinden çıkarın.
- Hücre otofluoresansı için kontrol: Her hücrenin 0 ve 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1, floresan mikroskobu ile elde edilen çip ve ham görüntüleme verilerinin formatını göstermektedir. Enfekte olmayan ve enfekte olmuş hücrelerin mCherry ölçümü ile tanımlanması ve kümelenmesi Şekil 2'de gösterilmiştir. Bu kümeler, HIV ile enfekte olmuş hücrelerde erken kalsiyum akınını gösteren Şekil 3'tekalsiyum akını kinetiği için analiz edilir. Şekil 4 kalsiyum akını ile mCherry floresan 20arasında önemli bir pozitif korelasyon göstermektedir.
Şekil 1: Çip yükleme ve ham görüntüleme verileri. Opto-elektropozisyon (A) kullanarak çip üzerindeki kalemlere hücre yükleme şemaları. Kalsiyum akışı, FITC kanalındaki Fluo-4 kalsiyuma duyarlı boyanın 8,5 dakikalık bir zaman diliminde(B)tespit ederek ölçülür. HIV-1 üretken enfeksiyonu, Texas Red kanalında(C)mCherry muhabir virüsü HIV NL-CI tespit ederek 4 günlük bir zaman kursu boyunca ölçülür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Temsili HIV ile enfekte hücreler mCherry signalsat günü için pozitif 4 enfeksiyon sonrası. MT-4 hücrelerine optofluidik platformda mCherry muhabir virüsü HIV-1 NL-CI bulaştı ve mCherry sinyali enfeksiyon sonrası 4 gün (dpi) ölçüldü. 4 dpi'de mCherry sinyalinde 40.000 MFI (net bir kırılma noktasının kaydedildiği) > bir değişiklik olan hücreler "mCherry-high" popülasyonuna kümelenmiştir; mCherry floresan < 40.000 MFI'lık bir değişime sahip hücreler "mCherry-düşük" popülasyonunda kümelenmiştir. mCherry floresan ortalama değerlerini 0 ve 4 dpi olarak çizmek için istatistiksel yazılım kullanılmıştır. 4 dpi'deki istatistiksel önem, araçları (mCherry-high=50235 MFI; mCherry-low=25017 MFI; s<0.000001) eşlenmemiş bir t-testi kullanılarak ölçüldü. *=s<0.05, **=p<0.01, ***=p<0.001 Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Erken kalsiyum akını oranları yüksek olan HIV ile enfekte olmuş hücreleri temsili. MT-4 hücrelerine optofluidik platformda mCherry muhabir virüsü HIV-1 NL-CI bulaştı. Hücre içi kalsiyum Fluo-4 floresan ile 9 dakikalık bir zaman diliminde art arda ölçüldü. İstatistiksel yazılım, mCherry-high ve mCherry-low hücre kümelerinin ortalama Fluo-4 değerlerini çizmek için kullanılmıştır. İstatistiksel önem her zaman noktasında eşleşmeyen t-testleri kullanılarak ölçtü. *=s<0.05, **=p<0.01, ***=p<0.001. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: mCherry pozitif hücrelerde temsili hücre içi kalsiyum akısı daha yüksektir. MT-4 hücrelerine mCherry muhabir virüsü HIV-1 NL-CI bulaştı. Hücre içi kalsiyum Fluo-4 floresan ile ölçüldü 9 dk enfeksiyon sonrası, mCherry ise enfeksiyon sonrası 4 gün ölçüldü. İstatistiksel yazılım ile basit bir doğrusal regresyon gerçekleştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tek hücrelerde kalsiyum akını ve HIV-1 üretken enfeksiyonu arasındaki ilişkiyi incelemek için tanımlanan metodoloji, diğer agonistlere veya ilgi çekici antagonistlere yanıt olarak hücre içi kalsiyum kinetiğini incelemek için uyarlanabilir. Hücrelerin görüntüleme için hazırlanması basittir, minimum zaman yoğundur ve reaktifler yaygın olarak kullanılan üreticilerin uygun kitlerinde mevcuttur. Fluo-4 bazlı kalsiyum ölçümü literatürde iyi tanımlanmıştır ve HIV-1 bu platformda çalışmak için diğer virüsler veya ilgi çekici bileşikler için kolayca değiştirilebilir. Farklı hücre tipleri ve kültür ortamları kullanılabilir. Alternatif veya ek floresan kanalları desteklenir ve birden fazla florofor aynı anda veya ardışık olarak görüntülenebilir.
Ek olarak, prosedür uzunlamasına zaman kurslarında florofor etiketli olayları incelemek için yaygın olarak uyarlanabilir. Akış sitometrisi gibi standart yüksek aktarım hızı yöntemleri, zaman kurslarında ayrık olayların eşleştirilmiş çalışmasına izin vermez. Floresan mikroskopi ile geleneksel tek hücreli görüntüleme, aktarım hızı, görüş alanları arasında hücre geçişi ve yoğun zaman gereksinimleri ile sınırlıdır. Floresan görüntülemeyi yüksek verimli ve otomatik tek hücreli kültürle birleştirerek, bu yöntem hem kısa hem de uzun vadeli zaman aralıklarında ilgili moleküler kinetiklerin, sekellerin ve etkileşimlerin aydınlatıcılığına izin verir. Yazılım ve görüntü analizi optimizasyonunun her uygulama için kritik öneme sahip olduğunu unutmayın.
Mikroskop brightfield ve Cy5, Texas Red, FITC ve DAPI floresan kanalları ile donatılmıştır16. Mevcut büyütmeler 4x ve 10x'tir. Bu yöntem şu anda daha fazla floresan parametresi veya daha fazla büyütme gerektiren araştırmalar için uygun değildir. Hücre maruziyeti için çipe aşılanacak ilgi bileşikleri, kalemlere girmek ve hücrelere ulaşmak için difüzyon göstermelidir. Bir Beacon cihazına erişim, araştırmacılar için bir maliyet engeli oluşturabilir.
Optofluidik sistem geniş bir tarama ve dikiş yeteneğine sahiptir. Çipteki optik sıralama, hücre tipine bağlı olarak yüksek verimli bir değişkene sahiptir, ancak otomatik sıralama verimliliği% 80-90 arasındadır ve manuel sıralama bu verimliliği% 100'e artırabilir. Her çip 3.500 hücre barındırabilir ve paralel bir iş akışıyla dört yonga aynı anda çalıştırılabilir ve bu da yüksek ölçeklenebilirlik sağlar. Görüntüleme iş akışı el ile görüntü analizi ile raporlanırken, sistemdeki daha yeni güncelleştirmeler bunu otomatikleştirmeye izin verir. Burada gösterilen verilerin görüntü eşiği analizinin sınırlamaları dahilinde temsili olduğunu ve görüntü analizinin optimizasyonu ve otomatizasyonunun HIV-1 üretken enfeksiyonunun göstergesi olarak hem kalsiyum akını hem de mCherry sinyalinin daha hassas önlemlerine neden olacağını belirtmek önemlidir.
Açıklanan protokol, daha önce açıklandığı gibi MT-4 hücreleri ve HIV-1 kullanılarak oluşturulmuştur7,21,22. Protokolü diğer hücre hatlarına veya floresan ilgi çekici hedeflere uyarlarken optimizasyon ve doğrulama gereklidir. Fluo-4 efflux kinetiği hücre hattına bağımlıdır, bu nedenle hücre tipine özgü boya tutmanın en azından amaçlanan kalsiyum görüntüleme süresi seyrinde sürdüğü doğrulanmalıdır. Bu optofluidik cihazda boya tutma ve agonist yanıtın doğrulanması, fitc kanalında güçlü hücresel kalsiyum akınına ve Fluo-4 sinyaline neden olması gereken 10 μM iyonomisin içeren büyüme ortamı ile çip üzerindeki hücrelerin tedavi edilmesiyle tamamlanabilir. Hücrelere uygun konsantrasyon ve difüzyon sağlamak için çipe aşılanacak agonistler/ antagonistler için benzer kontroller ve doğrulamalar yapılmalıdır. Tek hücreli analizler için hücreler, tek tek hücrelerin kalemlere ayrıştırılmasını kolaylaştırmak için tek hücreli bir süspansiyon olarak hazırlanmalıdır. Geleneksel floresan mikroskopisi gibi, floresan maruz kalma süreleri ve ölçülen zaman noktaları da ilgili her ilgi hedefine göre optimize edilmelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
R.P.S. Sema4'ün çalışanıdır. Diğer yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.
Acknowledgments
Dr. Benjamin Chen ile yaptığımız bilimsel tartışmalar için minnettarız. Bu çalışma K08AI120806 (THS), R01DA052255 (THS ve KB) ve R21AI152833 (THS ve KB) tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Beacon Optofluidic System | Berkeley Lights | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | ||
| FIJI | Open-source software | PMID: 22743772, 22930834 | |
| Fluo-4 Calcium Imaging Kit | Thermo Fisher | F10489 | |
| HIV-1 NLCINL4-3 | Laboratory of Benjamin Chen | PMID: 28148796 | |
| Hyclone Pennecillin Streptomycin solution | GE Healthcare Life sciences | SV30010 | |
| MT-4 cells | NIH AIDS Reagent | ARP-120 | |
| OptoSelect 3500 chip | Berkeley Lights | ||
| Pipettor Tips | Denville Scientific | P3020-CPS | |
| Prism 9.0.0 | GraphPad | ||
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Serological Pipettes | Fisher Brand | 13-678-11E | |
| Tissue Culture Hood | Various models | ||
| T75 flasks | Corning | 3073 |
References
- Aberg, J. A. Aging, inflammation, and HIV infection. Topics in Antiviral Medicine. 20 (3), 101-105 (2012).
- Deeks, S. G., Tracy, R., Douek, D. C. Systemic effects of inflammation on health during chronic HIV infection. Immunity. 39 (4), 633-645 (2013).
- Swartz, T. H., Dubyak, G. R., Chen, B. K. Purinergic receptors: Key mediators of HIV-1 infection and inflammation. Fromtiers in Immunology. 6, 585 (2015).
- Giroud, C., Marin, M., Hammonds, J., Spearman, P., Melikyan, G. B. P2X1 receptor antagonists inhibit HIV-1 fusion by blocking virus-coreceptor interactions. Journal of Virology. 89 (18), 9368-9382 (2015).
- Hazleton, J. E., Berman, J. W., Eugenin, E. A. Purinergic receptors are required for HIV-1 infection of primary human macrophages. Journal of Immunology. 188 (9), 4488-4495 (2012).
- Marin, M., et al. High-throughput HIV-cell fusion assay for discovery of virus entry inhibitors. Assay and Drug Development Technology. 13 (3), 155-166 (2015).
- Soare, A. Y., et al. P2X Antagonists inhibit HIV-1 productive infection and inflammatory cytokines interleukin-10 (IL-10) and IL-1β in a human tonsil explant model. Journal of Virology. 93 (1), 01186 (2019).
- Sorrell, M. E., Hauser, K. F. Ligand-gated purinergic receptors regulate HIV-1 Tat and morphine related neurotoxicity in primary mouse striatal neuron-glia co-cultures. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (2), 233-244 (2014).
- Swartz, T. H., Esposito, A. M., Durham, N. D., Hartmann, B. M., Chen, B. K. P2X-selective purinergic antagonists are strong inhibitors of HIV-1 fusion during both cell-to-cell and cell-free infection. Journal of Virology. 88 (19), 11504-11515 (2014).
- Soare, A. Y., et al. P2RX7 at the host-pathogen interface of infectious diseases. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 85 (1), (2021).
- Chen, P., Hübner, W., Spinelli, M. A., Chen, B. K. Predominant mode of human immunodeficiency virus transfer between T cells is mediated by sustained Env-dependent neutralization-resistant virological synapses. Journal of Virology. 81 (22), 12582-12595 (2007).
- Dale, B. M., et al. Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion. Cell Host Microbe. 10 (6), 551-562 (2011).
- Gee, K. R., et al. Chemical and physiological characterization of fluo-4 Ca(2+)-indicator dyes. Cell Calcium. 27 (2), 97-106 (2000).
- He, M. L., Zemkova, H., Koshimizu, T. A., Tomić, M., Stojilkovic, S. S. Intracellular calcium measurements as a method in studies on activity of purinergic P2X receptor channels. American Journal of Physiology and Cell Physiology. 285 (2), 467-479 (2003).
- Li, H., Zony, C., Chen, P., Chen, B. K. Reduced potency and incomplete neutralization of broadly neutralizing antibodies against cell-to-cell transmission of HIV-1 with transmitted founder envs. Journal of Virology. 91 (9), 02425 (2017).
- Beaumont, K. G., et al. Multiparameter cell characterization using nanofluidic technology facilitates real-time phenotypic and genotypic elucidation of intratumor heterogeneity. bioRxiv. , 457010 (2018).
- Le, K., et al. Assuring clonality on the beacon digital cell line development platform. Biotechnology Journal. 15 (1), 1900247 (2020).
- Mocciaro, A., et al. Light-activated cell identification and sorting (LACIS) for selection of edited clones on a nanofluidic device. Communications in Biology. 1, 41 (2018).
- Winters, A., et al. Rapid single B cell antibody discovery using nanopens and structured light. MAbs. 11 (6), 1025-1035 (2019).
- Wu, N., Nishioka, W. K., Derecki, N. C., Maher, M. P. High-throughput-compatible assays using a genetically-encoded calcium indicator. Science Reports. 9 (1), 12692 (2019).
- Esposito, A. M., et al. A high-throughput cre-lox activated viral membrane fusion assay to identify inhibitors of HIV-1 viral membrane fusion. Journal of Visualized Experiments. (138), e58074 (2018).
- Soare, A. Y., et al. P2X1 selective antagonists block HIV-1 infection through inhibition of envelope conformation-dependent fusion. Journal of Virology. 94 (6), 01622 (2020).
