Summary
Aquí, presentamos un protocolo en el cual las solas células se supervisan para los eventos agudos y la infección productiva HIV-1 en un dispositivo nanofluidic. Los datos de imágenes definen las interacciones virus-receptor huésped y la dinámica de la vía de señalización. Este es el primer método para el cultivo unicelular longitudinal nanofluídico de alto rendimiento y las imágenes para estudiar la cinética de señalización y las interacciones moleculares.
Abstract
El VIH-1 causa una infección crónica que afecta a más de 37 millones de personas en todo el mundo. Las personas que viven con el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) experimentan comorbilidad relacionada con la inflamación crónica a pesar de la terapia antirretroviral. Sin embargo, estas señales inflamatorias no se han caracterizado completamente. El papel de los eventos de entrada temprana en la activación de los eventos de señalización celular y la expresión génica aguas abajo no se ha capturado a nivel unicelular. Aquí los autores describen un método que aplica los principios de la microscopía de fluorescencia de células vivas a una plataforma unicelular automatizada que cultivos e imágenes de células a través de cursos de tiempo personalizados por el usuario, lo que permite el análisis de alto rendimiento de los procesos celulares dinámicos. Este ensayo puede rastrear la microscopía de fluorescencia en vivo unicelular de los eventos tempranos que siguen inmediatamente a la infección por VIH-1, en particular la afluencia de calcio que acompaña a la exposición al virus y el desarrollo de una infección productiva utilizando un virus reportero fluorescente. Las células MT-4 se cargan con un tinte sensible al calcio y se cultivan en plumas aisladas en un dispositivo nanofluídico. Las células cultivadas están infectadas con un virus reportero del VIH-1 (VIH-1 NLCI). Un microscopio de fluorescencia colocado por encima del dispositivo nanofluídico mide la afluencia de calcio durante un curso de tiempo de 8 minutos después de la exposición aguda al VIH-1. La infección productiva por VIH-1 se mide en esas mismas células durante un intervalo de 4 días. Los datos de imágenes de estos cursos de tiempo se analizan para definir las interacciones virus-receptor huésped y la dinámica de la vía de señalización. Los autores presentan una alternativa integrada y escalable a los métodos de imagen tradicionales utilizando una nueva plataforma optofluídica capaz de clasificar, cultivar, obtener imágenes y automatización de software unicelulares. Este ensayo puede medir la cinética de los eventos bajo diversas condiciones, incluyendo el tipo de célula, agonista, o efecto antagonista, mientras que la medición de una serie de parámetros. Este es el primer método establecido para el cultivo unicelular longitudinal nanofluídico de alto rendimiento y la imagen: Esta técnica se puede adaptar ampliamente para estudiar la cinética de señalización celular y las interacciones moleculares dinámicas.
Introduction
La inflamación crónica es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad tempranas asociadas al VIH1,2,3. Hay mecanismos múltiples por los cuales el VIH pueda activar la señalización inflamatoria, y la evidencia reciente sugiere un papel de los receptores P2X en la entrada del VIH que son receptores de trifosfato de adenosina (ATP) de calcio-gating3,4,5,6,7,8,9,10. El subtipo P2X de receptores purinérgicos (P2XR) puede ser facilitadores importantes de esta inflamación. Sin embargo, los mecanismos moleculares de las interacciones VIH-P2XR son en gran parte desconocidos y pueden afectar los pasos tempranos y tardíos del ciclo de vida viral del VIH-1. Definir las vías y la cinética que impulsan la inflamación crónica asociada al VIH es fundamental para avanzar en las opciones de tratamiento para las personas con VIH.
Para evaluar si el VIH-1 agoniza directamente los receptores P2X, la activación de P2XR y la infección por VIH-1 deben medirse en paralelo. Los análisis de la actividad de P2XR y de la infección VIH-1 se han establecido independientemente: La afluencia celular del calcio es un indicador de la activación de P2XR, y la infección productiva VIH-1 se puede cuantificar por abundancia del ARN. La detección de fluorescencia de la afluencia de calcio es posible con el colorante sensible al calcio Fluo-4, y la infección por VIH-1 se puede visualizar con el virus reportero fluorescente mCherry VIH-NLCI11,12,13,14,15.
Debido a que estos indicadores de activación de P2X (afluencia celular aguda de calcio) y la infección por VIH-1 (síntesis de ARN VIH-1) ocurren en diferentes escalas de tiempo (minutos versus días), no hay un método de alto rendimiento que permita el análisis emparejado de la activación de P2XR y la infección por VIH-1. Las técnicas experimentales estándar de alto rendimiento, como la citometría de flujo, permiten el análisis de la población, pero no pueden evaluar la relación entre los eventos agudos y longitudinales en células individuales. Alternativamente, la proyección de imagen unicelular con microscopia estándar de la fluorescencia es de bajo rendimiento. Estas limitaciones experimentales presentan una necesidad de técnicas nuevas, de alto rendimiento para medir las asociaciones entre los eventos celulares agudos y longitudinales directamente.
Un sistema optofluídico descrito es una nueva plataforma capaz de clasificación y aislamiento unicelular, cultivo, imágenes y automatización de software16,17,18,19. Este sistema presenta una alternativa integrada y de alto rendimiento a las limitaciones de los métodos de imagen tradicionales. La plataforma Beacon consiste en una incubadora de dióxido de carbono (CO2)y temperatura controlada que soporta las células contenidas en un chip. El chip posee transistores fotosensibles que generan un gradiente eléctrico en respuesta a la luz dirigida. Esta fuerza dielectroforética resultante se utiliza para mover células individuales a través del chip nanofluídico a las regiones deseadas. Las células se clasifican en bolígrafos en el chip, que proporcionan una barrera para aislar las células individuales físicamente. El flujo laminar continuo de medios de crecimiento a través del chip evita la migración celular de las plumas al tiempo que permite la difusión de partículas pequeñas de nutrientes y reactivos específicos del experimento. Un microscopio de fluorescencia se encuentra por encima del chip. La automatización de software se utiliza para capturar imágenes del chip en el punto de tiempo especificado por el usuario.
Toda la caracterización celular se realizó utilizando un sistema optofluídico para la selección y manipulación unicelular. Este sistema consiste en componentes mecánicos, microfluídicos y ópticos integrados que permiten la manipulación unicelular, el ensayo, el cultivo y la obtención de imágenes. Las células se cargan y cultivan en el dispositivo nanofluídico desechable que consta de 3.500 cámaras individuales (bolígrafos), cada una capaz de contener el volumen sub-nanolitro. Las células pueden colocarse dentro de corrales utilizando "jaulas" dielectroforéticas inducidas por la luz y cultivarse en condiciones controladas por temperatura y CO2. La microfluídica permite la perfusión de medios o tampones en el chip para el cultivo celular o el tratamiento farmacológico. Una aguja accionada permite la importación y exportación de células de placas de pozo incubadas y obturadas. El área del chip se puede tomar imágenes a un aumento de 4x o 10x en canales fluorescentes y de campo brillante (incluidos DAPI, FITC, TRed o Cy5) para caracterizar fenotipos celulares o análisis funcional. Todo el sistema está automatizado mediante software que se puede utilizar para flujos de trabajo prediseñados o experimentos personalizados.
Se han estudiado las relaciones entre la infección por VIH-1 y P2XR, pero no se ha informado de un procedimiento de alto rendimiento para caracterizar directamente estas interacciones en paralelo. Aquí, los autores describen una metodología para estudiar las interacciones VIH-P2XR a través del seguimiento de la afluencia aguda de calcio y la posterior infección productiva por VIH-1 a nivel unicelular. En particular, esto establece una herramienta novedosa que permite la medición directa, de alto rendimiento y longitudinal de múltiples objetivos en celdas individuales.
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Protocol
1. Preparación de células para la proyección de imagen
- Prepare la solución de carga fresca Fluo-4 AM: Agregue 25 μL de disolvente detergente concentrado 100x, luego agregue 2.5 μL de Fluo-4 AM 1000x a un tubo de 1.5 mL. Vórtice para mezclar.
- Pipetear 2,5 mL de medios de cultivo en la solución de carga e invertir para mezclar. Proteger de la luz.
- Centrífuga 2 x 106 células MT-4 a 500 x g durante 3 min.
- Retire el medio y resuspend el pellet en 2 mL de la solución de carga Fluo-4 AM preparada. Proteger de la luz.
- Pipeta resuspended las células en una placa de Petri de 35 milímetros. Incubar a 37 °C durante 15-30 min, luego incubar durante 15-30 min adicionales a temperatura ambiente.
- Transfiera la suspensión de la célula a un tubo de centrífuga. Centrífuga las células a 500 x g durante 3 min y retire el sobrenadante que consiste en la solución de carga.
- Resuspend el pellet celular pipeteando en 1 mL del medio de cultivo y centrífuga a 500 x g durante 3 min para lavar.
- Resuspend el pellet celular pipeteando en el medio de cultivo a una concentración de 2 x 106 células/mL (mínimo 50 μL). Proteger de la luz.
2. Preparación del sistema optofluídico, carga celular y penning celular
- Prepare un chip con la solución humectante, lo que facilita el penning celular.
- Para ello, cargue tubos centrífugos que contengan 2 mL de solución humectante y 50 mL de agua DI en el instrumento con un nuevo chip optofluídico y ejecute la función Wet Chip. Esta función inundará automáticamente el chip con la solución humectante a través del sistema fluídico, incubará el chip a 50, °C y enjuagará el chip con agua 3 veces.
- Una vez que se haya realizado el lavado de agua, enjuague el chip con 3 ciclos de 250 μL de medio de cultivo.
- Complemente la suspensión celular del paso 1.8 con soluto detergente 1:100 F-127 antes de la carga para reducir la probabilidad de que las células se peguen a los canales de la viruta.
- Utilice la aguja de exportación del instrumento para importar celdas de un tubo centrífuga de 1,5 mL utilizando la operación de carga y la importación de volumen pequeño para un volumen de paquete de celdas de 5 μL.
- Celdas de pluma que utilizan un voltaje de posicionamiento optoelectrónico optimizado (OEP) de 4,3 V y 5 μm/s de velocidad de jaula. Penning se produce mediante OEP. Realice el penning usando la función Autopen, que detectará automáticamente las células individuales, las rodeará con una jaula OEP y las moverá a una pluma cercana. Si las celdas de interés permanecen después del etiquetado automático, utilice la función Lápiz manual para seleccionar las celdas de destino (con un clic del mouse) y un lápiz de destino (con un clic posterior del mouse).
- Una vez que se haya completado el penning (ya sea cuando se complete la función Autopen o cuando se haya alcanzado el número deseado de celdas colgadas), enjuague el chip con 3 ciclos de 250 μL de medios de cultivo para eliminar cualquier celda restante sin colgar del chip.
3. Infección unicelular e imágenes funcionales
- Después de escribir las células, obtenga imágenes fluorescentes de células en los canales FITC, Texas Red y DAPI para medir la línea de base Fluo-4, mCherry y autofluorescencia.
- Infundir el VIH-1 en el microchip a una concentración de 13 ng de VIH-1 NL-CI por 2 x 106 células pipeteando lentamente la suspensión en el chip a través de la aguja de exportación.
- Inmediatamente después de la adición del VIH-1, obtenga repetidamente imágenes en los canales FITC y DAPI durante un curso de tiempo de 10 minutos.
- Obtenga imágenes en los canales Texas Red y DAPI a los 1, 2, 3 y 4 días después de la infección (DPI).
4. Análisis de datos de imágenes funcionales unicelulares con el software FIJI
- En cada punto de tiempo de cada canal de imagen de interés, utilice la herramienta Fiji Point Selection y la función Measure para medir las señales Fluo-4, mCherry y autofluorescencia de cada célula. Mida simultáneamente la fluorescencia de fondo calculando la intensidad media de fluorescencia (IMF) de la pluma y el chip que contiene cada célula.
- Controle la fluorescencia y la autofluorescencia de fondo mediante la función Medir para encontrar la IMF en una selección de región y restar este valor del valor de fluorescencia celular.
- Normalizar la fluorescencia de fondo de cada imagen de chip: Mida la IMF del chip en cada campo. A continuación, reste la IMF del chip con la menor fluorescencia de fondo de todas las demás mediciones de MFI de chip.
- Normalizar la fluorescencia de fondo de cada pluma que contiene células: mida la IMF de la pluma de cada célula en cada campo de visión. A continuación, reste este valor de la IMF sin procesar de la celda para cada campo.
- Control para la autofluorescencia celular: Restar el día 0 y el día 4 DAPI MFI de cada célula del día 0 y día 4 mCherry MFIs.
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Representative Results
La Figura 1 ilustra el formato del chip y los datos de imágenes en bruto adquiridos a través del microscopio de fluorescencia. La identificación y agrupación de células no infectadas e infectadas a través de la medición de mCherry se muestran en la Figura 2. Estos grupos se analizan para la cinética de influjo de calcio en la Figura 3,que demuestra la afluencia temprana de calcio en las células infectadas por el VIH. La Figura 4 muestra una correlación positiva significativa entre la afluencia de calcio y la fluorescencia mCherry 20.
Figura 1:Carga de chips y datos de imágenes sin procesar. Esquemas de carga de celdas en bolígrafos en el chip mediante opto-electroposición (A). La afluencia de calcio se cuantifica mediante la detección del colorante sensible al calcio Fluo-4 en el canal FITC durante un curso de tiempo de 8,5 minutos(B). La infección productiva por VIH-1 se mide durante un curso de 4 días mediante la detección del virus reportero mCherry VIH NL-CI en el canal Rojo de Texas(C). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 2:Células representativas infectadas por el VIH positivas para las señales de mCherry en el día 4 después de la infección. Las células MT-4 fueron infectadas con el virus del reportero del mCherry HIV-1 NL-CI en la plataforma optofluídica, y la señal del mCherry fue medida 4 días de la poste-infección (dpi). Las células con un cambio en la señal de mCherry >40.000 MFI (donde un punto de desempate claro fue observado) en 4 dpi fueron agrupadas en el "mCherry-alto" población; Las células con un cambio en fluorescencia del mCherry <40.000 MFI fueron agrupadas en el "mCherry-bajo" población. Se utilizó un software estadístico para trazar los valores medios de fluorescencia mCherry a 0 y 4 dpi. La significación estadística a 4 dpi se midió utilizando una prueba t no emparejada de las medias (mCherry-high=50235 MFI; mCherry-low=25017 MFI; p<0.000001). *=p<0.05, **=p<0.01, ***=p<0.001 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3:Células representativas infectadas por el VIH que tienen altas tasas de afluencia temprana de calcio. Las células MT-4 fueron infectadas con el virus del reportero del mCherry HIV-1 NL-CI en la plataforma optofluidic. El calcio intracelular fue medido por fluorescencia Fluo-4 en varias ocasiones durante un curso del tiempo de 9 minutos. El software estadístico fue utilizado para trazar los valores medios Fluo-4 de los racimos celulares mCherry-alto y mCherry-bajo. La significación estadística fue medida usando las t-pruebas desapareadas en cada punto del tiempo. *=p<0.05, **=p<0.01, ***=p<0.001. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 4: Flujo de calcio intracelular representativo más alto en células mCherry-positivas. Las células MT-4 fueron infectadas con el virus del reportero del mCherry HIV-1 NL-CI. El calcio intracelular fue medido por la poste-infección del minuto fluo-4 9 minutos, y el mCherry fue medido 4 días de poste-infección. Se realizó una regresión lineal simple con software estadístico. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
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Discussion
La metodología descrita para estudiar la relación entre la afluencia de calcio y la infección productiva por VIH-1 en células individuales puede adaptarse para estudiar la cinética intracelular del calcio en respuesta a otros agonistas o antagonistas de interés. La preparación de las células para la obtención de imágenes es simple, requiere un tiempo mínimo, y los reactivos están disponibles en kits convenientes de fabricantes ampliamente utilizados. La medición de calcio basada en Fluo-4 está bien descrita en la literatura, y el VIH-1 puede sustituirse fácilmente por otros virus o compuestos de interés para estudiar en esta plataforma. Se pueden utilizar diferentes tipos celulares y medios de cultivo. Se admiten canales de fluorescencia alternativos o adicionales, y se pueden obtener imágenes de múltiples fluoróforos simultánea o secuencialmente.
Además, el procedimiento se puede adaptar ampliamente para estudiar eventos marcados con fluoróforos en cursos longitudinales de tiempo. Los métodos estándar de alto rendimiento, como la citometría de flujo, no permiten el estudio emparejado de eventos discretos a lo largo del tiempo. Las imágenes unicelulares tradicionales a través de microscopía de fluorescencia están limitadas por el rendimiento, la migración celular a través de campos de visión y los requisitos de tiempo intensivo. Al combinar imágenes de fluorescencia con cultivos unicelulares automatizados y de alto rendimiento, este método permite la elucidación de la cinética molecular relevante, secuelas e interacciones a intervalos de tiempo a corto y largo plazo. Es importante tener en cuenta que la optimización del software y el análisis de imágenes es fundamental para cada aplicación.
El microscopio está equipado con brightfield y cy5, texas red, FITC, y dapi canales de fluorescencia16. Los aumentos disponibles son 4x y 10x. Este método no es actualmente adecuado para investigaciones que requieren parámetros de fluorescencia más numerosos o mayores aumentos. Los compuestos de interés que se infundirán en el chip para la exposición celular deben exhibir difusión para entrar en las plumas y llegar a las células. El acceso a un instrumento Beacon puede suponer una barrera de costos para los investigadores.
El sistema optofluídico tiene una amplia capacidad de escaneo y costura. La clasificación óptica en el chip tiene una variable de alta eficiencia dependiendo del tipo de celda, pero la eficiencia de clasificación automática está entre el 80-90%, y la clasificación manual puede aumentar esa eficiencia al 100%. Cada chip puede acomodar 3.500 celdas, y cuatro chips se pueden ejecutar simultáneamente, con un flujo de trabajo paralelo, lo que resulta en una alta escalabilidad. Mientras que el flujo de trabajo de imágenes se notifica mediante el análisis manual de imágenes, las actualizaciones más recientes en el sistema permiten automatizar esto. Es importante tener en cuenta que los datos que se muestran aquí son representativos dentro de las limitaciones del análisis del umbral de imagen, y es probable que la optimización y automatización del análisis de imágenes resulte en medidas más sensibles tanto de la afluencia de calcio como de la señal mCherry como indicativo de la infección productiva por VIH-1.
El protocolo descrito se estableció utilizando células MT-4 y VIH-1 como se describiópreviamente 7,21,22. Al adaptar el protocolo a otras líneas celulares o dianas fluorescentes de interés, se requiere optimización y validación. La cinética de la emanación Fluo-4 es línea-dependiente de la célula, así que la retención tipo-específica del tinte de la célula se debe confirmar para durar por lo menos si el curso previsto del tiempo de la proyección de imagen del calcio. La validación de la retención de colorantes y la respuesta agonista en este dispositivo optofluídico se puede completar mediante el tratamiento de células en el chip con el medio de crecimiento que contiene 10 μM de ionomicina, lo que debería inducir una potente afluencia celular de calcio y la señal Fluo-4 en el canal FITC. Se deben realizar controles y validaciones similares para cualquier agonista/antagonista que se infunda en el chip para garantizar la concentración y difusión adecuadas a las células. Para el análisis unicelular, las células deben prepararse como una suspensión unicelular para facilitar la clasificación de células individuales en bolígrafos. Al igual que la microscopía de fluorescencia tradicional, los tiempos de exposición a la fluorescencia y los puntos de tiempo medidos deben optimizarse para cada objetivo respectivo de interés.
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Disclosures
R.P.S. es un empleado de Sema4. Los otros autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Estamos agradecidos por las discusiones científicas con el Dr. Benjamin Chen. Este trabajo fue financiado por K08AI120806 (THS), R01DA052255 (THS y KB) y R21AI152833 (THS y KB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Beacon Optofluidic System | Berkeley Lights | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | ||
| FIJI | Open-source software | PMID: 22743772, 22930834 | |
| Fluo-4 Calcium Imaging Kit | Thermo Fisher | F10489 | |
| HIV-1 NLCINL4-3 | Laboratory of Benjamin Chen | PMID: 28148796 | |
| Hyclone Pennecillin Streptomycin solution | GE Healthcare Life sciences | SV30010 | |
| MT-4 cells | NIH AIDS Reagent | ARP-120 | |
| OptoSelect 3500 chip | Berkeley Lights | ||
| Pipettor Tips | Denville Scientific | P3020-CPS | |
| Prism 9.0.0 | GraphPad | ||
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Serological Pipettes | Fisher Brand | 13-678-11E | |
| Tissue Culture Hood | Various models | ||
| T75 flasks | Corning | 3073 |
References
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