Summary
在这里，我们提出了一个协议，其中单个细胞被监测急性事件和生产性HIV-1感染的纳米流体设备。成像数据定义病毒-宿主受体相互作用和信号通路动力学。这是研究信号动力学和分子相互作用的纳米流体高通量纵向单细胞培养和成像的第一种方法。
Abstract
艾滋病毒-1导致慢性感染，影响全世界3 700多万人。尽管进行了抗逆转录病毒治疗，但患有人类免疫缺陷病毒（HIV）的人会经历与慢性炎症有关的合并。然而，这些炎症信号并没有完全定性。早期进入事件对细胞信号事件和下游基因表达的激活作用尚未在单细胞水平上被捕捉到。在这里，作者描述了一种将活细胞荧光显微镜原理应用于自动化单细胞平台的方法，该平台通过用户定制的时间过程培养和成像细胞，从而能够对动态细胞过程进行高通量分析。这种检测可以跟踪HIV-1感染后立即发生的早期事件的单细胞活荧光显微镜，特别是接触病毒后钙的流入以及使用荧光记者病毒发展出的生产性感染。MT-4细胞装有钙敏感染料，在纳米流体装置上用分离的笔培养。培养的细胞感染了HIV-1报告病毒（HIV-1 NLCI）。放置在纳米流体装置上方的荧光显微镜测量急性HIV-1暴露后8分钟时间内的钙流入量。HIV-1生产性感染在4天间隔内在这些细胞中测量。分析这些时间课程的成像数据，以定义病毒-宿主受体相互作用和信号通路动力学。作者使用一种能够单细胞分拣、培养、成像和软件自动化的新型光伏平台，提出了一种集成的可扩展传统成像方法的替代方案。此检测可以测量各种条件下事件的动力学，包括细胞类型、激动剂或拮抗作用，同时测量一系列参数。这是第一个建立的纳米流体高通量纵向单细胞培养和成像方法：该技术可广泛应用于细胞信号动力学和动态分子相互作用的研究。
Introduction
慢性炎症是导致HIV相关早期发病率和死亡率的主要原因1，2，3。HIV可以激活炎症信号的多种机制，最近的证据表明P2X受体在HIV进入中的作用，即钙凝胶腺苷三磷酸盐（ATP）受体3、4、5、6、7、8、9、10。纯能受体的P2X亚型（P2XR）可能是这种炎症的重要促进剂。然而，艾滋病毒-P2XR相互作用的分子机制在很大程度上是未知的，并可能影响早期和后期艾滋病毒-1病毒的生命周期步骤。确定驱动艾滋病毒相关慢性炎症的途径和动力学对于推进艾滋病毒感染者的治疗方案至关重要。
为了评估HIV-1是否直接使P2X受体感到痛苦，必须同时测量P2XR活化和HIV-1感染。P2XR活性和HIV-1感染的检测已经独立确定：细胞钙的流入是P2XR活化的指标，HIV-1生产性感染可以通过RNA丰度进行量化。氟化物检测钙的流入是可能的与氟-4钙敏感染料，和HIV-1感染可以与MCherry荧光记者病毒HIV-NLCI 11，12，13，14，15可视化。
由于P2X活化（急性细胞钙流入）和HIV-1感染（HIV-1 RNA合成）的这些指标发生在不同的时间尺度（分钟与天数），因此缺乏一种高通量方法，可以对P2XR活化和HIV-1感染进行配对分析。标准的高通量实验技术，如流动细胞测量，允许对种群进行分析，但无法评估单个细胞中急性和纵向事件之间的关系。或者，具有标准荧光显微镜的单细胞成像是低通量的。这些实验限制要求采用新型的高通量技术直接测量急性和纵向细胞事件之间的关联。
描述的光伏系统是一个新型的平台，能够单细胞分拣和隔离，培养，成像和软件自动化16，17，18，19。该系统是传统成像方法的局限性之外，具有集成的高通量替代方法。信标平台由二氧化碳（CO2）和温度控制的孵化器组成，支持芯片上所含的细胞。该芯片具有感光晶体管，可产生电梯度以响应目标光。由此产生的介电力用于将单个细胞穿过纳米流体芯片移动到所需的区域。细胞被分拣成芯片上的笔，这为物理上分离单个细胞提供了障碍。整个芯片中生长介质的连续层压流可防止从笔中移动细胞，同时允许小颗粒传播营养物质和实验特异性试剂。荧光显微镜位于芯片上方。软件自动化用于在用户指定的时间点捕获芯片的图像。
所有细胞特征都是使用光伏系统进行单细胞选择和操作的。该系统由集成机械、微流体和光学元件组成，可实现单细胞操作、检测、培养和成像。细胞在一次性纳米流体装置上加载和培养，由 3，500 个单独的腔室（笔）组成，每个腔室都能够容纳亚纳米音量。细胞可以使用光诱导的介电"笼子"定位在笔内，并在温度和二氧化碳控制条件下培养。微流体允许在芯片上灌注介质或缓冲液用于细胞培养或药物治疗。一个激活的针头允许从孵化和关闭的井板细胞的进出口。芯片区域可在明亮场和荧光通道（包括 DAPI、FITC、TRed 或 Cy5）中以 4 倍或 10 倍的放大倍数进行成像，以描述蜂窝表型或功能分析。整个系统使用可用于预先设计的工作流或自定义实验的软件实现自动化。
已研究艾滋病毒-1感染与P2XR之间的关系，但尚未报告直接描述这些相互作用的高通量程序。在这里，作者描述了一种通过跟踪急性钙流入和随后的HIV-1单细胞水平生产性感染来研究HIV-P2XR相互作用的方法。值得注意的是，这建立了一个新颖的工具，允许直接，高通量，纵向测量多个目标在单个细胞。
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Protocol
1. 为成像准备细胞
- 准备新鲜的 Fluo-4 AM 加载解决方案：加入 25 μL 的 100 倍浓缩洗涤剂溶剂，然后将 2.5 μL 的 Fluo-4 AM 1000x 添加到 1.5 mL 管中。漩涡混合。
- 派珀特 2.5 mL 的文化介质进入加载解决方案并倒置混合。防止光线照射。
- 离心机 2 x 106 MT-4 电池在 500 x g 3 分钟。
- 取出介质，并在准备好的 Fluo-4 AM 加载解决方案的 2 mL 中重新喷射颗粒。防止光线照射。
- 派佩特将细胞重新注入35毫米的培养皿中。在 37 °C 孵育 15-30 分钟，然后在室温下再孵育 15-30 分钟。
- 将细胞悬架转移到离心机管中。离心机在500 x g 下3分钟，并去除由加载解决方案组成的超自然体。
- 通过在培养介质的 1 mL 中管管和离心机在 500 x g 中重新加热细胞颗粒，洗 3 分钟。
- 在培养介质中以浓度为 2 x 106 细胞/mL（至少 50 μL）的管道来补充细胞颗粒。防止光线照射。
2. 光伏系统制备、细胞加载和细胞笔下
- 用润湿溶液准备芯片，从而促进细胞笔下。
- 为此，将含有 2 mL 润湿溶液和 50 mL DI 水的离心机管用新的光伏芯片加载到仪器上，并运行 湿芯片 功能。此功能将通过系统流体自动将芯片与润湿溶液充斥，在 50°C 时孵化芯片，并将芯片冲洗 3 次。
- 冲水完成后，用 3 个周期的 250 μL 培养介质冲洗芯片。
- 在加载前，用 1：100 F-127 洗涤剂溶解剂补充步骤 1.8 的细胞悬架，以减少细胞粘附在芯片通道上的可能性。
- 使用仪器导出针头从 1.5 mL 离心机管导入细胞，使用 负载 操作和 小批量导入 5 μL 电池包体积。
- 使用优化的光电定位 （OEP） 电压为 4.3 V 和 5 μm/s 网箱速度的笔电池。使用 OEP 进行笔下。使用 自动笔 功能完成笔下处理，该功能将自动检测单个细胞，用 OEP 笼环绕它们，并将它们移入附近的笔中。如果感兴趣的单元格仍然遵循自动笔下，请使用 手动笔 功能选择目标单元件（鼠标单击）和目标笔（随后点击鼠标）。
- 笔下完成后（无论是当 自动笔功能 完成时，还是当所需的笔形细胞数量达到时），用 3 个周期的 250μL 培养介质冲洗芯片，以清除芯片中剩余的未固定细胞。
3. 单细胞感染和功能成像
- 在写入细胞后，获取 FITC、德克萨斯红和 DAPI 通道中细胞的荧光图像，以测量基线 Fluo-4、mCherry 和自流。
- 通过出口针将悬架慢慢输送到芯片中，将 HIV-1 注入微芯片，浓度为每 2 x 10 6 个细胞 13 ng 的HIV-1 NL-CI。
- 立即添加 HIV-1 后，在 10 分钟的时间内在 FITC 和 DAPI 通道中反复获取图像。
- 在感染后 1 天、2 天、3 天和 4 天 （DPI） 处在德克萨斯州红色和 DAPI 通道中获取图像。
4. 使用 FIJI 软件分析单细胞功能成像数据
- 在每个感兴趣的成像通道的每个时间点，使用 FIJI 点选择 工具和 测量 功能来测量每个单元的 Fluo-4、mCherry 和自流信号。同时通过计算包含每个细胞的笔和芯片的平均荧光强度 （MFI） 来测量背景荧光。
- 通过使用 测量 功能在 区域选择 中查找 MFI 并从细胞荧光值中减去此值来控制背景荧光和自流。
- 使每个芯片图像的背景荧光正常化：测量每个字段中的芯片的 MFI。然后从所有其他芯片 MFI 测量中减去背景荧光最少的芯片的 MFI。
- 使每个含细胞笔的背景荧光正常化：测量每个视域中每个细胞笔的 MFI。然后从每个字段的单元的原始 MFI 中减去此值。
- 细胞自流的控制：从第0天和第4天减去每个细胞的第0天和第4天的DAPI MFI。
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Representative Results
图1说明了通过荧光显微镜获得的芯片格式和原始成像数据。通过mCherry测量对未受感染和受感染细胞的识别和聚集显示在 图2中。这些聚类被分析为 图3中的钙流入动力学，这表明早期钙在HIV感染细胞中的流入。 图4 显示钙流入和mCherry荧光 20之间有显著的正相关关系。
图1：芯片加载和原始成像数据。 使用光电定位（A）将细胞加载到芯片上的笔中的示意图。钙的流入量通过检测FITC通道中的Fluo-4钙敏感染料在8.5分钟的时间过程中（B）进行量化。通过在德克萨斯州红色通道（C）检测 mCherry 记者病毒 NL-CI，在 4 天的时间内测量 HIV-1 生产性感染。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：感染HIV的细胞在感染后的第4天对MCherry信号呈阳性。 MT-4细胞在光伏平台上感染了MCherry记者病毒HIV-1 NL-CI，并且mCherry信号在感染后4天（dpi）被测量。mCherry 信号变化的细胞> 40，000 MFI（其中注意到一个明显的断点）在 4 dpi 被聚集到"mCherry 高"种群中;MCherry荧光变化的细胞<40，000 MFI被聚集到"MCherry低"种群中。统计软件用于绘制 m 樱桃荧光的平均值为 0 和 4 dpi。使用未修饰的 t 测试手段（mCherry 高=50235 MFI;m 樱桃低=25017 MFI;p<0.000001）测量了 4 dpi 的统计学意义。**p<0.05，**=p<0.01，***p<0.001 请点击这里查看此图的更大版本。
图3：具有代表性的HIV感染细胞，其早期钙流入率很高。 MT-4细胞在光伏平台上感染了MCherry记者病毒HIV-1 NL-CI。细胞内钙在9分钟的时间内反复用荧光-4荧光测量。统计软件用于绘制 mCherry 高和 m 樱桃低细胞簇的平均 Fluo-4 值。统计学意义是使用未修损的 t 测试在每个时间点测量的。**p<0.05，**=p<0.01，***p<0.001。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：具有代表性的细胞内钙通量高于m樱桃阳性细胞。 MT-4细胞感染了MCherry记者病毒HIV-1 NL-CI。细胞内钙由感染后9分钟的荧光测量，感染后4天测量mCherry。使用统计软件执行了简单的线性回归。 请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
研究单细胞中钙流入与HIV-1生产性感染之间关系的描述方法可以应用于研究细胞内钙动力学，以应对其他感兴趣的拮抗剂或拮抗剂。成像细胞的制备简单、时间最短，并且试剂可从广泛使用的制造商的方便套件中获得。氟-4基钙测量在文献中得到了很好的描述，在这个平台上研究HIV-1很容易被其他病毒或感兴趣的化合物所取代。可以使用不同的细胞类型和文化介质。支持替代或附加荧光通道，并可以同时或按顺序对多个荧光素进行成像。
此外，该程序可以广泛应用于纵向时间课程中荧光标记事件的研究。标准的高通量方法，如流细胞测量，不允许在时间课程中对离散事件进行配对研究。传统的单细胞成像通过荧光显微镜受吞吐量、跨视野的细胞迁移和密集的时间要求的限制。通过将荧光成像与高通量和自动单细胞培养相结合，该方法允许在短期和长期间隔内阐明相关的分子动力学、后遗症和相互作用。需要注意的是，软件和图像分析优化对于每个应用程序都至关重要。
显微镜配备了光明场和Cy5，得克萨斯红，FITC和DAPI荧光通道16。可用放大倍数为 4 倍和 10 倍。这种方法目前不适合需要更多荧光参数或更大放大倍数的调查。将注入芯片进行细胞暴露的兴趣化合物必须表现出扩散进入笔和到达细胞。访问信标仪器可能会给调查人员带来成本障碍。
光伏系统具有广泛的扫描和缝合能力。芯片上的光学分拣具有基于单元类型的高效率变量，但自动分拣效率在 80-90% 之间，手动分拣可将效率提高到 100%。每个芯片可容纳 3，500 个单元格，四个芯片可以同时运行，并行工作流，从而产生高可扩展性。虽然通过手动图像分析报告了成像工作流程，但系统中的最新更新允许实现自动化。需要注意的是，此处显示的数据在图像阈值分析的局限性中具有代表性，图像分析的优化和自动化可能导致对钙流入和 mCherry 信号的更敏感测量，以指示 HIV-1 生产性感染。
所述协议是使用MT-4细胞和HIV-1建立的，如先前描述的7，21，22。当将协议调整到其他细胞系或感兴趣的荧光目标时，需要优化和验证。Fluo-4 efflux 的动力学依赖于细胞系，因此，如果预期的钙成像时间过程，应确认细胞类型特定染料保留至少持续。通过用含有10μM离子霉素的生长介质处理芯片上的细胞，可以完成对这种光伏装置染料保留和激动反应的验证，这应能在FITC通道中诱导强效细胞钙流入和Fluo-4信号。应对注入芯片的任何拮抗剂/拮抗剂进行类似的控制和验证，以确保细胞的适当浓度和扩散。对于单细胞分析，细胞应作为单细胞悬架进行准备，以便于将单个细胞分拣成笔。与传统的荧光显微镜一样，应根据每个感兴趣的目标优化荧光暴露时间和时间点。
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Disclosures
R.P.S. 是 Sema4 的员工。其他作者没有利益冲突要披露。
Acknowledgments
我们感谢与陈本雅明博士的科学讨论。这项工作由 K08AI120806 （THS）、R01DA052255 （THS 和 KB） 和 R21AI152833 （THS 和 KB） 资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Beacon Optofluidic System | Berkeley Lights | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | ||
| FIJI | Open-source software | PMID: 22743772, 22930834 | |
| Fluo-4 Calcium Imaging Kit | Thermo Fisher | F10489 | |
| HIV-1 NLCINL4-3 | Laboratory of Benjamin Chen | PMID: 28148796 | |
| Hyclone Pennecillin Streptomycin solution | GE Healthcare Life sciences | SV30010 | |
| MT-4 cells | NIH AIDS Reagent | ARP-120 | |
| OptoSelect 3500 chip | Berkeley Lights | ||
| Pipettor Tips | Denville Scientific | P3020-CPS | |
| Prism 9.0.0 | GraphPad | ||
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Serological Pipettes | Fisher Brand | 13-678-11E | |
| Tissue Culture Hood | Various models | ||
| T75 flasks | Corning | 3073 |
References
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