Summary
이 간소화된 프로토콜은 조직을 고정하는 것에서부터 시투 혼성화에서 형광을 함유한 미생물을 염색하는 것까지 복잡한 조직 샘플에서 박테리아를 감지하고 이미지화하는 워크플로우를 자세히 설명합니다.
Abstract
생체 내 미생물의 국소화를 측정하는 것은 미생물과 척추 동물 장 사이의 기능적 관계를 밝히는 데 필수적인 단계입니다. 창자 microbiota의 공간 풍경은 물리적 인 기능 (장 점액, 토굴 및 주름)에 의해 엄격하게 제어되며 pH, 산소 가용성 및 면역 요인과 같은 호스트 제어 특성의 영향을받습니다. 이러한 속성은 창 자를 안정적으로 식민지화 하는 commensal 미생물및 병원 체의 능력을 제한. 미크로네 규모에서 미생물 조직은 미생물과 숙주 간의 상호 작용뿐만 아니라 다른 미생물 간의 근거리 상호 작용을 결정합니다. 이러한 상호 작용은 대규모 장기 기능 및 호스트 건강에 영향을 미칩니다.
이 프로토콜은 세포 간 거리에서 장기 전체 스케일에 이르는 장내 미생물군도 공간 조직을 시각화할 수 있게 한다. 이 방법은 장 구조 및 점액 특성을 보존하면서 창자 조직을 고정하는 것을 기반으로합니다. 고정 된 샘플은 그 때 내장, 단면 및 시상 혼성화 (FISH)에서 형광을 통해 특정 세균종을 강조하기 위하여 염색됩니다. 점액 및 숙주 세포 구성 요소와 같은 호스트 특징은 형광으로 표시된 렉틴으로 표시됩니다. 마지막으로, 스테인드 섹션은 높은 배율에서 타일 스캔 이미징을 활용하여 미크로네를 센티미터 길이 로 연결하는 공초점 현미경을 사용하여 이미지화됩니다. 화상 진찰의 이 모형은 건강과 질병에 있는 창자에 있는 microbiota의 생물지리학을 결정하기 위하여 인간 적인 조직에서 동물 모형 및 생검에서 장 단면도에 적용될 수 있습니다.
Introduction
미생물 시각화 기술은 17세기에 안토니 반 류웬후크가 현미경을 사용하여 치아 플라크와 대변에서 박테리아("동물분"이라고 함)를 관찰했을 때 미생물학 자체만큼 오래된 기원을 가지고 있습니다. 그 이후로, 호스트-microbiota1과 연관된 살아있는 박테리아, 곰팡이 및 바이러스의 컨소시엄의 공간 조직을 시각화하기 위하여 수많은 기술이 개발되었습니다. 이러한 미생물의 국소화를 해명하는 것은 동물 호스트 내에서 자신의 기능을 결정하는 데 필수적입니다. 박테리아의 생체 학은 특정 위치 (예를 들어, 상피), 영양 기판 및 특정 미생물이 종 간 및 왕국 간 상호 작용의 근간 대사 산물의 세균 생산을 지시 할 수 있기 때문에, 모두 성공과 병원성 taxa에서 중요하다.
구강, 장, 폐와 같은 여러 이질성 신체 부위의 박테리아와 숙주 조직을 분리하는 주요 구조는 점액입니다 - 둘 다 숙주 상피 세포에 미생물 전좌를 방지하고 microbiota2,3,4에 대한 영양 자원역할을 호스트 생산 층 . 이 장벽의 위반과 변화를 특성화하는 것이 중요한 중요하며, 단독으로 5,6,7을 시퀀싱하여 얻을 수 없는 호스트-microbiota 상호 작용에 대한 기계적 통찰력으로 이어집니다. 예를 들어, 이미징은 항생제 노출이 점액 층 및 microbiota 조직7,8을 방해할 수 있다는 발견을 가능하게 했으며, 완하제가 점액을 고갈시킬 수 있으며 면역 매개 변수5의 큰 변화와 상관 관계가 있습니다.
이 프로토콜은 요한슨과 한손9의 작업에 내장 된 미생물 및 숙주 조직 (그림 1)을 고정, 염색 및 이미징하기위한 일반적인 프레임 워크를 간략하게 설명합니다. 이 프로토콜은 장 섹션의 맥락에서 모델링되지만 다른 조직 유형에 쉽게 적응 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 실험동물 또는 인간 임상 샘플의 처리를 가능하게 한다. 두 가지 유형의 샘플을 처리하기 위한 메모가 포함되어 있습니다. 여기에 제시된 예에서, 호스트 상피 및 발광 박테리아는 동시에 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 염색, 플루오레세인 (FITC)-공주 렉틴, 울렉스 유로파 아글루틴 I (UEA-1), 및 특정 세균성 생선을 사용하여 점액으로 표시되었습니다. FISH 프로브는 일반적으로 높은 복사 성적 증명서를 결합에서 높은 신호를 보장하기 위해 분류의 16S rRNA 유전자에 대해 설계되었습니다.
이 예에서, 프로브는 Muribaculaceae 세균 성 가족의 16S rRNA를 표적으로 한다(도 2). 그러나, 얼룩은 적절한 생물학적 질문을 수용하기 위해 다른 FISH 프로브 및/또는 렉틴으로 쉽게 대체됩니다. 이전에 검증된 FISH 프로브는 rRNA 표적 올리고뉴클레오티드 프로브를 위한 온라인 리소스인 ProbeBase10 또는 리보소말 RNA 데이터베이스인 SILVA11에서 찾을 수 있습니다. 새로운 프로브의 설계를 위해 독자는 HiPR-FISH8 또는 Oligominer12와 같은 새로운 파이프라인을 참조할 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하여 장 루멘에서 박테리아의 밀폐 포장과 소화관 전체에 걸쳐 장 점액의 다양한 특징을 관찰 할 수 있습니다. 여기에 설명된 워크플로우를 통해 호스트 환경의 공간 컨텍스트에서 미생물을 정량적 분석할 수 있습니다.
Protocol
이 프로토콜에 설명된 모든 동물 실험 및 조직 수집은 캐나다 동물 관리 위원회(CCAC) 지침에 따라 수행되었으며 브리티시 컬럼비아 대학의 동물 관리 위원회의 승인을 받았습니다. 세균이 없는 스위스 웹스터 마우스가 사용되었습니다. 모든 동물은 8-10 주 나이, 남녀 모두 사용 되었고, 모든 쥐는 케이지 당 적어도 2 마리의 마우스와 함께 공동 수용 되었다. 동물은 이차 자궁 경부 탈구 또는 심장 천자를 가진 이산화탄소를 사용하여 안락사되었습니다.
1. 이미징 실험 설계: 고려 사항 및 샘플 수집
- FISH 프로브 설계
- 적절한 FISH 프로브가 있는 경우 배경에 비해 레이블이 부착된 셀에 강한 신호를 표시하는 기존 게시된 프로브를 선택합니다.
- 시험관 내의 새로운 프로브를 검증하여 대상 박테리아의 고정 된 샘플에 결합하고 다른 박테리아에 결합하는 오프 타겟에 결합하는 효율성을 결정합니다.
- 대상 유기체로부터의 16S 서열 또는 샘플로부터의 16S rRNA 시퀀싱에 대해 모두 사용되는 모든 16S FISH 프로브를 확인하여 양성 일치의 예상 비율이 존재하고 프로브가 다른 미생물 군수에 비특이적으로 결합하지 않도록 분석한다.
- Clustal Omega13과 같은 도구를 사용하여 FISH 프로브를 전체 길이 서열 또는 앰플리시온 서열 변형에 맞게 정렬하여 프로브와 대상의 잠재적 인 결합을 평가합니다.
- 실리코 테스트 외에도 순수한 배양에 대한 검증되지 않은 프로브의 정확성과 물고기 염색 수준을 테스트합니다8,14.
참고: 여러 커뮤니티 구성원을 염색할 때, 사용되는 형광이 흥분 및 방출 스펙트럼에서 겹치지 않는 경우(예: 가족별 프로브와 속별 프로브의 조합)를 조합하여 사용할 수 있습니다(선형 혼합 해제를 수행할 수 있는 시스템을 이미징하지 않는 한). 또한 특이성 제어/스크램블 프로브를 포함하거나 비형광 프로브와의 경쟁에 의해 특이성이 입증될 수 있다.
- 샘플 유형 및 조직 수집
- 선명하고 깨끗한 도구를 사용하여 이미징을 위해 gnotobiotic 스위스 웹스터 마우스에서 장 세그먼트를 잘라냅니다. 샘플을 가능한 한 많이 방해최소화하고 가장자리별로 섹션을 처리하여 이미징 영역에 영향을 주지 않도록 합니다. 분해를 방지하기 위해 해부 후 가능한 한 빨리 샘플을 수정합니다.
참고: 동물 연구의 경우, 그대로, 플러시되지 않은 장 섹션이 바람직하다; 멤브레인은 발광 및 점막 조직을 그대로 유지하는 데 도움이됩니다. - 샘플과 사이트 사이에 70% 에탄올로 닦아 공구를 청소하십시오. 점액 및 장 아키텍처뿐만 아니라 미생물이 다른 위치에서 현저하게 변화함에 따라 장 내 섹션 /생검 위치 당 적어도 3 개의 생물학적 복제를 얻을 수 있습니다.
- 선명하고 깨끗한 도구를 사용하여 이미징을 위해 gnotobiotic 스위스 웹스터 마우스에서 장 세그먼트를 잘라냅니다. 샘플을 가능한 한 많이 방해최소화하고 가장자리별로 섹션을 처리하여 이미징 영역에 영향을 주지 않도록 합니다. 분해를 방지하기 위해 해부 후 가능한 한 빨리 샘플을 수정합니다.
2. 조직 샘플 고정 및 침투
- 고정
- 60% 절대 메탄올, 30% 클로로폼, 10% 빙하 아세트산 등 호환 되는 용기에 신선한 메타칸을 준비합니다. 연기 후드에 이러한 화학 물질의 각각을 분배. 뚜껑을 열어 환기할 수 있는 용기를 선택합니다. 메타카른은 폴리스티렌과 호환되지 않기 때문에, 클로로폼과 빙하 아세트산을 위해 유리 졸업 실린더 / 세로지스틱 파이프를 사용하여 폴리에틸렌 용기에서 준비하십시오.
참고: 혼합 하는 동안, 연기 생산 되 고 용기 안에 구축 압력을 일으킬 수 있습니다. 샘플이 적극적으로 첨가되지 않는 경우 연기 후드에서 제거한 후 용기를 비교적 단단히 닫는 것이 좋습니다. 클로로폼은 독성이 있습니다. 피부를 흡입하거나 삼키거나 흡수하지 마십시오. 메탄올은 독성이 높고 인화성이 높습니다. 피부를 흡입하거나 삼키거나 흡수하지 마십시오. 빙하 아세트산은 인화성이며 피부와 눈에 부식성이 높습니다. - 디스펜싱 후, 용기를 닫고, 소용돌이를 섞은 다음 환기하십시오. 오프 가스가 멈출 때까지 반복하십시오 (그리고 압력은 더 이상 뚜껑 아래에 현저하게 증가하지 않습니다).
참고 : 배수구에서 메타칸을 처분하지 마십시오. 기관 지침에 따라 유해 화학 폐기물을 수거하고 폐기합니다. 많은 펜 잉크가 메타칸 용액에서 벗겨지므로 연약카세트에 라벨을 붙이세요. - 핀셋으로 조직의 가장자리를 섬세하게 잡고 조직학 카세트에 장 섹션을 배치합니다. 카세트를 닫고 신선한 메타칸 용액에 완전히 담가 두세요. 카세트가 침수될 때 솔루션이 몇 시간 이상 오래되지 않았는지 확인합니다.
- 연기 후드에 접근하지 않고 임상 스위트에서 수집될 임상 샘플의 경우, 연골 카세트의 통과를 허용하는 뚜껑으로 플랩이 자른 폴리에틸렌 저장 용기를 사용하십시오. 독성 연기의 이스케이프를 방지하기 위해 샘플을 통과하지 않을 때이 플랩이 닫혀 테이프.
참고: 마스킹 테이프를 사용하여 용기에 접착제가 용해되는 것을 방지하는 것이 중요합니다- 일부 유형의 테이프(예: 플라스틱 포장 테이프)는 메타칸 연기를 잘 유지하지 못할 수 있습니다. - 최소 3시간 및 최대 2주 동안 샘플을 수정합니다.
참고: 두꺼운 샘플은 3시간 이상 고정 시간이 필요할 수 있습니다. 고정 시간은 다른 메타칸 솔루션에 고정된 카세트에 대한 동시 파라핀 침투 처리를 가능하게 하도록 선택될 수 있다(예를 들어, 2주 동안 수집및 고정된 샘플 그룹에 파라핀 침투를 동시에 수행).
- 60% 절대 메탄올, 30% 클로로폼, 10% 빙하 아세트산 등 호환 되는 용기에 신선한 메타칸을 준비합니다. 연기 후드에 이러한 화학 물질의 각각을 분배. 뚜껑을 열어 환기할 수 있는 용기를 선택합니다. 메타카른은 폴리스티렌과 호환되지 않기 때문에, 클로로폼과 빙하 아세트산을 위해 유리 졸업 실린더 / 세로지스틱 파이프를 사용하여 폴리에틸렌 용기에서 준비하십시오.
- 파라핀 침투 및 포함
- 파라핀을 내열 용기에 넣고 하룻밤 사이에 60°C의 오븐에서 녹입니다. 파라핀 펠릿이 녹기 전에 더 많은 공간을 차지하므로 모든 카세트를 덮기 위해 충분한 파라핀이 녹아 있는지 확인하십시오.
참고: 아티팩트를 발생시킬 수 있으므로 온도가 60°C 이상이어야 합니다. - 적절한 폐기물 리셉터클에 액체를 붓고 다음 화학 물질로 즉시 교체하여 조직을 세척하십시오.
- 절대 메탄올에서 30분 동안 배양하십시오.
- 절대 에탄올에서 20분 동안 배양하십시오.
- 15분 동안 자일렌으로 배양하십시오.
- 카세트를 건조시키지 않도록 주의하여 세서스를 빠르게 교환하십시오. 각 세척이 비커 또는 용기의 카세트를 완전히 덮는지 확인합니다.
참고: Xylenes는 인화성이며 흡입하면 고농도 (>200 ppm)에 노출되면 잠재적 인 장기 신경 학적 결과로 중추 신경계를 우울하게 할 수 있습니다. 연기 후드 내에서만 자일렌을 처리하십시오. 자일렌은 위험하므로 조직학적 카세트를 커버하는 데 필요한 최소 금액을 사용하십시오.
- 포함 하는 동안, 내장 세그먼트카세트의 길이에 평행 (똑바로 반대) 정량적 이미징에 대 한 더 많은 잠재적인 샘플 영역을 제공 하기 위해 단면 도넛 대신 세로, 횡단 섹션을 제공 하는 핀셋을 사용 하 여 (똑바로 반대)
- 카세트(~1-2cm 또는 0.5인치)를 약간 열어 파라핀이 조직 세그먼트를 잃지 않고 들어갈 수 있도록 합니다. 손가락의 과열 또는 가벼운 연소를 방지하기 위해이 단계 또는 핀셋에 이중 장갑을 사용합니다. 녹은 파라핀 용기에 카세트를 잠수하고 닫고 용기를 60°C 오븐에 다시 넣습니다. 카세트가 파라핀으로 채워지고 큰 기포가 남아 있지 않도록 하십시오.
- 60 °C에서 2 시간 동안 인큐베이션 후 오븐에서 용기를 제거하십시오. 집게를 사용하여 카세트를 조심스럽게 제거하고 냉각하기 위해 알루미늄 호일 조각에 개별적으로 놓습니다. 포함 및 단면에 대한 준비가 될 때까지 실온에서 보관하십시오.
- 미세 절름발이를 사용하여 파라핀 블록을 절제하여 발광 내용이 노출되는 블록깊숙이 충분히 깊게 분리하여 발광 내용 및 점액 외에도 비리 및/또는 토굴의 세로 섹션을 가능하게 합니다. 대변 물질이 조직에 비해 블레이드를 빠르게 무디게하기 때문에 블레이드를 교체하십시오. 면부분을 두께4μm로 잘라 이미지의 최적의 선명도를 제공합니다. 섹션을 코팅되지 않은 일반 슬라이드로 전송합니다.
- FISH 염색의 경우, 강한 FISH 신호를 달성하기 위해 가능한 한 빨리 장 섹션을 얼룩지게합니다 (즉, 단면의 몇 주 이내에). FISH 염색을 생략하는 경우, 렉틴 + DAPI 염색은 신호의 상당한 손실없이 덜 신선한 (즉, 개월 된) 샘플에서 수행 할 수 있습니다.
- 파라핀을 내열 용기에 넣고 하룻밤 사이에 60°C의 오븐에서 녹입니다. 파라핀 펠릿이 녹기 전에 더 많은 공간을 차지하므로 모든 카세트를 덮기 위해 충분한 파라핀이 녹아 있는지 확인하십시오.
3. 박테리아 염색 및 호스트 기능
- 준비
- 오븐을 60°C로 가열합니다. 빈 코플린 항아리와 유리 병에 자일렌으로 항아리의 유리 슬라이드를 두 번 덮을 만큼 충분한 부피를 미리 데우고, 자일렌의 증발을 방지하기 위해 뚜껑 주변의 파라필름을 주의하십시오. xylenes의 온도가 60 °C에 도달하도록 허용합니다.
참고: 표준 코플린 항아리는 8개의 슬라이드에 적합하며 슬라이드는 약 50mL의 액체로 덮을 수 있습니다(브랜드에 따라 40~60mL 정도 다를 수 있음). 자일렌 대체품은 독성이 적고 다른 그룹에서 왁싱 해제 단계(단계 3.2)8,9에 성공적으로 사용되어 왔다. - 별도의 오븐을 사용할 수 있는 경우 혼성화 오븐을 50°C로 미리 데워보시면 미리 데워보실 수 있습니다. 그렇지 않으면, 이 단계는 3.2.3 단계 후에 슬라이드를 굽는 데 사용되는 것과 동일한 오븐으로 수행될 수 있다.
- FISH 혼성화 솔루션 준비: 20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 0.9 M NaCl; 0.01%26 - 0.1%9 (w/v) 나트륨 도데킬술페이트(SDS)가 뉴클레아제없는 물에서. 필요한 경우 5-50%(v/v) 폼아미드를 추가합니다. 이 혼성화 용액을 50°C에서 미리 따뜻하게 하여 파라피화 시.
참고: 포르마미드는 테라토겐 역할을 하는 아미드입니다. 장갑과 고글을 곁들인 폼아미드를 처리합니다. 소량으로 눈, 피부 또는 점막에 노출되면 자극적입니다. 다량에서, 포르마이드 증기는 의학적 개입을 요구할 수 있다. 포르마미드는 -20°C 냉동고에 100%로 보관할 수 있다.
- 오븐을 60°C로 가열합니다. 빈 코플린 항아리와 유리 병에 자일렌으로 항아리의 유리 슬라이드를 두 번 덮을 만큼 충분한 부피를 미리 데우고, 자일렌의 증발을 방지하기 위해 뚜껑 주변의 파라필름을 주의하십시오. xylenes의 온도가 60 °C에 도달하도록 허용합니다.
- 염색을 위한 슬라이드 준비: 분리
- 코플린 항아리에 슬라이드를 배치하여 섹션이 다른 슬라이드 또는 항아리와 접촉하지 않도록하고 슬라이드를 10 분 동안 60 °C에서 굽습니다.
- 연기 후드에서 코플린 항아리를 오븐에서 미리 데워진 자일렌으로 채우고, 샘플 위에 직접 붓지 않고 조직을 빠져나가지 않도록 주의하십시오. 코플린 항아리를 60°C 오븐에 다시 놓습니다. 연기를 후드에 나머지 자일렌과 병을 둡니다.
- 사용된 자일렌을 적절한 폐기물 용기에 붓고, 유리 슬라이드의 조직 섹션을 방해하지 않도록 주의하고, 한 쌍의 집게를 사용하여 슬라이드가 코플린 항아리에서 떨어지는 것을 막습니다. 코플린 항아리에 남은 자일렌을 보충하고 연기 후드의 실온에서 10 분 동안 배양하십시오.
- 실온에서 5 분 동안 99.5 %의 에탄올로 섹션을 배양하십시오. 이 인큐베이션 단계 후, 코플린 항아리에서 슬라이드를 제거하고, 실험실 닦아 또는 종이 타월에 슬라이드의 뒷면을 닦고, 에탄올 방울이 사라질 때까지 잠시 공기 건조.
참고: 슬라이드 뒷면을 닦아 건조 진행 상황을 더 잘 시각화할 수 있습니다.
- 생선으로 세균 염색
- 액체 차단제 또는 PAP 펜을 사용하여 각 조직 섹션의 영역을 돌면 액체 팽창 영역을 제한하십시오. 잉크가 섹션 자체와 접촉하지 않는지 확인합니다. 혼성화 용액에 의해 커버되어야 하는 표면적을 최소화하기 위해 조직에 접촉하지 않고 가능한 한 각 조직 섹션에 가까운 원을 만듭니다.
- 혼성화 용액 준비: 사전 웜 하이브리드화 솔루션의 50 μL마다 0.5 μg 프로브(예: 1 μg/μL 프로브의 0.5 μL)를 추가합니다. 슬라이드의 섹션에 혼성화 솔루션을 파이펫(섹션/원 크기에 따라~20 μL/단면). 인큐베이션 단계 및 저장 중에 이 시점부터 하이브리드화 솔루션과 슬라이드를 빛으로부터 보호합니다.
- 사용된 액체의 부피가 유연한 플라스틱 커버슬립으로 오버레이시 전체 섹션을 덮는지 확인합니다. 습한 챔버에서 슬라이드를 배양하여 증발을 줄입니다. 습도를 제공하기 위해 과도한 혼성화 용액 또는 인산염 완충식식염(PBS)으로 담근 바닥에 물티슈 또는 종이 타월이 있는 파이펫 팁 박스가 있는 습한 챔버를 만듭니다. 프로브 세트에 따라 45-50°C에서 섹션을 배양하여 >3h에 대해 배양합니다.
- 생선 세척 버퍼를 따뜻하게 : 20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 인큐베이션 기간 동안 0.9M NaCl ~ 50°C. 코플린 항아리의 슬라이드를 덮을 수 있는 충분한 세척 버퍼를 준비합니다.
- 플라스틱 커버립을 제거합니다. 코플린 항아리에 생선 세척 버퍼에 슬라이드를 인큐베이션, 모두 50 °C로 미리 따뜻하게. 코플린 항아리를 50°C 오븐에 다시 넣고 10-20분 간 놓습니다. 두꺼운 샘플의 경우 버퍼를 추가하고 커버립을 부드럽게 분리하여 코플린 항아리의 커버립을 제거하여 슬라이스를 얼룩지게하지 않도록 합니다.
- 점액 과 호스트 기능을 염색
- PBS에서 일반 DNA/점액 카운터스테인을 준비하십시오: 최종 10 μg/mL DAPI + 40 μg/mL 점액 얼룩 UEA-1. 추가 커버립으로 조직을 손상시키지 않도록 커버슬립이 없는 경우 반점을 덮을 충분한 카운터스테인을 준비하십시오.
참고: 커버슬립이 없는 경우 반점을 덮는 것은 3.3.2에 사용된 20 μL보다 더 큰 부피가 필요합니다. 평균 크기의 단면(직경~10mm)의 경우 200μL이 한 지점을 커버하기에 충분합니다. 더미 슬라이드에서 이 볼륨을 미리 테스트합니다. - FISH 세척 버퍼를 제거하고 코플린 항아리에 PBS로 교체하십시오. 코플린 항아리를 PBS로 리필한 직후 PBS를 장식합니다.
- 병에서 슬라이드를 제거하고 피펫 끝으로 조직을 만지지 않도록하면서 섹션 의 상단에 있는 카운터스테인을 피펫합니다. 전체 섹션을 거품으로 덮습니다. 어둠 속에서 45 분 동안 4 °C에서 배양하십시오.
- 신선한 PBS로 얼룩을 3 번 빠르게 씻으십시오 : 핀셋을 사용하여 슬라이드를 제자리에 잡고 싱크대에 PBS를 부어 신선한 PBS로 즉시 리필하십시오.
- 슬라이드 뒷면을 닦아 서 대부분의 PBS는 피펫 팁에 연결된 진공 라인의 도움으로 섹션에서 증발하게합니다. 다시 한번 파이펫 끝으로 단면을 만지지 마십시오.
- (DAPI 없이) 마운팅 매체를 사용하여 섹션을 마운트하고 유리 커버립으로 덮여 실온에서 설정하여 커버립이 평평하고 장착 매체에 기포가 없도록합니다.
- 투명 매니큐어로 커버슬립가장자리를 따라 페인팅하여 슬라이드에 커버립을 부착하고 슬라이드 가장자리에서 벗어나 슬라이드가 이미징 중에 현미경 슬라이드 홀더에 수평을 유지하도록 주의하십시오.
- 형광이 고갈되기 전에 몇 주 동안 어둠 속에서 4 °C에서 슬라이드를 저장합니다.
- PBS에서 일반 DNA/점액 카운터스테인을 준비하십시오: 최종 10 μg/mL DAPI + 40 μg/mL 점액 얼룩 UEA-1. 추가 커버립으로 조직을 손상시키지 않도록 커버슬립이 없는 경우 반점을 덮을 충분한 카운터스테인을 준비하십시오.
4. 이미징 및 이미지 분석
- 얼룩 시각화
- 조직과 루멘을 모두 포함하는 조직의 영역을 선택하여 미생물-숙주 인터페이스를 이미지화한다. 점액 두께 및 발광 생물 지리학의 정량적 이미징을 위해 상피 빌리 및/또는 토굴의 조각이 종방향이고 단면이 아닌 관점 필드를 선택합니다. 점액과 상피 사이에 큰 간격이 있는 영역을 피하여 아티팩트를 단면화하지 않도록 하십시오.
- 물고기를 찾아 서 접경 신호의 사진 표백을 피하기 위해 초점을 맞추기 위해 DAPI 신호를 활용하여 조직을 찾아 초점 평면을 수정합니다.
- 이미징 설정을 조정합니다. 세균DAPI 얼룩을 시각화하려면 레이저 전력을 증가시키고 상피 세포의 DAPI 신호가 과포화 또는 "날려 버린" 지점까지 얻습니다.
참고: 과포화를 하지 마십시오, 이 복구 할 수없는 핵에 표백 및 시각적 유물로 이어질 것입니다. - 다른 모든 채널의 경우 백그라운드 위에 선명한 신호를 제공하는 레이저 전력의 최소량을 사용하고 과포화하지 않도록 주의하십시오.
참고: 타일 간의 겹침이 이미지될 때 포토표백이 문제가 되기 때문에 타일 스캔을 수행할 때 특히 중요합니다. - 개별 박테리아를 이미지하기 위해 40배 이상의 배율을 사용하십시오.
- 이미지를 획득합니다.
- 타일 스캔을 획득하여 루멘 내의 미생물의 점액 두께 및 공간 분포에 대한 정량적 데이터를 얻습니다. 타일 사이에 15% 겹쳐야 하고 비네팅/고르지 않은 조명을 확인하여 <1x 줌으로 악화될 수 있습니다. 타일 스캔을 설정할 때, 흐릿 /초점이 외투적인 이미지를 분석 할 수 없기 때문에 조직이 모든 타일에 초점을 맞추고 있는지 여부에주의를 기울이면 (그림 3B).
- 가능하다면, 상피 및 점액 층이 각도가 아닌 타일과 평행하도록 스캔 영역을 회전하여 상피의 주어진 길이를 이미지하는 데 필요한 타일 수를 최소화한다. 그렇지 않으면, 유사한 효과를 달성하기 위해 이미징 영역에 평행또는 수직인 상피의 단면을 찾아냅니다.
Representative Results
마우스 장에서 특정 창 자 운동 균의 국소화를 조사 하기 위해, 세균 없는 스위스 웹스터 마우스 개별 세균 성 분리와 식민지화 했다이 연구에서 사용 되었다. 이 실험을 위해, 표지된 세균종은 i) Muribaculaceae family5, Muribaculum intestinale, murine microbiota15에 있는 박테리아의 풍부하고 널리 퍼진 가족, 뿐만 아니라 ii) 박테리아는 유전적 인 유전적으로 일반적인 창자 박테리아인 taiotaomicron이었다. 평형의 2 주 후, 마우스는 안락사되었다, 배설물 펠릿을 포함하는 결장의 세그먼트는 절제 및 갓 준비 된 메타칸에 고정되었다. 이틀 간의 고정 후, 이 섹션은 메탄올, 에탄올 및 자일렌을 통해 처리하여 탈수되었고, 파라핀으로 침투한 다음 발광 4 μm 슬라이스로 단면되었습니다. 이러한 샘플은 올리고미너 소프트웨어를 사용하여 설계된 Muribaculum 분리에 특정한 FISH 프로브(3'Cy3-tagged)로 염색되었으며 NuPACK 및 mathFISH16,17을 사용하여 보조 및 삼차 구조와 최소한의 비특이적 결합을 검사했습니다. 샘플은 또한 로다민 바인딩 렉틴 UEA-1 (점액에 fucolated 글리칸얼룩) 및 DAPI로 대응되었다. 스테인드 섹션은 40배 오일 목표 및 초해상도 모듈을 사용하여 이미지화되었습니다.
그림 1: 내장의 미생물 호스트 인터페이스 시각화 워크플로우. (A) 파이프라인에 대한 그림 워크플로우. (B) 두 단면 평면은 횡단 면(이 파이프라인에 우선) 또는 단면 "도넛"을 생성합니다. (C) 매우 다른 두께의 조직을 포함하면 한 조직 또는 다른 조직에만 최적인 슬라이스가 발생할 수 있습니다. 약어: 물고기 = 시상 혼성화의 형광; DAPI = 4′,6-디아미드노-2-페닐린돌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 결장 이미징은 노토바이오틱 마우스 모델의 점액 에 비해 Muribaculum 장의 국소화를 보여줍니다. 단면도는 DAPI(파란색), 무리바쿠라세 피쉬 프로브(빨간색), UEA-1(녹색)으로 염색하였다. (A) 무리바쿨룸 장 과 (B) 마우스의 말단 결장무와 (B) 무리바쿨룸 장 과 박테로이드 테테오타우미넨으로 식민지화. 스케일 바 = 20 μm. (C 및 D) Cy3-FISH(왼쪽), DAPI(가운데), 및 (A) 및 (B)의 발광 개시 부분을 위한 결합된 Cy3-FISH + DAPI 채널. 스케일 바 = 5 μm. (A) 및 (C)에서, 모든 박테리아 모양 및 박테리아 크기의 DAPI 신호는 Cy3 (단일 화살촉) 및 (B)에서 (D)로 표시되며, 이러한 Cy3 및 DAPI 이중 양성 세포 (단일 화살촉) 외에도, 단일 및 이중 결장 화분에 대한 예상대로 Cy3-negative (이중 화살표 헤드)인 DAPI 염색 세균 세포가 있습니다. 더 긴 필라멘트 박테리아를 제외하고, 더 큰 (>4 μm 길이) DAPI 양성 구조 (무딘 화살표)는 숙주 세포에서 식물 재료 또는 핵이다. 약어: 물고기 = 시상 혼성화의 형광; DAPI = 4′,6-디아미드노-2-페닐린돌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 일반적인 문제. (A) 얕은 단면은 장의 발광 조각을 제공하지 않습니다. (왼쪽) 상피의 경도뿐만 아니라 루멘의 뷰를 제공하는 깊이로 절제된 장 세그먼트. (오른쪽) 너무 얕은 절제 된 장 세그먼트, 단지 지하실의 단면 및 아니 일정한 점액 층 또는 박테리아를 공개. (B) 고르지 않은 조직/커버슬립 커버리지는 흐릿하고 고르지 않게 조명된 타일 스캔을 초래할 수 있습니다. 타일 스캔은 초점이 맞지 않는 위치(오른쪽 상단 모서리)로 설정되었습니다. (C) 일반 배경(왼쪽)과 높은 배경(오른쪽)의 예입니다. 이 예에서, DAPI 신호-핵 외부상피로부터 오는 신호. 모든 스케일 바 = 20 μm. 약어: DAPI = 4′,6-디아미드노-2-페닐린돌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
전술한 프로토콜은 숙주-미생물군유동을 시각화하는 재현 가능한 방법을 제공한다. 이러한 분석안은 FISH 라벨링18 의 최적화부터 점액 보존 및 이미징9에 이르기까지 프로토콜 개발로부터 상당한 혜택을 누리고 있습니다. 고정 및 포함은 또한 샘플의 유용한 저장을 제공합니다; 또한, 파라핀 에 침투된 카세트는 샘플이 완전히 고정되고 불활성이기 때문에 제한 없이 우편으로 발송할 수 있습니다.
유의성 및 대체 방법
FISH와 점액 염색의 조합은 특정 조직 위치에서 미생물군운분비 조성의 분석과 개별 박테리아와 숙주 간의 상호 작용을 가능하게 합니다. microbiota 내의 특정 사이트의 분석을 포함하는 대체 기술은 일반적으로 시퀀싱19와 결합된 레이저 포획 미세 절의 경우와 같은 이러한 상호 작용의 단일 세포 특성을 탐구할 수 없다. 그러나, 시퀀싱 기반 기술은 16S rRNA 프로브보다 더 미세하고 광범위하게 미생물의 유전 적 구성을 캡처 할 수있는 장점이 있습니다.
제시된 프로토콜의 함정은 호스트와 관련하여 미생물의 단일 스냅샷을 제공한다는 것입니다. 살아있는 동물에서 실시간 이미징을 위해서는 심부 조직에서 형광 신호의 수집을 용이하게하기 위해 특수 이미징 기술이 필요합니다 (예 : 인브레인 2 광자 현미경 및 광시트 형광 현미경 20,21). 이러한 방법에서, 모델 유기체는 그들의 봉투20 또는 형광 단백질을 항구 하는 유전자 변형 된 박테리아에 결합 하는 분자로 염색 되는 박테리아로 식민지화 21. 후자의 경우, 형광 단백질의 성숙은 대부분의 표준 형광 단백질이 빛을 방출하기 위해 산소를 필요로하기 때문에 중요한 문제입니다. 따라서, 적어도 난로빅 환경(산소의 나노몰러 농도)을 갖는 모델 유기체는 호기성 제브라피시 용기21과 같은 것이 요구된다.
이 프로토콜에서 메탄올-카르노이는 물을 포함하지 않기 때문에 파라포름알데히드 또는 포름틴 대신 고정제로 사용됩니다. 이렇게 하면 처리 중에 수분 공급, 탈수 및 점액 층의 붕괴를 방지하고 점액 두께의 정확한 측정을 용이하게 합니다. 메타칸 고정 및 파라핀 포함은 현장에서 표준이 되었지만, 점액 보존을 최적화하기 위해 상이한 고정 및 포함 기술이 조사되었으며, 일부 연구에서는 수지가 파라핀 임베딩22보다 우수할 수 있음을 나타내는 연구도 있다. 파라핀 포함 및 메타카른 고정에 대한 또 다른 중요한 제한은 형광 단백질 형광의 손실이며, 이는 대체 고정제(예: 포름알린 또는 파라포름데히드(PFA)) 또는 수정된 임베딩 기법(23)을 사용하여 피할 수 있다. 각 고정은 이점과 단점을 가지고 있으며, 고정의 선택은 이미징 우선 순위에 따라 달라집니다. 생물학적 복제가 PFA와 메타칸에서 고정되고 두 샘플모두에서 이미지를 얻을 수 있는 경우 이미징 양식이 결합될 수 있습니다.
FISH는 특정 항 Muc2C3 토끼 폴리클론 항체9,24와 격리된 인스턴스에서 면역 형광과 결합되었습니다. 이러한 결과는 다른 Muc2 항체와 함께 널리 재현되지 않았으며, 이는 항체의 선택이 FISH-면역 형광 조합의 성공에 중요할 수 있음을 나타낸다. 주어진 항체에 대 한 성공적인 항체 염색에 대 한 조건 물고기 염색의 보존을 허용 하지 않을 수 있습니다.
문제 해결
이 프로토콜에서 샘플 수집, 단면 및 염색은 이미징 아티팩트의 생성을 방지하는 중요한 단계를 나타냅니다. 예를 들어, 수집 시 및 포함되기 전에 조직을 누르면 미생물의 잘못된 지역화로 이어질 수 있으며 점액 품질에 영향을 줄 수 있습니다. 또 다른 중요한 고려 사항은 소장의 상대적으로 빈 조각과 탈구 결장 내의 펠릿과 같은 단일 카세트에 매우 다른 두께의 세그먼트를 결합하지 않도록하는 것입니다. 상이한 두께는 이미징에 어려움을 초래할 수 있습니다: 한 세그먼트에 대한 특정 깊이에서 횡단 편면은 다른 세그먼트에 대한 이미징에 대한 잘못된 깊이에 있을 수 있습니다(예를 들어, 루멘은 각 조직에 대해 서로 다른 깊이에 있을 것입니다)(도 1B, C 및 도 3A). 더욱이, 이미징 동물 모델 대변 펠릿을 위해, 그들은 수막24로 감갈 수 있다. 이 기술에서, 갓 고립 된 회막의 작은 부분은 부드럽게 의자 주위에 접혀 프로토콜에 설명 된 세척 단계 동안 펠릿의 구조를 보존한다.
내용으로 동물 조직을 처리하는 것과는 달리, 인간 장 샘플을 이미징하는 것은 몇 가지 과제를 제시합니다. 특히, 발광 내용 및 점막 안대기는 일반적으로 장 생검 또는 절제술 절차 전에 일반적으로 수행된 대장 내시경 대장 준비에 의해 중단될 가능성이 높습니다. 또한 생검을 수집할 때 장 내용이 없는 경우 특정 기능(예: 루멘 대 서브mucosa)의 식별을 돕기 위해 조직 방향을 주의하는 것이 좋습니다. 3% 한천 및/또는 한천을 사전 포함: 젤라틴 혼합물은 조직 극성 25를 유지하는 데 유용할 수 있습니다. 그러나, 문헌에 보고된 바와 같이, 천의 탈수 및 단면에 문제가 있고, 처리 시간을 변경해야 할 지도 모릅니다.
좋은 물고기 염색을 달성하기위한 주요 측면은 특정 FISH 프로브에 대한 포름 아미드 농도조정에서 온다. 포르마미드는 대상에 FISH 프로브의 혼성화 문자열을 제어합니다. a) 적절한 포르마이드 농도가 주어진 커뮤니티를 염색하기 위해 선택되도록 하는 것이 중요하며, b) 활용되고 있는 프로브 조합에 적합한 포르마이드 농도가 가능하다는 것을-이는 다중 프로브를 활용할 때 최적의 프로브 선택에 영향을 미칠 수 있다. mathFISH (http://mathfish.cee.wisc.edu/)와 같은 웹 사이트는 주어진 프로브에 대한 적절한 포름아미드 농도를 계산하는 데 도움이 될 수 있습니다. 적절한 포름아미드 농도에 대한 정보가 없는 경우, 이 프로토콜은 0% 및 10% formamide로 테스트될 수 있다.
임베디드 샘플을 절제하려면 블록을 발광 조각을 얻기에 충분한 깊이로 절단해야 하며, 블록으로 너무 얕게 분할하면 조명 내용이 없는 사블리/토굴의 단면 보기가 됩니다(그림 3A). 최적의 FISH 신호를 위해 단면화 직후 샘플을 염색하고, 배경 문제(그림 3C)를 해결하기 위해 신선한 DAPI(또는 -20°C에 저장된 DAPI)를 사용합니다. 한 달 이상 된 섹션의 물고기 염색은 가난 / 일관성 없는 얼룩을 초래할 수 있습니다.
조직 또는 커버슬립이 슬라이드와 관련하여 완벽하게 평평하지 않은 경우, 샘플은 타일 스캔 내의 모든 위치에서 집중되지 않을 수 있습니다(그림 3B), 낭비된 노력과 잠재적광표백으로 이어지는. 이 모든 위치가 초점을 맞출 수 있도록 확인된 작은 타일 스캔을 통해 해결할 수 있습니다. 무딘 블레이드로 단면은 또한 화상 진찰하는 동안 큰 어두운 지역으로 나타나는 점액및 발광 내용의 분리로 이끌어 낼 수 있습니다. 마지막으로, 혼성화 단계 중 용액 또는 기포의 증발은 조직에서 FISH 프로브의 얼룩을 고르지 않게 할 수 있다.
FISH 프로브 바인딩의 효율성에 영향을 미치는 또 다른 중요한 매개 변수는 서로 다른 프로브 간의 경쟁입니다. FISH 프로브가 박테리아를 라벨링하고 있는지 확인하는 유용한 검사는 DAPI(도 2C,D)와 FISH 프로브로부터의 신호의 공동국화를 검사하는 것이다. 다중 rRNA 프로브의 사용을 필요로 하는 샘플에서, 혼성화 온도, 프로브 농도 및 formamide와 같은 매개 변수를 조정하는 것은 프로브가 올바른 종에 효율적으로 결합되도록 하는 것이 중요합니다18.
이미징에 대한 참고 사항
물고기 염색 박테리아는 가장 공초점 현미경 및 적어도 40 배율의 목표를 사용하여 시각화됩니다. 63배배율은 단일 세포 수준에서 박테리아를 이미지화하는 것이 바람직하지만, 디지털 줌을 최대화하거나 초해상도 시스템을 채택하여 40배율을 사용할 수도 있다. 초분해능 기능이 장착된 시스템은 개별 세균 세포의 세포 분해능을 제공할 수도 있습니다. 낮은 배율 목표는 세균성 국소화 및 점액 두께의 일반적인 감각을 얻기 위하여 이용될 수 있습니다.
8비트 이미지 대신 16비트 이미지를 획득하는 것도 매우 권장되며, 높은 다이나믹 레인지는 상피의 매우 밝은 핵과 발광균의 비교적 약한 신호로부터 DAPI 신호의 넓은 범위를 포착하는 데 도움이 될 것입니다. 위에서 설명한 이미징 설정을 사용하는 것 외에도 중요한 이미징 고려 사항은 형광의 선택입니다. 세균 모형 사이 제일 분리를 위해, 사용된 형광이 여기와 방출 스펙트럼에서 겹치지 않는다는 것을 확인하십시오 (선형 언믹싱을 능력을 가진 시스템에 화상 진찰이 없는 한). 또한 프로브는 조합(예: 가족 별 프로브 및 속별 프로브의 조합)을 조합하여 추가 커뮤니티 구성원을 식별할 수 있습니다. 선형 미혼 또는 검증되지 않은 프로브를 사용하는 경우 순수 배양에 대한 FISH 염색의 정확성과 수준을 테스트하는 것이 필수적입니다8,14.
이미지가 수집되면 BacSpace26, HiPR-FISH8 및 기타 세분화 도구27과 같은 호스트-미생물군유한 인터페이스의 정량적 분석에 여러 도구를 사용할 수 있습니다. BacSpace는 조직 및 발광 성분의 세분화 및 images26에서 식물 물질의 제거를 허용하는 MATLAB 소프트웨어입니다. 또한 이 프로그램은 2D의 점액 두께 를 분석하고 다른 채널26의 픽셀 거리를 기반으로 공간 분포의 정량화를 제공합니다. 반대로 HiPR-FISH 이미지 분석 소프트웨어는 FISH 염색 셀8의 세분화를 허용합니다. 마지막으로, 시험관 내 실험에 최적화된 다른 세균 세분화 도구27도 이 응용 분야에 적용될 수 있습니다.
결론
시투 이미징에서 다른 지역 사회 구성원의 맥락에서 개별 미생물 택시의 정량적 분석과 식이 요법, 점액 및 숙주 상피 토굴에 의해 생성 된 다양한 미세 환경이 가능합니다. 유기체 간의 상호 작용은 숙주 관련 미생물 시스템의 생물학을 지시하고 건강에 영향을 미치는 동요 도중 이 구조물에 있는 변경의 필수적인 분석을 제공합니다. 특히, 위에서 설명한 프로토콜을 통해 시상에서 미생물을 이미지화하는 능력은 동물 숙주와 관련하여 미생물의 생체 지리학에 놀라운 창을 제공합니다.
Disclosures
저자는 이해상충이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 귀중한 기술 개발에 대한 박사 크리스틴 얼, 문제 해결 도움을 앰버 한, 원고의 비판적 검토를위한 박사 젠 응우옌과 딘나 페핀, 박사 헤샴 솔리만과 현미경 액세스를 제공하기위한 브리티시 컬럼비아 대학의 로시 연구소에 감사드립니다. 저자는 CIHR 팀 그랜트의 지원을 인정: 캐나다 미생물군유전체 이니셔티브 2 (C.T.), 크론과 대장염 캐나다 (C.T. 및 K.M.N.), CIFAR (C.T. 및 K.M.N.), 건강 연구 학자 상 마이클 스미스 재단 (C.T.), 웨스턴 재단 : 웨스턴 가족 미생물 이니셔티브 (C.T.에)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum foil | |||
| Chloroform | Fisher | C298-500 | Toxic |
| Coplin jar | Fisher | 08-813E | |
| Cover glass, 22 × 22 mm, no #1 | VWR | CA48366-227-1 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Resuspended to 5 mg/mL |
| Empty pipette tip box(es) | To melt paraffin | ||
| Ethanol, anhydrous, molecular grade | -- | -- | |
| FISH probes | |||
| FISH hybridization solution | -- | -- | 20 mM Tris–HCl pH 7.4, 0.9 M NaCl, 0.01% (w/v) SDS in nuclease-free water. Optional addition of 5–50% (v/v) formamide |
| FISH washing buffer | -- | -- | 20 mM Tris–HCl pH 7.4, 0.9 M NaCl |
| Fluorescently-labeled Ulex Europaeus Agglutinin (UEA-1) lectin | Vector Laboratories | FL-1061 (Fluorescein-labeled) or RL-1062-2 (Rhodamine-labeled) | UEA-1 labels fucosylated glycans, so it is not appropriate for germ-free mice or for samples from fucosyltransferase 2 (FUT2)-deficient hosts. |
| Forceps | |||
| Formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | |
| Fumehood | |||
| Glacial Acetic Acid | Fisher | A38-212 | Corrosive and flammable |
| HybriSlip flexible plastic cover slips, 22 x 22 mm × 0.25 mm | Sigma Aldrich | GBL722222 | for FISH hybridization steps, can substitute glass coverslips |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Kimwipes | |||
| Methanol | Fisher | A412 | Toxic and flammable |
| Microtome | for sectioning | ||
| Multipurpose Specimen Storage Containers, 473 mL | Fisher | 14-955-117A | Can substitute with a glass or polyethylene container of your choice. Methacarn is not compatible with polystyrene or metal. |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | Any nail polish should work |
| Oven | Necessary range: 45-60 °C | ||
| Paraffin: Leica Paraplast | Leica | 39601006 | |
| PBS, Phosphate-buffered Saline (10x solution) | Fisher | BP3991 | Dilute to 1x for protocol |
| Sodium chloride | Fisher | S271 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), 20% Solution, RNase-free | Invitrogen | AM9820 | |
| Tissue-Loc HistoScreen Cassettes | Thermo Scientific | CA83009-999 | |
| Trizma hydrochloride solution, 1M Tris-HCl, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2663-1L | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Water, nuclease-free | Fisher | BP2484100 | |
| Xylenes | Fisher | X3P-1GAL | Toxic and flammable |
References
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