Summary
Este protocolo simplificado detalla un flujo de trabajo para detectar e obtener imágenes de bacterias en muestras de tejido complejo, desde la fijación del tejido hasta la tinción de microbios con hibridación fluorescente in situ .
Abstract
Medir la localización de microbios dentro de su contexto in vivo es un paso esencial para revelar las relaciones funcionales entre la microbiota y el intestino de los vertebrados. El paisaje espacial de la microbiota intestinal está estrechamente controlado por características físicas (moco intestinal, criptas y pliegues) y se ve afectado por propiedades controladas por el huésped, como el pH, la disponibilidad de oxígeno y los factores inmunológicos. Estas propiedades limitan la capacidad de los microbios comensales y los patógenos por igual para colonizar el intestino de manera estable. A escala micrométrica, la organización microbiana determina las interacciones de corto alcance entre diferentes microbios, así como las interacciones entre los microbios y su huésped. Estas interacciones afectan la función de los órganos a gran escala y la salud del huésped.
Este protocolo permite la visualización de la organización espacial de la microbiota intestinal desde las distancias entre las células hasta las escalas de todo el órgano. El método se basa en la fijación de los tejidos intestinales mientras se preservan la estructura intestinal y las propiedades del moco. Las muestras fijas se incrustan, seccionan y tiñen para resaltar especies bacterianas específicas a través de la hibridación fluorescente in situ (FISH). Las características del huésped, como el moco y los componentes de la célula huésped, están etiquetadas con lectinas marcadas fluorescentemente. Finalmente, las secciones teñidas se toman imágenes utilizando un microscopio confocal que utiliza imágenes de escaneo de azulejos a gran aumento para unir las escalas de micras a centímetros de longitud. Este tipo de imágenes se pueden aplicar a secciones intestinales de modelos animales y biopsias de tejidos humanos para determinar la biogeografía de la microbiota en el intestino en la salud y la enfermedad.
Introduction
Las técnicas de visualización microbiana tienen orígenes que son tan antiguos como la microbiología misma, cuando Antonie Van Leeuwenhoek usó su microscopio para observar bacterias (a las que llamó "animalcules") de la placa dental y las heces en el siglo 17. Desde entonces, se han desarrollado numerosas técnicas para visualizar la organización espacial del consorcio de bacterias, hongos y virus que viven asociados a un huésped: la microbiota1. Dilucidar la localización de estos microbios es esencial para determinar su función dentro de su huésped animal. La biogeografía de las bacterias es importante tanto en los taxones comensales como en los patógenos, ya que la proximidad a lugares específicos (por ejemplo, el epitelio), los sustratos nutricionales y los microbios específicos pueden dictar la producción bacteriana de metabolitos subyacentes entre especies e interacciones entre reinos.
Una estructura clave que separa las bacterias y los tejidos del huésped en varios sitios corporales dispares, como la cavidad oral, el intestino o el pulmón, es el moco, una capa producida por el huésped que previene la translocación microbiana en las células epiteliales del huésped y sirve como recurso nutricional para la microbiota2,3,4 . Caracterizar las brechas y cambios en esta barrera es de vital importancia, lo que lleva a una visión mecanicista de las interacciones huésped-microbiota que no se obtendrían solo mediante la secuenciación5,6,7. Por ejemplo, las imágenes permitieron descubrir que la exposición a antibióticos puede alterar la capa de moco y la organización de la microbiota7,8, y que los laxantes pueden agotar el moco, correlacionándose con grandes cambios en los parámetros inmunes5.
Este protocolo describe un marco general para la fijación, tinción e imagen de la microbiota y el tejido huésped (Figura 1), basado en el trabajo de Johansson y Hansson9. Si bien este protocolo se modela en el contexto de las secciones intestinales, se puede adaptar fácilmente a otros tipos de tejidos. Este protocolo permite el procesamiento de muestras clínicas experimentales de animales o humanos; se han incluido notas para el procesamiento de ambos tipos de muestras. En el ejemplo presentado aquí, el epitelio huésped y las bacterias luminales se han marcado simultáneamente con tinción de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), moco con la lectina conjugada con fluoresceína (FITC), Aglutinina I de Ulex europaeus (UEA-1) y un taxón bacteriano específico utilizando FISH. Las sondas FISH generalmente están diseñadas contra los genes de ARNr 16S de un taxón para garantizar la alta señal de unión de una transcripción de alta copia.
En este ejemplo, la sonda se dirige al ARNr 16S de la familia bacteriana Muribaculaceae (Figura 2). Sin embargo, las manchas se sustituyen fácilmente con diferentes sondas FISH y / o lectinas para adaptarse a la pregunta biológica apropiada. Las sondas FISH previamente validadas se pueden encontrar en ProbeBase10, un recurso en línea para sondas de oligonucleótidos dirigidas a ARNr, o en SILVA11, una base de datos de ARN ribosómico. Para el diseño de nuevas sondas, el lector puede referirse a nuevas tuberías como HiPR-FISH8 u Oligominer12. Usando este protocolo, es posible observar el empaquetamiento cercano de bacterias en la luz intestinal y las diferentes características del moco intestinal en todo el tracto digestivo. El flujo de trabajo descrito aquí permite el análisis cuantitativo de la microbiota en el contexto espacial de su entorno huésped.
Protocol
Todos los experimentos con animales y la recolección de tejidos descritos en este protocolo se realizaron de conformidad con las directrices del Consejo Canadiense de Cuidado Animal (CCAC) y fueron aprobados por el Comité de Cuidado animal de la Universidad de Columbia Británica. Se utilizaron ratones Webster suizos libres de gérmenes. Todos los animales tenían entre 8 y 10 semanas de edad, se utilizaron ambos sexos y todos los ratones fueron co-alojados con al menos dos ratones por jaula. Los animales fueron sacrificados usando dióxido de carbono con luxación cervical secundaria o punción cardíaca.
1. Diseño de un experimento de imagen: consideraciones y recolección de muestras
- Diseño de la sonda FISH
- Si existe una sonda FISH adecuada, seleccione una publicada preexistente que muestre una señal fuerte en las celdas marcadas en comparación con el fondo.
- Validar nuevas sondas in vitro para determinar su eficiencia de unión a muestras fijas de las bacterias objetivo y unión fuera del objetivo a otras bacterias.
- Verifique todas las sondas 16S FISH que se utilizarán contra secuencias 16S del organismo objetivo o contra la secuenciación de ARNr 16S de las muestras que se analizarán para garantizar que la proporción esperada de coincidencias positivas esté presente y que las sondas no se unan de manera no específica a otros miembros de la microbiota.
- Alinee las sondas FISH con secuencias de longitud completa o variantes de secuencia de amplicón utilizando una herramienta, como Clustal Omega13, para evaluar la posible unión de las sondas y sus objetivos.
- Además de las pruebas in silico, pruebe la precisión y el nivel de tinción FISH de sondas no validadas en cultivos puros8,14.
NOTA: Al teñir a varios miembros de la comunidad, las sondas se pueden usar combinatoriamente (por ejemplo, la combinación de una sonda específica de la familia y una sonda específica del género) si los fluoróforos utilizados no se superponen en los espectros de excitación y emisión (a menos que se tomen imágenes en un sistema con la capacidad de realizar desmezcla lineal). Además, la especificidad puede demostrarse mediante la inclusión de controles de especificidad / sondas codificadas o mediante la competencia con sondas no fluorescentes.
- Tipos de muestras y recolección de tejidos
- Usando herramientas afiladas y limpias, corte segmentos intestinales de ratones Webster suizos gnotobióticos para obtener imágenes. Minimice la perturbación de la muestra tanto como sea posible y maneje las secciones por sus bordes para evitar afectar el área de la imagen. Fije la muestra tan pronto como sea posible después de la disección para evitar la degradación.
NOTA: Para estudios con animales, se prefieren las secciones intestinales intactas y sin cuenca; la membrana ayudará a mantener intacta la organización luminal y mucosa. - Limpie las herramientas limpiándolas con etanol al 70% entre muestras y sitios. Obtener al menos tres réplicas biológicas por sección intestinal / ubicación de biopsia, teniendo cuidado de muestrear ubicaciones intestinales consistentes, ya que el moco y la arquitectura intestinal, así como la microbiota, cambian significativamente en diferentes ubicaciones.
- Usando herramientas afiladas y limpias, corte segmentos intestinales de ratones Webster suizos gnotobióticos para obtener imágenes. Minimice la perturbación de la muestra tanto como sea posible y maneje las secciones por sus bordes para evitar afectar el área de la imagen. Fije la muestra tan pronto como sea posible después de la disección para evitar la degradación.
2. Fijación e infiltración de muestras de tejido
- Fijación
- Prepare metacarno fresco en un recipiente compatible con las siguientes proporciones: 60% de metanol absoluto, 30% de cloroformo y 10% de ácido acético glacial. Dispense cada uno de estos productos químicos en una campana extractora de humos. Elija un recipiente que se pueda ventilar abriendo la tapa. Como el metacarno no es compatible con el poliestireno, prepárelo en un recipiente de polietileno, utilizando cilindros graduados de vidrio / pipetas serológicas para el cloroformo y el ácido acético glacial.
NOTA: Durante la mezcla, se producen humos y pueden hacer que se acumule presión dentro del recipiente. Es aconsejable mantener el recipiente relativamente bien cerrado una vez retirado de la campana de humos si las muestras no se agregan activamente. El cloroformo es tóxico; no inhale, trague ni absorba a través de la piel. El metanol es tóxico y altamente inflamable; no inhale, trague ni absorba a través de la piel. El ácido acético glacial es inflamable y altamente corrosivo para la piel y los ojos. - Después de dispensar, cierre el recipiente, gire para mezclar y luego ventile; repita esto hasta que la desgasificación se haya detenido (y la presión ya no se acumule apreciablemente debajo de la tapa).
NOTA: No deseche el metacarno en los desagües; recolectar y eliminar como residuos químicos peligrosos según las directrices institucionales. Use un lápiz para etiquetar casetes de histología, ya que muchas tintas de pluma se desprenderán en la solución de metacarno. - Coloque las secciones intestinales en casetes histológicos sosteniendo delicadamente un borde del tejido con pinzas. Cierre el cassette y sumérjalo completamente en una solución de metacarno fresco. Asegúrese de que la solución no tenga más de unas pocas horas después de la inmersión de los casetes.
- Para las muestras clínicas que se recogerán en una sala clínica sin acceso a una campana extractora, utilice un recipiente de almacenamiento de polietileno con una solapa cortada en la tapa que permitirá el paso de los casetes histológicos. Cierre con cinta adhesiva esta solapa cuando no pasen muestras para evitar el escape de humos tóxicos.
NOTA: Es importante usar cinta adhesiva para evitar la disolución del pegamento en el recipiente; algunos tipos de cinta (por ejemplo, cinta de embalaje de plástico) pueden no resistir bien los humos de metacarno. - Fijar muestras durante un mínimo de 3 h y un máximo de dos semanas.
NOTA: Las muestras más gruesas pueden requerir tiempos de fijación superiores a 3 h. Se puede elegir el tiempo de fijación para permitir el procesamiento simultáneo de infiltración de parafina para casetes fijados en diferentes soluciones de metacarn (por ejemplo, para realizar simultáneamente la infiltración de parafina en grupos de muestras recogidas y fijadas durante dos semanas).
- Prepare metacarno fresco en un recipiente compatible con las siguientes proporciones: 60% de metanol absoluto, 30% de cloroformo y 10% de ácido acético glacial. Dispense cada uno de estos productos químicos en una campana extractora de humos. Elija un recipiente que se pueda ventilar abriendo la tapa. Como el metacarno no es compatible con el poliestireno, prepárelo en un recipiente de polietileno, utilizando cilindros graduados de vidrio / pipetas serológicas para el cloroformo y el ácido acético glacial.
- Infiltración e incrustación de parafina
- Coloque la parafina en un recipiente resistente al calor y derrítala en un horno a 60 °C durante la noche. Como los gránulos de parafina ocupan más espacio antes de fundirse, asegúrese de que se derrita suficiente parafina para cubrir todos los casetes.
NOTA: La temperatura no debe ser superior a 60 ° C, ya que puede dar lugar a artefactos. - Lave el pañuelo vertiendo el líquido en el recipiente de desechos apropiado y reemplazándolo inmediatamente con los siguientes productos químicos.
- Incubar en metanol absoluto durante 30 min. Repetir una vez.
- Incubar en etanol absoluto durante 20 min. Repetir una vez.
- Incubar en xilenos durante 15 min. Repetir una vez.
- Intercambia los lavados rápidamente, teniendo cuidado de evitar dejar secar los casetes. Asegúrese de que cada lavado cubra completamente los casetes en el vaso de precipitados o recipiente.
NOTA: Los xilenos son inflamables, y si se inhalan, los vapores pueden deprimir el sistema nervioso central con posibles consecuencias neurológicas a largo plazo tras la exposición a altas concentraciones (>200 ppm). Manipule los xilenos solo dentro de una campana de humos. Como los xilenos son peligrosos, tenga cuidado de usar la cantidad mínima necesaria para cubrir los casetes histológicos.
- Durante la incrustación, oriente los segmentos intestinales paralelos a la longitud del cassette (en lugar de vertical) utilizando pinzas para proporcionar secciones transversales longitudinales en lugar de donas transversales para proporcionar más área de muestra potencial para imágenes cuantitativas (Figura 1B).
- Abra los casetes ligeramente (~ 1-2 cm o 0.5 pulgadas) para permitir que la parafina entre sin perder los segmentos de tejido. Use guantes dobles para este paso o pinzas para evitar el sobrecalentamiento o el ardor leve de los dedos. Sumergir y cerrar los casetes en el recipiente de parafina derretida, colocando el recipiente de nuevo en el horno a 60 °C. Asegúrese de que los casetes estén llenos de parafina y que no queden grandes burbujas de aire.
- Después de la incubación durante 2 h a 60 °C, retire el recipiente del horno. Usando fórceps, retire cuidadosamente los casetes y colóquelos individualmente sobre un trozo de papel de aluminio para que se enfríen. Guárdelos a temperatura ambiente hasta que estén listos para incrustar y seccionar.
- Seccione los bloques de parafina con un microtomo, seccionando lo suficientemente profundo en el bloque como para que el contenido luminal esté expuesto, permitiendo una sección longitudinal de vellosidades y / o criptas además del contenido luminal y el moco. Tenga cuidado de reemplazar las cuchillas ya que el material fecal embota la cuchilla rápidamente en comparación con el tejido. Corte secciones a 4 μm de espesor para una nitidez óptima de las imágenes. Transfiera las secciones a diapositivas regulares sin recubrimiento.
- Para la tinción de FISH, manche las secciones intestinales lo antes posible (es decir, dentro de unas pocas semanas de la sección) para lograr una fuerte señal de FISH. Si se omite la tinción FISH, la tinción con lectina + DAPI se puede realizar en muestras menos frescas (es decir, de meses de antigüedad) sin pérdida significativa de señal.
- Coloque la parafina en un recipiente resistente al calor y derrítala en un horno a 60 °C durante la noche. Como los gránulos de parafina ocupan más espacio antes de fundirse, asegúrese de que se derrita suficiente parafina para cubrir todos los casetes.
3. Bacterias de tinción y características del huésped
- Preparación
- Calentar el horno a 60 °C. Precaliente un frasco de Coplin vacío y suficiente volumen para cubrir los portaobjetos de vidrio en el frasco dos veces con xilenos en una botella de vidrio, teniendo cuidado de parafilmar alrededor de la tapa para evitar la evaporación de los xilenos. Permita que la temperatura de los xilenos alcance los 60 °C.
NOTA: Un frasco Coplin estándar se adapta a 8 diapositivas, y las diapositivas se pueden cubrir con aproximadamente 50 ml de líquido (puede variar entre 40 y 60 ml dependiendo de la marca). Los sustitutos del xileno son menos tóxicos y han sido utilizados con éxito por otros grupos para la etapa de depilación (paso 3.2)8,9. - Si hay un horno separado disponible, precaliente un horno de hibridación a 50 °C. De lo contrario, este paso se puede realizar con el mismo horno utilizado para hornear los portaobjetos después del paso 3.2.3.
- Preparar la solución de hibridación FISH: 20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 0,9 M NaCl; 0.01%26 - 0.1%9 (p/v) dodecilsulfato de sodio (SDS) en agua libre de nucleasas. Si es necesario, agregue formamida al 5-50% (v/v). Precaliente esta solución de hibridación a 50 °C durante la desparafinación.
NOTA: La formamida es una amida que actúa como teratógeno; manipule formamida con guantes y gafas. En pequeñas dosis y tras la exposición a los ojos, la piel o las membranas mucosas, es irritante. En grandes cantidades, el vapor de formamida puede requerir intervención médica. La formamida se puede almacenar al 100% en un congelador de -20 °C.
- Calentar el horno a 60 °C. Precaliente un frasco de Coplin vacío y suficiente volumen para cubrir los portaobjetos de vidrio en el frasco dos veces con xilenos en una botella de vidrio, teniendo cuidado de parafilmar alrededor de la tapa para evitar la evaporación de los xilenos. Permita que la temperatura de los xilenos alcance los 60 °C.
- Preparación de las diapositivas para la tinción: desparafinación
- Coloque las diapositivas en el frasco Coplin, asegurándose de que las secciones no entren en contacto con otras diapositivas o el frasco, y hornee las diapositivas a 60 ° C durante 10 minutos.
- En la campana de humos, llene el frasco de Coplin con xilenos precalentados del horno, teniendo cuidado de no verter directamente sobre las muestras y potencialmente desalojar los tejidos. Vuelva a colocar el frasco de Coplin en el horno a 60 °C. Deje la botella con los xilenos restantes en la campana de humos.
- Vierta los xilenos usados en un recipiente de desechos adecuado para su eliminación, teniendo cuidado de no molestar las secciones de tejido en los portaobjetos de vidrio y usando un par de fórceps para evitar que los portaobjetos se caigan del frasco de Coplin. Reponga el frasco de Coplin con los xilenos restantes e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente en la campana de humos.
- Incubar las secciones en etanol al 99,5% durante 5 min a temperatura ambiente. Después de este paso de incubación, retire las diapositivas del frasco de Coplin, limpie la parte posterior de las diapositivas en una toallita de laboratorio o una toalla de papel, y seque brevemente al aire hasta que las gotas de etanol desaparezcan.
NOTA: Limpiar la parte posterior de las diapositivas permite una mejor visualización del progreso del secado.
- Tinción bacteriana con FISH
- Use un bloqueador líquido o una pluma de PAP para limitar el área de expansión del líquido rodeando el área de cada sección de tejido. Asegúrese de que la tinta no entre en contacto con la sección en sí. Cree un círculo lo más cerca posible de cada sección de tejido sin entrar en contacto con el tejido para minimizar el área de superficie que debe cubrir la solución de hibridación.
- Preparar la solución de hibridación: por cada 50 μL de solución de hibridación precalentada, añadir 0,5 μg de sonda (por ejemplo, 0,5 μL de sonda de 1 μg/μL). Pipetear la solución de hibridación en las secciones de la diapositiva (~20 μL/sección, dependiendo del tamaño de la sección/círculo). Proteja la solución de hibridación y los portaobjetos de la luz a partir de este punto durante los pasos de incubación y almacenamiento.
- Asegúrese de que el volumen de líquido utilizado cubra toda la sección al superponerlo con una cubierta de plástico flexible. Incubar el portaobjetos en una cámara húmeda para reducir la evaporación. Cree una cámara húmeda con una caja de punta de pipeta con toallitas o toallas de papel en la parte inferior que se hayan empapado con un exceso de solución de hibridación o solución salina tamponada con fosfato (PBS) para proporcionar humedad. Incubar las secciones a 45-50 °C, dependiendo del conjunto de sondas, durante >3 h.
- Calentar el tampón de lavado FISH: 20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 0,9 M de NaCl a 50 °C durante el período de incubación. Prepare suficiente tampón de lavado para cubrir las diapositivas en el frasco Coplin.
- Retire las fundas de plástico; incubar los portaobjetos en tampón de lavado FISH en un frasco de Coplin, ambos precalentados a 50 °C. Coloque el frasco de Coplin de nuevo en el horno de 50 °C durante 10-20 min. Para muestras gruesas, retire las fundas en el frasco de Coplin agregando el tampón y desalojando suavemente las hojas de cubierta para evitar manchar la rebanada.
- Tinción del moco y las características del huésped
- Preparar una contratinción general de ADN/moco en PBS: tinción final de 10 μg/mL DAPI + 40 μg/mL de mucosidad UEA-1. Prepare suficiente contramancha para cubrir las manchas en ausencia de un coverlip para evitar dañar el tejido con cubiertas adicionales.
NOTA: Cubrir las manchas en ausencia de un coverlip requerirá volúmenes mayores que los 20 μL utilizados en 3.3.2. Para secciones de tamaño promedio (~ 10 mm de diámetro), 200 μL es suficiente para cubrir un punto; pruebe este volumen de antemano en una diapositiva ficticia. - Retire el tampón de lavado FISH y reemplácelo con PBS en el frasco Coplin. Inmediatamente después de rellenar el frasco de Coplin con PBS, decantar el PBS.
- Retire las diapositivas del frasco y pipetee la contratinta en la parte superior de la sección mientras se asegura de no tocar el pañuelo con la punta de la pipeta. Cubra toda la sección con una burbuja. Incubar a 4 °C durante 45 min en la oscuridad.
- Lave las manchas 3 veces rápidamente con PBS fresco: mientras mantiene las diapositivas en su lugar con pinzas, vierta el PBS en un fregadero e inmediatamente vuelva a llenar con PBS fresco.
- Limpiando la parte posterior de las diapositivas contra una toallita o toalla de papel, deje que la mayor parte del PBS se evapore de las secciones, con la ayuda de una línea de vacío conectada a una punta de pipeta. Una vez más, evite tocar la sección con la punta de la pipeta.
- Monte las secciones utilizando un medio de montaje (sin DAPI) y déjelo ajustar a temperatura ambiente cubierto por cubiertas de vidrio, asegurándose de que las cubiertas sean planas y que no haya burbujas de aire en el medio de montaje.
- Fije los cubrehojas a la diapositiva pintando a lo largo de los bordes de la funda con esmalte de uñas transparente, teniendo cuidado de mantenerse alejado del borde de la diapositiva para asegurarse de que la diapositiva se quede nivelada en el soporte de la diapositiva del microscopio durante la toma de imágenes.
- Guarde los portaobjetos a 4 °C en la oscuridad durante unas semanas antes de que se agote la fluorescencia.
- Preparar una contratinción general de ADN/moco en PBS: tinción final de 10 μg/mL DAPI + 40 μg/mL de mucosidad UEA-1. Prepare suficiente contramancha para cubrir las manchas en ausencia de un coverlip para evitar dañar el tejido con cubiertas adicionales.
4. Análisis de imágenes e imágenes
- Visualización de las manchas
- Seleccione un área del tejido que contenga tejido y luz para obtener imágenes de la interfaz microbiota-huésped. Para obtener imágenes cuantitativas del grosor del moco y la biogeografía luminal, seleccione campos de visión donde las rebanadas de las vellosidades epiteliales y / o criptas sean longitudinales y no transversales. Evite las áreas con grandes espacios entre el moco y el epitelio para evitar seccionar artefactos.
- Localice el tejido y corrija el plano focal, utilizando la señal DAPI para localizar y enfocar para evitar el fotoblanqueo de la señal de fluorescencia FISH.
- Ajuste la configuración de imagen. Para visualizar la tinción bacteriana DAPI, aumente la potencia del láser y la ganancia hasta el punto en que la señal DAPI de las células epiteliales esté sobresaturada o "soplada".
NOTA: No sobresaturar excesivamente, ya que esto dará lugar a fotoblanqueo y artefactos visuales en los núcleos que no se pueden recuperar. - Para todos los demás canales, use la cantidad mínima de potencia láser que proporcionará una señal clara sobre el fondo, y tenga cuidado de no sobresaturar.
NOTA: Esto es especialmente importante cuando se realizan escaneos de mosaicos, ya que el fotoblanqueo será problemático cuando se muestre la superposición entre mosaicos. - Use un aumento de 40x o más para obtener imágenes de bacterias individuales.
- Adquiere las imágenes.
- Adquiera escaneos de baldosas para obtener datos cuantitativos sobre el grosor del moco y la distribución espacial de los microbios dentro del lumen. Asegúrese de que el 15% se superponga entre los mosaicos y verifique si hay viñeteado / iluminación desigual, que puede exacerbarse con el zoom < 1x. Al configurar un escaneo de mosaico, preste mucha atención a si el tejido está enfocado en todos los mosaicos, ya que las imágenes borrosas / desenfocadas no se pueden analizar (Figura 3B).
- Si es posible, minimice el número de baldosas necesarias para obtener imágenes de una longitud dada del epitelio girando el área de escaneo para que el epitelio y la capa de moco sean paralelos a la baldosa y no en ángulo. De lo contrario, encuentre una sección del epitelio que sea paralela o perpendicular al área de la imagen para lograr un efecto similar.
Representative Results
Para investigar la localización de bacterias comensales intestinales específicas en el intestino del ratón, en este estudio se utilizaron ratones Webster suizos libres de gérmenes que habían sido colonizados con aislados bacterianos individuales. Para este experimento, las especies bacterianas etiquetadas fueron i) un aislado humano de la familia Muribaculaceae5, Muribaculum intestinale, una familia abundante y prevalente de bacterias en la microbiota murina15, así como ii) Bacteroides thetaiotaomicron, una bacteria intestinal genéticamente tratable y común. Después de dos semanas de equilibrio, los ratones fueron sacrificados, y un segmento del colon que contenía un gránulo fecal fue seccionado y fijado en metacarno recién preparado. Después de dos días de fijación, las secciones se deshidrataron mediante el procesamiento a través de metanol, etanol y xilenos, se infiltraron con parafina, se incrustaron y luego se seccionaron en rodajas luminales de 4 μm. Estas muestras se tiñeron con una sonda FISH (3' Cy3-tagged) específica para el aislado de Muribaculum, diseñada utilizando el software Oligominer12, y se verificó la estructura secundaria y terciaria y la unión mínima no específica utilizando NuPACK y mathFISH16,17. Las muestras también se contrateñeron con la lectina UNIDA a la rodamina UEA-1 (que tiñe los glicanos fucosilados en el moco) y DAPI. Las secciones teñidas se tomaron imágenes utilizando un objetivo de aceite 40x y un módulo de superresolución.
Figura 1: Flujo de trabajo de visualización de la interfaz microbiota-huésped en el intestino. (A) Un flujo de trabajo ilustrado para la tubería. (B) Los dos planos de seccionamiento producirán secciones transversales (preferidas para esta tubería) o "rosquillas" de sección transversal. (C) La incrustación de tejidos de espesores muy diferentes puede dar lugar a rebanadas que solo son óptimas para un tejido u otro. Abreviaturas: FISH = hibridación fluorescente in situ ; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Las imágenes del colon muestran la localización de Muribaculum intestinale en relación con el moco en un modelo de ratón gnotobiótico. Las secciones se tiñeron con DAPI (azul), sonda Muribaculaceae FISH (rojo) y UEA-1 (verde). (A) Colon distal de ratón monocolonizado con Muribaculum intestinale y (B) colon distal de ratón bicolonizado con Muribaculum intestinale y Bacteroides thetaiotaomicron. Barra de escala = 20 μm. (C y D) Cy3-FISH (izquierda), DAPI (centro) y canales combinados Cy3-FISH + DAPI para porciones luminales insertadas de (A) y (B), respectivamente. Barra de escala = 5 μm. En (A) y (C), todas las señales DAPI con forma de bacteria y del tamaño de una bacteria están etiquetadas con Cy3 (puntas de flecha simples), y en (B) y (D), además de estas células Cy3 y DAPI de doble positivo (puntas de flecha simples), hay células bacterianas teñidas con DAPI que son Cy3 negativas (puntas de flecha dobles), como se espera para los estados de mono y bicolonización. Con la excepción de las bacterias filamentosas más largas, las estructuras DAPI positivas más grandes (>4 μm de longitud) (flechas romas) son material vegetal o núcleos de células huésped. Abreviaturas: FISH = hibridación fluorescente in situ ; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Problemas comunes. (A) La sección superficial no proporcionará cortes luminales del intestino. (Izquierda) Un segmento intestinal que ha sido seccionado a una profundidad que proporciona una vista de la luz, así como vistas longitudinales del epitelio. (Derecha) Un segmento intestinal que ha sido seccionado demasiado superficialmente, revelando solo secciones transversales de criptas y sin capa de moco constante o bacterias. (B) La cobertura desigual de tejido/deslizamiento puede dar lugar a exploraciones de baldosas borrosas y desigualmente iluminadas. Se configuró un escaneo de mosaicos con posiciones que estaban fuera de foco (esquina superior derecha). (C) Ejemplo de fondo normal (izquierda) y fondo alto (derecha). En este ejemplo, para la señal DAPI, observe la señal proveniente del epitelio, fuera de los núcleos. Todas las barras de escala = 20 μm. Abreviatura: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
El protocolo descrito anteriormente proporciona un método reproducible para visualizar la interfaz huésped-microbiota. Estos ensayos se han beneficiado considerablemente del desarrollo de protocolos, desde la optimización del etiquetado FISH18 hasta la preservación e imagen del moco9. La fijación y la incrustación también proporcionan un almacenamiento útil de muestras; además, los casetes infiltrados en parafina se pueden enviar por correo sin ninguna restricción, ya que las muestras están completamente fijas e inertes.
Importancia y métodos alternativos
La combinación de FISH y tinción de moco permite el análisis de la composición de la microbiota en ubicaciones específicas del tejido y la interacción entre las bacterias individuales y el huésped. Las técnicas alternativas que implican el análisis de sitios específicos dentro de la microbiota generalmente no pueden explorar la naturaleza unicelular de estas interacciones, como en el caso de la microdisección de captura láser junto con la secuenciación19. Sin embargo, las técnicas basadas en la secuenciación tienen la ventaja de poder capturar la composición genética de la microbiota a un nivel más fino y más ampliamente que las sondas de ARNr 16S.
Una trampa del protocolo presentado es que proporciona una instantánea única de la microbiota en relación con el huésped. Para la obtención de imágenes en tiempo real en animales vivos, se requieren técnicas especiales de imagen para facilitar la adquisición de una señal de fluorescencia en el tejido profundo (por ejemplo, microscopía intravital de dos fotones y microscopía de fluorescencia de lámina de luz20,21). En estos métodos, el organismo modelo es colonizado con bacterias que se tiñen con moléculas que se unen a su envoltura20 o bacterias modificadas genéticamente que albergan proteínas fluorescentes21. En este último caso, la maduración de las proteínas de fluorescencia es un tema clave, ya que la mayoría de las proteínas fluorescentes estándar requieren oxígeno para emitir luz. Por lo tanto, se requieren organismos modelo que tengan al menos ambientes nanaeróbicos (concentración nanomolar de oxígeno), como el intestino aeróbico del pez cebra21.
En este protocolo, el metanol-Carnoy se utiliza como fijador en lugar de paraformaldehído o formalina porque no contiene agua. Esto evita la hidratación, la deshidratación y el colapso de la capa de moco durante el procesamiento y facilita las mediciones precisas del grosor del moco. Si bien la fijación de metacarno y la incrustación de parafina se han convertido en un estándar en el campo, se han investigado diferentes fijadores y técnicas de incrustación para optimizar la preservación del moco9,22, y algunos estudios indican que las resinas pueden ser superiores a la incrustación de parafina22. Otra limitación importante para la incrustación de parafina y la fijación de metacarna es la pérdida de fluorescencia de proteínas fluorescentes, que puede evitarse mediante el uso de fijadores alternativos (por ejemplo, formalina o paraformaldehído (PFA)) o técnicas de incrustación modificadas23. Cada fijador tiene beneficios e inconvenientes, y la elección del fijador depende de las prioridades de imagen. Las modalidades de imagen se pueden combinar si las réplicas biológicas se fijan en PFA y metacarno y se obtienen imágenes de ambas muestras.
FISH se ha combinado con inmunofluorescencia en casos aislados con anticuerpos policlonales específicos anti-Muc2C3 de conejo9,24. Estos resultados no se han reproducido ampliamente con otros anticuerpos Muc2, lo que indica que la elección de los anticuerpos puede ser crítica en el éxito de la combinación FISH-inmunofluorescencia. Las condiciones para una tinción exitosa de anticuerpos para un anticuerpo dado pueden no permitir la retención de la tinción FISH.
Solución de problemas
En este protocolo, la recolección de muestras, la sección y la tinción representan pasos críticos para evitar la creación de artefactos de imágenes. Por ejemplo, presionar el tejido en el momento de la recolección y antes de la incrustación puede conducir a una mala localización de la microbiota y afectar la calidad del moco. Otra consideración importante es evitar la combinación de segmentos de espesores muy diferentes en un solo cassette, como una pieza relativamente vacía del intestino delgado y un pellet dentro del colon distal. Los diferentes espesores conducen a dificultades en la obtención de imágenes: después de la incrustación, la sección transversal a una profundidad específica para un segmento puede estar a la profundidad incorrecta para la obtención de imágenes para el otro (por ejemplo, la luz estará a diferentes profundidades para cada tejido) (Figura 1B, C y Figura 3A). Además, para la obtención de imágenes de gránulos de heces de modelo animal, pueden estar envueltos en membrana peritoneal24. En esta técnica, una pequeña sección de peritoneo recién aislado se pliega suavemente alrededor de las heces y preserva la estructura del pellet durante los pasos de lavado descritos en el protocolo.
A diferencia del procesamiento de tejido animal con contenido, la obtención de imágenes de muestras intestinales humanas presenta algunos desafíos. Específicamente, el contenido luminal y el revestimiento de la mucosa probablemente se verán interrumpidos por la preparación intestinal de colonoscopia que generalmente se realiza antes de las biopsias intestinales o los procedimientos de resección. Además, cuando se recolectan biopsias, es útil anotar la orientación del tejido para ayudar en la identificación de características específicas (por ejemplo, lumen vs. submucosa) en ausencia de contenido intestinal. Pre-incrustación con agar al 3% y/o agar:las mezclas de gelatina pueden ser útiles para mantener la polaridad del tejido25; sin embargo, hay problemas con la deshidratación y la sección de agar, como se informa en la literatura, y los tiempos de procesamiento pueden necesitar ser alterados.
Un aspecto clave para lograr una buena tinción fish proviene del ajuste de la concentración de formamida para sondas FISH específicas. La formamida controlará la rigurosidad de hibridación de las sondas FISH a sus objetivos. Es importante asegurarse de que a) se elija la concentración adecuada de formamida para teñir una comunidad determinada, y b) que incluso sea posible una concentración de formamida adecuada para la combinación de sonda que se está utilizando, esto puede afectar la elección óptima de la sonda cuando se utilizan múltiples sondas. Los sitios web como mathFISH (http://mathfish.cee.wisc.edu/) pueden ayudar a calcular las concentraciones adecuadas de formamida para una sonda determinada. En ausencia de información sobre las concentraciones apropiadas de formamida, este protocolo se puede probar con formamida al 0% y al 10%.
Seccionar las muestras incrustadas requiere cortar el bloque a una profundidad suficiente para obtener cortes luminales, ya que seccionar demasiado superficialmente en un bloque dará como resultado una vista transversal de las vellosidades / criptas sin contenido luminal (Figura 3A). Manche las muestras poco después de la sección para obtener una señal FISH óptima y use DAPI fresco (o DAPI almacenado a -20 ° C) para resolver problemas de fondo (Figura 3C). La tinción fish de secciones que tienen más de un mes de edad puede resultar en una tinción más pobre / inconsistente.
Si el tejido o el cubrebocas no es perfectamente plano con respecto a la diapositiva, es posible que la muestra no esté enfocada en todas las posiciones dentro de una exploración de mosaico (Figura 3B), lo que lleva a un esfuerzo desperdiciado y un posible fotoblanqueo. Esto se puede resolver tomando escaneos de mosaicos más pequeños en los que se ha verificado que todas las posiciones están enfocadas. La seccionamiento con cuchillas opacas también puede conducir al desprendimiento del contenido mucoso y luminal, que aparecen como grandes áreas oscuras durante la toma de imágenes. Finalmente, la evaporación de la solución o burbujas durante el paso de hibridación puede conducir a una tinción desigual de las sondas FISH en el tejido.
Otro parámetro crítico que afecta la eficiencia de la unión de la sonda FISH es la competencia entre diferentes sondas. Una comprobación útil para verificar que la sonda FISH está etiquetando bacterias es examinar la colocalización de la señal de la sonda FISH con DAPI (Figura 2C, D). En muestras que requieren el uso de múltiples sondas de ARNr, el ajuste de parámetros como la temperatura de hibridación, la concentración de la sonda y la formamida se vuelve crítico para garantizar que las sondas se unan a la especie correcta de manera eficiente18.
Notas sobre imágenes
Las bacterias teñidas con PECES se visualizan mejor utilizando un microscopio confocal y un objetivo de al menos 40x de aumento. Si bien se prefiere el aumento de 63x a las bacterias de imagen a nivel de una sola célula, el aumento de 40x también se puede usar maximizando el zoom digital o empleando un sistema de superresolución. Los sistemas equipados con capacidades de superresolución también pueden proporcionar resolución subcelular de células bacterianas individuales. Se pueden utilizar objetivos de menor aumento para obtener una sensación general de la localización bacteriana y el grosor del moco.
También se recomienda adquirir imágenes de 16 bits en lugar de imágenes de 8 bits, ya que el rango dinámico más alto ayudará a capturar el amplio rango de la señal DAPI de los núcleos extremadamente brillantes del epitelio y la señal relativamente débil de las bacterias luminales. Además de utilizar la configuración de imágenes descrita anteriormente, una consideración importante de las imágenes es la elección de los fluoróforos. Para una mejor separación entre los tipos bacterianos, asegúrese de que los fluoróforos utilizados no se superpongan en los espectros de excitación y emisión (a menos que se tomen imágenes en un sistema con la capacidad de realizar una desmezcla lineal). Además, las sondas se pueden usar en combinación (por ejemplo, la combinación de una sonda específica de la familia y una sonda específica del género) para identificar miembros adicionales de la comunidad. Si se utilizan sondas lineales sin mezclar o no validadas, es esencial probar la precisión y el nivel de tinción FISH en cultivos puros8,14.
Una vez recogidas las imágenes, se dispone de múltiples herramientas para el análisis cuantitativo de la interfaz huésped-microbiota, como BacSpace26, HiPR-FISH8 y otras herramientas de segmentación27. BacSpace es un software de MATLAB que permite la segmentación de los componentes tisulares y luminales y la eliminación de material vegetal de las imágenes26. El programa también proporciona análisis del espesor de moco en 2D y cuantificación de la distribución espacial basada en distancias de píxeles en diferentes canales26. Por el contrario, el software HiPR-FISH Image Analysis permite la segmentación de células teñidas con FISH8. Finalmente, otras herramientas de segmentación bacteriana que han sido optimizadas para experimentos in vitro27 también podrían adaptarse a esta aplicación.
Conclusión
Las imágenes in situ permiten el análisis cuantitativo de taxones microbianos individuales en el contexto de otros miembros de la comunidad y los diversos microambientes creados por la dieta, el moco y las criptas epiteliales del huésped. La interacción entre organismos dicta la biología de los sistemas microbianos asociados al huésped y proporciona un análisis esencial del cambio en estas estructuras durante la perturbación que tiene implicaciones para la salud. En particular, la capacidad de obtener imágenes de la microbiota in situ a través del protocolo descrito anteriormente proporciona una ventana increíble a la biogeografía de la microbiota en relación con el huésped animal.
Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses.
Acknowledgments
Kristen Earle por el invaluable desarrollo de la técnica, Amber Hann por la ayuda para la solución de problemas, la Dra. Jen Nguyen y Deanna Pepin por la revisión crítica del manuscrito, y el Dr. Hesham Soliman y el laboratorio Rossi de la Universidad de Columbia Británica por proporcionar acceso al microscopio. Los autores reconocen el apoyo de CIHR Team Grant: Canadian Microbiome Initiative 2 (C.T.), Crohn's and Colitis Canada (to C.T. and K.M.N.), CIFAR (to C.T. and K.M.N.), Michael Smith Foundation for Health Research Scholar Award (to C.T.), the Weston Foundation: Weston Family Microbiome Initiative (to C.T.), Paul Allen Distinguished Investigator Award (to C.T.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum foil | |||
| Chloroform | Fisher | C298-500 | Toxic |
| Coplin jar | Fisher | 08-813E | |
| Cover glass, 22 × 22 mm, no #1 | VWR | CA48366-227-1 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Resuspended to 5 mg/mL |
| Empty pipette tip box(es) | To melt paraffin | ||
| Ethanol, anhydrous, molecular grade | -- | -- | |
| FISH probes | |||
| FISH hybridization solution | -- | -- | 20 mM Tris–HCl pH 7.4, 0.9 M NaCl, 0.01% (w/v) SDS in nuclease-free water. Optional addition of 5–50% (v/v) formamide |
| FISH washing buffer | -- | -- | 20 mM Tris–HCl pH 7.4, 0.9 M NaCl |
| Fluorescently-labeled Ulex Europaeus Agglutinin (UEA-1) lectin | Vector Laboratories | FL-1061 (Fluorescein-labeled) or RL-1062-2 (Rhodamine-labeled) | UEA-1 labels fucosylated glycans, so it is not appropriate for germ-free mice or for samples from fucosyltransferase 2 (FUT2)-deficient hosts. |
| Forceps | |||
| Formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | |
| Fumehood | |||
| Glacial Acetic Acid | Fisher | A38-212 | Corrosive and flammable |
| HybriSlip flexible plastic cover slips, 22 x 22 mm × 0.25 mm | Sigma Aldrich | GBL722222 | for FISH hybridization steps, can substitute glass coverslips |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Kimwipes | |||
| Methanol | Fisher | A412 | Toxic and flammable |
| Microtome | for sectioning | ||
| Multipurpose Specimen Storage Containers, 473 mL | Fisher | 14-955-117A | Can substitute with a glass or polyethylene container of your choice. Methacarn is not compatible with polystyrene or metal. |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | Any nail polish should work |
| Oven | Necessary range: 45-60 °C | ||
| Paraffin: Leica Paraplast | Leica | 39601006 | |
| PBS, Phosphate-buffered Saline (10x solution) | Fisher | BP3991 | Dilute to 1x for protocol |
| Sodium chloride | Fisher | S271 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), 20% Solution, RNase-free | Invitrogen | AM9820 | |
| Tissue-Loc HistoScreen Cassettes | Thermo Scientific | CA83009-999 | |
| Trizma hydrochloride solution, 1M Tris-HCl, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2663-1L | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Water, nuclease-free | Fisher | BP2484100 | |
| Xylenes | Fisher | X3P-1GAL | Toxic and flammable |
References
- Tropini, C., Earle, K. A., Huang, K. C., Sonnenburg, J. L. The gut microbiome: connecting spatial organization to function. Cell Host and Microbe. 21 (4), 433-442 (2017).
- Hansson, G. C., Johansson, M. E. V. The inner of the two Muc2 mucin-dependent mucus layers in colon is devoid of bacteria. Gut Microbes. 1 (1), 51-54 (2010).
- Johansson, M. E. V., et al. Normalization of host intestinal mucus layers requires long-term microbial colonization. Cell Host and Microbe. 18 (5), 582-592 (2015).
- Jakobsson, H. E., et al. The composition of the gut microbiota shapes the colon mucus barrier. EMBO Reports. 16 (2), 164-177 (2015).
- Tropini, C., et al. Transient osmotic perturbation causes long-term alteration to the aut microbiota. Cell. 173 (7), 1742-1754 (2018).
- Desai, M. S., et al. A dietary fiber-deprived gut microbiota degrades the colonic mucus barrier and enhances pathogen susceptibility. Cell. 167 (5), 1339-1353 (2016).
- Ng, K. M., et al. Recovery of the gut microbiota after antibiotics depends on host diet, community context, and environmental reservoirs. Cell Host and Microbe. 26 (5), 650-665 (2019).
- Shi, H., et al. Highly multiplexed spatial mapping of microbial communities. Nature. 588 (7839), 676-681 (2020).
- Johansson, M. E. V., Hansson, G. C. Preservation of mucus in histological sections, immunostaining of mucins in fixed tissue, and localization of bacteria with FISH. Methods in Molecular Biology. 842, 229-235 (2012).
- Greuter, D., Loy, A., Horn, M., Rattei, T. ProbeBase-an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes and primers: New features 2016. Nucleic Acids Research. 44 (1), 586-589 (2016).
- Quast, C., et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: Improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Research. 41 (1), 590-596 (2013).
- Beliveau, B. J., et al. OligoMiner provides a rapid, flexible environment for the design of genome-scale oligonucleotide in situ hybridization probes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2183-2192 (2018).
- Madeira, F., et al. The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019. Nucleic Acids Research. 47 (1), 636-641 (2019).
- Welch, J. L. M., Hasegawa, Y., McNulty, N. P., Gordon, J. I., Borisy, G. G. Spatial organization of a model 15-member human gut microbiota established in gnotobiotic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (43), 9105-9114 (2017).
- Lagkouvardos, I., et al. Sequence and cultivation study of Muribaculaceae reveals novel species, host preference, and functional potential of this yet undescribed family. Microbiome. 7 (1), 28 (2019).
- Zadeh, J. N., et al. NUPACK: Analysis and design of nucleic acid systems. Journal of Computational Chemistry. 32 (1), 170-173 (2011).
- Yilmaz, L. S., Parnerkar, S., Noguera, D. R. MathFISH, a web tool that uses thermodynamics-based mathematical models for in silico evaluation of oligonucleotide probes for fluorescence in situ hybridization. Applied and Environmental Microbiology. 77 (3), 1118-1122 (2011).
- Huber, D., Voith von Voithenberg, L., Kaigala, G. V. Fluorescence in situ hybridization (FISH): History, limitations and what to expect from micro-scale FISH. Micro and Nano Engineering. 1, 15-24 (2018).
- Wang, Y., et al. Laser capture microdissection and metagenomic analysis of intact mucosa-associated microbial communities of human colon. Applied Microbiology and Biotechnology. 88 (6), 1333-1342 (2010).
- Geva-Zatorsky, N., et al. In vivo imaging and tracking of host–microbiota interactions via metabolic labeling of gut anaerobic bacteria. Nature medicine. 21 (9), 1091-1100 (2015).
- Jemielita, M., et al. Spatial and temporal features of the growth of a bacterial species colonizing the zebrafish gut. mBio. 5 (6), 01751 (2014).
- Hasegawa, Y., Mark Welch, J. L., Rossetti, B. J., Borisy, G. G. Preservation of three-dimensional spatial structure in the gut microbiome. PLoS ONE. 12 (11), 0188257 (2017).
- Zhanmu, O., et al. Maintenance of fluorescence during paraffin embedding of fluorescent protein-labeled specimens. Frontiers in Neuroscience. 13, 752 (2019).
- Bergstrom, K., et al. Proximal colon-derived O-glycosylated mucus encapsulates and modulates the microbiota. Science. 370 (6515), 467-472 (2020).
- Jones, M. V., Calabresi, P. A. Agar-gelatin for embedding tissues prior to paraffin processing. BioTechniques. 42 (5), 569-570 (2007).
- Earle, K. A., et al. Quantitative imaging of gut microbiota spatial organization. Cell Host and Microbe. 18 (4), 478-488 (2015).
- Jeckel, H., Drescher, K. Advances and opportunities in image analysis of bacterial cells and communities. FEMS Microbiology Reviews. , (2020).
