Summary
Bu kolaylaştırılmış protokol, karmaşık doku örneklerindeki bakterileri tespit etmek ve görüntülemek için, dokuyu sabitlemekten floresan in situ hibridizasyonlu mikropları boyamaya kadar bir iş akışını detaylandırıyor.
Abstract
Mikropların in vivo bağlamlarında lokalizasyonunu ölçmek, mikrobiyota ve omurgalı bağırsak arasındaki fonksiyonel ilişkileri ortaya çıkarmak için önemli bir adımdır. Bağırsak mikrobiyotasının mekansal manzarası fiziksel özellikler - bağırsak mukusu, mahzenler ve kıvrımlar - tarafından sıkı bir şekilde kontrol edilir ve pH, oksijen kullanılabilirliği ve bağışıklık faktörleri gibi konak kontrollü özelliklerden etkilenir. Bu özellikler, kommensal mikropların ve patojenlerin bağırsakları bıçakla kolonileştirme yeteneğini sınırlar. Mikron ölçeğinde mikrobiyal organizasyon, farklı mikroplar arasındaki yakın mesafe etkileşimlerinin yanı sıra mikroplar ve konakları arasındaki etkileşimleri de belirler. Bu etkileşimler daha sonra büyük ölçekli organ fonksiyonunu ve konak sağlığını etkiler.
Bu protokol, bağırsak mikrobiyota mekansal organizasyonunun hücreler arasındaki mesafelerden organ çapındaki ölçeklere kadar görselleştirilmesini sağlar. Yöntem, bağırsak yapısını ve mukus özelliklerini korurken bağırsak dokularını sabitleyene dayanır. Sabit numuneler daha sonra floresan in situ hibridizasyonu (FISH) yoluyla belirli bakteri türlerini vurgulamak için gömülür, bölümlenir ve lekelenir. Mukus ve konak hücre bileşenleri gibi ana bilgisayar özellikleri floresan etiketli lektinlerle etiketlenir. Son olarak, lekeli bölümler, mikron ila santimetre uzunluğundaki ölçekleri köprülemek için yüksek büyütmede karo tarama görüntülemesi kullanan bir konfokal mikroskop kullanılarak görüntülenir. Bu tür görüntülemeler, sağlık ve hastalıkta bağırsaktaki mikrobiyotanın biyogeografisini belirlemek için hayvan modellerinden bağırsak bölümlerine ve insan dokularından biyopsilere uygulanabilir.
Introduction
Mikrobiyal görselleştirme teknikleri, Antonie Van Leeuwenhoek'in mikroskobunu kullanarak 17. O zamandan beri, bir konak-mikrobiyota1 ile ilişkili yaşayan bakteri, mantar ve virüs konsorsiyumunun mekansal organizasyonunu görselleştirmek için çok sayıda teknik geliştirilmiştir. Bu mikropların lokalizasyonunu kolaylaştırmak, hayvan konaklarında işlevlerini belirlemek için gereklidir. Bakterilerin biyojeografisi, kommensal ve patojenik taksonlarda önemlidir, çünkü belirli yerlere (örneğin epitel), besinsel substratlara ve belirli mikroplara yakınlık, türlerin ve krallıklar arası etkileşimlerin altında kalan metabolitlerin bakteriyel üretimini dikte edebilir.
Ağız boşluğu, bağırsak veya akciğer gibi çeşitli farklı vücut bölgelerindeki bakterileri ve konak dokuları ayıran önemli bir yapı mukus - hem konak epitel hücrelerine mikrobiyal translokasyonu önleyen hem de mikrobiyota için beslenme kaynağı görevi görür2,3,4 . Bu bariyerdeki ihlalleri ve değişiklikleri karakterize etmek, tek başına sıralanarak elde edilmeyecek konak-mikrobiyota etkileşimleri hakkında mekanistik içgörüye yol açan önemli bir öneme sahiptir5,6,7. Örneğin, görüntüleme, antibiyotik maruziyetinin mukus tabakasını ve mikrobiyota organizasyonunu bozabileceğinin keşfedilmesini sağladı7,8 ve müshillerin mukusu yetersiz hale getirince bağışıklık parametrelerindeki büyük değişikliklerle ilişkili olabilir5.
Bu protokol, Johansson ve Hansson9'un çalışmaları üzerine inşa edilen mikrobiyota ve konak dokusunun sabitlenerek, boyanarak ve görüntülenmesi için genel bir çerçeveyi özetlemektedir (Şekil 1). Bu protokol bağırsak bölümleri bağlamında modellenirken, diğer doku tiplerine kolayca uyarlanabilir. Bu protokol, deneysel hayvan veya insan klinik örneklerinin işlenmesini sağlar; her iki tür numunenin işlenmesine ilişkin notlar eklenmiştir. Burada sunulan örnekte, konak epitel ve luminal bakteriler aynı anda 4′,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) boyama, floresan (FITC) konjuge lektin ile mukus, Ulex europaeus aglutinin I (UEA-1) ve FISH kullanılarak belirli bir bakteri takson ile etiketlenmiştir. FISH probları genellikle bir taksonun 16S rRNA genlerine karşı, yüksek kopya transkriptinin bağlanmasından yüksek sinyali sağlamak için tasarlanmıştır.
Bu örnekte, prob Muribaculaceae bakteri ailesinin 16S rRNA'sını hedeflememektedir (Şekil 2). Bununla birlikte, lekeler uygun biyolojik soruyu karşılamak için farklı FISH probları ve / veya lektinlerle kolayca ikame edilir. Önceden doğrulanmış FISH probları, rRNA hedefli oligonükleotid probları için çevrimiçi bir kaynak olan ProbeBase10'da veya bir ribozomal RNA veritabanı olan SILVA11'de bulunabilir. Yeni probların tasarımı için okuyucu HiPR-FISH8 veya Oligominer12 gibi yeni işlem hatlarına başvurabilir. Bu protokolü kullanarak, bağırsak lümeninde bakterilerin yakın paketlenmesi ve sindirim sistemi boyunca bağırsak mukusunun farklı özelliklerini gözlemlemek mümkündür. Burada açıklanan iş akışı, mikrobiyotanın konak ortamının uzamsal bağlamında nicel analizini sağlar.
Protocol
Bu protokolde açıklanan tüm hayvan deneyleri ve doku toplama, Kanada Hayvan Bakımı Konseyi (CCAC) yönergelerine uygun olarak gerçekleştirildi ve British Columbia Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylandı. Mikropsuz İsviçre Webster fareleri kullanıldı. Tüm hayvanlar 8-10 haftalıktı, her iki cinsiyet de kullanıldı ve tüm fareler kafes başına en az iki fare ile birlikte barındırıldı. Hayvanlar ikincil servikal çıkık veya kardiyak delinme ile karbondioksit kullanılarak ötenaziye tabi edildi.
1. Bir görüntüleme deneyi tasarlamak: dikkat edilmesi gerekenler ve örnek toplama
- FISH prob tasarımı
- Uygun bir FISH probu varsa, etiketli hücrelerde arka plana kıyasla güçlü bir sinyal gösteren önceden yayımlanmış bir tane seçin.
- Hedef bakterilerin sabit örneklerine bağlanma ve diğer bakterilere hedef dışı bağlanma verimliliklerini belirlemek için yeni probları in vitro olarak doğrulayın.
- Hedef organizmadan 16S dizilerine karşı veya analiz edilecek örneklerden 16S rRNA dizilimine karşı kullanılacak tüm 16S FISH problarını kontrol edin, böylece beklenen pozitif eşleşme oranının mevcut olduğundan ve probların özellikle diğer mikrobiyota üyelerine bağlanmayacağından emin olun.
- Probların ve hedeflerinin potansiyel bağlamasını değerlendirmek için Clustal Omega13 gibi bir araç kullanarak FISH problarını tam uzunlukta dizilere veya amplicon dizisi varyantlarına göre hizalayın.
- Siliko testine ek olarak, saf kültürler üzerinde doğrulanmamış probların FISH boyama doğruluğunu ve seviyesini test edin8,14.
NOT: Birden fazla topluluk üyesini lekelerken, kullanılan floroforlar heyecan ve emisyon spektrumlarında örtüşmezse (doğrusal karıştırma yapma yeteneğine sahip bir sistemde görüntüleme olmadıkça) problar kombinatorially (örneğin, aileye özgü bir prob ve cinse özgü bir prob kombinasyonu) kullanılabilir. Ayrıca, özgüllük kontrolleri/karıştırılmış problar dahil edilerek veya floresan olmayan problarla rekabet edilerek özgüllük gösterilebilir.
- Örnek tipleri ve doku toplama
- Keskin ve temiz aletler kullanarak, görüntüleme için gnotobiyotik İsviçre Webster farelerinden bağırsak segmentlerini kesin. Numuneyi mümkün olduğunca rahatsız etmeyi en aza indirin ve görüntüleme alanını etkilememek için bölümleri kenarlarından idare edin. Bozulmayı önlemek için diseksiyondan sonra örneği mümkün olan en kısa sürede düzeltin.
NOT: Hayvan çalışmaları için sağlam, iltihapsız bağırsak bölümleri tercih edilir; membran, ışık ve mukozal organizasyonun bozulmadan kalmasına yardımcı olacaktır. - Aletleri numuneler ve siteler arasında% 70 etanol ile silerek temizleyin. Mukus ve bağırsak mimarisinin yanı sıra mikrobiyota farklı yerlerde önemli ölçüde değiştiği için tutarlı bağırsak konumlarını örneklemeye özen ederek bağırsak kesit / biyopsi yeri başına en az üç biyolojik çoğalır elde edin.
- Keskin ve temiz aletler kullanarak, görüntüleme için gnotobiyotik İsviçre Webster farelerinden bağırsak segmentlerini kesin. Numuneyi mümkün olduğunca rahatsız etmeyi en aza indirin ve görüntüleme alanını etkilememek için bölümleri kenarlarından idare edin. Bozulmayı önlemek için diseksiyondan sonra örneği mümkün olan en kısa sürede düzeltin.
2. Doku örneği fiksasyonu ve infiltrasyon
- Fiksasyon
- Aşağıdaki oranlarla uyumlu bir kapta taze metanonda hazırlayın: % 60 mutlak metanol,% 30 kloroform ve% 10 buzul asetik asit. Bu kimyasalların her birini duman kaputuna dağıtın. Kapağı kırarak havalandırılabilen bir kap seçin. Metakarn polistiren ile uyumlu olmadığı için, kloroform ve buzul asetik asit için cam dereceli silindirler / serolojik pipetler kullanarak polietilen bir kapta hazırlayın.
NOT: Karıştırma sırasında dumanlar üretilir ve kabın içinde basınç birikmesine neden olabilir. Numuneler aktif olarak eklenmezse, kabın duman davlumbazından çıkarıldıktan sonra nispeten sıkıca kapalı tutulması önerilir. Kloroform toksiktir; cildi soluma, yutma veya emmeyin. Metanol toksiktir ve oldukça yanıcıdır; cildi soluma, yutma veya emmeyin. Buzul asetik asit yanıcıdır ve cilt ve gözler için oldukça aşındırıcıdır. - Dağıttıktan sonra kabı kapatın, karıştırmak için döndürün ve sonra havalandırma; gaz çıkarma durana kadar (ve basınç artık kapağın altında kayda değer bir şekilde birikmeyin) bunu tekrarlayın.
NOT: Metakarın drenajlara atmayın; kurumsal yönergelere göre tehlikeli kimyasal atıkları toplamak ve bertaraf etmek. Histoloji kasetlerini etiketlemek için bir kalem kullanın, çünkü metakarn çözeltisinde birçok kalem mürekkede çıkacaktır. - Bağırsak bölümlerini, dokunun bir kenarını cımbızla hassas bir şekilde tutarak histoloji kasetlerine yerleştirin. Kaseti kapatın ve taze metakarn çözeltisi ile tamamen batırın. Kasetlerin batırılmasından sonra çözeltinin birkaç saatten eski olmadığından emin olun.
- Duman kaputuna erişimi olmayan bir klinik süitte toplanacak klinik örnekler için, histoloji kasetlerinin geçişine izin verecek kapağı kesilmiş bir polietilen saklama kabı kullanın. Zehirli dumanların kaçmasını önlemek için numuneleri geçirmediğinizde bu kapağı kapatın.
NOT: Tutkalın kabın üzerine dağılmasını önlemek için maskeleme bandı kullanmak önemlidir-bazı bant türleri (örneğin, plastik ambalaj bandı) metakarn dumanlarına iyi dayanamayabilir. - Örnekleri en az 3 saat ve en fazla iki hafta boyunca sabitle.
NOT: Daha kalın numuneler 3 saatten daha uzun sabitleme süreleri gerektirebilir. Farklı metakarn çözeltilerinde sabitlenmiş kasetler için eşzamanlı parafin infiltrasyon işlemesini etkinleştirmek için sabitleme süresi seçilebilir (örneğin, iki hafta boyunca toplanan ve sabitlenmiş numune gruplarına aynı anda parafin infiltrasyonunu gerçekleştirmek).
- Aşağıdaki oranlarla uyumlu bir kapta taze metanonda hazırlayın: % 60 mutlak metanol,% 30 kloroform ve% 10 buzul asetik asit. Bu kimyasalların her birini duman kaputuna dağıtın. Kapağı kırarak havalandırılabilen bir kap seçin. Metakarn polistiren ile uyumlu olmadığı için, kloroform ve buzul asetik asit için cam dereceli silindirler / serolojik pipetler kullanarak polietilen bir kapta hazırlayın.
- Parafin sızma ve gömme
- Parafin ısıya dayanıklı bir kaba yerleştirin ve gece boyunca 60 °C'de bir fırında eritin. Parafin peletleri erimeden önce daha fazla yer kapladıkça, tüm kasetleri kapsayacak kadar parafin eritilmesini sağlayın.
NOT: Sıcaklık, eserlere yol verebileceğinden 60 °C'den yüksek olmamalıdır. - Sıvıyı uygun atık hazneye dökerek ve hemen aşağıdaki kimyasallarla değiştirerek dokuyu yıkayın.
- Mutlak metanolde 30 dakika kuluçkaya yaslanın.
- Mutlak etanolde 20 dakika kuluçkaya yaslanın.
- 15 dakika boyunca ksilenlerde kuluçkaya yaslanın.
- Kasetlerin kurumasını önlemek için yıkamaları hızlı bir şekilde değiştirin. Her yıkamanın kabın veya kabın kasetlerini tamamen kapladığından emin olun.
NOT: Ksilenler yanıcıdır ve solunursa, buharlar merkezi sinir sistemini yüksek konsantrasyonlara maruz kaldıktan sonra potansiyel uzun vadeli nörolojik sonuçlarla depresif hale getirebilir (>200 ppm). Ksilenleri sadece duman kaputunun içinde işle. Ksilenler tehlikeli olduğundan, histolojik kasetleri örtmek için gereken minimum miktarı kullanmaya özenin.
- Gömme sırasında, nicel görüntüleme için daha potansiyel örnek alan sağlamak için kesitli çörekler yerine uzunlamasına, enine kesitler sağlamak için cımbız kullanarak bağırsak segmentlerini kasetin uzunluğuna paralel (dikin aksine) yönlendirin (Şekil 1B).
- Parafin doku segmentlerini kaybetmeden girmesini sağlamak için kasetleri hafifçe (~1-2 cm veya 0,5 inç) açın. Parmakların aşırı ısınmasını veya hafif yanmasını önlemek için bu adım veya cımbız için çift eldiven kullanın. Kasetleri eritilmiş parafin kabına batırın ve kapatın, kabı tekrar 60 ° C fırına yerleştirin. Kasetlerin parafinle dolu olduğundan ve büyük hava kabarcıklarının kalmadığından emin olun.
- 60 °C'de 2 saat kuluçkadan sonra kabı fırından çıkarın. Tokmakları kullanarak, kasetleri dikkatlice çıkarın ve soğutmak için bir alüminyum folyo parçasına ayrı ayrı koyun. Gömme ve bölümleme için hazır olana kadar oda sıcaklığında saklayın.
- Parafin bloklarını bir mikrotom ile bölümlendirerek, luminal içeriğin açığa çıkardığı bloğa yeterince derine kesilerek, ışık içeriğine ve mukusa ek olarak villi ve/veya mahzenlerin uzunlamasına bir bölümünü sağlar. Dışkı malzemesi bıçağı dokuya kıyasla hızla köreltirken bıçakları değiştirmeye özen edin. Görüntülerin optimum keskinliği için bölümleri 4 μm kalınlığa kesin. Bölümleri normal kaplamasız slaytlara aktarın.
- BALIK boyama için, güçlü bir FISH sinyali elde etmek için bağırsak bölümlerini mümkün olan en kısa sürede (yani kesitlerden sonraki birkaç hafta içinde) lekelendirin. BALIK lekesi atlanırsa, önemli sinyal kaybı olmadan daha az taze (yani aylar önce) numunelerde lektin + DAPI boyama yapılabilir.
- Parafin ısıya dayanıklı bir kaba yerleştirin ve gece boyunca 60 °C'de bir fırında eritin. Parafin peletleri erimeden önce daha fazla yer kapladıkça, tüm kasetleri kapsayacak kadar parafin eritilmesini sağlayın.
3. Lekeleme bakterileri ve konak özellikleri
- Hazırlık
- Fırını 60 °C'ye ısıtın. Boş bir Coplin kavanozunu ve kavanozdaki cam slaytları iki kez cam şişedeki ksilenlerle kaplayacak kadar hacim ısıtın, ksilenlerin buharlaşmasını önlemek için kapağın etrafında parafilm yapmaya özen gösterir. Ksilenlerin sıcaklığının 60 ° C'ye ulaşmasını izin verin.
NOT: Standart bir Coplin kavanozu 8 slayta uyar ve slaytlar kabaca 50 mL sıvı ile kaplanabilir (markaya bağlı olarak 40 ila 60 mL arasında değişebilir). Ksilen ikameleri daha az toksiktir ve diğer gruplar tarafından ağdayı azaltma adımı (adım 3.2) 8,9 için başarıyla kullanılmıştır. - Ayrı bir fırın varsa, bir hibridizasyon fırınunu 50 °C'ye önceden ısıtın. Aksi takdirde, bu adım 3.2.3 adımından sonra slaytları pişirmek için kullanılan fırınla gerçekleştirilebilir.
- FISH hibridizasyon çözümünü hazırlayın: 20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 0.9 M NaCl; 0.01%26 - 0.1%9 (w/v) sodyum dodecylsulfate (SDS) çekirdeksiz suda. Gerekirse% 5-50 (v/v) formamid ekleyin. Bu hibridizasyon çözeltisinin de-parafinizasyon sırasında 50 °C'de önceden ısıtın.
NOT: Formamide, teratojen görevi görür; eldiven ve gözlüklerle formamid kullanın. Küçük dozlarda ve gözlere, cilde veya mukoza zarlarına maruz kalınması üzerine rahatsız edicidir. Büyük miktarlarda, formamid buharı tıbbi müdahale gerektirebilir. Formamid %100 oranında -20 °C dondurucuda saklanabilir.
- Fırını 60 °C'ye ısıtın. Boş bir Coplin kavanozunu ve kavanozdaki cam slaytları iki kez cam şişedeki ksilenlerle kaplayacak kadar hacim ısıtın, ksilenlerin buharlaşmasını önlemek için kapağın etrafında parafilm yapmaya özen gösterir. Ksilenlerin sıcaklığının 60 ° C'ye ulaşmasını izin verin.
- Slaytları boyamaya hazırlama: deparaffinizasyon
- Slaytları Coplin kavanozuna yerleştirin, bölümlerin diğer slaytlarla veya kavanozla temas etmemesini sağlayın ve slaytları 60 °C'de 10 dakika pişirin.
- Duman kaputunda, Coplin kavanozunu fırından önceden ısıtılmış ksilenlerle doldurun, örneklerin üzerine doğrudan dökmemeye ve dokuları potansiyel olarak yerinden çıkarmamaya dikkat edin. Coplin kavanozu 60 °C fırına geri yerleştirin. Şişeyi kalan ksilenleri duman kaputunda bırakın.
- Kullanılmış ksilenleri bertaraf için uygun bir atık kabına dökün, cam slaytlardaki doku bölümlerini rahatsız etmemeye dikkat edin ve slaytların Coplin kavanozundan düşmesini önlemek için bir çift forseps kullanarak. Coplin kavanozunu kalan ksilenlerle doldurun ve duman kaputunda oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yaslayın.
- Bölümleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca% 99,5 etanolde kuluçkaya yatırın. Bu kuluçka adımından sonra, slaytları Coplin kavanozundan çıkarın, slaytların arkasını bir laboratuvar mendili veya kağıt havlu üzerinde silin ve etanol damlacıkları gidene kadar kısa bir süre havayla kurulayın.
NOT: Slaytların arkasını silmek, kurutma ilerlemesinin daha iyi görselleştirilmesini sağlar.
- BALIK ile bakteriyel boyama
- Her doku bölümünün alanını çevreleyerek sıvı genişleme alanını sınırlamak için bir sıvı engelleyici veya PAP kalemi kullanın. Mireksin bölümün kendisiyle temas etmediğine emin olun. Melezleme çözümü ile kaplanması gereken yüzey alanını en aza indirmek için dokuya temas etmeden her doku bölümüne mümkün olduğunca yakın bir daire oluşturun.
- Hibridizasyon çözümünü hazırlayın: önceden ısıtılmış her 50 μL hibridizasyon çözümü için 0,5 μg prob (örneğin, 1 μg/μL probun 0,5 μL'si) ekleyin. Hibridizasyon çözümünü slayttaki bölümlere pipetleyin (bölüme/daire boyutuna bağlı olarak~20 μL/kesit). Kuluçka adımları ve depolama sırasında hibridizasyon çözümünü ve slaytları bu noktadan itibaren ışıktan koruyun.
- Kullanılan sıvı hacminin esnek bir plastik kapak kapağı ile kaplama sırasında tüm bölümü kapladığından emin olun. Buharlaşmayı azaltmak için slaydı nemli bir odada kuluçkaya yatırın. Nem sağlamak için fazla hibridizasyon çözeltisi veya fosfat tamponlu salin (PBS) ile ıslatılmış altta mendil veya kağıt havlu içeren pipet ucu kutusu ile nemli bir oda oluşturun. Prob sete bağlı olarak bölümleri 45-50 °C'de >3 saat kuluçkaya yatırın.
- FISH yıkama tamponu ısıtın: 20 mM Tris-HCl, pH 7.4; Kuluçka döneminde 0,9 M NaCl ila 50 °C. Coplin kavanozundaki slaytları kaplayacak kadar yıkama tamponu hazırlayın.
- Plastik kapakları çıkarın; Her ikisi de önceden 50 °C'ye kadar ısıtılmış bir Coplin kavanozunda FISH yıkama tamponunda slaytları kuluçkaya yaslayın. Coplin kavanozu 10-20 dakika boyunca 50 °C fırına geri yerleştirin. Kalın numuneler için, tamponu ekleyerek ve dilimin bumasını önlemek için kapakları hafifçe yerinden çıkararak Coplin kavanozundaki kapakları çıkarın.
- Mukus ve ana bilgisayar özelliklerini boyama
- PBS'de genel bir DNA/mukus kontrtain hazırlayın: son 10 μg/mL DAPI + 40 μg/mL mukus lekesi UEA-1. Ek kapak uçları ile dokuya zarar vermemek için bir kapak parçasının yokluğunda lekeleri örtmek için yeterli karşıtlık hazırlayın.
NOT: Kapak parçasının yokluğunda lekelerin kaplanması, 3,3,2'de kullanılan 20 μL'den daha büyük hacimler gerektirecektir. Ortalama boyutlu bölümler (~10 mm çapında) için, bir noktayı kapsayacak şekilde 200 μL yeterlidir; bu birimi önceden sahte bir slaytta test edin. - FISH yıkama tamponu çıkarın ve Coplin kavanozunda PBS ile değiştirin. Coplin kavanozu PBS ile doldurduktan hemen sonra PBS'yi boşaltın.
- Pipet ucu ile dokuya dokunmamak için slaydı kavanozdan çıkarın ve kontrtain bölümün üstündeki pipeti çıkarın. Tüm bölümü bir kabarcıkla kapla. Karanlıkta 45 dakika boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatırın.
- Lekeleri taze PBS ile 3 kez hızlı bir şekilde yıkayın: slaytları cımbız kullanarak yerinde tutarken, PBS'yi bir lavaboya dökün ve hemen taze PBS ile doldurun.
- Slaytların arkasını bir mendile veya kağıt havluya karşı silerek, PBS'nin çoğunun pipet ucuna bağlı bir vakum hattı ile desteklenen bölümlerden buharlaşmasına izin verin. Bir kez daha pipet ucu olan bölüme dokunmaktan kaçının.
- Bölümleri bir montaj ortamı (DAPI olmadan) kullanarak monte edin ve cam kapaklarla kaplı oda sıcaklığına ayarlayın, kapak altlıklarının düz olmasını ve montaj ortamında hava kabarcıkları olmamasını sağlayın.
- Kapakların kenarlarını şeffaf oje ile boyayarak slayta yapıştırın, slaytın görüntüleme sırasında mikroskop slayt tutucusunda hizada oturmasını sağlamak için slaytın kenarından uzak durmaya özen göstererek.
- Floresan tükenmeden önce slaytları 4 °C'de karanlıkta birkaç hafta saklayın.
- PBS'de genel bir DNA/mukus kontrtain hazırlayın: son 10 μg/mL DAPI + 40 μg/mL mukus lekesi UEA-1. Ek kapak uçları ile dokuya zarar vermemek için bir kapak parçasının yokluğunda lekeleri örtmek için yeterli karşıtlık hazırlayın.
4. Görüntüleme ve görüntü analizi
- Lekeleri görselleştirme
- Mikrobiyota-konak arayüzünü görüntülemek için dokunun hem doku hem de lümen içeren bir alanını seçin. Mukus kalınlığının nicel görüntülemesi ve luminal biyogeografi için epitel villi ve/veya mahzen dilimlerinin kesitsel değil boyuna olduğu görüş alanlarını seçin. Eserlerin parçalanmaması için mukus ve epitel arasında büyük boşluklar olan alanlardan kaçının.
- Fish floresan sinyalinin foto-ağartılmasını önlemek için dapi sinyalini kullanarak dokuyu bulun ve odak düzlemini düzeltin.
- Görüntüleme ayarlarını yapın. Bakteriyel DAPI lekesini görselleştirmek için lazer gücünü artırın ve epitel hücrelerinden gelen DAPI sinyalinin aşırı doymamış veya "üflendiği" noktaya kadar kazanın.
NOT: Aşırı doymamış olmayın, çünkü bu, çekirdekte kurtarılamayan fotobleaching ve görsel eserlere yol açacaktır. - Diğer tüm kanallar için, arka planın üzerinde net bir sinyal sağlayacak minimum lazer gücü kullanın ve aşırı doymamaya dikkat edin.
NOT: Bu özellikle karo taramaları yaparken önemlidir, çünkü fayanslar arasındaki çakışma görüntülendiğinde fotobleaching sorunlu olacaktır. - Bireysel bakterileri görüntülemek için 40x veya daha yüksek büyütme kullanın.
- Görüntüleri alın.
- Lümen içindeki mikropların mukus kalınlığı ve mekansal dağılımı hakkında nicel veriler elde etmek için karo taramaları alın. Fayanslar arasında %15 çakışma sağlayın ve <1x yakınlaştırma ile şiddetlenebilecek vinyet/düzensiz aydınlatma olup olmadığını kontrol edin. Karo taraması kurarken, bulanık/odak dışı görüntüler analiz edilemediğinden, dokunun tüm karolarda odakta olup olmadığına çok dikkat edin (Şekil 3B).
- Mümkünse, tarama alanını döndürerek belirli bir epitel uzunluğunu görüntülemesi için gereken karo sayısını en aza indirin, böylece epitel ve mukus tabakası bir açıyla değil, karoya paralel olur. Aksi takdirde, benzer bir etki elde etmek için epitelimin görüntüleme alanına paralel veya dik bir bölümünü bulun.
Representative Results
Fare bağırsağındaki spesifik bağırsak kommensal bakterilerinin lokalizasyonunu araştırmak için, bireysel bakteriyel izolatlarla kolonize edilmiş mikropsuz İsviçre Webster fareleri kullanılmıştır. Bu deney için etiketlenen bakteri türleri i) Muribaculaceae familyasının insan İzolesi5, Muribaculum intestinale, murine mikrobiyota15'te bol ve yaygın bir bakteri ailesi ve ii) Genetik olarak çekişli ve yaygın bir bağırsak bakterisi olan Bakterioidler tetaiotaomin. İki haftalık dengeden sonra, fareler ötenaziye tabi edildi ve dışkı pelet içeren kolonun bir bölümü yeni hazırlanmış metakarna bölümlere ayırıldı ve sabitlendi. İki günlük fiksasyondan sonra, bölümler metanol, etanol ve ksilenler yoluyla işlenerek susuz bırakıldı, parafinle sızıldı, gömüldü ve daha sonra luminal 4 μm dilimlere bölümlere çıkarıldı. Bu örnekler daha sonra Muribaculum izolesi için özel bir FISH probu (3' Cy3 etiketli) ile boyandı, Oligominer yazılımı12 kullanılarak tasarlandı ve NuPACK ve mathFISH16,17 kullanılarak ikincil ve üçüncül yapı ve minimal spesifik olmayan bağlama için kontrol edildi. Örnekler ayrıca Rhodamine bağlı lektin UEA-1 (mukustaki fukosillenmiş glikanları lekeleyen) ve DAPI ile karşı konuldu. Lekeli bölümler 40x yağ hedefi ve süper çözünürlüklü modül kullanılarak görüntülenmiştir.
Şekil 1: Bağırsaktaki mikrobiyota-konak arabiriminin görselleştirilmesi iş akışı. (A) İşlem hattı için resimli bir iş akışı. (B) İki kesit düzlemi enine bölümler (bu işlem hattı için tercih edilir) veya kesitsel "halkalar" verir. (C) Çok farklı kalınlıklarda dokuların gömülmesi, sadece bir doku veya başka bir doku için en uygun dilimlere neden olabilir. Kısaltmalar: FISH = floresan in situ hibridizasyon; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Kolonun görüntülenmesi, muribaculum intestinale'nin gnotobiyotik fare modelinde mukusa göre lokalizasyonunu gösterir. Bölümler DAPI (mavi), Muribaculaceae FISH probu (kırmızı) ve UEA-1 (yeşil) ile boyandı. (A) Muribaculum intestinale ile mono-kolonize fare distal kolonu ve (B) Muribaculum intestinale ve Bacteroides tetaiotaomicron ile iki kolonize fare distal kolonu. Ölçek çubuğu = 20 μm. (C ve D) Cy3-FISH (solda), DAPI (ortada) ve (A) ve (B) ışıklı inset bölümleri için cy3-FISH + DAPI kanallarını birleştirir. Ölçek çubuğu = 5 μm. (A) ve (C) içinde, tüm bakteri şeklindeki ve bakteri boyutunda DAPI sinyalleri Cy3 (tek ok uçları) ile etiketlenir ve (B) ve (D) içinde, bu Cy3 ve DAPI çift pozitif hücrelere (tek ok uçları) ek olarak, mono ve çift kolonizasyon durumları için beklendiği gibi Cy3 negatif (çift ok uçları) olan DAPI lekeli bakteri hücreleri vardır. Daha uzun filamentli bakteriler hariç, daha büyük (>4 μm uzunluğunda) DAPI pozitif yapılar (kör oklar) bitki malzemesi veya konak hücrelerden çekirdeklerdir. Kısaltmalar: FISH = floresan in situ hibridizasyon; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Yaygın problemler. (A) Sığ kesitler bağırsağın ışık dilimlerini sağlamaz. (Sol) Epitelimin boyuna manzarasının yanı sıra lümenin bir görünümünü sağlayan bir derinlikte bölümlenmiş bir bağırsak segmenti. (Sağ) Çok sığ bir şekilde bölümlenmiş bir bağırsak segmenti, sadece mahzenlerin kesitlerini ve sürekli mukus tabakası veya bakterisini ortaya çıkarır. (B) Düzensiz doku/kapak kılıfı kapsama alanı bulanık ve düzensiz aydınlatılmış karo taramalarına neden olabilir. Odak dışında (sağ üst köşe) konumlarla bir kutucuk taraması kuruldu. (C) Normal arka plan (sol) ve yüksek arka plan (sağ) örneği. Bu örnekte, DAPI sinyali için çekirdeğin dışındaki epitelden gelen sinyali not edin. Tüm ölçek çubukları = 20 μm. Kısaltma: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Yukarıda açıklanan protokol, ana bilgisayar mikrobiyota arabirimini görselleştirmek için yeniden oluşturulebilir bir yöntem sağlar. Bu tahliller, FISH etiketleme18'in optimizasyonundan başlayarak mukus koruma ve görüntülemeye kadar protokol geliştirmeden önemli ölçüde yararlanmıştır9. Fiksasyon ve gömme de örneklerin yararlı depolanmasını sağlar; ayrıca, numuneler tamamen sabit ve hareketsiz olduğu için parafin sızmış kasetler herhangi bir kısıtlama olmadan postalanabilir.
Anlam ve alternatif yöntemler
FISH ve mukus boyama kombinasyonu, belirli doku yerlerinde mikrobiyota bileşiminin analizini ve bireysel bakteriler ile konak arasındaki etkileşimi sağlar. Mikrobiyota içindeki belirli bölgelerin analizini içeren alternatif teknikler genellikle bu etkileşimlerin tek hücreli doğasını keşfedemez, örneğin lazer yakalama mikrodisksiyonu durumunda sıralama19 ile birleştiğinde. Bununla birlikte, sıralama tabanlı teknikler, mikrobiyotanın genetik makyajını daha ince bir seviyede ve 16S rRNA problarından daha geniş bir şekilde yakalayabilme avantajına sahiptir.
Sunulan protokolün bir tuzak, ana bilgisayarla ilgili olarak mikrobiyotanın tek seferlik bir anlık görüntüsünü sağlamasıdır. Canlı hayvanlarda gerçek zamanlı görüntüleme için derin dokuda floresan sinyali alımını kolaylaştırmak için özel görüntüleme teknikleri gereklidir (örneğin, intravital iki foton mikroskopisi ve ışık tabakası floresan mikroskopi20,21). Bu yöntemlerde, model organizma ya zarflarına bağlanan moleküllerle lekelenmiş bakterilerle kolonize edilir20 ya da floresan proteinleri barındıran genetiği değiştirilmiş bakteriler21. İkinci durumda, floresan proteinlerin olgunlaşması önemli bir konudur, çünkü çoğu standart floresan protein ışık yaymak için oksijen gerektirir. Bu nedenle, aerobik zebra balığı gut21 gibi en az nanaerobik ortamlara (nanomolar oksijen konsantrasyonu) sahip model organizmalar gereklidir.
Bu protokolde metanol-Karnoy su içermediği için paraformaldehit veya formalin yerine fiksatif olarak kullanılmaktadır. Bu, işleme sırasında mukus tabakasının hidrasyonunu, dehidratasyonunu ve çökmesini önler ve mukus kalınlığının doğru ölçümlerini kolaylaştırır. Methakarn fiksasyonu ve parafin gömme alanında bir standart haline gelmişken, mukus korumasını optimize etmek için farklı fiksatifler ve gömme teknikleri araştırılmıştır9,22, bazı çalışmalar reçinelerin parafin gömmeden daha üstün olabileceğini gösterir22. Parafin gömme ve metakarn fiksasyonu için bir diğer önemli sınırlama, alternatif fiksatifler (örneğin, formalin veya paraformaldehit (PFA)) veya değiştirilmiş gömme teknikleri23 kullanılarak önlenebilen floresan protein floresan kaybıdır23. Her sabitleyicinin yararları ve dezavantajları vardır ve sabitleyicinin seçimi görüntüleme önceliklerine bağlıdır. Pfa ve metakarnda biyolojik çoğalmalar sabitlenirse ve her iki örnekten de görüntüler elde edilirse görüntüleme yöntemleri birleştirilebilir.
FISH, spesifik anti-Muc2C3 tavşan poliklonal antikorları ile izole edilmiş örneklerde immünofluoresans ile birleştirilmiştir9,24. Bu sonuçlar diğer Muc2 antikorları ile yaygın olarak çoğaltılamamıştır, bu da FISH-immünofluoresans kombinasyonunun başarısında antikor seçiminin kritik olabileceğini göstermektedir. Belirli bir antikor için başarılı antikor lekeleme koşulları BALIK lekelemenin tutulmasına izin vermeyebilir.
Sorun giderme
Bu protokolde, örnek toplama, bölümleme ve boyama, görüntüleme yapıtlarının oluşturulmasını önlemek için kritik adımları temsil eder. Örneğin, toplama sırasında ve gömülmeden önce dokuya basmak mikrobiyotanın yanlış hesaplanmasına yol açabilir ve mukus kalitesini etkileyebilir. Bir diğer önemli husus, ince bağırsağın nispeten boş bir parçası ve distal kolon içindeki bir pelet gibi çok farklı kalınlıklardaki parçaların tek bir kasette birleştirilmesinden kaçınmaktır. Farklı kalınlıklar görüntülemede zorluklara yol açar: gömmeden sonra, bir segment için belirli bir derinlikte enine kesitleme, diğeri için görüntüleme için yanlış derinlikte olabilir (örneğin, lümen her doku için farklı derinliklerde olacaktır) (Şekil 1B,C ve Şekil 3A). Ayrıca, hayvan modeli dışkı peletlerini görüntülemek için periton membranlarına sarılabilirler24. Bu teknikte, taze izole peritonun küçük bir bölümü dışkının etrafına hafifçe katlanır ve protokolde belirtilen yıkama adımları sırasında peletin yapısını korur.
Hayvan dokusunun içerikle işlenmesinin aksine, insan bağırsak örneklerinin görüntülenmesi bazı zorluklar ortaya koyuyor. Özellikle, luminal içerik ve mukozal astar muhtemelen kolonoskopi bağırsak hazırlığı genellikle bağırsak biyopsileri veya rezeksiyon işlemlerinden önce gerçekleştirilir. Ek olarak, biyopsiler toplandığında, bağırsak içeriğinin yokluğunda belirli özelliklerin (örneğin, lümen ve submucosa) tanımlanmasına yardımcı olmak için doku yönelimini not etmek yararlıdır. % 3 agar ve / veya agar: jelatin karışımları ile ön gömme doku polaritesini korumada yararlı olabilir25; bununla birlikte, literatürde bildirildiği gibi agarın susuz kalması ve bölümlenilmesi ile ilgili sorunlar vardır ve işlem sürelerinin değiştirilmesi gerekebilir.
İyi BALIK boyama elde etmenin önemli bir yönü, belirli FISH probları için formamid konsantrasyonu ayarlamaktan gelir. Formamide, FISH problarının hedeflerine melezleme sıkılığını kontrol edecektir. a) belirli bir topluluğu lekeleme için uygun formamid konsantrasyonu seçilmesini ve b) kullanılan prob kombinasyonu için uygun bir formamid konsantrasyonu bile mümkün olduğundan emin olmak önemlidir-bu, birden fazla prob kullanırken en uygun prob seçimini etkileyebilir. MathFISH (http://mathfish.cee.wisc.edu/) gibi web siteleri, belirli bir prob için uygun formamid konsantrasyonlarının hesaplanmasına yardımcı olabilir. Uygun formamid konsantrasyonları hakkında bilgi yokluğunda, bu protokol% 0 ve% 10 formamid ile test edilebilir.
Gömülü örneklerin bölümlere ayırılmak, bir bloğa çok sığ bir şekilde bölmek, parlak içeriği olmayan villi/mahzenlerin kesitsel görünümüne neden olacağından, bloğun parlak dilimler elde etmek için yeterli bir derinliğe kesilmesini gerektirir (Şekil 3A). En uygun FISH sinyali için kesitlemeden kısa bir süre sonra örnekleri lekelenin ve arka plan sorunlarını çözmek için taze DAPI (veya -20 °C'de depolanan DAPI) kullanın (Şekil 3C). Balik bir aydan daha eski olan bölümlerin lekelenerek daha zayıf/tutarsız lekeler oluşabilir.
Doku veya kapak kayması slayt açısından mükemmel bir şekilde düz değilse, örnek bir karo taraması (Şekil 3B) içindeki her pozisyonda odakta olmayabilir ve bu da boşa harcanan çabaya ve potansiyel fotobleachinge yol açabilir. Bu, tüm konumların odakta olduğu doğrulanan daha küçük döşeme taramaları alınarak çözülebilir. Donuk bıçaklarla kesitleme, görüntüleme sırasında geniş karanlık alanlar olarak görünen mukus ve ışık içeriğinin de kopmasını sağlayabilir. Son olarak, melezleme adımı sırasında çözeltinin veya kabarcıkların buharlaşması, dokudaki FISH problarının düzensiz lekelenmesine neden olabilir.
FISH prob bağlamasının verimliliğini etkileyen bir diğer kritik parametre de farklı problar arasındaki rekabettir. FISH probunun bakterileri etiketlediğini doğrulamak için yararlı bir kontrol, FISH probundan gelen sinyalin DAPI ile kolokalizasyonunu incelemektir (Şekil 2C, D). Birden fazla rRNA probunun kullanılmasını gerektiren örneklerde, hibridizasyon sıcaklığı, prob konsantrasyonu ve formamid gibi parametrelerin ayarlanması, probların doğru türlere verimli bir şekilde bağlanmasını sağlamak için kritik hale gelir18.
Görüntüleme hakkında notlar
BALIK lekeli bakteriler en iyi konfokal mikroskop ve en az 40 kat büyütme hedefi kullanılarak görselleştirilir. Bakterileri tek hücre seviyesinde görüntülemek için 63x büyütme tercih edilirken, dijital yakınlaştırmayı en üst düzeye çıkararak veya süper çözünürlüklü bir sistem kullanılarak 40x büyütme de kullanılabilir. Süper çözünürlük yeteneklerine sahip sistemler, bireysel bakteri hücrelerinin alt hücresel çözünürlüğünü de sağlayabilir. Genel bir bakteri lokalizasyonu ve mukus kalınlığı hissi elde etmek için daha düşük büyütme hedeflerinden yararlanılabilir.
8 bit görüntüler yerine 16 bit görüntüler elde etmek de şiddetle tavsiye edilir, çünkü daha yüksek dinamik aralık, epitelin son derece parlak çekirdeklerinden ve parlak bakterilerin nispeten zayıf sinyalinden DAPI sinyalinin geniş yelpazesini yakalamaya yardımcı olacaktır. Yukarıda açıklanan görüntüleme kurulumunu kullanmanın yanı sıra, önemli bir görüntüleme değerlendirmesi florofor seçimidir. Bakteri türleri arasında en iyi ayrım için, kullanılan floroforların ekscitasyon ve emisyon spektrumunda çakışmamasını sağlayın (doğrusal karıştırma yapma yeteneğine sahip bir sistemde görüntüleme olmadıkça). Ek olarak, problar ek topluluk üyelerini tanımlamak için birlikte kullanılabilir (örneğin, aileye özgü bir prob ve cinse özgü bir probun kombinasyonu). Doğrusal karıştırmayan veya doğrulanmamış problar kullanıyorsanız, saf kültürler üzerinde FISH boyamanın doğruluğunu ve seviyesini test etmek önemlidir8,14.
Görüntüler toplandıktan sonra, ana bilgisayar mikrobiyota arabiriminin nicel analizi için BacSpace26, HiPR-FISH8 ve diğer segmentasyon araçları27 gibi birden fazla araç kullanılabilir. BacSpace, doku ve ışık bileşenlerinin segmentasyonuna ve bitki materyalinin görüntülerden uzaklaştırılmasına izin veren bir MATLAB yazılımıdır26. Program ayrıca mukus kalınlığının 2D olarak analiz edilmesini ve farklı kanallardaki piksel mesafelerine göre mekansal dağılımın nicelleştirilmesini sağlar26. Tersine, HiPR-FISH Görüntü Analizi yazılımı FISH lekeli hücrelerin segmentasyonuna izin verir8. Son olarak, in vitro deneyler için optimize edilmiş diğer bakteri segmentasyon araçları27 de bu uygulamaya uyarlanabilir.
Son
Yerinde görüntüleme, diğer topluluk üyeleri ve diyet, mukus ve konak epitel mahzenleri tarafından oluşturulan çeşitli mikroçevreler bağlamında bireysel mikrobiyal taksonların nicel analizini sağlar. Organizmalar arasındaki etkileşim, konakla ilişkili mikrobiyal sistemlerin biyolojisini belirler ve pertürbasyon sırasında bu yapılardaki değişimin sağlık için etkileri olan temel bir analizini sağlar. Özellikle, yukarıda açıklanan protokol aracılığıyla mikrobiyotayı yerinde görüntüleyebilme yeteneği, hayvan konağı ile ilgili olarak mikrobiyotanın biyogeografisine inanılmaz bir pencere sağlar.
Disclosures
Yazarların çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Yazarlar paha biçilmez teknik geliştirme için Dr. Kristen Earle'e, sorun giderme yardımı için Amber Hann'a, makalenin eleştirel incelemesi için Dr. Jen Nguyen ve Deanna Pepin'e ve mikroskop erişimi sağladıkları için British Columbia Üniversitesi'ndeki Dr. Hesham Soliman ve Rossi laboratuvarına teşekkür etmek istiyor. Yazarlar CIHR Team Grant: Canadian Microbiome Initiative 2 (C.T.), Crohn's ve Colitis Canada'dan (C.T.'ye) destek kabul ediyorlar. ve K.M.N.), CIFAR (C.T. ve K.M.N.'ye), Michael Smith Sağlık Araştırma Bursiyeri Ödülü (C.T.'ye), Weston Vakfı: Weston Aile Mikrobiyom Girişimi (C.T.'ye), Paul Allen Seçkin Araştırmacı Ödülü (C.T.'ye).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum foil | |||
| Chloroform | Fisher | C298-500 | Toxic |
| Coplin jar | Fisher | 08-813E | |
| Cover glass, 22 × 22 mm, no #1 | VWR | CA48366-227-1 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Resuspended to 5 mg/mL |
| Empty pipette tip box(es) | To melt paraffin | ||
| Ethanol, anhydrous, molecular grade | -- | -- | |
| FISH probes | |||
| FISH hybridization solution | -- | -- | 20 mM Tris–HCl pH 7.4, 0.9 M NaCl, 0.01% (w/v) SDS in nuclease-free water. Optional addition of 5–50% (v/v) formamide |
| FISH washing buffer | -- | -- | 20 mM Tris–HCl pH 7.4, 0.9 M NaCl |
| Fluorescently-labeled Ulex Europaeus Agglutinin (UEA-1) lectin | Vector Laboratories | FL-1061 (Fluorescein-labeled) or RL-1062-2 (Rhodamine-labeled) | UEA-1 labels fucosylated glycans, so it is not appropriate for germ-free mice or for samples from fucosyltransferase 2 (FUT2)-deficient hosts. |
| Forceps | |||
| Formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | |
| Fumehood | |||
| Glacial Acetic Acid | Fisher | A38-212 | Corrosive and flammable |
| HybriSlip flexible plastic cover slips, 22 x 22 mm × 0.25 mm | Sigma Aldrich | GBL722222 | for FISH hybridization steps, can substitute glass coverslips |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Kimwipes | |||
| Methanol | Fisher | A412 | Toxic and flammable |
| Microtome | for sectioning | ||
| Multipurpose Specimen Storage Containers, 473 mL | Fisher | 14-955-117A | Can substitute with a glass or polyethylene container of your choice. Methacarn is not compatible with polystyrene or metal. |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | Any nail polish should work |
| Oven | Necessary range: 45-60 °C | ||
| Paraffin: Leica Paraplast | Leica | 39601006 | |
| PBS, Phosphate-buffered Saline (10x solution) | Fisher | BP3991 | Dilute to 1x for protocol |
| Sodium chloride | Fisher | S271 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), 20% Solution, RNase-free | Invitrogen | AM9820 | |
| Tissue-Loc HistoScreen Cassettes | Thermo Scientific | CA83009-999 | |
| Trizma hydrochloride solution, 1M Tris-HCl, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2663-1L | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Water, nuclease-free | Fisher | BP2484100 | |
| Xylenes | Fisher | X3P-1GAL | Toxic and flammable |
References
- Tropini, C., Earle, K. A., Huang, K. C., Sonnenburg, J. L. The gut microbiome: connecting spatial organization to function. Cell Host and Microbe. 21 (4), 433-442 (2017).
- Hansson, G. C., Johansson, M. E. V. The inner of the two Muc2 mucin-dependent mucus layers in colon is devoid of bacteria. Gut Microbes. 1 (1), 51-54 (2010).
- Johansson, M. E. V., et al. Normalization of host intestinal mucus layers requires long-term microbial colonization. Cell Host and Microbe. 18 (5), 582-592 (2015).
- Jakobsson, H. E., et al. The composition of the gut microbiota shapes the colon mucus barrier. EMBO Reports. 16 (2), 164-177 (2015).
- Tropini, C., et al. Transient osmotic perturbation causes long-term alteration to the aut microbiota. Cell. 173 (7), 1742-1754 (2018).
- Desai, M. S., et al. A dietary fiber-deprived gut microbiota degrades the colonic mucus barrier and enhances pathogen susceptibility. Cell. 167 (5), 1339-1353 (2016).
- Ng, K. M., et al. Recovery of the gut microbiota after antibiotics depends on host diet, community context, and environmental reservoirs. Cell Host and Microbe. 26 (5), 650-665 (2019).
- Shi, H., et al. Highly multiplexed spatial mapping of microbial communities. Nature. 588 (7839), 676-681 (2020).
- Johansson, M. E. V., Hansson, G. C. Preservation of mucus in histological sections, immunostaining of mucins in fixed tissue, and localization of bacteria with FISH. Methods in Molecular Biology. 842, 229-235 (2012).
- Greuter, D., Loy, A., Horn, M., Rattei, T. ProbeBase-an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes and primers: New features 2016. Nucleic Acids Research. 44 (1), 586-589 (2016).
- Quast, C., et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: Improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Research. 41 (1), 590-596 (2013).
- Beliveau, B. J., et al. OligoMiner provides a rapid, flexible environment for the design of genome-scale oligonucleotide in situ hybridization probes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2183-2192 (2018).
- Madeira, F., et al. The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019. Nucleic Acids Research. 47 (1), 636-641 (2019).
- Welch, J. L. M., Hasegawa, Y., McNulty, N. P., Gordon, J. I., Borisy, G. G. Spatial organization of a model 15-member human gut microbiota established in gnotobiotic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (43), 9105-9114 (2017).
- Lagkouvardos, I., et al. Sequence and cultivation study of Muribaculaceae reveals novel species, host preference, and functional potential of this yet undescribed family. Microbiome. 7 (1), 28 (2019).
- Zadeh, J. N., et al. NUPACK: Analysis and design of nucleic acid systems. Journal of Computational Chemistry. 32 (1), 170-173 (2011).
- Yilmaz, L. S., Parnerkar, S., Noguera, D. R. MathFISH, a web tool that uses thermodynamics-based mathematical models for in silico evaluation of oligonucleotide probes for fluorescence in situ hybridization. Applied and Environmental Microbiology. 77 (3), 1118-1122 (2011).
- Huber, D., Voith von Voithenberg, L., Kaigala, G. V. Fluorescence in situ hybridization (FISH): History, limitations and what to expect from micro-scale FISH. Micro and Nano Engineering. 1, 15-24 (2018).
- Wang, Y., et al. Laser capture microdissection and metagenomic analysis of intact mucosa-associated microbial communities of human colon. Applied Microbiology and Biotechnology. 88 (6), 1333-1342 (2010).
- Geva-Zatorsky, N., et al. In vivo imaging and tracking of host–microbiota interactions via metabolic labeling of gut anaerobic bacteria. Nature medicine. 21 (9), 1091-1100 (2015).
- Jemielita, M., et al. Spatial and temporal features of the growth of a bacterial species colonizing the zebrafish gut. mBio. 5 (6), 01751 (2014).
- Hasegawa, Y., Mark Welch, J. L., Rossetti, B. J., Borisy, G. G. Preservation of three-dimensional spatial structure in the gut microbiome. PLoS ONE. 12 (11), 0188257 (2017).
- Zhanmu, O., et al. Maintenance of fluorescence during paraffin embedding of fluorescent protein-labeled specimens. Frontiers in Neuroscience. 13, 752 (2019).
- Bergstrom, K., et al. Proximal colon-derived O-glycosylated mucus encapsulates and modulates the microbiota. Science. 370 (6515), 467-472 (2020).
- Jones, M. V., Calabresi, P. A. Agar-gelatin for embedding tissues prior to paraffin processing. BioTechniques. 42 (5), 569-570 (2007).
- Earle, K. A., et al. Quantitative imaging of gut microbiota spatial organization. Cell Host and Microbe. 18 (4), 478-488 (2015).
- Jeckel, H., Drescher, K. Advances and opportunities in image analysis of bacterial cells and communities. FEMS Microbiology Reviews. , (2020).
