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Immunology and Infection

सीटू संकरण, लेक्टिन स्टेनिंग, और इमेजिंग में प्रतिदीप्ति के माध्यम से आंत माइक्रोबायोटा-होस्ट इंटरैक्शन का विज़ुअलाइज़ेशन

Published: July 9, 2021 doi: 10.3791/62646
Automatic Translation
1,2, 1,2,3
1School of Biomedical Engineering, University of British Columbia, 2Department of Microbiology and Immunology, University of British Columbia, 3Humans and the Microbiome Program, Canadian Institute for Advanced Research (CIFAR)

Summary

यह सुव्यवस्थित प्रोटोकॉल जटिल ऊतक नमूनों में बैक्टीरिया का पता लगाने और छवि बनाने के लिए एक वर्कफ़्लो का विवरण देता है, ऊतक को ठीक करने से लेकर सीटू संकरण में फ्लोरोसेंट के साथ रोगाणुओं को धुंधला करने तक।

Abstract

उनके इन विवो संदर्भ के भीतर रोगाणुओं के स्थानीयकरण को मापना माइक्रोबायोटा और कशेरुक आंत के बीच कार्यात्मक संबंधों को प्रकट करने में एक आवश्यक कदम है। आंत माइक्रोबायोटा के स्थानिक परिदृश्य को शारीरिक विशेषताओं - आंतों के बलगम, क्रिप्ट्स और सिलवटों द्वारा कसकर नियंत्रित किया जाता है - और पीएच, ऑक्सीजन की उपलब्धता और प्रतिरक्षा कारकों जैसे मेजबान-नियंत्रित गुणों से प्रभावित होता है। ये गुण आंत को स्थिर रूप से उपनिवेशित करने के लिए कॉमेन्सल रोगाणुओं और रोगजनकों की क्षमता को सीमित करते हैं। माइक्रोन-स्केल पर, माइक्रोबियल संगठन विभिन्न रोगाणुओं के साथ-साथ रोगाणुओं और उनके मेजबान के बीच बातचीत के बीच क्लोज-रेंज इंटरैक्शन को निर्धारित करता है। ये इंटरैक्शन तब बड़े पैमाने पर अंग समारोह और मेजबान स्वास्थ्य को प्रभावित करते हैं।

यह प्रोटोकॉल कोशिकाओं के बीच की दूरी से लेकर अंग-व्यापी तराजू तक आंत माइक्रोबायोटा स्थानिक संगठन के विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम बनाता है। यह विधि आंतों की संरचना और बलगम गुणों को संरक्षित करते हुए आंत के ऊतकों को ठीक करने पर आधारित है। निश्चित नमूनों को तब एम्बेडेड, विभाजित और सीटू संकरण (FISH) में प्रतिदीप्ति के माध्यम से विशिष्ट जीवाणु प्रजातियों को उजागर करने के लिए दाग दिया जाता है। मेजबान सुविधाओं, जैसे बलगम और होस्ट सेल घटकों, फ्लोरोसेंटली लेबल लेक्टिन के साथ लेबल किए जाते हैं। अंत में, दाग वर्गों को एक confocal माइक्रोस्कोप का उपयोग करके चित्रित किया जाता है जो माइक्रोन को सेंटीमीटर लंबाई के तराजू को पुल करने के लिए उच्च आवर्धन पर टाइल-स्कैन इमेजिंग का उपयोग करता है। इस प्रकार की इमेजिंग को मानव ऊतकों से पशु मॉडल और बायोप्सी से आंतों के वर्गों पर लागू किया जा सकता है ताकि स्वास्थ्य और बीमारी में आंत में माइक्रोबायोटा के जैव भूगोल को निर्धारित किया जा सके।

Introduction

माइक्रोबियल विज़ुअलाइज़ेशन तकनीकों की उत्पत्ति होती है जो माइक्रोबायोलॉजी के रूप में पुरानी होती है, जब एंटोनी वैन लीवेनहोक ने 17 वीं शताब्दी में दांत पट्टिका और मल से बैक्टीरिया (जिसे उन्होंने "एनिमलक्यूल्स" कहा जाता था) का निरीक्षण करने के लिए अपने माइक्रोस्कोप का उपयोग किया था। तब से, बैक्टीरिया, कवक और वायरस के कंसोर्टियम के स्थानिक संगठन की कल्पना करने के लिए कई तकनीकों को विकसित किया गया है जो एक मेजबान-माइक्रोबायोटा 1 के साथ जुड़े रहते हैं। इन रोगाणुओं के स्थानीयकरण को स्पष्ट करना उनके पशु मेजबान के भीतर उनके कार्य को निर्धारित करने के लिए आवश्यक है। बैक्टीरिया का जैवभूगोल कॉमेन्सल और रोगजनक टैक्सा में समान रूप से महत्वपूर्ण है, क्योंकि विशिष्ट स्थानों (जैसे, उपकला), पोषण संबंधी सब्सट्रेट, और विशिष्ट रोगाणुओं की निकटता अंतर-प्रजाति और अंतर-राज्य इंटरैक्शन के अंतर्निहित चयापचयों के जीवाणु उत्पादन को निर्धारित कर सकती है।

कई असमान शरीर साइटों, जैसे कि मौखिक गुहा, आंत, या फेफड़े में बैक्टीरिया और मेजबान ऊतकों को अलग करने वाली एक प्रमुख संरचना बलगम है - एक मेजबान-उत्पादित परत जो दोनों मेजबान उपकला कोशिकाओं पर माइक्रोबियल ट्रांसलोकेशन को रोकती है और माइक्रोबायोटा के लिए पोषण संसाधन के रूप में कार्य करती है2,3,4 . इस बाधा में उल्लंघनों और परिवर्तनों की विशेषता महत्वपूर्ण महत्व की है, जिससे मेजबान-माइक्रोबायोटा इंटरैक्शन में यांत्रिक अंतर्दृष्टि होती है जो अकेले अनुक्रमण द्वारा प्राप्त नहीं की जाएगी5,6,7। उदाहरण के लिए, इमेजिंग ने इस खोज को सक्षम किया कि एंटीबायोटिक एक्सपोजर बलगम परत और माइक्रोबायोटा संगठन को बाधित कर सकता है7,8, और यह कि जुलाब बलगम को समाप्त कर सकते हैं, प्रतिरक्षा मापदंडों में बड़े बदलावों के साथ सहसंबंधित हो सकते हैं5।

यह प्रोटोकॉल माइक्रोबायोटा और मेजबान ऊतक (चित्रा 1) को ठीक करने, धुंधला करने और इमेजिंग करने के लिए एक सामान्य ढांचे की रूपरेखा तैयार करता है, जो जोहानसन और हैन्सन 9 के काम पर बनाया गया है। जबकि इस प्रोटोकॉल को आंतों के वर्गों के संदर्भ में मॉडलिंग की गई है, इसे आसानी से अन्य ऊतक प्रकारों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल या तो प्रयोगात्मक पशु या मानव नैदानिक नमूनों के प्रसंस्करण को सक्षम बनाता है; दोनों प्रकार के नमूनों को संसाधित करने के लिए नोट्स शामिल किए गए हैं। यहां प्रस्तुत उदाहरण में, मेजबान उपकला और ल्यूमिनल बैक्टीरिया को एक साथ 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) धुंधला, फ्लोरोसीन (FITC) के साथ बलगम-संयुग्मित लेक्टिन, Ulex europaeus agglutinin I (UEA-1), और FISH का उपयोग करके एक विशिष्ट जीवाणु टैक्सन के साथ लेबल किया गया है। FISH जांच आमतौर पर एक टैक्सन के 16S rRNA जीन के खिलाफ डिज़ाइन की जाती है ताकि उच्च-प्रतिलिपि प्रतिलिपि प्रतिलेख को बांधने से उच्च संकेत सुनिश्चित किया जा सके।

इस उदाहरण में, जांच मुरिबाकुलेसी बैक्टीरियल परिवार के 16 एस आरआरएनए को लक्षित करती है (चित्रा 2)। हालांकि, उचित जैविक प्रश्न को समायोजित करने के लिए दागों को आसानी से विभिन्न मछली जांच और / या लेक्टिन के साथ प्रतिस्थापित किया जाता है। पहले से मान्य FISH जांच ProbeBase10, rRNA-लक्षित ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड जांच के लिए एक ऑनलाइन संसाधन, या SILVA11, एक राइबोसोमल आरएनए डेटाबेस पर पाया जा सकता है। नई जांच के डिजाइन के लिए, पाठक नई पाइपलाइनों जैसे कि HiPR-FISH8 या Oligominer12 का उल्लेख कर सकता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, आंतों के लुमेन में बैक्टीरिया की करीबी पैकिंग और पाचन तंत्र में आंतों के बलगम की विभिन्न विशेषताओं का निरीक्षण करना संभव है। यहां वर्णित वर्कफ़्लो अपने मेजबान वातावरण के स्थानिक संदर्भ में माइक्रोबायोटा के मात्रात्मक विश्लेषण को सक्षम बनाता है।

Protocol

इस प्रोटोकॉल में वर्णित सभी पशु प्रयोगों और ऊतक संग्रह को पशु देखभाल (CCAC) दिशानिर्देशों पर कनाडाई परिषद के अनुपालन में किया गया था और ब्रिटिश कोलंबिया विश्वविद्यालय में पशु देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। रोगाणु मुक्त स्विस वेबस्टर चूहों का उपयोग किया गया था। सभी जानवरों की उम्र 8-10 सप्ताह थी, दोनों लिंगों का उपयोग किया गया था, और सभी चूहों को प्रति पिंजरे में कम से कम दो चूहों के साथ सह-रखा गया था। जानवरों को द्वितीयक गर्भाशय ग्रीवा विस्थापन या कार्डियक पंचर के साथ कार्बन डाइऑक्साइड का उपयोग करके euthanized किया गया था।

1. एक इमेजिंग प्रयोग डिजाइन: विचार और नमूना संग्रह

  1. मछली जांच डिजाइन
    1. यदि एक उपयुक्त FISH जांच मौजूद है, तो एक पूर्व-मौजूदा प्रकाशित का चयन करें जो पृष्ठभूमि की तुलना में लेबल किए गए कक्षों में एक मजबूत संकेत दिखाता है।
    2. लक्ष्य बैक्टीरिया के निश्चित नमूनों के लिए बाध्यकारी की उनकी दक्षता निर्धारित करने के लिए विट्रो में नई जांच को मान्य करें और अन्य बैक्टीरिया के लिए ऑफ-टारगेट बाइंडिंग।
    3. लक्ष्य जीव से 16S अनुक्रमों के खिलाफ या नमूनों से 16S rRNA अनुक्रमण के खिलाफ उपयोग किए जाने वाले सभी 16S FISH जांच की जांच करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि सकारात्मक मैचों का अपेक्षित अनुपात मौजूद है, और यह जांच गैर-विशेष रूप से अन्य माइक्रोबायोटा सदस्यों को बाध्य नहीं करेगी।
      1. जांच और उनके लक्ष्यों के संभावित बंधन का मूल्यांकन करने के लिए एक उपकरण, जैसे Clustal Omega13 का उपयोग करके या तो पूर्ण-लंबाई अनुक्रम या एम्प्लिकॉन अनुक्रम वेरिएंट के खिलाफ FISH जांच को संरेखित करें।
      2. सिलिको परीक्षण के अलावा, शुद्ध संस्कृतियों पर बेमानी जांच की मछली धुंधला की सटीकता और स्तर का परीक्षण करें8,14.

नोट: कई समुदाय के सदस्यों को धुंधला करते समय, जांच का उपयोग संयोजनात्मक रूप से किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, एक परिवार-विशिष्ट जांच और एक जीनस-विशिष्ट जांच का संयोजन) यदि उपयोग किए जाने वाले फ्लोरोफोर उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा में ओवरलैप नहीं होते हैं (जब तक कि रैखिक अनमिक्सिंग करने की क्षमता के साथ एक प्रणाली पर इमेजिंग न हो)। इसके अतिरिक्त, विशिष्टता को विशिष्टता नियंत्रण / स्क्रैम्बल्ड जांच को शामिल करके या गैर-फ्लोरोसेंट जांच के साथ प्रतिस्पर्धा द्वारा प्रदर्शित किया जा सकता है।

  1. नमूना प्रकार और ऊतक संग्रह
    1. तेज और साफ उपकरणों का उपयोग करते हुए, इमेजिंग के लिए gnotobiotic स्विस वेबस्टर चूहों से आंतों के खंडों में कटौती। जितना संभव हो सके नमूने को परेशान करना कम करें, और इमेजिंग क्षेत्र को प्रभावित करने से बचने के लिए अपने किनारों से वर्गों को संभालें। गिरावट को रोकने के लिए विच्छेदन के बाद जितनी जल्दी हो सके नमूने को ठीक करें।
      नोट: पशु अध्ययन के लिए, बरकरार, unflushed आंत्र वर्गों को पसंद किया जाता है; झिल्ली luminal और mucosal संगठन बरकरार रखने में मदद मिलेगी.
    2. नमूनों और साइटों के बीच 70% इथेनॉल के साथ उन्हें पोंछकर उपकरण साफ करें। प्रति आंतों के अनुभाग / बायोप्सी स्थान पर कम से कम तीन जैविक प्रतिकृति प्राप्त करें, सुसंगत आंतों के स्थानों का नमूना लेने के लिए ध्यान रखें, क्योंकि बलगम और आंतों की वास्तुकला के साथ-साथ माइक्रोबायोटा विभिन्न स्थानों में काफी बदलाव करता है।

2. ऊतक नमूना निर्धारण और घुसपैठ

  1. ग्रस्तता
    1. निम्नलिखित अनुपातों के साथ एक संगत कंटेनर में ताजा मेथाकार्न तैयार करें: 60% पूर्ण मेथनॉल, 30% क्लोरोफॉर्म, और 10% ग्लेशियल एसिटिक एसिड। इन रसायनों में से प्रत्येक को धुएं के हुड में वितरित करें। एक कंटेनर चुनें जिसे ढक्कन को खोलने के लिए क्रैक करके वेंटेड किया जा सकता है। जैसा कि मेथाकार्न पॉलीस्टीरीन के साथ संगत नहीं है, इसे एक पॉलीइथिलीन कंटेनर में तैयार करें, क्लोरोफॉर्म और ग्लेशियल एसिटिक एसिड के लिए ग्लास स्नातक सिलेंडर / सीरोलॉजिकल पिपेट्स का उपयोग करके।
      नोट: मिश्रण के दौरान, धुएं का उत्पादन किया जाता है और कंटेनर के अंदर निर्माण करने के लिए दबाव पैदा कर सकता है। यह सलाह दी जाती है कि कंटेनर को अपेक्षाकृत कसकर बंद रखें एक बार धुएं के हुड से हटा दिया जाए यदि नमूनों को सक्रिय रूप से नहीं जोड़ा जा रहा है। क्लोरोफॉर्म विषाक्त है; त्वचा के माध्यम से साँस लेना, निगलना, या अवशोषित न करें। मेथनॉल विषाक्त और अत्यधिक ज्वलनशील है; त्वचा के माध्यम से साँस लेना, निगलना, या अवशोषित न करें। ग्लेशियल एसिटिक एसिड ज्वलनशील और त्वचा और आंखों के लिए अत्यधिक संक्षारक है।
    2. वितरण के बाद, कंटेनर को बंद करें, मिश्रण करने के लिए घुमाएं और फिर वेंट करें; इसे तब तक दोहराएं जब तक कि ऑफ-गैसिंग बंद न हो जाए (और दबाव अब ढक्कन के नीचे प्रशंसनीय रूप से नहीं बनता है)।
      नोट: नालियों में मेथाकार्न का निपटान न करें; संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार खतरनाक रासायनिक अपशिष्ट के रूप में एकत्र करना और निपटान करना। हिस्टोलॉजी कैसेट लेबल करने के लिए एक पेंसिल का उपयोग करें, क्योंकि मेथाकार्न समाधान में कई पेन स्याही बंद हो जाएंगी।
    3. चिमटी के साथ ऊतक के एक किनारे को नाजुक रूप से पकड़कर आंतों के वर्गों को हिस्टोलॉजी कैसेट में रखें। कैसेट को बंद करें और इसे पूरी तरह से ताजा मेथाकार्न समाधान में डुबो दें। सुनिश्चित करें कि कैसेट के विसर्जन पर समाधान कुछ घंटों से अधिक पुराना नहीं है।
    4. नैदानिक नमूनों के लिए जो एक धुएं के हुड तक पहुंच के बिना एक नैदानिक सूट में एकत्र किए जाएंगे, ढक्कन में एक फ्लैप कट के साथ एक पॉलीथीन भंडारण कंटेनर का उपयोग करें जो हिस्टोलॉजी कैसेट के पारित होने की अनुमति देगा। टेप इस प्रालंब बंद जब विषाक्त धुएं के भागने को रोकने के लिए नमूनों को पारित नहीं कर रहा है.
      नोट: कंटेनर पर गोंद के विघटन से बचने के लिए मास्किंग टेप का उपयोग करना महत्वपूर्ण है- कुछ प्रकार के टेप (उदाहरण के लिए, प्लास्टिक पैकिंग टेप) मेथाकार्न धुएं को अच्छी तरह से पकड़ नहीं सकते हैं।
    5. कम से कम 3 घंटे और अधिकतम दो सप्ताह के लिए नमूने तय करें।
      नोट: मोटे नमूनों को 3 घंटे से अधिक समय तक निर्धारण समय की आवश्यकता हो सकती है। निर्धारण समय को विभिन्न मेथाकार्न समाधानों में तय किए गए कैसेट के लिए एक साथ पैराफिन घुसपैठ प्रसंस्करण को सक्षम करने के लिए चुना जा सकता है (उदाहरण के लिए, एकत्र किए गए और दो सप्ताह में तय किए गए नमूनों के समूहों पर पैराफिन घुसपैठ करने के लिए)।
  2. पैराफिन घुसपैठ और एम्बेडिंग
    1. पैराफिन को गर्मी प्रतिरोधी कंटेनर में रखें और इसे रात भर 60 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में पिघला दें। जैसा कि पैराफिन छर्रों को पिघलने से पहले अधिक जगह लेते हैं, सुनिश्चित करें कि सभी कैसेट को कवर करने के लिए पर्याप्त पैराफिन पिघलाया जाता है।
      नोट: तापमान 60 डिग्री सेल्सियस से अधिक नहीं होना चाहिए क्योंकि यह कलाकृतियों को जन्म दे सकता है।
    2. उपयुक्त अपशिष्ट रिसेप्टैकल में तरल को डालकर ऊतक को धोएं और इसे तुरंत निम्नलिखित रसायनों के साथ बदल दें।
      1. 30 मिनट के लिए पूर्ण मेथनॉल में इनक्यूबेट करें। एक बार दोहराएं।
      2. 20 मिनट के लिए पूर्ण इथेनॉल में इनक्यूबेट करें। एक बार दोहराएं।
      3. 15 मिनट के लिए xylenes में इनक्यूबेट करें। एक बार दोहराएं।
      4. कैसेट को सूखने से बचने के लिए ध्यान रखें, जल्दी से धोने का आदान-प्रदान करें। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक धोने में बीकर या कंटेनर में कैसेट को पूरी तरह से कवर किया गया है।
        नोट: Xylenes ज्वलनशील हैं, और यदि साँस लेते हैं, तो वाष्प उच्च सांद्रता (>200 पीपीएम) के संपर्क में आने पर संभावित दीर्घकालिक न्यूरोलॉजिकल परिणामों के साथ केंद्रीय तंत्रिका तंत्र को दबा सकते हैं। केवल एक धुएं हुड के भीतर xylenes संभाल. चूंकि जाइलीन खतरनाक हैं, इसलिए हिस्टोलॉजिकल कैसेट को कवर करने के लिए आवश्यक न्यूनतम राशि का उपयोग करने का ध्यान रखें।
    3. एम्बेडिंग के दौरान, कैसेट की लंबाई के समानांतर आंतों के खंडों को उन्मुख करें (जैसा कि सीधा होने के विपरीत) चिमटी का उपयोग करके मात्रात्मक इमेजिंग के लिए अधिक संभावित नमूना क्षेत्र प्रदान करने के लिए क्रॉस-सेक्शनल डोनट्स के बजाय अनुदैर्ध्य, अनुप्रस्थ वर्गों को प्रदान करने के लिए (चित्रा 1 बी)।
    4. कैसेट थोड़ा (~ 1-2 सेमी या 0.5 इंच) खोलें ताकि पैराफिन को ऊतक खंडों को खोए बिना प्रवेश करने की अनुमति मिल सके। इस चरण या चिमटी के लिए डबल दस्ताने का उपयोग करें ताकि उंगलियों के ओवरहीटिंग या हल्के जलने को रोका जा सके। जलमग्न और पिघल पैराफिन के कंटेनर में कैसेट बंद, कंटेनर वापस 60 डिग्री सेल्सियस ओवन में रखने. सुनिश्चित करें कि कैसेट पैराफिन से भरे हुए हैं, और कोई बड़ा हवा का बुलबुले नहीं रहता है।
    5. 60 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेशन के बाद, ओवन से कंटेनर को हटा दें। संदंश का उपयोग करते हुए, ध्यान से कैसेट्स को हटा दें और उन्हें ठंडा करने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के एक टुकड़े पर व्यक्तिगत रूप से रखें। उन्हें कमरे के तापमान पर स्टोर करें जब तक कि एम्बेडिंग और सेक्शनिंग के लिए तैयार न हो जाए।
    6. एक माइक्रोटोम के साथ पैराफिन ब्लॉकों को अनुभाग करें, ब्लॉक में काफी गहराई से विभाजित करें कि ल्यूमिनल सामग्री उजागर होती है, जिससे ल्यूमिनल सामग्री और बलगम के अलावा विली और / या क्रिप्ट्स के अनुदैर्ध्य अनुभाग को सक्षम किया जा सकता है। ब्लेड को बदलने के लिए ध्यान रखें क्योंकि फेकल सामग्री ऊतक की तुलना में ब्लेड को तेजी से सुस्त करती है। छवियों के इष्टतम तीक्ष्णता के लिए मोटाई के 4 μm करने के लिए वर्गों में कटौती। अनुभागों को नियमित रूप से अनकोटेड स्लाइड्स पर स्थानांतरित करें.
    7. मछली धुंधला करने के लिए, एक मजबूत मछली संकेत प्राप्त करने के लिए जितनी जल्दी हो सके आंतों के वर्गों को दाग दें (यानी, सेक्शनिंग के कुछ हफ्तों के भीतर)। यदि मछली धुंधला छोड़ दिया जाता है, तो लेक्टिन + डीएपीआई धुंधला सिग्नल के महत्वपूर्ण नुकसान के बिना कम ताजा (यानी, महीनों पुराने) नमूनों पर किया जा सकता है।

3. धुंधला बैक्टीरिया और मेजबान सुविधाओं

  1. तैयारी
    1. ओवन को 60 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें। एक खाली कोप्लिन जार को पूर्व-गर्म करें और एक कांच की बोतल में जाइलीन के साथ दो बार जार में ग्लास स्लाइड को कवर करने के लिए पर्याप्त मात्रा में, जाइलीन के वाष्पीकरण को रोकने के लिए ढक्कन के चारों ओर पैराफिल्म का ध्यान रखें। ज़ायलीन का तापमान 60 डिग्री सेल्सियस तक पहुंचने दें।
      नोट: एक मानक कोप्लिन जार 8 स्लाइड फिट बैठता है, और स्लाइड्स को लगभग 50 मिलीलीटर तरल के साथ कवर किया जा सकता है (ब्रांड के आधार पर 40 और 60 एमएल के बीच भिन्न हो सकता है)। Xylene विकल्प कम विषाक्त हैं और सफलतापूर्वक डी-वैक्सिंग चरण (चरण 3.2) 8,9 के लिए अन्य समूहों द्वारा उपयोग किया गया है।
    2. यदि एक अलग ओवन उपलब्ध है, तो एक संकरण ओवन को 50 डिग्री सेल्सियस तक प्री-वार्म करें। अन्यथा, यह चरण चरण 3.2.3 के बाद स्लाइड्स को बेक करने के लिए उपयोग किए जाने वाले एक ही ओवन के साथ किया जा सकता है।
    3. मछली संकरण समाधान तैयार करें: 20 mM Tris-HCl, पीएच 7.4; 0.9 M NaCl; न्यूक्लिएज मुक्त पानी में 0.01%26 - 0.1%9 (w/v) सोडियम डोडेसिलसल्फेट (SDS)। यदि आवश्यक हो, तो 5-50% (v / v) फॉर्मामाइड जोड़ें। डी-पैराफिनाइजेशन के दौरान 50 डिग्री सेल्सियस पर इस संकरण समाधान को पूर्व-गर्म करें।
      नोट: Formamide एक एमाइड है कि एक teratogen के रूप में कार्य करता है; दस्ताने और चश्मे के साथ formamide संभाल. छोटी खुराक में और आंखों, त्वचा, या श्लेष्मा झिल्ली के संपर्क में आने पर, यह परेशान है। बड़ी मात्रा में, फॉर्मामाइड वाष्प को चिकित्सा हस्तक्षेप की आवश्यकता हो सकती है। फॉर्मामाइड को -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में 100% पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. धुंधला करने के लिए स्लाइड तैयार करना: deparaffinization
    1. स्लाइड्स को कोप्लिन जार में रखें, यह सुनिश्चित करते हुए कि अनुभाग अन्य स्लाइड या जार के संपर्क में न आएं, और स्लाइड्स को 10 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर सेंकें।
    2. धुएं के हुड में, ओवन से पूर्व-गर्म xylenes के साथ Coplin जार भरें, ध्यान रखें कि सीधे नमूनों के शीर्ष पर न डालें और संभावित रूप से ऊतकों को हटा दें। कोप्लिन जार को 60 डिग्री सेल्सियस ओवन में वापस रखें। धुएं हुड में शेष xylenes के साथ बोतल छोड़ दें।
    3. निपटान के लिए एक उचित अपशिष्ट कंटेनर में इस्तेमाल किया xylenes डालो, ध्यान रखने के लिए कांच स्लाइड पर ऊतक वर्गों को परेशान नहीं है और संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करने के लिए स्लाइड को Coplin जार से बाहर गिरने से रखने के लिए. शेष xylenes के साथ Coplin जार को फिर से भरें और धुएं के हुड में कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    4. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 99.5% इथेनॉल में वर्गों को इनक्यूबेट करें। इस इनक्यूबेशन चरण के बाद, कोप्लिन जार से स्लाइड्स को हटा दें, एक प्रयोगशाला पोंछे या पेपर तौलिया पर स्लाइड के पीछे पोंछें, और इथेनॉल बूंदों के चले जाने तक संक्षेप में हवा-सूखा।
      नोट:: स्लाइड के पीछे पोंछना सुखाने की प्रगति के बेहतर विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम बनाता है।
  3. मछली के साथ जीवाणु धुंधला
    1. प्रत्येक ऊतक अनुभाग के क्षेत्र को घुमाकर तरल विस्तार के क्षेत्र को सीमित करने के लिए एक तरल अवरोधक या पीएपी पेन का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि स्याही अनुभाग के संपर्क में ही नहीं आती है। सतह क्षेत्र को कम करने के लिए ऊतक से संपर्क किए बिना जितना संभव हो सके प्रत्येक ऊतक अनुभाग के करीब एक सर्कल बनाएं जिसे संकरण समाधान द्वारा कवर करने की आवश्यकता होती है।
    2. संकरण समाधान तैयार करें: पूर्व-गर्म संकरण समाधान के प्रत्येक 50 μL के लिए, 0.5 μg प्रोब जोड़ें (उदाहरण के लिए, 1 μg / μL जांच का 0.5 μL)। स्लाइड पर अनुभागों पर संकरण समाधान पिपेट (~ 20 μL / अनुभाग, अनुभाग / सर्कल आकार के आधार पर)। इनक्यूबेशन चरणों और भंडारण के दौरान इस बिंदु से आगे संकरण समाधान और स्लाइड को प्रकाश से सुरक्षित रखें।
    3. सुनिश्चित करें कि उपयोग किए गए तरल की मात्रा एक लचीले प्लास्टिक कवरस्लिप के साथ ओवरलेइंग पर पूरे अनुभाग को कवर करती है। वाष्पीकरण को कम करने के लिए एक आर्द्र कक्ष में स्लाइड को इनक्यूबेट करें। नमी प्रदान करने के लिए अतिरिक्त संकरण समाधान या फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (पीबीएस) के साथ भिगोया गया है कि नीचे पोंछे या कागज तौलिया के साथ एक पिपेट टिप बॉक्स के साथ एक आर्द्र कक्ष बनाएँ। जांच सेट के आधार पर 45-50 डिग्री सेल्सियस पर वर्गों को इनक्यूबेट करें, >3 ज के लिए।
    4. मछली धोने बफर को गर्म करें: 20 mM Tris-HCl, पीएच 7.4; इनक्यूबेशन अवधि के दौरान 0.9 M NaCl से 50 °C तक। Coplin जार में स्लाइड को कवर करने के लिए पर्याप्त धोने बफर तैयार करें।
    5. प्लास्टिक coverslips निकालें; एक Coplin जार में मछली धोने बफर में स्लाइड incubate, दोनों पूर्व 50 डिग्री सेल्सियस करने के लिए गर्म. Coplin जार वापस 10-20 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस ओवन में रखें। मोटे नमूनों के लिए, बफर जोड़कर कोप्लिन जार में कवरलिप्स को हटा दें और स्लाइस को स्मीयर करने से बचने के लिए धीरे-धीरे कवरलिप्स को हटा दें।
  4. बलगम और मेजबान सुविधाओं धुंधला
    1. पीबीएस में एक सामान्य डीएनए / बलगम काउंटरस्टेन तैयार करें: अंतिम 10 μg / mL DAPI + 40 μg / mL बलगम दाग UEA-1। अतिरिक्त कवरलिप के साथ हानिकारक ऊतक से बचने के लिए एक coverslip की अनुपस्थिति में धब्बों को कवर करने के लिए पर्याप्त काउंटरस्टेन तैयार करें।
      नोट: एक coverslip की अनुपस्थिति में धब्बों को कवर करने के लिए 3.3.2 में उपयोग किए जाने वाले 20 μL की तुलना में बड़े वॉल्यूम की आवश्यकता होगी। औसत आकार के वर्गों (~ 10 मिमी व्यास) के लिए, 200 μL एक स्थान को कवर करने के लिए पर्याप्त है; एक डमी स्लाइड पर पहले से ही इस मात्रा का परीक्षण करें।
    2. मछली धोने बफर निकालें और Coplin जार में पीबीएस के साथ इसे प्रतिस्थापित करें। पीबीएस के साथ कोप्लिन जार को फिर से भरने के तुरंत बाद, पीबीएस को डिकेंट करें।
    3. जार से स्लाइड निकालें और पिपेट टिप के साथ ऊतक को स्पर्श नहीं करने के लिए सुनिश्चित करते हुए अनुभाग के शीर्ष पर काउंटरस्टेन को पिपेट करें। एक बुलबुले के साथ पूरे अनुभाग को कवर करें। अंधेरे में 45 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    4. ताजा पीबीएस के साथ दाग को 3 बार जल्दी से धोएं: चिमटी का उपयोग करके स्लाइड को पकड़ते समय, पीबीएस को सिंक में डालें और तुरंत ताजा पीबीएस के साथ फिर से भरें।
    5. एक पोंछे या कागज तौलिया के खिलाफ स्लाइड के पीछे पोंछते हुए, पीबीएस के अधिकांश वर्गों को वाष्पित होने दें, एक पिपेट टिप से जुड़ी वैक्यूम लाइन द्वारा सहायता प्राप्त। एक बार फिर, पिपेट टिप के साथ अनुभाग को छूने से बचें।
    6. एक बढ़ते माध्यम (DAPI के बिना) का उपयोग करके वर्गों को माउंट करें और इसे ग्लास कवरलिप्स द्वारा कवर किए गए कमरे के तापमान पर सेट करने दें, यह सुनिश्चित करते हुए कि कवरस्लिप फ्लैट हैं और बढ़ते माध्यम में कोई हवा के बुलबुले नहीं हैं।
    7. स्पष्ट नेल पॉलिश के साथ कवरस्लिप के किनारों के साथ पेंटिंग करके स्लाइड पर कवरलिप्स चिपकाएं, यह सुनिश्चित करने के लिए स्लाइड के किनारे से दूर रहने का ध्यान रखें कि स्लाइड इमेजिंग के दौरान माइक्रोस्कोप स्लाइड धारक में स्तर पर बैठेगी।
    8. प्रतिदीप्ति समाप्त होने से पहले स्लाइड को कुछ हफ्तों के लिए अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

4. इमेजिंग और छवि विश्लेषण

  1. दाग visualizing
    1. माइक्रोबायोटा-होस्ट इंटरफ़ेस की छवि बनाने के लिए ऊतक और लुमेन दोनों वाले ऊतक के एक क्षेत्र का चयन करें। बलगम मोटाई और ल्यूमिनल बायोजियोग्राफी की मात्रात्मक इमेजिंग के लिए, दृश्य के क्षेत्रों का चयन करें जहां उपकला विल्ली और / या क्रिप्ट्स के स्लाइस अनुदैर्ध्य हैं और क्रॉस-अनुभागीय नहीं हैं। कलाकृतियों को विभाजित करने से बचने के लिए बलगम और उपकला के बीच बड़े अंतराल वाले क्षेत्रों से बचें।
    2. ऊतक का पता लगाएं और फोकल प्लेन को सही करें, मछली प्रतिदीप्ति संकेत के फोटो-ब्लीचिंग से बचने के लिए डीएपीआई सिग्नल का पता लगाने और ध्यान केंद्रित करने के लिए डीएपीआई सिग्नल का उपयोग करें।
    3. इमेजिंग सेटिंग्स समायोजित करें. बैक्टीरियल डीएपीआई दाग की कल्पना करने के लिए, लेजर शक्ति को बढ़ाएं और उस बिंदु तक लाभ उठाएं जहां उपकला कोशिकाओं से डीएपीआई सिग्नल ओवरसैचुरेटेड या "उड़ा दिया गया है।
      नोट: अत्यधिक संतृप्त न करें, क्योंकि इससे नाभिक में फोटोब्लीचिंग और दृश्य कलाकृतियां होंगी जिन्हें पुनर्प्राप्त नहीं किया जा सकता है।
    4. अन्य सभी चैनलों के लिए, लेजर पावर की न्यूनतम मात्रा का उपयोग करें जो पृष्ठभूमि के ऊपर एक स्पष्ट संकेत प्रदान करेगा, और सावधान रहें कि ओवरसैचुरेट न करें।
      नोट:: टाइल-स्कैन करते समय यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, क्योंकि जब टाइल्स के बीच ओवरलैप को चित्रित किया जाता है तो फोटोब्लीचिंग समस्याग्रस्त हो जाएगी।
    5. व्यक्तिगत बैक्टीरिया की छवि के लिए 40x या उच्चतर आवर्धन का उपयोग करें।
    6. छवियों को प्राप्त करें।
      1. लुमेन के भीतर रोगाणुओं के बलगम मोटाई और स्थानिक वितरण पर मात्रात्मक डेटा प्राप्त करने के लिए टाइल स्कैन प्राप्त करें। टाइल्स के बीच 15% ओवरलैप सुनिश्चित करें और विग्नेटिंग / असमान रोशनी के लिए जांच करें, जिसे <1x ज़ूम द्वारा बढ़ाया जा सकता है। टाइल स्कैन की स्थापना करते समय, इस बात पर ध्यान दें कि क्या ऊतक सभी टाइलों में ध्यान केंद्रित कर रहा है, क्योंकि धुंधली / आउट-ऑफ-फोकस छवियों का विश्लेषण नहीं किया जा सकता है (चित्रा 3 बी)।
      2. यदि संभव हो, तो स्कैन क्षेत्र को घुमाकर उपकला की एक निश्चित लंबाई को प्रतिबिंबित करने के लिए आवश्यक टाइलों की संख्या को कम करें ताकि उपकला और बलगम परत टाइल के समानांतर हो और कोण पर न हो। अन्यथा, उपकला का एक खंड ढूंढें जो एक समान प्रभाव प्राप्त करने के लिए इमेजिंग क्षेत्र के समानांतर या लंबवत है।

Representative Results

माउस आंत में विशिष्ट आंत commensal बैक्टीरिया के स्थानीयकरण की जांच करने के लिए, रोगाणु मुक्त स्विस वेबस्टर चूहों कि व्यक्तिगत जीवाणु आइसोलेट्स के साथ उपनिवेशित किया गया था इस अध्ययन में इस्तेमाल किया गया था. इस प्रयोग के लिए, लेबल की गई जीवाणु प्रजातियां थीं i) मुरीबाकुलेसी परिवार 5, मुरीबाकुलम आंतों का एक मानव अलगाव, मुरीन माइक्रोबायोटा 15 में बैक्टीरिया का एक प्रचुर और प्रचलित परिवार, साथ ही साथ ii) बैक्टेरोइड्स थेटायोटाओमाइक्रोन, एक आनुवंशिक रूप से असभ्य और आम आंत जीवाणु। संतुलन के दो हफ्तों के बाद, चूहों को euthanized किया गया था, और एक फेकल गोली युक्त बृहदान्त्र के एक खंड को विभाजित किया गया था और ताजा तैयार मेथाकार्न में तय किया गया था। निर्धारण के दो दिनों के बाद, वर्गों को मेथनॉल, इथेनॉल और जाइलीन के माध्यम से प्रसंस्करण द्वारा निर्जलित किया गया था, पैराफिन के साथ घुसपैठ की गई थी, एम्बेडेड किया गया था, और फिर ल्यूमिनल 4 μm स्लाइस में विभाजित किया गया था। इन नमूनों को तब एक मछली जांच (3'Cy3-टैग) के साथ दाग दिया गया था, जो मुरीबाकुलम आइसोलेट के लिए विशिष्ट था, जिसे ओलिगोमिनर सॉफ़्टवेयर 12 का उपयोग करके डिज़ाइन किया गया था, और NuPACK और mathFISH16,17 का उपयोग करके माध्यमिक और तृतीयक संरचना और न्यूनतम गैर-विशिष्ट बाध्यकारी के लिए जांच की गई थी। नमूनों को रोडामाइन-बाउंड लेक्टिन यूईए -1 (जो बलगम में फ्यूकोसिलेटेड ग्लाइकन को दागता है) और डीएपीआई के साथ भी काउंटरकिया गया था। दाग वर्गों को 40x तेल उद्देश्य और सुपर-रिज़ॉल्यूशन मॉड्यूल का उपयोग करके चित्रित किया गया था।

Figure 1
चित्र 1: आंत में माइक्रोबायोटा-होस्ट इंटरफ़ेस के विज़ुअलाइज़ेशन का वर्कफ़्लो. (A) पाइपलाइन के लिए एक सचित्र वर्कफ़्लो. (बी) दो सेक्शनिंग विमानया तो अनुप्रस्थ वर्गों (इस पाइपलाइन के लिए पसंद किया जाता है) या क्रॉस-सेक्शनल "डोनट्स" उत्पन्न करेंगे। (सी) बहुत अलग मोटाई के ऊतकों को एम्बेड करने के परिणामस्वरूप स्लाइस हो सकते हैं जो केवल एक ऊतक या किसी अन्य के लिए इष्टतम हैं। संक्षेप: FISH = सीटू संकरण में प्रतिदीप्ति; DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: बृहदान्त्र इमेजिंग एक gnotobiotic माउस मॉडल में बलगम के सापेक्ष Muribaculum आंत्र के स्थानीयकरण से पता चलता है. अनुभागों को DAPI (नीले), Muribaculaceae FISH probe (लाल), और UEA-1 (हरे रंग) के साथ दाग दिया गया था। (ए) माउस मोनो-उपनिवेशित का डिस्टल बृहदान्त्र मुरीबाकुलम आंत्र के साथ और (बी) माउस के डिस्टल बृहदान्त्र को मुरीबाकुलम आंत्र और बैक्टेरोइड्स थेटिओटाओमिक्रॉन के साथ द्वि-उपनिवेशित किया गया। स्केल बार = 20 μm. (C और D) Cy3-FISH (बाएं), DAPI (मध्य), और क्रमशः (A) और (B) के ल्यूमिनल इनसेट भागों के लिए संयुक्त Cy3-FISH + DAPI चैनल। स्केल बार = 5 μm. (ए) और (सी) में, सभी बैक्टीरिया के आकार के और बैक्टीरिया के आकार के डीएपीआई संकेतों को Cy3 (एकल एरोहेड्स) के साथ लेबल किया जाता है, और (बी) और (डी) में, इन Cy3- और DAPI-डबल-पॉजिटिव कोशिकाओं (एकल एरोहेड्स) के अलावा, DAPI-दाग वाली जीवाणु कोशिकाएं हैं जो Cy3-नकारात्मक (डबल एरोहेड्स) हैं, जैसा कि मोनो- और द्वि-उपनिवेशीकरण राज्यों के लिए अपेक्षित है। लंबे फिलामेंटस बैक्टीरिया के अपवाद के साथ, बड़े (लंबाई में >4 μm) DAPI-सकारात्मक संरचनाएं (कुंद तीर) मेजबान कोशिकाओं से पौधे की सामग्री या नाभिक हैं। संक्षेप: FISH = सीटू संकरण में प्रतिदीप्ति; DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: सामान्य समस्याएं। (ए) उथले सेक्शनिंग आंत के ल्यूमिनल स्लाइस प्रदान नहीं करेगा। (बाएँ) एक आंत्र खंड जिसे गहराई पर विभाजित किया गया है जो लुमेन के साथ-साथ उपकला के अनुदैर्ध्य दृश्यों का दृश्य प्रदान करता है। (दाएँ) एक आंत्र खंड जिसे बहुत उथले रूप से विभाजित किया गया है, जो केवल क्रिप्ट्स के क्रॉस-सेक्शन और कोई निरंतर बलगम परत या बैक्टीरिया का खुलासा करता है। (बी) असमान ऊतक / कवरस्लिप कवरेज के परिणामस्वरूप धुंधला और असमान रूप से प्रकाशित टाइल-स्कैन हो सकता है। एक टाइल-स्कैन को उन पदों के साथ स्थापित किया गया था जो फोकस से बाहर थे (शीर्ष दाएं कोने)। (सी) सामान्य पृष्ठभूमि (बाएं) और उच्च पृष्ठभूमि (दाएं) का उदाहरण। इस उदाहरण में, DAPI सिग्नल-नोट के लिए नाभिक के बाहर, उपकला से आने वाले सिग्नल को नोट करें। सभी स्केल सलाखों = 20 μm. संक्षिप्त नाम: DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल मेजबान-माइक्रोबायोटा इंटरफ़ेस की कल्पना करने के लिए एक पुनरुत्पादक विधि प्रदान करता है। इन assays काफी प्रोटोकॉल विकास से लाभ हुआ है, FISH labeling18 के अनुकूलन से शुरू बलगम संरक्षण और इमेजिंग9 करने के लिए. निर्धारण और एम्बेडिंग भी नमूनों का उपयोगी भंडारण प्रदान करते हैं; इसके अलावा, पैराफिन-घुसपैठ कैसेट को बिना किसी प्रतिबंध के मेल किया जा सकता है, क्योंकि नमूने पूरी तरह से तय और निष्क्रिय हैं।

महत्व और वैकल्पिक तरीके
मछली और बलगम धुंधला का संयोजन विशिष्ट ऊतक स्थानों पर माइक्रोबायोटा संरचना के विश्लेषण और व्यक्तिगत बैक्टीरिया और मेजबान के बीच बातचीत को सक्षम बनाता है। वैकल्पिक तकनीकें जो माइक्रोबायोटा के भीतर विशिष्ट साइटों के विश्लेषण को शामिल करती हैं, आमतौर पर इन इंटरैक्शन की एकल-सेल प्रकृति का पता लगाने में असमर्थ होती हैं, जैसे कि अनुक्रमण 19 के साथ युग्मित लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन के मामले में। हालांकि, अनुक्रमण-आधारित तकनीकों में माइक्रोबायोटा के आनुवंशिक मेकअप को महीन स्तर पर और अधिक मोटे तौर पर 16 एस आरआरएनए जांच से अधिक व्यापक रूप से कैप्चर करने में सक्षम होने का लाभ है।

प्रस्तुत प्रोटोकॉल का एक नुकसान यह है कि यह मेजबान के संबंध में माइक्रोबायोटा का एक एकल-समय स्नैपशॉट प्रदान करता है। जीवित जानवरों में वास्तविक समय इमेजिंग के लिए, गहरे ऊतक में प्रतिदीप्ति संकेत के अधिग्रहण की सुविधा के लिए विशेष इमेजिंग तकनीकों की आवश्यकता होती है (उदाहरण के लिए, इंट्रावाइटल दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी और लाइट-शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी 20,21)। इन तरीकों में, मॉडल जीव या तो बैक्टीरिया के साथ उपनिवेशित होता है जो अणुओं के साथ दागदार होते हैं जो उनके लिफाफे 20 या आनुवंशिक रूप से संशोधित बैक्टीरिया से बंधे होते हैं जो फ्लोरोसेंट प्रोटीन को आश्रय देते हैं21। बाद के मामले में, प्रतिदीप्ति प्रोटीन की परिपक्वता एक महत्वपूर्ण मुद्दा है क्योंकि अधिकांश मानक फ्लोरोसेंट प्रोटीन को प्रकाश उत्सर्जित करने के लिए ऑक्सीजन की आवश्यकता होती है। इसलिए, मॉडल जीवों में कम से कम nanaerobic वातावरण (ऑक्सीजन की नैनोमोलर एकाग्रता) की आवश्यकता होती है, जैसे कि एरोबिक ज़ेबराफ़िश gut21।

इस प्रोटोकॉल में, मेथनॉल-कार्नॉय का उपयोग पैराफॉर्मेल्डिहाइड या फॉर्मेलिन के बजाय फिक्सेटिव के रूप में किया जाता है क्योंकि इसमें पानी नहीं होता है। यह प्रसंस्करण के दौरान जलयोजन, निर्जलीकरण और बलगम परत के पतन को रोकता है और बलगम मोटाई के सटीक माप की सुविधा प्रदान करता है। जबकि मेथाकार्न फिक्सेशन और पैराफिन एम्बेडिंग क्षेत्र में एक मानक बन गए हैं, बलगम संरक्षण 9,22 को अनुकूलित करने के लिए विभिन्न फिक्सेटिव और एम्बेडिंग तकनीकों की जांच की गई है, कुछ अध्ययनों से संकेत मिलता है कि रेजिन पैराफिन एम्बेडिंग 22 से बेहतर हो सकते हैं। पैराफिन एम्बेडिंग और मेथाकार्न निर्धारण के लिए एक और महत्वपूर्ण सीमा फ्लोरोसेंट प्रोटीन प्रतिदीप्ति का नुकसान है, जिसे वैकल्पिक फिक्सेटिव (जैसे, फॉर्मेलिन या पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए)) या संशोधित एम्बेडिंग तकनीकों का उपयोग करके टाला जा सकता है। प्रत्येक फिक्सेटिव के लाभ और कमियां होती हैं, और फिक्सेटिव का विकल्प इमेजिंग प्राथमिकताओं पर निर्भर करता है। इमेजिंग तौर-तरीकों को संयुक्त किया जा सकता है यदि जैविक प्रतिकृतियों को या तो पीएफए और मेथाकार्न में तय किया जाता है और छवियों को दोनों नमूनों से प्राप्त किया जाता है।

FISH को विशिष्ट विरोधी Muc2C3 खरगोश polyclonal एंटीबॉडी9,24 के साथ अलग-अलग उदाहरणों में immunofluorescence के साथ जोड़ा गया है। इन परिणामों को व्यापक रूप से अन्य Muc2 एंटीबॉडी के साथ पुन: पेश नहीं किया गया है, यह दर्शाता है कि एंटीबॉडी की पसंद FISH-immunofluorescence संयोजन की सफलता में महत्वपूर्ण हो सकती है। किसी दिए गए एंटीबॉडी के लिए सफल एंटीबॉडी स्टेनिंग की शर्तें फिश स्टेनिंग के प्रतिधारण की अनुमति नहीं दे सकती हैं।

समस्या निवारण
इस प्रोटोकॉल में, नमूना संग्रह, अनुभाग, और धुंधला इमेजिंग कलाकृतियों के निर्माण को रोकने के लिए महत्वपूर्ण चरणों का प्रतिनिधित्व करते हैं। उदाहरण के लिए, संग्रह पर और एम्बेड करने से पहले ऊतक पर दबाने से माइक्रोबायोटा का गलत स्थानीयकरण हो सकता है और बलगम की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकता है। एक और महत्वपूर्ण विचार यह है कि एक एकल कैसेट में बहुत अलग मोटाई के खंडों के संयोजन से बचें, जैसे कि छोटी आंत का अपेक्षाकृत खाली टुकड़ा और डिस्टल बृहदान्त्र के भीतर एक गोली। विभिन्न मोटाई इमेजिंग में कठिनाइयों का कारण बनती है: एम्बेड करने के बाद, एक खंड के लिए एक विशिष्ट गहराई पर अनुप्रस्थ सेक्शनिंग दूसरे के लिए इमेजिंग के लिए गलत गहराई पर हो सकती है (उदाहरण के लिए, लुमेन प्रत्येक ऊतक के लिए अलग-अलग गहराई पर होगा) (चित्रा 1 बी, सी और चित्रा 3 ए)। इसके अलावा, इमेजिंग पशु मॉडल मल छर्रों के लिए, उन्हें पेरिटोनियल झिल्ली 24 में लपेटा जा सकता है। इस तकनीक में, ताजा अलग-थलग पेरिटोनियम का एक छोटा सा हिस्सा धीरे से मल के चारों ओर मुड़ा हुआ है और प्रोटोकॉल में उल्लिखित धोने के चरणों के दौरान गोली की संरचना को संरक्षित करता है।

सामग्री के साथ पशु ऊतक के प्रसंस्करण के विपरीत, मानव आंतों के नमूनों की इमेजिंग कुछ चुनौतियां प्रस्तुत करती है। विशेष रूप से, ल्यूमिनल सामग्री और म्यूकोसल अस्तर आमतौर पर आंतों की बायोप्सी या लकीर प्रक्रियाओं से पहले किए जाने वाले कोलोनोस्कोपी आंत्र तैयारी से बाधित हो जाएगा। इसके अतिरिक्त, जब बायोप्सी एकत्र की जाती है, तो आंतों की सामग्री की अनुपस्थिति में विशिष्ट विशेषताओं (जैसे, लुमेन बनाम सबम्यूकोसा) की पहचान में सहायता करने के लिए ऊतक अभिविन्यास को नोट करना सहायक होता है। 3% अगर और / या अगर के साथ पूर्व-एम्बेडिंग: जिलेटिन मिश्रण ऊतक ध्रुवीयता को बनाए रखने में उपयोगी हो सकता है25; हालांकि, निर्जलीकरण और अगर के सेक्शनिंग के साथ मुद्दे हैं, जैसा कि साहित्य में बताया गया है, और प्रसंस्करण समय को बदलने की आवश्यकता हो सकती है।

अच्छा मछली धुंधला प्राप्त करने के लिए एक महत्वपूर्ण पहलू विशिष्ट मछली जांच के लिए formamide एकाग्रता को समायोजित करने से आता है. Formamide अपने लक्ष्यों के लिए FISH जांच के संकरण stringency को नियंत्रित करेगा। यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि ए) किसी दिए गए समुदाय को धुंधला करने के लिए उचित फॉर्मामाइड एकाग्रता को चुना जाता है, और बी) कि जांच संयोजन के लिए एक उपयुक्त फॉर्मामाइड एकाग्रता भी संभव है जिसका उपयोग किया जा रहा है-यह कई जांचों का उपयोग करते समय इष्टतम जांच विकल्प को प्रभावित कर सकता है। MathFISH (http://mathfish.cee.wisc.edu/) जैसी वेबसाइटें किसी दिए गए जांच के लिए उचित फॉर्मामाइड सांद्रता की गणना करने में मदद कर सकती हैं। उपयुक्त फॉर्मामाइड सांद्रता के बारे में जानकारी के अभाव में, इस प्रोटोकॉल को 0% और 10% फॉर्मामाइड के साथ परीक्षण किया जा सकता है।

एम्बेडेड नमूनों को विभाजित करने के लिए ब्लॉक को ल्यूमिनल स्लाइस प्राप्त करने के लिए पर्याप्त गहराई तक काटने की आवश्यकता होती है, क्योंकि ब्लॉक में बहुत उथले रूप से विभाजित होने के परिणामस्वरूप विल्ली / क्रिप्ट्स का क्रॉस-सेक्शनल दृश्य होगा जिसमें कोई ल्यूमिनल सामग्री नहीं होगी (चित्रा 3 ए)। इष्टतम FISH संकेत के लिए अनुभाग के तुरंत बाद नमूनों को दाग, और पृष्ठभूमि के मुद्दों (चित्रा 3 C) को हल करने के लिए ताजा DAPI (या DAPI -20 °C पर संग्रहीत) का उपयोग करें। एक महीने से अधिक पुराने वर्गों के मछली दाग के परिणामस्वरूप गरीब / असंगत धुंधला हो सकता है।

यदि ऊतक या कवरस्लिप स्लाइड के संबंध में पूरी तरह से सपाट नहीं है, तो नमूना टाइल स्कैन (चित्रा 3 बी) के भीतर हर स्थिति में ध्यान केंद्रित नहीं कर सकता है, जिससे बर्बाद प्रयास और संभावित फोटोब्लीचिंग हो सकती है। इसे छोटे टाइल स्कैन लेकर हल किया जा सकता है जिसमें सभी पदों को ध्यान में रखने के लिए सत्यापित किया गया है। सुस्त ब्लेड के साथ सेक्शनिंग भी बलगम और ल्यूमिनल सामग्री की टुकड़ी का कारण बन सकती है, जो इमेजिंग के दौरान बड़े अंधेरे क्षेत्रों के रूप में दिखाई देती है। अंत में, संकरण चरण के दौरान समाधान या बुलबुले के वाष्पीकरण से ऊतक में मछली जांच का असमान धुंधला हो सकता है।

एक और महत्वपूर्ण पैरामीटर जो FISH जांच बाइंडिंग की दक्षता को प्रभावित करता है, वह विभिन्न जांचों के बीच प्रतिस्पर्धा है। यह सत्यापित करने के लिए एक उपयोगी जांच कि FISH जांच बैक्टीरिया को लेबल कर रही है, DAPI (चित्रा 2C, D) के साथ FISH जांच से सिग्नल के सह-स्थानीयकरण की जांच करना है। उन नमूनों में जिन्हें कई आरआरएनए जांच के उपयोग की आवश्यकता होती है, संकरण तापमान, जांच एकाग्रता और फॉर्मामाइड जैसे मापदंडों को समायोजित करना यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण हो जाता है कि जांच सही प्रजातियों के लिए कुशलतापूर्वक बाध्यकारी हैं18।

इमेजिंग के बारे में नोट्स
मछली-दाग वाले बैक्टीरिया को एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप और कम से कम 40x आवर्धन के उद्देश्य का उपयोग करके सबसे अच्छा विज़ुअलाइज़ किया जाता है। जबकि 63x आवर्धन को एकल-सेल स्तर पर छवि बैक्टीरिया के लिए पसंद किया जाता है, 40x आवर्धन का उपयोग डिजिटल ज़ूम को अधिकतम करके या सुपर-रिज़ॉल्यूशन सिस्टम को नियोजित करके भी किया जा सकता है। सुपर-रिज़ॉल्यूशन क्षमताओं से लैस सिस्टम व्यक्तिगत जीवाणु कोशिकाओं के उप-सेलुलर रिज़ॉल्यूशन भी प्रदान कर सकते हैं। कम आवर्धन उद्देश्यों का उपयोग जीवाणु स्थानीयकरण और बलगम मोटाई की सामान्य भावना प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है।

8-बिट छवियों के बजाय 16-बिट छवियों को प्राप्त करना भी अत्यधिक अनुशंसित है, क्योंकि उच्च गतिशील रेंज उपकला के बेहद उज्ज्वल नाभिक और ल्यूमिनल बैक्टीरिया के अपेक्षाकृत कमजोर संकेत से डीएपीआई सिग्नल की विस्तृत श्रृंखला पर कब्जा करने में मदद करेगी। ऊपर वर्णित इमेजिंग सेटअप का उपयोग करने के अलावा, एक महत्वपूर्ण इमेजिंग विचार फ्लोरोफोरस की पसंद है। बैक्टीरियल प्रकारों के बीच सर्वोत्तम अलगाव के लिए, सुनिश्चित करें कि उपयोग किए जाने वाले फ्लोरोफोर उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा में ओवरलैप नहीं होते हैं (जब तक कि रैखिक अनमिक्सिंग करने की क्षमता वाले सिस्टम पर इमेजिंग न हो)। इसके अतिरिक्त, अतिरिक्त समुदाय के सदस्यों की पहचान करने के लिए जांच का उपयोग संयोजन में किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, एक परिवार-विशिष्ट जांच और एक जीनस-विशिष्ट जांच का संयोजन)। यदि रैखिक अमिश्रण या अमान्य जांच का उपयोग कर रहे हैं, तो शुद्ध संस्कृतियों पर FISH धुंधला की सटीकता और स्तर का परीक्षण करना आवश्यक है8,14.

एक बार छवियों को एकत्र करने के बाद, कई उपकरण मेजबान-माइक्रोबायोटा इंटरफ़ेस के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए उपलब्ध हैं, जैसे कि BacSpace26, HiPR-FISH8, और अन्य विभाजन उपकरण 27। BacSpace एक MATLAB सॉफ्टवेयर है कि ऊतक और luminal घटकों के विभाजन और छवियों से संयंत्र सामग्री को हटाने की अनुमति देता है26. कार्यक्रम 2 डी में बलगम मोटाई का विश्लेषण और विभिन्न चैनलों में पिक्सेल दूरी के आधार पर स्थानिक वितरण का परिमाणीकरण भी प्रदान करता है26। इसके विपरीत, HiPR-FISH छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर FISH-दाग कोशिकाओं के विभाजन की अनुमति देता है8. अंत में, अन्य जीवाणु विभाजन उपकरण जो इन विट्रो प्रयोगों के लिए अनुकूलित किए गए हैं27 को भी इस आवेदन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

समाप्ति
सीटू इमेजिंग में अन्य समुदाय के सदस्यों के संदर्भ में व्यक्तिगत माइक्रोबियल टैक्सा के मात्रात्मक विश्लेषण और आहार, बलगम और मेजबान उपकला क्रिप्ट्स द्वारा बनाए गए विभिन्न माइक्रोएन्वायरमेंट को सक्षम बनाता है। जीवों के बीच बातचीत मेजबान से जुड़े माइक्रोबियल सिस्टम के जीव विज्ञान को निर्धारित करती है और इन संरचनाओं में परिवर्तन का एक आवश्यक विश्लेषण प्रदान करती है जो स्वास्थ्य के लिए निहितार्थ है। विशेष रूप से, ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल के माध्यम से सीटू में माइक्रोबायोटा की छवि बनाने की क्षमता पशु मेजबान के संबंध में माइक्रोबायोटा के जैवभूगोल में एक अविश्वसनीय खिड़की प्रदान करती है।

Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

लेखकमूल्य तकनीक विकास के लिए डॉ क्रिस्टन अर्ले, समस्या निवारण सहायता के लिए एम्बर हान, पांडुलिपि की महत्वपूर्ण समीक्षा के लिए डॉ जेन गुयेन और डेना पेपिन, और माइक्रोस्कोप एक्सेस प्रदान करने के लिए ब्रिटिश कोलंबिया विश्वविद्यालय में डॉ हेशम सोलीमैन और रॉसी लैब को धन्यवाद देना चाहते हैं। लेखकों ने CIHR टीम अनुदान से समर्थन स्वीकार किया: कनाडाई माइक्रोबायोम पहल 2 (सीटी), क्रोहन और कोलाइटिस कनाडा (सीटी और के.M.एन.), CIFAR (सीटी और के.M.एन.), माइकल स्मिथ फाउंडेशन फॉर हेल्थ रिसर्च स्कॉलर अवार्ड (सीटी के लिए), वेस्टन फाउंडेशन: वेस्टन फैमिली माइक्रोबायोम इनिशिएटिव (सीटी के लिए), पॉल एलन प्रतिष्ठित अन्वेषक पुरस्कार (सीटी के लिए)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aluminum foil
Chloroform Fisher C298-500 Toxic
Coplin jar Fisher 08-813E
Cover glass, 22 × 22 mm, no #1 VWR CA48366-227-1
DAPI Sigma-Aldrich D9542 Resuspended to 5 mg/mL
Empty pipette tip box(es) To melt paraffin
Ethanol, anhydrous, molecular grade -- --
FISH probes
FISH hybridization solution -- -- 20 mM Tris–HCl pH 7.4, 0.9 M NaCl, 0.01% (w/v) SDS in nuclease-free water. Optional addition of 5–50% (v/v) formamide
FISH washing buffer -- -- 20 mM Tris–HCl pH 7.4, 0.9 M NaCl
Fluorescently-labeled Ulex Europaeus Agglutinin (UEA-1) lectin Vector Laboratories FL-1061 (Fluorescein-labeled) or RL-1062-2 (Rhodamine-labeled) UEA-1 labels fucosylated glycans, so it is not appropriate for germ-free mice or for samples from fucosyltransferase 2 (FUT2)-deficient hosts.
Forceps
Formamide Sigma-Aldrich F9037
Fumehood
Glacial Acetic Acid Fisher A38-212 Corrosive and flammable
HybriSlip flexible plastic cover slips, 22 x 22 mm × 0.25 mm Sigma Aldrich GBL722222 for FISH hybridization steps, can substitute glass coverslips
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen Vector Laboratories H-4000
Kimwipes
Methanol Fisher A412 Toxic and flammable
Microtome for sectioning
Multipurpose Specimen Storage Containers, 473 mL Fisher 14-955-117A Can substitute with a glass or polyethylene container of your choice. Methacarn is not compatible with polystyrene or metal.
Nail Polish Electron Microscopy Sciences 72180 Any nail polish should work
Oven Necessary range: 45-60 °C
Paraffin: Leica Paraplast Leica 39601006
PBS, Phosphate-buffered Saline (10x solution) Fisher BP3991 Dilute to 1x for protocol
Sodium chloride Fisher S271
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), 20% Solution, RNase-free Invitrogen AM9820
Tissue-Loc HistoScreen Cassettes Thermo Scientific CA83009-999
Trizma hydrochloride solution, 1M Tris-HCl, pH 7.4 Sigma-Aldrich T2663-1L
Vectashield Vector Laboratories H-1000
Water, nuclease-free Fisher BP2484100
Xylenes Fisher X3P-1GAL Toxic and flammable

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References

  1. Tropini, C., Earle, K. A., Huang, K. C., Sonnenburg, J. L. The gut microbiome: connecting spatial organization to function. Cell Host and Microbe. 21 (4), 433-442 (2017).
  2. Hansson, G. C., Johansson, M. E. V. The inner of the two Muc2 mucin-dependent mucus layers in colon is devoid of bacteria. Gut Microbes. 1 (1), 51-54 (2010).
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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 173
सीटू संकरण, लेक्टिन स्टेनिंग, और इमेजिंग <em>में</em> प्रतिदीप्ति के माध्यम से आंत माइक्रोबायोटा-होस्ट इंटरैक्शन का विज़ुअलाइज़ेशन
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Ng, K. M., Tropini, C. Visualization … More

Ng, K. M., Tropini, C. Visualization of Gut Microbiota-host Interactions via Fluorescence In Situ Hybridization, Lectin Staining, and Imaging. J. Vis. Exp. (173), e62646, doi:10.3791/62646 (2021).

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