Summary
Questo protocollo semplificato descrive in dettaglio un flusso di lavoro per rilevare e visualizzare batteri in campioni di tessuto complessi, dal fissaggio del tessuto alla colorazione dei microbi con ibridazione fluorescente in situ .
Abstract
Misurare la localizzazione dei microbi all'interno del loro contesto in vivo è un passo essenziale per rivelare le relazioni funzionali tra il microbiota e l'intestino dei vertebrati. Il paesaggio spaziale del microbiota intestinale è strettamente controllato dalle caratteristiche fisiche - muco intestinale, cripte e pieghe - ed è influenzato da proprietà controllate dall'ospite come pH, disponibilità di ossigeno e fattori immunitari. Queste proprietà limitano la capacità dei microbi commensali e degli agenti patogeni di colonizzare stabilmente l'intestino. Su scala micron, l'organizzazione microbica determina le interazioni a distanza ravvicinata tra diversi microbi e le interazioni tra i microbi e il loro ospite. Queste interazioni influenzano quindi la funzione degli organi su larga scala e la salute dell'ospite.
Questo protocollo consente la visualizzazione dell'organizzazione spaziale del microbiota intestinale dalle distanze tra le cellule alle scale a livello di organo. Il metodo si basa sul fissaggio dei tessuti intestinali preservando la struttura intestinale e le proprietà del muco. I campioni fissi vengono quindi incorporati, sezionati e colorati per evidenziare specifiche specie batteriche attraverso l'ibridazione fluorescente in situ (FISH). Le caratteristiche dell'ospite, come il muco e i componenti delle cellule ospiti, sono etichettate con lectine marcate fluorescentemente. Infine, le sezioni macchiate vengono visualizzate utilizzando un microscopio confocale che utilizza l'imaging a scansione di piastrelle ad alto ingrandimento per collegare le scale di lunghezza da micron a centimetro. Questo tipo di imaging può essere applicato a sezioni intestinali da modelli animali e biopsie da tessuti umani per determinare la biogeografia del microbiota nell'intestino in salute e malattia.
Introduction
Le tecniche di visualizzazione microbica hanno origini antiche quanto la microbiologia stessa, quando Antonie Van Leeuwenhoek usò il suo microscopio per osservare i batteri (che chiamava "animalcules") dalla placca dei denti e dalle feci nel 17 ° secolo. Da allora, sono state sviluppate numerose tecniche per visualizzare l'organizzazione spaziale del consorzio di batteri, funghi e virus che vivono associati a un ospite: il microbiota1. Chiarire la localizzazione di questi microbi è essenziale per determinare la loro funzione all'interno del loro ospite animale. La biogeografia dei batteri è importante sia nei taxa commensali che in quelli patogeni, poiché la vicinanza a posizioni specifiche (ad esempio, l'epitelio), substrati nutrizionali e microbi specifici può dettare la produzione batterica di metaboliti alla base delle interazioni interspecie e inter-regno.
Una struttura chiave che separa i batteri e i tessuti ospiti in diversi siti corporei disparati, come la cavità orale, l'intestino o il polmone, è il muco - uno strato prodotto dall'ospite che impedisce la traslocazione microbica sulle cellule epiteliali dell'ospite e funge da risorsa nutrizionale per il microbiota2,3,4 . Caratterizzare le violazioni e i cambiamenti in questa barriera è di fondamentale importanza, portando a una comprensione meccanicistica delle interazioni ospite-microbiota che non sarebbero ottenute sequenziando da solo5,6,7. Ad esempio, l'imaging ha permesso di scoprire che l'esposizione agli antibiotici può interrompere lo strato di muco e l'organizzazione del microbiota7,8 e che i lassativi possono esaurire il muco, correlando con grandi cambiamenti nei parametri immunitari5.
Questo protocollo delinea un quadro generale per il fissaggio, la colorazione e l'imaging del microbiota e del tessuto ospite (Figura 1), basato sul lavoro di Johansson e Hansson9. Mentre questo protocollo è modellato nel contesto delle sezioni intestinali, può essere facilmente adattato ad altri tipi di tessuto. Questo protocollo consente l'elaborazione di campioni clinici animali da esperimento o umani; sono state incluse note per l'elaborazione di entrambi i tipi di campioni. Nell'esempio qui presentato, l'epitelio ospite e i batteri luminali sono stati simultaneamente etichettati con la colorazione 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI), il muco con la lectina coniugata con fluoresceina (FITC), l'agglutinina I di Ulex europaeus (UEA-1) e uno specifico taxon batterico che utilizza FISH. Le sonde FISH sono solitamente progettate contro i geni rRNA 16S di un taxon per garantire che il segnale elevato leghi un trascritto ad alta copia.
In questo esempio, la sonda prende di mira l'rRNA 16S della famiglia batterica delle Muribaculaceae (Figura 2). Tuttavia, le macchie sono prontamente sostituite con diverse sonde FISH e / o lectine per soddisfare la domanda biologica appropriata. Le sonde FISH precedentemente convalidate possono essere trovate su ProbeBase10, una risorsa online per sonde oligonucleotidiche mirate all'rRNA, o su SILVA11, un database di RNA ribosomiale. Per la progettazione di nuove sonde, il lettore può fare riferimento a nuove pipeline come HiPR-FISH8 o Oligominer12. Utilizzando questo protocollo, è possibile osservare l'impacchettamento ravvicinato dei batteri nel lume intestinale e le diverse caratteristiche del muco intestinale in tutto il tratto digestivo. Il flusso di lavoro qui descritto consente l'analisi quantitativa del microbiota nel contesto spaziale del suo ambiente ospite.
Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali e la raccolta dei tessuti descritti in questo protocollo sono stati eseguiti in conformità con le linee guida del Canadian Council on Animal Care (CCAC) e sono stati approvati dall'Animal Care Committee dell'Università della British Columbia. Sono stati utilizzati topi Webster svizzeri privi di germi. Tutti gli animali avevano un'età di 8-10 settimane, sono stati usati entrambi i sessi e tutti i topi sono stati co-ospitati con almeno due topi per gabbia. Gli animali sono stati sottoposti a eutanasia utilizzando anidride carbonica con lussazione cervicale secondaria o puntura cardiaca.
1. Progettare un esperimento di imaging: considerazioni e raccolta di campioni
- Design della sonda FISH
- Se esiste una sonda FISH appropriata, selezionarne una precedente pubblicata che mostri un segnale forte nelle celle etichettate rispetto allo sfondo.
- Convalidare nuove sonde in vitro per determinare la loro efficienza di legame a campioni fissi dei batteri bersaglio e legame off-target ad altri batteri.
- Controllare tutte le sonde 16S FISH da utilizzare contro sequenze 16S dall'organismo bersaglio o contro il sequenziamento dell'rRNA 16S dai campioni da analizzare per garantire che sia presente la percentuale prevista di corrispondenze positive e che le sonde non si leghino in modo non specifico ad altri membri del microbiota.
- Allineare le sonde FISH rispetto a sequenze a lunghezza intera o varianti di sequenze amplicon utilizzando uno strumento, come Clustal Omega13, per valutare il potenziale legame delle sonde e dei loro bersagli.
- Oltre ai test in silico, testare l'accuratezza e il livello di colorazione FISH di sonde non convalidate su colture pure8,14.
NOTA: quando si colorano più membri della comunità, le sonde possono essere utilizzate in modo combinatorio (ad esempio, la combinazione di una sonda specifica della famiglia e di una sonda specifica del genere) se i fluorofori utilizzati non si sovrappongono negli spettri di eccitazione ed emissione (a meno che l'imaging su un sistema con la capacità di eseguire unmixing lineare). Inoltre, la specificità può essere dimostrata includendo controlli di specificità/sonde criptate o in concorrenza con sonde non fluorescenti.
- Tipi di campioni e raccolta dei tessuti
- Utilizzando strumenti nitidi e puliti, tagliare i segmenti intestinali dai topi webster svizzeri gnotobiotici per l'imaging. Riduci al minimo il disturbo del campione il più possibile e gestisci le sezioni dai bordi per evitare di influenzare l'area di imaging. Fissare il campione il prima possibile dopo la dissezione per evitare la degradazione.
NOTA: per gli studi sugli animali, sono preferite sezioni intestinali intatte e non fluenti; la membrana aiuterà a mantenere intatta l'organizzazione luminale e mucosale. - Pulire gli strumenti pulendoli con il 70% di etanolo tra campioni e siti. Ottenere almeno tre repliche biologiche per sezione intestinale / posizione bioptica, avendo cura di campionare posizioni intestinali coerenti, poiché il muco e l'architettura intestinale e il microbiota cambiano significativamente in posizioni diverse.
- Utilizzando strumenti nitidi e puliti, tagliare i segmenti intestinali dai topi webster svizzeri gnotobiotici per l'imaging. Riduci al minimo il disturbo del campione il più possibile e gestisci le sezioni dai bordi per evitare di influenzare l'area di imaging. Fissare il campione il prima possibile dopo la dissezione per evitare la degradazione.
2. Fissazione e infiltrazione del campione di tessuto
- Fissazione
- Preparare il metacarn fresco in un contenitore compatibile con i seguenti rapporti: 60% di metanolo assoluto, 30% di cloroformio e 10% di acido acetico glaciale. Erogare ciascuna di queste sostanze chimiche in una cappa aspirante. Scegli un contenitore che può essere ventilato aprendo il coperchio. Poiché il metacarn non è compatibile con il polistirene, prepararlo in un contenitore di polietilene, utilizzando cilindri graduati di vetro /pipette sierologiche per il cloroformio e l'acido acetico glaciale.
NOTA: Durante la miscelazione, vengono prodotti fumi che possono causare l'accumulo di pressione all'interno del contenitore. Si consiglia di tenere il contenitore relativamente ben chiuso una volta rimosso dalla cappa aspirante se i campioni non vengono aggiunti attivamente. Il cloroformio è tossico; non inalare, deglutire o assorbire attraverso la pelle. Il metanolo è tossico e altamente infiammabile; non inalare, deglutire o assorbire attraverso la pelle. L'acido acetico glaciale è infiammabile e altamente corrosivo per la pelle e gli occhi. - Dopo l'erogazione, chiudere il contenitore, ruotare per mescolare e quindi sfiatare; ripetere questa operazione fino a quando la degassificazione non si è fermata (e la pressione non si accumula più sensibilmente sotto il coperchio).
NOTA: Non smaltire il metacarn negli scarichi; raccogliere e smaltire come rifiuti chimici pericolosi secondo le linee guida istituzionali. Utilizzare una matita per etichettare le cassette istologiche, poiché molti inchiostri per penna si staccano nella soluzione di metacarn. - Posizionare le sezioni intestinali in cassette di istologia tenendo delicatamente un bordo del tessuto con una pinzetta. Chiudere la cassetta e immergerla completamente in una soluzione di metacarn fresco. Assicurarsi che la soluzione non sia più vecchia di qualche ora dopo l'immersione delle cassette.
- Per i campioni clinici che verranno raccolti in una suite clinica senza accesso a una cappa aspirante, utilizzare un contenitore di stoccaggio in polietilene con un lembo tagliato nel coperchio che consentirà il passaggio delle cassette istologiche. Nastro chiuso questo lembo quando non si passano campioni per impedire la fuoriuscita di fumi tossici.
NOTA: è importante utilizzare del nastro adesivo per evitare la dissoluzione della colla sul contenitore: alcuni tipi di nastro (ad esempio, nastro da imballaggio in plastica) potrebbero non reggere bene ai fumi del metacarn. - Fissare i campioni per un minimo di 3 ore e un massimo di due settimane.
NOTA: i campioni più spessi possono richiedere tempi di fissaggio superiori a 3 ore. Il tempo di fissazione può essere scelto per consentire l'elaborazione simultanea dell'infiltrazione di paraffina per cassette fissate in diverse soluzioni di metacarno (ad esempio, per eseguire simultaneamente l'infiltrazione di paraffina su gruppi di campioni raccolti e fissati nell'arco di due settimane).
- Preparare il metacarn fresco in un contenitore compatibile con i seguenti rapporti: 60% di metanolo assoluto, 30% di cloroformio e 10% di acido acetico glaciale. Erogare ciascuna di queste sostanze chimiche in una cappa aspirante. Scegli un contenitore che può essere ventilato aprendo il coperchio. Poiché il metacarn non è compatibile con il polistirene, prepararlo in un contenitore di polietilene, utilizzando cilindri graduati di vetro /pipette sierologiche per il cloroformio e l'acido acetico glaciale.
- Infiltrazione e incorporamento di paraffina
- Mettere la paraffina in un contenitore resistente al calore e scioglierla in forno a 60 °C durante la notte. Poiché i pellet di paraffina occupano più spazio prima di sciogliersi, assicurarsi che venga fusa una quantità sufficiente di paraffina per coprire tutte le cassette.
NOTA: La temperatura non deve essere superiore a 60 °C in quanto può dare origine a artefatti. - Lavare il fazzoletto versando il liquido nell'apposito contenitore di scarico e sostituendolo immediatamente con i seguenti prodotti chimici.
- Incubare in metanolo assoluto per 30 minuti. Ripetere una volta.
- Incubare in etanolo assoluto per 20 minuti. Ripetere una volta.
- Incubare in xilene per 15 minuti. Ripetere una volta.
- Sostituire i lavaggi velocemente, avendo cura di evitare di lasciare asciugare le cassette. Assicurarsi che ogni lavaggio copra completamente le cassette nel becher o nel contenitore.
NOTA: Gli xileni sono infiammabili e, se inalati, i vapori possono deprimere il sistema nervoso centrale con potenziali conseguenze neurologiche a lungo termine in caso di esposizione ad alte concentrazioni (>200 ppm). Maneggiare gli xileni solo all'interno di una cappa aspirante. Poiché gli xileni sono pericolosi, fare attenzione a utilizzare la quantità minima necessaria per coprire le cassette istologiche.
- Durante l'incorporamento, orientare i segmenti intestinali parallelamente alla lunghezza della cassetta (anziché in posizione verticale) utilizzando una pinzetta per fornire sezioni longitudinali trasversali anziché ciambelle trasversali per fornire più area di campionamento potenziale per l'imaging quantitativo (Figura 1B).
- Aprire leggermente le cassette (~ 1-2 cm o 0,5 pollici) per consentire alla paraffina di entrare senza perdere i segmenti di tessuto. Utilizzare doppi guanti per questo passaggio o pinzette per evitare il surriscaldamento o la lieve combustione delle dita. Immergere e chiudere le cassette nel contenitore di paraffina fusa, rimettendo il contenitore nel forno a 60 °C. Assicurarsi che le cassette siano riempite con paraffina e che non rimangano grandi bolle d'aria.
- Dopo l'incubazione per 2 ore a 60 °C, rimuovere il contenitore dal forno. Usando una pinza, rimuovere con cura le cassette e appoggiarle singolarmente su un pezzo di foglio di alluminio per raffreddarle. Conservali a temperatura ambiente fino a quando non sono pronti per l'incorporamento e il sezionamento.
- Sezionare i blocchi di paraffina con un microtomo, sezionando abbastanza in profondità nel blocco da esporre il contenuto luminale, consentendo una sezione longitudinale di villi e / o cripte oltre al contenuto luminale e al muco. Fare attenzione a sostituire le lame poiché il materiale fecale opacizza rapidamente la lama rispetto al tessuto. Tagliare le sezioni a 4 μm di spessore per una nitidezza ottimale delle immagini. Trasferire le sezioni su normali diapositive non rivestite.
- Per la colorazione FISH, colorare le sezioni intestinali il prima possibile (cioè entro poche settimane dal sezionamento) per ottenere un forte segnale FISH. Se si omette la colorazione FISH, la colorazione lectina + DAPI può essere eseguita su campioni meno freschi (cioè di mesi) senza una significativa perdita di segnale.
- Mettere la paraffina in un contenitore resistente al calore e scioglierla in forno a 60 °C durante la notte. Poiché i pellet di paraffina occupano più spazio prima di sciogliersi, assicurarsi che venga fusa una quantità sufficiente di paraffina per coprire tutte le cassette.
3. Colorazione dei batteri e delle caratteristiche dell'ospite
- Preparazione
- Riscaldare il forno a 60 °C. Preriscaldare un barattolo coplin vuoto e il volume sufficiente per coprire due volte i vetrini nel barattolo con xileni in una bottiglia di vetro, avendo cura di parafilmare intorno al coperchio per evitare l'evaporazione degli xileni. Lasciare che la temperatura degli xileni raggiunga i 60 °C.
NOTA: un barattolo Coplin standard si adatta a 8 diapositive e le diapositive possono essere coperte con circa 50 ml di liquido (possono variare tra 40 e 60 ml a seconda della marca). I sostituti dello xilene sono meno tossici e sono stati utilizzati con successo da altri gruppi per la fase di de-ceretta (fase 3.2)8,9. - Se è disponibile un forno separato, preriscaldare un forno di ibridazione a 50 °C. In caso contrario, questa fase può essere eseguita con lo stesso forno utilizzato per la cottura dei vetrini dopo il punto 3.2.3.
- Preparare la soluzione di ibridazione FISH: 20 mM Tris-HCl, pH 7,4; 0,9 m NaCl; 0,01%26 - 0,1%9 (p/v) dodecilsolfato di sodio (SDS) in acqua priva di nucleasi. Se necessario, aggiungere il 5-50% (v/v) di formammide. Preriscaldare questa soluzione di ibridazione a 50 °C durante la deparaffinazione.
NOTA: La formamide è un'ammide che agisce come teratogeno; maneggiare la formamide con guanti e occhiali. In piccole dosi e dopo l'esposizione agli occhi, alla pelle o alle mucose, è irritante. In grandi quantità, il vapore di formammide può richiedere un intervento medico. La formammide può essere conservata al 100% in un congelatore a -20 °C.
- Riscaldare il forno a 60 °C. Preriscaldare un barattolo coplin vuoto e il volume sufficiente per coprire due volte i vetrini nel barattolo con xileni in una bottiglia di vetro, avendo cura di parafilmare intorno al coperchio per evitare l'evaporazione degli xileni. Lasciare che la temperatura degli xileni raggiunga i 60 °C.
- Preparazione dei vetrini per la colorazione: deparaffinizzazione
- Posizionare i vetrini nel barattolo Coplin, assicurandosi che le sezioni non entrino in contatto con altri vetrini o con il barattolo, e cuocere i vetrini a 60 °C per 10 minuti.
- Nella cappa aspirante, riempire il barattolo Coplin con xileni preriscaldati dal forno, facendo attenzione a non versare direttamente sopra i campioni e potenzialmente rimuovere i tessuti. Rimettere il barattolo Coplin nel forno a 60 °C. Lasciare la bottiglia con gli xileni rimanenti nella cappa aspirante.
- Versare gli xileni usati in un apposito contenitore per lo smaltimento, avendo cura di non disturbare le sezioni di tessuto sui vetrini e utilizzando un paio di pinze per evitare che i vetrini cadano fuori dal barattolo Coplin. Ricostituire il barattolo Coplin con gli xileni rimanenti e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente nella cappa aspirante.
- Incubare le sezioni in etanolo al 99,5% per 5 minuti a temperatura ambiente. Dopo questa fase di incubazione, rimuovere i vetrini dal barattolo Coplin, pulire il retro dei vetrini su una salvietta da laboratorio o un tovagliolo di carta e asciugare brevemente all'aria fino a quando le goccioline di etanolo non sono sparite.
NOTA: la pulizia del retro delle diapositive consente una migliore visualizzazione dell'avanzamento dell'asciugatura.
- Colorazione batterica con FISH
- Utilizzare un bloccante liquido o una penna PAP per limitare l'area di espansione del liquido circondando l'area di ciascuna sezione di tessuto. Assicurarsi che l'inchiostro non entri in contatto con la sezione stessa. Creare un cerchio il più vicino possibile a ciascuna sezione di tessuto senza contattare il tessuto per ridurre al minimo l'area superficiale che deve essere coperta dalla soluzione di ibridazione.
- Preparare la soluzione di ibridazione: per ogni 50 μL di soluzione di ibridazione preriscaldata, aggiungere una sonda da 0,5 μg (ad esempio, 0,5 μL di sonda da 1 μg/μL). Pipettare la soluzione di ibridazione sulle sezioni della slitta (~20 μL/sezione, a seconda delle dimensioni della sezione/cerchio). Proteggere la soluzione di ibridazione e le diapositive dalla luce da questo punto in poi durante le fasi di incubazione e stoccaggio.
- Assicurarsi che il volume di liquido utilizzato copra l'intera sezione al momento della posa con un coperchio di plastica flessibile. Incubare il vetrino in una camera umida per ridurre l'evaporazione. Creare una camera umida con una scatola di punta della pipetta con salviette o asciugamani di carta sul fondo che sono stati imbevuti di soluzione di ibridazione in eccesso o soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per fornire umidità. Incubare le sezioni a 45-50 °C, a seconda del set di sonde, per >3 h.
- Riscaldare il tampone di lavaggio FISH: 20 mM Tris-HCl, pH 7,4; Da 0,9 M NaCl a 50 °C durante il periodo di incubazione. Preparare abbastanza tampone di lavaggio per coprire le diapositive nel barattolo Coplin.
- Rimuovere le coperture di plastica; incubare i vetrini nel tampone di lavaggio FISH in un barattolo Coplin, entrambi preriscaldati a 50 °C. Rimettere il barattolo Coplin nel forno a 50 °C per 10-20 minuti. Per campioni spessi, rimuovere i coverslip nel barattolo Coplin aggiungendo il buffer e spostando delicatamente i coverslips per evitare di spalmare la fetta.
- Colorazione delle caratteristiche del muco e dell'ospite
- Preparare una controcolorazione generale dna/muco in PBS: finale 10 μg/mL DAPI + 40 μg/mL di muffa MACCHIA UEA-1. Preparare abbastanza contromacchia per coprire le macchie in assenza di una copertura per evitare di danneggiare il tessuto con ulteriori coverslip.
NOTA: coprire i punti in assenza di una copertura richiederà volumi maggiori rispetto ai 20 μL utilizzati in 3.3.2. Per sezioni di medie dimensioni (~ 10 mm di diametro), 200 μL sono sufficienti per coprire un punto; testare questo volume in anticipo su una diapositiva fittizia. - Rimuovere il tampone di lavaggio FISH e sostituirlo con PBS nel barattolo Coplin. Subito dopo aver riempito il barattolo Coplin con PBS, decantare il PBS.
- Rimuovere i vetrini dal barattolo e pipettare la controcolorazione sulla parte superiore della sezione assicurandosi di non toccare il tessuto con la punta della pipetta. Coprire l'intera sezione con una bolla. Incubare a 4 °C per 45 minuti al buio.
- Lavare le macchie 3 volte rapidamente con PBS fresco: tenendo le diapositive in posizione usando una pinzetta, versare il PBS in un lavandino e riempire immediatamente con PBS fresco.
- Pulendo il retro delle diapositive contro una salvietta o un tovagliolo di carta, lasciare evaporare la maggior parte del PBS dalle sezioni, aiutato da una linea di vuoto collegata a una punta della pipetta. Ancora una volta, evitare di toccare la sezione con la punta della pipetta.
- Montare le sezioni utilizzando un mezzo di montaggio (senza DAPI) e lasciarlo impostare a temperatura ambiente coperto da coperture in vetro, assicurandosi che i coperchi siano piatti e che non ci siano bolle d'aria nel mezzo di montaggio.
- Apporre le coverslips sulla diapositiva dipingendo lungo i bordi del coverslip con smalto trasparente, avendo cura di stare lontano dal bordo del vetrino per assicurarsi che il vetrino si trovi a livello nel supporto del vetrino del microscopio durante l'imaging.
- Conservare i vetrini a 4 °C al buio per alcune settimane prima che la fluorescenza si esaurisca.
- Preparare una controcolorazione generale dna/muco in PBS: finale 10 μg/mL DAPI + 40 μg/mL di muffa MACCHIA UEA-1. Preparare abbastanza contromacchia per coprire le macchie in assenza di una copertura per evitare di danneggiare il tessuto con ulteriori coverslip.
4. Imaging e analisi delle immagini
- Visualizzazione delle macchie
- Selezionare un'area del tessuto che contiene sia tessuto che lume per visualizzare l'interfaccia microbiota-ospite. Per l'imaging quantitativo dello spessore del muco e della biogeografia luminale, selezionare i campi visivi in cui le fette dei villi epiteliali e/o delle cripte sono longitudinali e non trasversali. Evitare le aree con grandi spazi tra il muco e l'epitelio per evitare di sezionare artefatti.
- Localizzare il tessuto e correggere il piano focale, utilizzando il segnale DAPI per la localizzazione e la messa a fuoco per evitare il fotosbiancamento del segnale di fluorescenza FISH.
- Regolare le impostazioni di imaging. Per visualizzare la macchia BATTERICA DAPI, aumentare la potenza del laser e guadagnare fino al punto in cui il segnale DAPI dalle cellule epiteliali è sovrasaturato o "espulso".
NOTA: Non sovrasaturare eccessivamente, in quanto ciò porterà a fotosbiancamento e artefatti visivi nei nuclei che non possono essere recuperati. - Per tutti gli altri canali, utilizzare la quantità minima di potenza laser che fornirà un segnale chiaro sopra lo sfondo e fare attenzione a non sovrasaturare.
NOTA: questo è particolarmente importante quando si eseguono scansioni di riquadri, poiché il fotosbiancamento sarà problematico quando viene creata un'immagine della sovrapposizione tra i riquadri. - Usa un ingrandimento 40x o superiore per visualizzare i singoli batteri.
- Acquisisci le immagini.
- Acquisire scansioni di piastrelle per ottenere dati quantitativi sullo spessore del muco e sulla distribuzione spaziale dei microbi all'interno del lume. Garantire una sovrapposizione del 15% tra le tessere e verificare la presenza di vignettatura/illuminazione irregolare, che potrebbe essere esacerbata dallo zoom <1x. Quando si imposta una scansione dei riquadri, prestare molta attenzione al fatto che il tessuto sia a fuoco in tutti i riquadri, poiché le immagini sfocate/sfocate non possono essere analizzate (Figura 3B).
- Se possibile, ridurre al minimo il numero di tessere necessarie per l'immagine di una determinata lunghezza di epitelio ruotando l'area di scansione in modo che l'epitelio e lo strato di muco siano paralleli alla piastrella e non ad angolo. Altrimenti, trova una sezione dell'epitelio parallela o perpendicolare all'area di imaging per ottenere un effetto simile.
Representative Results
Per studiare la localizzazione di specifici batteri commensali intestinali nell'intestino del topo, in questo studio sono stati utilizzati topi Webster svizzeri privi di germi che erano stati colonizzati con singoli isolati batterici. Per questo esperimento, le specie batteriche etichettate erano i) un isolato umano della famiglia delle Muribaculaceae5, Muribaculum intestinale, una famiglia abbondante e prevalente di batteri nel microbiota murino15, nonché ii) Bacteroides thetaiotaomicron, un batterio intestinale geneticamente trattabile e comune. Dopo due settimane di equilibrio, i topi sono stati sottoposti a eutanasia e un segmento del colon contenente un pellet fecale è stato sezionato e fissato in metacarn appena preparato. Dopo due giorni di fissazione, le sezioni sono state disidratate mediante lavorazione attraverso metanolo, etanolo e xileni, infiltrate con paraffina, incorporate e quindi sezionate a fette luminali da 4 μm. Questi campioni sono stati poi colorati con una sonda FISH (3' Cy3-tagged) specifica per l'isolato muribaculum, progettata utilizzando il software Oligominer12, e controllata per la struttura secondaria e terziaria e il legame minimo non specifico utilizzando NuPACK e mathFISH16,17. I campioni sono stati anche controcolorati con la lectina legata alla rodamina UEA-1 (che colora i glicani fucosilati nel muco) e DAPI. Le sezioni macchiate sono state riprese utilizzando un obiettivo a olio 40x e un modulo di super-risoluzione.
Figura 1: Flusso di lavoro di visualizzazione dell'interfaccia microbiota-ospite nell'intestino. (A) Un flusso di lavoro illustrato per la pipeline. (B) I due piani di sezionamento produrranno sezioni trasversali (preferite per questa tubazione) o "ciambelle" di sezione trasversale. (C) L'incorporamento di tessuti di spessori molto diversi può portare a fette ottimali solo per un tessuto o un altro. Abbreviazioni: FISH = ibridazione fluorescente in situ ; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindolo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: L'imaging del colon mostra la localizzazione di Muribaculum intestinale rispetto al muco in un modello murino gnotobiotico. Le sezioni sono state colorate con DAPI (blu), sonda Muribaculaceae FISH (rosso) e UEA-1 (verde). (A) Colon distale di topo monocolonizzato con Muribaculum intestinale e (B) colon distale di topo bi-colonizzato con Muribaculum intestinale e Bacteroides thetaiotaomicron. Barra della scala = 20 μm. (C e D) Cy3-FISH (a sinistra), DAPI (al centro) e canali combinati Cy3-FISH + DAPI per porzioni di inserto luminale di (A) e (B), rispettivamente. Barra di scala = 5 μm. In (A) e (C), tutti i segnali DAPI a forma di batterio e di dimensioni batteriche sono etichettati con Cy3 (punte di freccia singole) e in (B) e (D), oltre a queste cellule Cy3 e DAPI doppie positive (singole punte di freccia), ci sono cellule batteriche colorate con DAPI che sono Cy3-negative (doppie punte di freccia), come previsto per gli stati mono- e bi-colonizzazione. Ad eccezione dei batteri filamentosi più lunghi, le strutture DAPI-positive (>4 μm di lunghezza) (frecce smussate) sono materiale vegetale o nuclei delle cellule ospiti. Abbreviazioni: FISH = ibridazione fluorescente in situ ; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindolo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Problemi comuni. (A) Il sezionamento superficiale non fornirà fette luminali dell'intestino. (A sinistra) Un segmento intestinale che è stato sezionato a una profondità che fornisce una visione del lume e viste longitudinali dell'epitelio. (Destra) Un segmento intestinale che è stato sezionato troppo superficialmente, rivelando solo sezioni trasversali di cripte e nessuno strato di muco o batteri costanti. (B) La copertura irregolare del tessuto / coverslip può causare scansioni di piastrelle sfocate e illuminate in modo non uniforme. È stata impostata una scansione delle tessere con posizioni sfocate (angolo in alto a destra). (C) Esempio di sfondo normale (a sinistra) e sfondo alto (a destra). In questo esempio, per il segnale DAPI si noti il segnale proveniente dall'epitelio, al di fuori dei nuclei. Tutte le barre della scala = 20 μm. Abbreviazione: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindolo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
Il protocollo sopra descritto fornisce un metodo riproducibile per visualizzare l'interfaccia ospite-microbiota. Questi saggi hanno notevolmente beneficiato dello sviluppo del protocollo, a partire dall'ottimizzazione dell'etichettatura FISH18 alla conservazione e all'imaging del muco9. La fissazione e l'incorporamento forniscono anche un'utile conservazione dei campioni; inoltre, le cassette infiltrate di paraffina possono essere spedite senza alcuna restrizione, poiché i campioni sono completamente fissi e inerti.
Significato e metodi alternativi
La combinazione di FISH e colorazione del muco consente l'analisi della composizione del microbiota in specifiche posizioni tissutali e l'interazione tra i singoli batteri e l'ospite. Le tecniche alternative che comportano l'analisi di siti specifici all'interno del microbiota di solito non sono in grado di esplorare la natura unicellulare di queste interazioni, come nel caso della microdissezione a cattura laser accoppiata con il sequenziamento19. Tuttavia, le tecniche basate sul sequenziamento hanno il vantaggio di essere in grado di catturare il corredo genetico del microbiota a un livello più fine e più in generale rispetto alle sonde di rRNA 16S.
Un'insidia del protocollo presentato è che fornisce un'istantanea una tantum del microbiota in relazione all'ospite. Per l'imaging in tempo reale in animali vivi, sono necessarie tecniche di imaging speciali per facilitare l'acquisizione di un segnale di fluorescenza nei tessuti profondi (ad esempio, microscopia intravitale a due fotoni e microscopia a fluorescenza a foglio di luce20,21). In questi metodi, l'organismo modello viene colonizzato con batteri colorati con molecole che si legano al loro involucro20 o batteri geneticamente modificati che ospitano proteine fluorescenti21. In quest'ultimo caso, la maturazione delle proteine di fluorescenza è un problema chiave in quanto la maggior parte delle proteine fluorescenti standard richiede ossigeno per emettere luce. Pertanto, sono necessari organismi modello che abbiano almeno ambienti nanaerobici (concentrazione nanomolare di ossigeno), come l'intestino aerobico del pesce zebra21.
In questo protocollo, il metanolo-Carnoy viene utilizzato come fissativo al posto della paraformaldeide o della formalina perché non contiene acqua. Ciò previene l'idratazione, la disidratazione e il collasso dello strato di muco durante la lavorazione e facilita misurazioni accurate dello spessore del muco. Mentre la fissazione del metacarne e l'incorporamento della paraffina sono diventati uno standard sul campo, sono stati studiati diversi fissativi e tecniche di incorporamento per ottimizzare la conservazione del muco9,22, con alcuni studi che indicano che le resine possono essere superiori all'incorporamento di paraffina22. Un'altra importante limitazione all'incorporamento di paraffina e alla fissazione del metacarno è la perdita di fluorescenza proteica fluorescente, che può essere evitata utilizzando fissativi alternativi (ad esempio, formalina o paraformaldeide (PFA)) o tecniche di incorporamento modificate23. Ogni fissativo ha vantaggi e svantaggi e la scelta del fissativo dipende dalle priorità di imaging. Le modalità di imaging possono essere combinate se le repliche biologiche sono fissate in PFA e metacarn e le immagini sono ottenute da entrambi i campioni.
FISH è stato combinato con immunofluorescenza in casi isolati con anticorpi policlonali specifici anti-Muc2C3 coniglio9,24. Questi risultati non sono stati ampiamente riprodotti con altri anticorpi Muc2, indicando che la scelta degli anticorpi può essere fondamentale per il successo della combinazione FISH-immunofluorescenza. Le condizioni per una colorazione anticorpale efficace per un determinato anticorpo potrebbero non consentire la ritenzione della colorazione FISH.
Risoluzione dei problemi
In questo protocollo, la raccolta, il sezionamento e la colorazione dei campioni rappresentano passaggi critici per impedire la creazione di artefatti di imaging. Ad esempio, premere sul tessuto al momento della raccolta e prima dell'incorporamento può portare a una cattiva localizzazione del microbiota e influire sulla qualità del muco. Un'altra considerazione importante è quella di evitare di combinare segmenti di spessori molto diversi in una singola cassetta, come un pezzo relativamente vuoto dell'intestino tenue e un pellet all'interno del colon distale. I diversi spessori portano a difficoltà nell'imaging: dopo l'incorporamento, il sezionamento trasversale a una profondità specifica per un segmento può essere alla profondità sbagliata per l'imaging per l'altro (ad esempio, il lume sarà a profondità diverse per ciascun tessuto) (Figura 1B, C e Figura 3A). Inoltre, per l'imaging di pellet di feci modello animale, possono essere avvolti in membrana peritoneale24. In questa tecnica, una piccola sezione di peritoneo appena isolato viene delicatamente piegata attorno alle feci e preserva la struttura del pellet durante le fasi di lavaggio delineate nel protocollo.
A differenza della lavorazione del tessuto animale con contenuto, l'imaging di campioni intestinali umani presenta alcune sfide. In particolare, il contenuto luminale e il rivestimento della mucosa saranno probabilmente interrotti dalla preparazione della colonscopia intestinale solitamente eseguita prima delle biopsie intestinali o delle procedure di resezione. Inoltre, quando vengono raccolte biopsie, è utile notare l'orientamento del tessuto per aiutare nell'identificazione di caratteristiche specifiche (ad esempio, lume vs sottomucosa) in assenza di contenuti intestinali. Il pre-incorporamento con miscele di agar e/o agar al 3%: gelatina può essere utile per mantenere la polarità dei tessuti25; tuttavia, ci sono problemi con la disidratazione e il sezionamento dell'agar, come riportato in letteratura, e i tempi di elaborazione potrebbero dover essere modificati.
Un aspetto chiave per ottenere una buona colorazione FISH deriva dalla regolazione della concentrazione di formammide per sonde FISH specifiche. La formamide controllerà il rigore di ibridazione delle sonde FISH rispetto ai loro bersagli. È importante assicurarsi che a) venga scelta la corretta concentrazione di formammide per colorare una determinata comunità e b) che sia possibile anche una concentrazione di formammide adeguata per la combinazione di sonda che viene utilizzata, il che può influire sulla scelta ottimale della sonda quando si utilizzano più sonde. Siti web come mathFISH (http://mathfish.cee.wisc.edu/) possono aiutare a calcolare le corrette concentrazioni di formammide per una determinata sonda. In assenza di informazioni sulle concentrazioni appropriate di formammide, questo protocollo può essere testato con lo 0% e il 10% di formammide.
Sezionare i campioni incorporati richiede il taglio del blocco a una profondità sufficiente per ottenere fette luminali, poiché sezionare troppo superficialmente in un blocco si tradurrà in una vista trasversale dei villi / cripte senza contenuto luminale (Figura 3A). Colorare i campioni subito dopo la sezionamento per un segnale FISH ottimale e utilizzare DAPI freschi (o DAPI conservati a -20 °C) per risolvere i problemi di background (Figura 3C). La colorazione FISH di sezioni che hanno più di un mese può causare una colorazione più povera / incoerente.
Se il tessuto o il coverslip non è perfettamente piatto rispetto al vetrino, il campione potrebbe non essere a fuoco in ogni posizione all'interno di una scansione delle piastrelle (Figura 3B), causando uno sforzo sprecato e un potenziale fotosbiancamento. Questo può essere risolto eseguendo scansioni di piastrelle più piccole in cui tutte le posizioni sono state verificate per essere a fuoco. Il sezionamento con lame opache può anche portare al distacco del muco e del contenuto luminale, che appaiono come grandi aree scure durante l'imaging. Infine, l'evaporazione della soluzione o delle bolle durante la fase di ibridazione può portare a una colorazione irregolare delle sonde FISH nel tessuto.
Un altro parametro critico che influisce sull'efficienza del legame della sonda FISH è la competizione tra diverse sonde. Un controllo utile per verificare che la sonda FISH stia etichettando i batteri è quello di esaminare la colocalizzazione del segnale dalla sonda FISH con DAPI (Figura 2C,D). Nei campioni che richiedono l'uso di più sonde rRNA, la regolazione di parametri come la temperatura di ibridazione, la concentrazione della sonda e la formammide diventa fondamentale per garantire che le sonde si leghino alle specie corrette in modo efficiente18.
Note sull'imaging
I batteri macchiati di FISH sono meglio visualizzati utilizzando un microscopio confocale e un obiettivo di ingrandimento di almeno 40x. Mentre l'ingrandimento 63x è preferito all'immagine dei batteri a livello di singola cella, l'ingrandimento 40x può essere utilizzato anche massimizzando lo zoom digitale o impiegando un sistema di super-risoluzione. I sistemi dotati di capacità di super-risoluzione possono anche fornire la risoluzione sub-cellulare di singole cellule batteriche. Obiettivi di ingrandimento inferiore possono essere utilizzati per ottenere un senso generale di localizzazione batterica e spessore del muco.
Anche l'acquisizione di immagini a 16 bit invece di immagini a 8 bit è altamente raccomandata, poiché la gamma dinamica più elevata aiuterà a catturare l'ampia gamma del segnale DAPI dai nuclei estremamente luminosi dell'epitelio e dal segnale relativamente debole dei batteri luminali. Oltre a utilizzare la configurazione di imaging sopra descritta, un'importante considerazione di imaging è la scelta dei fluorofori. Per una migliore separazione tra i tipi batterici, assicurarsi che i fluorofori utilizzati non si sovrappongano negli spettri di eccitazione ed emissione (a meno che l'imaging su un sistema con la capacità di eseguire unmixing lineare). Inoltre, le sonde possono essere utilizzate in combinazione (ad esempio, la combinazione di una sonda specifica per famiglia e una sonda specifica per genere) per identificare ulteriori membri della comunità. Se si utilizzano sonde lineari non mistificate o non convalidate, è essenziale testare l'accuratezza e il livello di colorazione FISH su colture pure8,14.
Una volta raccolte le immagini, sono disponibili più strumenti per l'analisi quantitativa dell'interfaccia ospite-microbiota, come BacSpace26, HiPR-FISH8 e altri strumenti di segmentazione27. BacSpace è un software MATLAB che consente la segmentazione dei componenti tissutali e luminali e la rimozione di materiale vegetale dalle immagini26. Il programma fornisce anche l'analisi dello spessore del muco in 2D e la quantificazione della distribuzione spaziale in base alle distanze dei pixel in diversi canali26. Al contrario, il software HiPR-FISH Image Analysis consente la segmentazione di celle colorate fish8. Infine, anche altri strumenti di segmentazione batterica ottimizzati per esperimenti in vitro27 potrebbero essere adattati a questa applicazione.
Conclusione
L'imaging in situ consente l'analisi quantitativa dei singoli taxa microbici nel contesto di altri membri della comunità e dei vari microambienti creati dalla dieta, dal muco e dalle cripte epiteliali dell'ospite. L'interazione tra gli organismi determina la biologia dei sistemi microbici associati all'ospite e fornisce un'analisi essenziale del cambiamento in queste strutture durante la perturbazione che ha implicazioni per la salute. In particolare, la capacità di visualizzare il microbiota in situ attraverso il protocollo sopra descritto fornisce un'incredibile finestra sulla biogeografia del microbiota in relazione all'ospite animale.
Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare la dott.ssa Kristen Earle per l'inestimabile sviluppo della tecnica, Amber Hann per l'aiuto nella risoluzione dei problemi, la dott.ssa Jen Nguyen e Deanna Pepin per la revisione critica del manoscritto e il dottor Hesham Soliman e il laboratorio Rossi presso l'Università della British Columbia per aver fornito l'accesso al microscopio. Gli autori riconoscono il sostegno di CIHR Team Grant: Canadian Microbiome Initiative 2 (C.T.), Crohn's and Colitis Canada (a C.T. e K.M.N.), CIFAR (a C.T. e K.M.N.), Michael Smith Foundation for Health Research Scholar Award (a C.T.), Weston Foundation: Weston Family Microbiome Initiative (a C.T.), Paul Allen Distinguished Investigator Award (a C.T.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum foil | |||
| Chloroform | Fisher | C298-500 | Toxic |
| Coplin jar | Fisher | 08-813E | |
| Cover glass, 22 × 22 mm, no #1 | VWR | CA48366-227-1 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Resuspended to 5 mg/mL |
| Empty pipette tip box(es) | To melt paraffin | ||
| Ethanol, anhydrous, molecular grade | -- | -- | |
| FISH probes | |||
| FISH hybridization solution | -- | -- | 20 mM Tris–HCl pH 7.4, 0.9 M NaCl, 0.01% (w/v) SDS in nuclease-free water. Optional addition of 5–50% (v/v) formamide |
| FISH washing buffer | -- | -- | 20 mM Tris–HCl pH 7.4, 0.9 M NaCl |
| Fluorescently-labeled Ulex Europaeus Agglutinin (UEA-1) lectin | Vector Laboratories | FL-1061 (Fluorescein-labeled) or RL-1062-2 (Rhodamine-labeled) | UEA-1 labels fucosylated glycans, so it is not appropriate for germ-free mice or for samples from fucosyltransferase 2 (FUT2)-deficient hosts. |
| Forceps | |||
| Formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | |
| Fumehood | |||
| Glacial Acetic Acid | Fisher | A38-212 | Corrosive and flammable |
| HybriSlip flexible plastic cover slips, 22 x 22 mm × 0.25 mm | Sigma Aldrich | GBL722222 | for FISH hybridization steps, can substitute glass coverslips |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Kimwipes | |||
| Methanol | Fisher | A412 | Toxic and flammable |
| Microtome | for sectioning | ||
| Multipurpose Specimen Storage Containers, 473 mL | Fisher | 14-955-117A | Can substitute with a glass or polyethylene container of your choice. Methacarn is not compatible with polystyrene or metal. |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | Any nail polish should work |
| Oven | Necessary range: 45-60 °C | ||
| Paraffin: Leica Paraplast | Leica | 39601006 | |
| PBS, Phosphate-buffered Saline (10x solution) | Fisher | BP3991 | Dilute to 1x for protocol |
| Sodium chloride | Fisher | S271 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), 20% Solution, RNase-free | Invitrogen | AM9820 | |
| Tissue-Loc HistoScreen Cassettes | Thermo Scientific | CA83009-999 | |
| Trizma hydrochloride solution, 1M Tris-HCl, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2663-1L | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Water, nuclease-free | Fisher | BP2484100 | |
| Xylenes | Fisher | X3P-1GAL | Toxic and flammable |
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