Summary
Ce protocole simplifié détaille un flux de travail pour détecter et imager les bactéries dans des échantillons de tissus complexes, de la fixation du tissu à la coloration des microbes avec hybridation fluorescente in situ .
Abstract
Mesurer la localisation des microbes dans leur contexte in vivo est une étape essentielle pour révéler les relations fonctionnelles entre le microbiote et l’intestin des vertébrés. Le paysage spatial du microbiote intestinal est étroitement contrôlé par les caractéristiques physiques - mucus intestinal, cryptes et plis - et est affecté par des propriétés contrôlées par l’hôte telles que le pH, la disponibilité de l’oxygène et les facteurs immunitaires. Ces propriétés limitent la capacité des microbes commensaux et des agents pathogènes à coloniser l’intestin de manière stable. À l’échelle du micron, l’organisation microbienne détermine les interactions étroites entre différents microbes ainsi que les interactions entre les microbes et leur hôte. Ces interactions affectent ensuite le fonctionnement des organes à grande échelle et la santé de l’hôte.
Ce protocole permet de visualiser l’organisation spatiale du microbiote intestinal à partir des distances entre les cellules et des échelles à l’échelle de l’organe. La méthode est basée sur la fixation des tissus intestinaux tout en préservant la structure intestinale et les propriétés du mucus. Les échantillons fixes sont ensuite incorporés, sectionnés et colorés pour mettre en évidence des espèces bactériennes spécifiques par hybridation in situ par fluorescence (FISH). Les caractéristiques de l’hôte, telles que le mucus et les composants de la cellule hôte, sont marquées avec des lectines marquées par fluorescence. Enfin, les sections colorées sont imagées à l’aide d’un microscope confocal utilisant l’imagerie par balayage par tuiles à fort grossissement pour relier les échelles de longueur du micron au centimètre. Ce type d’imagerie peut être appliqué à des coupes intestinales à partir de modèles animaux et à des biopsies de tissus humains pour déterminer la biogéographie du microbiote dans l’intestin en santé et en maladie.
Introduction
Les techniques de visualisation microbienne ont des origines aussi anciennes que la microbiologie elle-même, quand Antonie Van Leeuwenhoek a utilisé son microscope pour observer les bactéries (qu’il a appelées « animalcules ») de la plaque dentaire et des selles au 17ème siècle. Depuis lors, de nombreuses techniques ont été développées pour visualiser l’organisation spatiale du consortium de bactéries, champignons et virus qui vivent associés à un hôte, le microbiote1. Élucider la localisation de ces microbes est essentiel pour déterminer leur fonction au sein de leur hôte animal. La biogéographie des bactéries est importante dans les taxons commensaux et pathogènes, car la proximité d’endroits spécifiques (par exemple, l’épithélium), de substrats nutritionnels et de microbes spécifiques peut dicter la production bactérienne de métabolites sous-jacents aux interactions inter-espèces et inter-règnes.
Une structure clé séparant les bactéries et les tissus hôtes dans plusieurs sites corporels disparates, tels que la cavité buccale, l’intestin ou le poumon, est le mucus - une couche produite par l’hôte qui empêche la translocation microbienne sur les cellules épithéliales de l’hôte et sert de ressource nutritionnelle pour le microbiote2,3,4 . La caractérisation des brèches et des changements dans cette barrière est d’une importance capitale, conduisant à un aperçu mécaniste des interactions hôte-microbiote qui ne serait pas obtenu par séquençage seul5,6,7. Par exemple, l’imagerie a permis de découvrir que l’exposition aux antibiotiques peut perturber la couche de mucus et l’organisation du microbiote7,8, et que les laxatifs peuvent épuiser le mucus, en corrélation avec de grands changements dans les paramètres immunitaires5.
Ce protocole décrit un cadre général pour la fixation, la coloration et l’imagerie du microbiote et du tissu hôte (Figure 1), basé sur les travaux de Johansson et Hansson9. Bien que ce protocole soit modélisé dans le contexte des coupes intestinales, il peut être facilement adapté à d’autres types de tissus. Ce protocole permet le traitement d’échantillons cliniques expérimentaux d’animaux ou d’humains; des notes pour le traitement des deux types d’échantillons ont été incluses. Dans l’exemple présenté ici, l’épithélium hôte et les bactéries luminales ont été marqués simultanément avec une coloration au 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI), du mucus avec la lectine conjuguée à la fluorescéine (FITC), de l’agglutinine I d’Ulex europaeus (UEA-1) et un taxon bactérien spécifique utilisant FISH. Les sondes FISH sont généralement conçues contre les gènes de l’ARNr 16S d’un taxon pour assurer le signal élevé de la liaison d’un transcrit à copie élevée.
Dans cet exemple, la sonde cible l’ARNr 16S de la famille bactérienne Muribaculaceae (Figure 2). Cependant, les taches sont facilement substituées par différentes sondes FISH et / ou lectines pour répondre à la question biologique appropriée. Les sondes FISH précédemment validées peuvent être trouvées sur ProbeBase10, une ressource en ligne pour les sondes d’oligonucléotides ciblées par l’ARNr, ou sur SILVA11, une base de données d’ARN ribosomique. Pour la conception de nouvelles sondes, le lecteur peut se référer à de nouveaux pipelines tels que HiPR-FISH8 ou Oligominer12. En utilisant ce protocole, il est possible d’observer l’emballage étroit des bactéries dans la lumière intestinale et les différentes caractéristiques du mucus intestinal dans tout le tube digestif. Le flux de travail décrit ici permet l’analyse quantitative du microbiote dans le contexte spatial de son environnement hôte.
Protocol
Toutes les expériences sur les animaux et les prélèvements de tissus décrits dans le présent protocole ont été effectués conformément aux lignes directrices du Conseil canadien des soins aux animaux (CCPA) et ont été approuvés par le Comité des soins aux animaux de l’Université de la Colombie-Britannique. Des souris Webster suisses sans germes ont été utilisées. Tous les animaux étaient âgés de 8 à 10 semaines, les deux sexes ont été utilisés et toutes les souris ont été co-logées avec au moins deux souris par cage. Les animaux ont été euthanasiés à l’aide de dioxyde de carbone avec luxation cervicale secondaire ou ponction cardiaque.
1. Conception d’une expérience d’imagerie : considérations et prélèvement d’échantillons
- Conception de la sonde FISH
- S’il existe une sonde FISH appropriée, sélectionnez une sonde publiée préexistante qui affiche un signal fort dans les cellules marquées par rapport à l’arrière-plan.
- Valider de nouvelles sondes in vitro pour déterminer leur efficacité à se lier à des échantillons fixes des bactéries cibles et à se lier hors cible à d’autres bactéries.
- Vérifiez toutes les sondes FISH 16S à utiliser par rapport aux séquences 16S de l’organisme cible ou au séquençage de l’ARNr 16S à partir des échantillons à analyser pour s’assurer que la proportion attendue de correspondances positives est présente et que les sondes ne se lient pas de manière non spécifique à d’autres membres du microbiote.
- Alignez les sondes FISH sur des séquences pleine longueur ou des variantes de séquence amplicon à l’aide d’un outil, tel que Clustal Omega13, pour évaluer la liaison potentielle des sondes et de leurs cibles.
- En plus des tests in silico, testez la précision et le niveau de coloration FISH des sondes non validées sur des cultures pures8,14.
REMARQUE : Lors de la coloration de plusieurs membres de la communauté, les sondes peuvent être utilisées de manière combinatoire (p. ex., la combinaison d’une sonde spécifique à une famille et d’une sonde spécifique à un genre) si les fluorophores utilisés ne se chevauchent pas dans les spectres d’excitation et d’émission (sauf imagerie sur un système capable d’effectuer un démélange linéaire). De plus, la spécificité peut être démontrée en incluant des contrôles de spécificité/sondes brouillées ou par la concurrence avec des sondes non fluorescentes.
- Types d’échantillons et prélèvement de tissus
- À l’aide d’outils tranchants et propres, coupez les segments intestinaux de souris suisses Webster gnotobiotiques pour l’imagerie. Minimisez autant que possible les perturbations de l’échantillon et manipulez les sections par leurs bords pour éviter d’affecter la zone d’imagerie. Fixez l’échantillon dès que possible après la dissection pour éviter toute dégradation.
REMARQUE: Pour les études animales, les sections intestinales intactes et non évanées sont préférées; la membrane aidera à garder intacte l’organisation luminale et muqueuse. - Nettoyez les outils en les essuyant avec de l’éthanol à 70% entre les échantillons et les sites. Obtenir au moins trois répliques biologiques par section intestinale / emplacement de biopsie, en prenant soin d’échantillonner des emplacements intestinaux cohérents, car le mucus et l’architecture intestinale ainsi que le microbiote changent de manière significative à différents endroits.
- À l’aide d’outils tranchants et propres, coupez les segments intestinaux de souris suisses Webster gnotobiotiques pour l’imagerie. Minimisez autant que possible les perturbations de l’échantillon et manipulez les sections par leurs bords pour éviter d’affecter la zone d’imagerie. Fixez l’échantillon dès que possible après la dissection pour éviter toute dégradation.
2. Fixation et infiltration de l’échantillon de tissu
- Fixation
- Préparez du méthacarn frais dans un récipient compatible avec les ratios suivants: 60% de méthanol absolu, 30% de chloroforme et 10% d’acide acétique glacial. Distribuer chacun de ces produits chimiques dans une hotte aspirante. Choisissez un récipient qui peut être ventilé en ouvrant le couvercle. Comme le méthacarn n’est pas compatible avec le polystyrène, préparez-le dans un récipient en polyéthylène, en utilisant des cylindres gradués en verre / canalisations sérologiques pour le chloroforme et l’acide acétique glacial.
REMARQUE: Pendant le mélange, des fumées sont produites et peuvent provoquer une accumulation de pression à l’intérieur du récipient. Il est conseillé de garder le récipient relativement bien fermé une fois retiré de la hotte si des échantillons ne sont pas activement ajoutés. Le chloroforme est toxique; ne pas inhaler, avaler ou absorber à travers la peau. Le méthanol est toxique et hautement inflammable; ne pas inhaler, avaler ou absorber à travers la peau. L’acide acétique glacial est inflammable et très corrosif pour la peau et les yeux. - Après la distribution, fermez le récipient, faites tourbillonner pour mélanger, puis évacuez; répétez cette opération jusqu’à ce que les dégagements de gaz aient cessé (et que la pression ne s’accumule plus sensiblement sous le couvercle).
REMARQUE: Ne pas jeter le méthacarn dans les drains; collecter et éliminer les déchets chimiques dangereux conformément aux directives institutionnelles. Utilisez un crayon pour étiqueter les cassettes d’histologie, car de nombreuses encres de stylo se détacheront dans la solution de méthacarn. - Placez les sections intestinales dans des cassettes d’histologie en tenant délicatement un bord du tissu avec une pince à épiler. Fermez la cassette et immergez-la complètement dans une solution de méthacarn frais. Assurez-vous que la solution ne date pas de quelques heures après l’immersion des cassettes.
- Pour les échantillons cliniques qui seront prélevés dans une suite clinique sans accès à une hotte aspirante, utilisez un récipient de stockage en polyéthylène avec un rabat coupé dans le couvercle qui permettra le passage des cassettes histologiques. Scotchez ce rabat fermé lorsqu’il ne passe pas les échantillons pour empêcher l’échappement des fumées toxiques.
REMARQUE: Il est important d’utiliser du ruban de masquage pour éviter la dissolution de la colle sur le récipient - certains types de ruban adhésif (par exemple, le ruban d’emballage en plastique) peuvent ne pas bien résister aux fumées de méthacarn. - Fixez les échantillons pendant un minimum de 3 h et un maximum de deux semaines.
REMARQUE: Les échantillons plus épais peuvent nécessiter des temps de fixation supérieurs à 3 h. Le temps de fixation peut être choisi pour permettre le traitement simultané de l’infiltration de paraffine pour les cassettes fixées dans différentes solutions de méthacarn (par exemple, pour effectuer simultanément l’infiltration de paraffine sur des groupes d’échantillons prélevés et fixés sur deux semaines).
- Préparez du méthacarn frais dans un récipient compatible avec les ratios suivants: 60% de méthanol absolu, 30% de chloroforme et 10% d’acide acétique glacial. Distribuer chacun de ces produits chimiques dans une hotte aspirante. Choisissez un récipient qui peut être ventilé en ouvrant le couvercle. Comme le méthacarn n’est pas compatible avec le polystyrène, préparez-le dans un récipient en polyéthylène, en utilisant des cylindres gradués en verre / canalisations sérologiques pour le chloroforme et l’acide acétique glacial.
- Infiltration et incorporation de paraffine
- Placer la paraffine dans un récipient résistant à la chaleur et la faire fondre dans un four à 60 °C pendant la nuit. Comme les granulés de paraffine prennent plus de place avant de fondre, assurez-vous que suffisamment de paraffine est fondue pour couvrir toutes les cassettes.
REMARQUE: La température ne doit pas être supérieure à 60 ° C car elle peut donner lieu à des artefacts. - Lavez les tissus en versant le liquide dans le récipient à déchets approprié et en le remplaçant immédiatement par les produits chimiques suivants.
- Incuber dans du méthanol absolu pendant 30 min. Répéter une fois.
- Incuber dans de l’éthanol absolu pendant 20 min. Répéter une fois.
- Incuber dans des xylènes pendant 15 min. Répéter une fois.
- Échangez les lavages rapidement, en prenant soin d’éviter de laisser sécher les cassettes. Assurez-vous que chaque lavage recouvre entièrement les cassettes dans le bécher ou le récipient.
REMARQUE: Les xylènes sont inflammables et, s’ils sont inhalés, les vapeurs peuvent déprimer le système nerveux central avec des conséquences neurologiques potentielles à long terme en cas d’exposition à des concentrations élevées (>200 ppm). Manipulez les xylènes uniquement à l’intérieur d’une hotte. Comme les xylènes sont dangereux, prenez soin d’utiliser la quantité minimale nécessaire pour couvrir les cassettes histologiques.
- Pendant l’intégration, orientez les segments intestinaux parallèlement à la longueur de la cassette (par opposition à la verticale) à l’aide d’une pince à épiler pour fournir des sections longitudinales transversales au lieu de beignets de section transversale afin de fournir plus de surface d’échantillon potentielle pour l’imagerie quantitative (Figure 1B).
- Ouvrez légèrement les cassettes (~1-2 cm ou 0,5 pouce) pour permettre à la paraffine d’entrer sans perdre les segments de tissu. Utilisez des gants doubles pour cette étape ou une pince à épiler pour éviter la surchauffe ou une légère brûlure des doigts. Immergez et fermez les cassettes dans le récipient de paraffine fondue, en replaçant le récipient dans le four à 60 °C. Assurez-vous que les cassettes sont remplies de paraffine et qu’il ne reste pas de grosses bulles d’air.
- Après incubation pendant 2 h à 60 °C, retirer le récipient du four. À l’aide de pinces, retirez soigneusement les cassettes et posez-les individuellement sur un morceau de papier d’aluminium pour refroidir. Conservez-les à température ambiante jusqu’à ce qu’ils soient prêts à être incorporés et sectionnés.
- Coupez les blocs de paraffine avec un microtome, sectionnant suffisamment profondément dans le bloc pour que le contenu luminal soit exposé, permettant une section longitudinale des villosités et / ou des cryptes en plus du contenu luminal et du mucus. Prenez soin de remplacer les lames car les matières fécales émoussent rapidement la lame par rapport aux tissus. Coupez des sections à 4 μm d’épaisseur pour une netteté optimale des images. Transférez les sections sur des diapositives ordinaires non revêtues.
- Pour la coloration FISH, colorez les sections intestinales dès que possible (c’est-à-dire dans les quelques semaines suivant le sectionnement) pour obtenir un signal FISH fort. Si l’on omet la coloration FISH, la coloration à la lectine + DAPI peut être effectuée sur des échantillons moins frais (c’est-à-dire âgés de plusieurs mois) sans perte significative de signal.
- Placer la paraffine dans un récipient résistant à la chaleur et la faire fondre dans un four à 60 °C pendant la nuit. Comme les granulés de paraffine prennent plus de place avant de fondre, assurez-vous que suffisamment de paraffine est fondue pour couvrir toutes les cassettes.
3. Coloration des bactéries et caractéristiques de l’hôte
- Préparation
- Chauffer le four à 60 °C. Préchauffez un pot Coplin vide et suffisamment de volume pour couvrir les lames de verre dans le pot deux fois avec des xylènes dans une bouteille en verre, en prenant soin de parafilmer autour du couvercle pour éviter l’évaporation des xylènes. Laisser la température des xylènes atteindre 60 °C.
REMARQUE: Un pot Coplin standard s’adapte à 8 lames, et les lames peuvent être recouvertes d’environ 50 mL de liquide (peut varier entre 40 et 60 mL selon la marque). Les substituts du xylène sont moins toxiques et ont été utilisés avec succès par d’autres groupes pour l’étape de décroissage (étape 3.2)8,9. - Si un four séparé est disponible, préchauffez un four d’hybridation à 50 °C. Sinon, cette étape peut être effectuée avec le même four utilisé pour la cuisson des lames après l’étape 3.2.3.
- Préparer la solution d’hybridation FISH : 20 mM de Tris-HCl, pH 7,4 ; 0,9 M NaCl; 0,01 %26 - 0,1 %9 (p/v) de dodécylsulfate de sodium (FDS) dans de l’eau sans nucléase. Si nécessaire, ajouter 5-50% (v / v) formamide. Préchauffez cette solution d’hybridation à 50 °C lors de la paraffinage.
REMARQUE: Le formamide est un amide qui agit comme un tératogène; manipuler le formamide avec des gants et des lunettes. À petites doses et lors de l’exposition aux yeux, à la peau ou aux muqueuses, il est irritant. En grande quantité, la vapeur de formamide peut nécessiter une intervention médicale. Le formamide peut être conservé à 100 % dans un congélateur à -20 °C.
- Chauffer le four à 60 °C. Préchauffez un pot Coplin vide et suffisamment de volume pour couvrir les lames de verre dans le pot deux fois avec des xylènes dans une bouteille en verre, en prenant soin de parafilmer autour du couvercle pour éviter l’évaporation des xylènes. Laisser la température des xylènes atteindre 60 °C.
- Préparation des lames pour la coloration: déparaffinisation
- Placez les lames dans le pot Coplin, en veillant à ce que les sections n’entrent pas en contact avec d’autres lames ou le pot, et faites cuire les lames à 60 °C pendant 10 min.
- Dans la hotte, remplissez le pot Coplin avec des xylènes préchauffés du four, en prenant soin de ne pas verser directement sur les échantillons et potentiellement déloger les tissus. Replacez le pot Coplin dans le four à 60 °C. Laissez la bouteille avec les xylènes restants dans la hotte.
- Versez les xylènes usagés dans un récipient à déchets approprié pour l’élimination, en prenant soin de ne pas déranger les sections de tissu sur les lames de verre et en utilisant une paire de pinces pour empêcher les lames de tomber du pot Coplin. Reconstituez le pot Coplin avec les xylènes restants et incubez pendant 10 minutes à température ambiante dans la hotte.
- Incuber les sections dans de l’éthanol à 99,5% pendant 5 min à température ambiante. Après cette étape d’incubation, retirez les lames du pot Coplin, essuyez l’arrière des lames sur une lingette de laboratoire ou une serviette en papier et séchez brièvement à l’air jusqu’à ce que les gouttelettes d’éthanol aient disparu.
REMARQUE: L’essuyage de l’arrière des diapositives permet une meilleure visualisation de la progression du séchage.
- Coloration bactérienne avec FISH
- Utilisez un bloqueur de liquide ou un stylo PAP pour limiter la zone d’expansion du liquide en encerclant la zone de chaque section de tissu. Assurez-vous que l’encre n’entre pas en contact avec la section elle-même. Créez un cercle aussi près que possible de chaque section de tissu sans entrer en contact avec le tissu afin de minimiser la surface qui doit être couverte par la solution d’hybridation.
- Préparer la solution d’hybridation : pour chaque 50 μL de solution d’hybridation préchauffée, ajouter 0,5 μg de sonde (par exemple, 0,5 μL de sonde de 1 μg/μL). Pipeter la solution d’hybridation sur les sections de la lame (~20 μL/section, selon la taille de la section/du cercle). Protégez la solution d’hybridation et les lames de la lumière à partir de ce point pendant les étapes d’incubation et de stockage.
- Assurez-vous que le volume de liquide utilisé couvre toute la section lors de la superposition avec un couvercle en plastique flexible. Incuber la lame dans une chambre humide pour réduire l’évaporation. Créez une chambre humide avec une boîte à embouts de pipette avec des lingettes ou des serviettes en papier au fond qui ont été trempées avec une solution d’hybridation en excès ou une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour fournir de l’humidité. Incuber les sections à 45-50 °C, selon le jeu de sondes, pendant >3 h.
- Réchauffez le tampon de lavage FISH : 20 mM Tris-HCl, pH 7,4 ; 0,9 M naCl à 50 °C pendant la période d’incubation. Préparez suffisamment de tampon de lavage pour couvrir les lames dans le pot Coplin.
- Retirez les couvercles en plastique; incuber les lames dans un tampon de lavage FISH dans un pot Coplin, tous deux préchauffés à 50 °C. Replacez le pot Coplin dans le four à 50 °C pendant 10 à 20 min. Pour les échantillons épais, retirez les couvercles dans le pot Coplin en ajoutant le tampon et en délogeant doucement les couvercles pour éviter de maculer la tranche.
- Coloration du mucus et des caractéristiques de l’hôte
- Préparer une contre-tache générale ADN/mucus dans le PBS : coloration finale de 10 μg/mL DAPI + 40 μg/mL de mucus UEA-1. Préparez suffisamment de contre-taches pour couvrir les taches en l’absence d’un couvercle pour éviter d’endommager les tissus avec des couvercles supplémentaires.
REMARQUE: Couvrir les taches en l’absence d’un couvercle nécessitera des volumes plus importants que les 20 μL utilisés dans le 3.3.2. Pour les sections de taille moyenne (~10 mm de diamètre), 200 μL suffisent pour couvrir un point; testez ce volume au préalable sur une diapositive factice. - Retirez le tampon de lavage FISH et remplacez-le par pbS dans le pot Coplin. Immédiatement après avoir rempli le pot Coplin avec du PBS, décantez le PBS.
- Retirez les glissières du pot et pipettez la contre-tache sur le dessus de la section tout en veillant à ne pas toucher le tissu avec la pointe de la pipette. Couvrez toute la section avec une bulle. Incuber à 4 °C pendant 45 min dans l’obscurité.
- Lavez les taches 3 fois rapidement avec du PBS frais: tout en maintenant les lames en place à l’aide d’une pince à épiler, versez le PBS dans un évier et remplissez immédiatement avec du PBS frais.
- En essuyant l’arrière des glissières contre une lingette ou une serviette en papier, laissez la majeure partie du PBS s’évaporer des sections, aidé par une conduite de vide reliée à une pointe de pipette. Encore une fois, évitez de toucher la section avec la pointe de la pipette.
- Montez les sections à l’aide d’un support de montage (sans DAPI) et laissez-les régler à température ambiante recouvertes de couvercles en verre, en veillant à ce que les couvercles soient plats et qu’il n’y ait pas de bulles d’air dans le support de montage.
- Fixez les lèvres de couverture sur la diapositive en peignant le long des bords de la lèvre de couverture avec du vernis à ongles transparent, en prenant soin de rester à l’écart du bord de la lame pour vous assurer que la lame restera à niveau dans le porte-lame du microscope pendant l’imagerie.
- Conservez les lames à 4 °C dans l’obscurité pendant quelques semaines avant que la fluorescence ne s’épuise.
- Préparer une contre-tache générale ADN/mucus dans le PBS : coloration finale de 10 μg/mL DAPI + 40 μg/mL de mucus UEA-1. Préparez suffisamment de contre-taches pour couvrir les taches en l’absence d’un couvercle pour éviter d’endommager les tissus avec des couvercles supplémentaires.
4. Imagerie et analyse d’images
- Visualiser les taches
- Sélectionnez une zone du tissu qui contient à la fois du tissu et de la lumière pour imager l’interface microbiote-hôte. Pour l’imagerie quantitative de l’épaisseur du mucus et la biogéographie luminale, sélectionnez des champs de vision où les tranches des villosités épithéliales et/ou des cryptes sont longitudinales et non transversales. Évitez les zones avec de grands espaces entre le mucus et l’épithélium pour éviter de sectionner les artefacts.
- Localisez le tissu et corrigez le plan focal, en utilisant le signal DAPI pour localiser et focaliser afin d’éviter le photo-blanchiment du signal de fluorescence FISH.
- Ajustez les paramètres d’imagerie. Pour visualiser la coloration bactérienne DAPI, augmentez la puissance du laser et gagnez au point où le signal DAPI des cellules épithéliales est sursaturé ou « soufflé ».
REMARQUE: Ne sursaturez pas excessivement, car cela entraînera un photoblanchiment et des artefacts visuels dans les noyaux qui ne peuvent pas être récupérés. - Pour tous les autres canaux, utilisez la quantité minimale de puissance laser qui fournira un signal clair au-dessus de l’arrière-plan et veillez à ne pas trop saturer.
REMARQUE: Ceci est particulièrement important lors de l’exécution de numérisations de tuiles, car le photoblanchiment sera problématique lorsque le chevauchement entre les tuiles est imagé. - Utilisez un grossissement de 40x ou plus pour imager des bactéries individuelles.
- Acquérir les images.
- Acquérir des scans de tuiles pour obtenir des données quantitatives sur l’épaisseur du mucus et la distribution spatiale des microbes dans la lumière. Assurez-vous d’un chevauchement de 15 % entre les carreaux et vérifiez s’il n’y a pas de vignettage/éclairage inégal, qui peut être exacerbé par le zoom <1x. Lors de la configuration d’une numérisation de vignettes, faites très attention à savoir si le tissu est mis au point dans toutes les tuiles, car les images floues/floues ne peuvent pas être analysées (Figure 3B).
- Si possible, réduisez au minimum le nombre de tuiles nécessaires pour imager une longueur donnée d’épithélium en faisant pivoter la zone de balayage de sorte que l’épithélium et la couche de mucus soient parallèles à la tuile et non inclinés. Sinon, trouvez une section de l’épithélium parallèle ou perpendiculaire à la zone d’imagerie pour obtenir un effet similaire.
Representative Results
Pour étudier la localisation de bactéries commensales intestinales spécifiques dans l’intestin de la souris, des souris Webster suisses sans germes qui avaient été colonisées avec des isolats bactériens individuels ont été utilisées dans cette étude. Pour cette expérience, les espèces bactériennes étiquetées étaient i) un isolat humain de la famille muribaculaceae5, Muribaculum intestinale, une famille abondante et répandue de bactéries dans le microbiote murin15, ainsi que ii) Bacteroides thetaiotaomicron, une bactérie intestinale génétiquement traitable et commune. Après deux semaines d’équilibrage, les souris ont été euthanasiées et un segment du côlon contenant une pastille fécale a été sectionné et fixé dans du méthacarn fraîchement préparé. Après deux jours de fixation, les sections ont été déshydratées par traitement à travers du méthanol, de l’éthanol et des xylènes, infiltrées avec de la paraffine, incorporées, puis sectionnées en tranches luminales de 4 μm. Ces échantillons ont ensuite été colorés avec une sonde FISH (3' marquée Cy3) spécifique à l’isolat de Muribaculum, conçue à l’aide du logiciel Oligominer12, et vérifiés pour la structure secondaire et tertiaire et la liaison minimale non spécifique à l’aide de NuPACK et mathFISH16,17. Les échantillons ont également été contre-colorés avec la lectine UEA-1 liée à la rhodamine (qui colore les glycanes fucosylés dans le mucus) et le DAPI. Les sections colorées ont été imagées à l’aide d’un objectif d’huile 40x et d’un module de super-résolution.
Figure 1 : Flux de travail de visualisation de l’interface microbiote-hôte dans l’intestin. (A) Un flux de travail illustré pour le pipeline. (B) Les deux plans de section donneront soit des sections transversales (préférées pour ce pipeline), soit des « beignets » de section transversale. (C) L’incorporation de tissus d’épaisseurs très différentes peut donner lieu à des tranches qui ne sont optimales que pour un tissu ou un autre. Abréviations : FISH = hybridation in situ par fluorescence; DAPI = 4′,6-diamidino-2-phénylindole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : L’imagerie du côlon montre la localisation de Muribaculum intestinale par rapport au mucus dans un modèle murin gnotobiotique. Les sections ont été colorées avec DAPI (bleu), Muribaculaceae FISH probe (rouge) et UEA-1 (vert). (A) Côlon distal de souris mono-colonisé avec Muribaculum intestinale et (B) côlon distal de souris bi-colonisé avec Muribaculum intestinale et Bacteroides thetaiotaomicron. Barre d’échelle = 20 μm. (C et D) Cy3-FISH (à gauche), DAPI (au milieu) et canaux combinés Cy3-FISH + DAPI pour les parties luminales de (A) et (B), respectivement. Barre d’échelle = 5 μm. Dans (A) et (C), tous les signaux DAPI en forme de bactéries et de taille bactérienne sont marqués avec Cy3 (pointes de flèche simples), et dans (B) et (D), en plus de ces cellules Cy3 et DAPI-double-positives (pointes de flèche simples), il existe des cellules bactériennes colorées DAPI qui sont Cy3-négatives (doubles pointes de flèche), comme prévu pour les états mono- et bi-colonisation. À l’exception des bactéries filamenteuses plus longues, les structures DAPI positives plus grandes (>4 μm de longueur) (flèches émoussées) sont du matériel végétal ou des noyaux provenant de cellules hôtes. Abréviations : FISH = hybridation in situ par fluorescence; DAPI = 4′,6-diamidino-2-phénylindole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3: Problèmes courants. (A) La section peu profonde ne fournira pas de tranches luminales de l’intestin. (À gauche) Un segment intestinal qui a été sectionné à une profondeur qui fournit une vue de la lumière ainsi que des vues longitudinales de l’épithélium. (À droite) Un segment intestinal qui a été sectionné trop peu profondément, ne révélant que des sections transversales de cryptes et aucune couche de mucus ou de bactéries constantes. (B) Une couverture inégale des tissus et des couvertures peut entraîner des balayages de carreaux flous et inégalement éclairés. Un balayage de tuiles a été mis en place avec des positions floues (coin supérieur droit). (C) Exemple d’arrière-plan normal (à gauche) et d’arrière-plan élevé (à droite). Dans cet exemple, pour le signal DAPI, notez le signal provenant de l’épithélium, à l’extérieur des noyaux. Toutes les barres d’échelle = 20 μm. Abréviation : DAPI = 4′,6-diamidino-2-phénylindole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Discussion
Le protocole décrit ci-dessus fournit une méthode reproductible pour visualiser l’interface hôte-microbiote. Ces tests ont considérablement bénéficié du développement du protocole, depuis l’optimisation du marquage FISH18 jusqu’à la conservation et l’imagerie du mucus9. La fixation et l’intégration fournissent également un stockage utile des échantillons; de plus, les cassettes infiltrées dans la paraffine peuvent être envoyées par la poste sans aucune restriction, car les échantillons sont complètement fixes et inertes.
Importance et méthodes alternatives
La combinaison de FISH et de coloration au mucus permet d’analyser la composition du microbiote à des endroits spécifiques des tissus et l’interaction entre les bactéries individuelles et l’hôte. Les techniques alternatives qui impliquent l’analyse de sites spécifiques au sein du microbiote sont généralement incapables d’explorer la nature unicellulaire de ces interactions, comme dans le cas de la microdissection de capture laser couplée au séquençage19. Cependant, les techniques basées sur le séquençage ont l’avantage de pouvoir capturer la constitution génétique du microbiote à un niveau plus fin et plus largement que les sondes d’ARNr 16S.
Un piège du protocole présenté est qu’il fournit un instantané unique du microbiote par rapport à l’hôte. Pour l’imagerie en temps réel chez des animaux vivants, des techniques d’imagerie spéciales sont nécessaires pour faciliter l’acquisition d’un signal de fluorescence dans les tissus profonds (p. ex., microscopie intravitale à deux photons et microscopie à fluorescence à feuille de lumière20,21). Dans ces méthodes, l’organisme modèle est soit colonisé par des bactéries colorées par des molécules qui se lient à leur enveloppe20, soit par des bactéries génétiquement modifiées qui hébergent des protéines fluorescentes21. Dans ce dernier cas, la maturation des protéines de fluorescence est un problème clé car la plupart des protéines fluorescentes standard ont besoin d’oxygène pour émettre de la lumière. Par conséquent, des organismes modèles qui ont au moins des environnements nanérobiques (concentration nanomolaire d’oxygène) sont nécessaires, tels que l’intestin aérobie du poisson-zèbre21.
Dans ce protocole, le méthanol-carnoy est utilisé comme fixateur au lieu du paraformaldéhyde ou du formol car il ne contient pas d’eau. Cela empêche l’hydratation, la déshydratation et l’effondrement de la couche de mucus pendant le traitement et facilite des mesures précises de l’épaisseur du mucus. Bien que la fixation du méthacarn et l’incorporation de paraffine soient devenues une norme dans le domaine, différents fixateurs et techniques d’incorporation ont été étudiés pour optimiser la conservation du mucus9,22, certaines études indiquant que les résines peuvent être supérieures à l’incorporation de paraffine22. Une autre limitation importante à l’incorporation de paraffine et à la fixation du méthacr est la perte de fluorescence des protéines fluorescentes, qui peut être évitée en utilisant d’autres fixateurs (par exemple, le formol ou le paraformaldéhyde (PFA)) ou des techniques d’incorporation modifiées23. Chaque fixateur a des avantages et des inconvénients, et le choix du fixateur dépend des priorités d’imagerie. Les modalités d’imagerie peuvent être combinées si des répliques biologiques sont fixées dans le PFA et le méthacarn et si des images sont obtenues à partir des deux échantillons.
FISH a été associé à l’immunofluorescence dans des cas isolés avec des anticorps polyclonaux de lapin anti-Muc2C3 spécifiques9,24. Ces résultats n’ont pas été largement reproduits avec d’autres anticorps Muc2, ce qui indique que le choix des anticorps peut être essentiel au succès de la combinaison FISH-immunofluorescence. Les conditions d’une coloration réussie des anticorps pour un anticorps donné peuvent ne pas permettre la rétention de la coloration FISH.
Dépannage
Dans ce protocole, la collecte d’échantillons, la section et la coloration représentent des étapes critiques pour empêcher la création d’artefacts d’imagerie. Par exemple, appuyer sur le tissu lors de la collecte et avant l’incorporation peut entraîner une mauvaise localisation du microbiote et affecter la qualité du mucus. Une autre considération importante est d’éviter de combiner des segments d’épaisseurs très différentes dans une seule cassette, comme un morceau relativement vide de l’intestin grêle et une pastille dans le côlon distal. Les différentes épaisseurs entraînent des difficultés d’imagerie : après l’encastrement, la section transversale à une profondeur spécifique pour un segment peut être à la mauvaise profondeur pour l’imagerie pour l’autre (par exemple, la lumière sera à des profondeurs différentes pour chaque tissu) (Figure 1B, C et Figure 3A). De plus, pour l’imagerie des granulés de selles de modèles animaux, ils peuvent être enveloppés dans une membrane péritonéale24. Dans cette technique, une petite section de péritoine fraîchement isolé est doucement pliée autour des selles et préserve la structure de la pastille pendant les étapes de lavage décrites dans le protocole.
Contrairement au traitement des tissus animaux avec contenu, l’imagerie des échantillons intestinaux humains présente certains défis. Plus précisément, le contenu luminal et la muqueuse seront probablement perturbés par la préparation intestinale de coloscopie habituellement effectuée avant les biopsies intestinales ou les procédures de résection. De plus, lorsque des biopsies sont prélevées, il est utile de noter l’orientation des tissus pour aider à identifier des caractéristiques spécifiques (par exemple, lumen vs sous-muqueuse) en l’absence de contenu intestinal. Pré-incorporation avec 3% d’agar et/ou d’agar:les mélanges de gélatine peuvent être utiles pour maintenir la polarité tissulaire25; cependant, il y a des problèmes avec la déshydratation et le sectionnement de la gélose, comme indiqué dans la littérature, et les délais de traitement peuvent devoir être modifiés.
Un aspect clé pour obtenir une bonne coloration FISH provient de l’ajustement de la concentration de formamide pour des sondes FISH spécifiques. Le formamide contrôlera la rigueur d’hybridation des sondes FISH vers leurs cibles. Il est important de s’assurer que a) la concentration appropriée de formamide est choisie pour colorer une communauté donnée, et b) qu’une concentration appropriée de formamide est même possible pour la combinaison de sondes utilisée, ce qui peut affecter le choix optimal de la sonde lors de l’utilisation de plusieurs sondes. Des sites Web tels que mathFISH (http://mathfish.cee.wisc.edu/) peuvent aider à calculer les concentrations appropriées de formamide pour une sonde donnée. En l’absence d’informations sur les concentrations appropriées de formamide, ce protocole peut être testé avec 0% et 10% de formamide.
La section des échantillons incorporés nécessite de couper le bloc à une profondeur suffisante pour obtenir des tranches luminales, car une section trop superficielle dans un bloc entraînera une vue en coupe transversale des villosités/ cryptes sans contenu luminal (Figure 3A). Colorez les échantillons peu après la section pour obtenir un signal FISH optimal et utilisez du DAPI frais (ou DAPI stocké à -20 °C) pour résoudre les problèmes d’arrière-plan (Figure 3C). La coloration FISH des sections âgées de plus d’un mois peut entraîner une coloration plus faible / incohérente.
Si le tissu ou le couvercle n’est pas parfaitement plat par rapport à la lame, l’échantillon peut ne pas être mis au point à toutes les positions d’un balayage de tuiles (Figure 3B), ce qui entraîne un gaspillage d’efforts et un photoblanchiment potentiel. Cela peut être résolu en prenant des scans de tuiles plus petits dans lesquels toutes les positions ont été vérifiées pour être au point. La section avec des lames ternes peut également entraîner le détachement du mucus et du contenu luminal, qui apparaissent comme de grandes zones sombres lors de l’imagerie. Enfin, l’évaporation de la solution ou des bulles lors de l’étape d’hybridation peut entraîner une coloration inégale des sondes FISH dans le tissu.
Un autre paramètre critique qui affecte l’efficacité de la liaison de la sonde FISH est la concurrence entre les différentes sondes. Une vérification utile pour vérifier que la sonde FISH marque les bactéries consiste à examiner la colocalisation du signal de la sonde FISH avec DAPI (Figure 2C,D). Dans les échantillons qui nécessitent l’utilisation de plusieurs sondes à ARNr, il devient essentiel d’ajuster des paramètres tels que la température d’hybridation, la concentration de la sonde et le formamide pour s’assurer que les sondes se lient efficacement à la bonne espèce18.
Remarques sur l’imagerie
Les bactéries colorées par FISH sont mieux visualisées à l’aide d’un microscope confocal et d’un objectif d’un grossissement d’au moins 40x. Alors que le grossissement 63x est préféré à l’image des bactéries au niveau de la cellule unique, le grossissement 40x peut également être utilisé en maximisant le zoom numérique ou en utilisant un système de super-résolution. Les systèmes équipés de capacités de super-résolution peuvent également fournir une résolution subcellulaire de cellules bactériennes individuelles. Des objectifs de grossissement plus faibles peuvent être utilisés pour obtenir une idée générale de la localisation bactérienne et de l’épaisseur du mucus.
L’acquisition d’images 16 bits au lieu d’images 8 bits est également fortement recommandée, car la plage dynamique plus élevée aidera à capturer la large gamme du signal DAPI à partir des noyaux extrêmement brillants de l’épithélium et le signal relativement faible des bactéries luminales. Outre l’utilisation de la configuration d’imagerie décrite ci-dessus, une considération d’imagerie importante est le choix des fluorophores. Pour une meilleure séparation entre les types bactériens, assurez-vous que les fluorophores utilisés ne se chevauchent pas dans les spectres d’excitation et d’émission (sauf imagerie sur un système capable d’effectuer un démélange linéaire). De plus, les sondes peuvent être utilisées en combinaison (p. ex., la combinaison d’une sonde spécifique à une famille et d’une sonde spécifique à un genre) pour identifier d’autres membres de la communauté. Si vous utilisez des sondes linéaires non mélangées ou non validées, il est essentiel de tester la précision et le niveau de coloration FISH sur des cultures pures8,14.
Une fois les images collectées, plusieurs outils sont disponibles pour l’analyse quantitative de l’interface hôte-microbiote, tels que BacSpace26, HiPR-FISH8 et d’autres outils de segmentation27. BacSpace est un logiciel MATLAB qui permet la segmentation des composants tissulaires et luminaux et l’élimination du matériel végétal des images26. Le programme fournit également une analyse de l’épaisseur du mucus en 2D et une quantification de la distribution spatiale basée sur les distances en pixels dans différents canaux26. Inversement, le logiciel HiPR-FISH Image Analysis permet la segmentation des cellules colorées FISH8. Enfin, d’autres outils de segmentation bactérienne optimisés pour les expériences in vitro27 pourraient également être adaptés à cette application.
Conclusion
L’imagerie in situ permet l’analyse quantitative de taxons microbiens individuels dans le contexte d’autres membres de la communauté et des divers microenvironnements créés par l’alimentation, le mucus et les cryptes épithéliales hôtes. L’interaction entre les organismes dicte la biologie des systèmes microbiens associés à l’hôte et fournit une analyse essentielle du changement dans ces structures au cours de la perturbation qui a des implications pour la santé. Notamment, la capacité d’imager le microbiote in situ grâce au protocole décrit ci-dessus offre une fenêtre incroyable sur la biogéographie du microbiote par rapport à l’hôte animal.
Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier la Dre Kristen Earle pour le développement inestimable de techniques, Amber Hann pour l’aide au dépannage, la Dre Jen Nguyen et Deanna Pepin pour l’examen critique du manuscrit, et le Dr Hesham Soliman et le laboratoire Rossi de l’Université de la Colombie-Britannique pour avoir fourni un accès au microscope. Les auteurs reconnaissent le soutien de la Subvention d’équipe des IRSC : Initiative canadienne pour le microbiome 2 (T.C.), Crohn et Colite Canada (à C.T. et K.M.N.), CIFAR (à C.T. et K.M.N.), Michael Smith Foundation for Health Research Scholar Award (à C.T.), la Weston Foundation: Weston Family Microbiome Initiative (à C.T.), Paul Allen Distinguished Investigator Award (à C.T.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum foil | |||
| Chloroform | Fisher | C298-500 | Toxic |
| Coplin jar | Fisher | 08-813E | |
| Cover glass, 22 × 22 mm, no #1 | VWR | CA48366-227-1 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Resuspended to 5 mg/mL |
| Empty pipette tip box(es) | To melt paraffin | ||
| Ethanol, anhydrous, molecular grade | -- | -- | |
| FISH probes | |||
| FISH hybridization solution | -- | -- | 20 mM Tris–HCl pH 7.4, 0.9 M NaCl, 0.01% (w/v) SDS in nuclease-free water. Optional addition of 5–50% (v/v) formamide |
| FISH washing buffer | -- | -- | 20 mM Tris–HCl pH 7.4, 0.9 M NaCl |
| Fluorescently-labeled Ulex Europaeus Agglutinin (UEA-1) lectin | Vector Laboratories | FL-1061 (Fluorescein-labeled) or RL-1062-2 (Rhodamine-labeled) | UEA-1 labels fucosylated glycans, so it is not appropriate for germ-free mice or for samples from fucosyltransferase 2 (FUT2)-deficient hosts. |
| Forceps | |||
| Formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | |
| Fumehood | |||
| Glacial Acetic Acid | Fisher | A38-212 | Corrosive and flammable |
| HybriSlip flexible plastic cover slips, 22 x 22 mm × 0.25 mm | Sigma Aldrich | GBL722222 | for FISH hybridization steps, can substitute glass coverslips |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Kimwipes | |||
| Methanol | Fisher | A412 | Toxic and flammable |
| Microtome | for sectioning | ||
| Multipurpose Specimen Storage Containers, 473 mL | Fisher | 14-955-117A | Can substitute with a glass or polyethylene container of your choice. Methacarn is not compatible with polystyrene or metal. |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | Any nail polish should work |
| Oven | Necessary range: 45-60 °C | ||
| Paraffin: Leica Paraplast | Leica | 39601006 | |
| PBS, Phosphate-buffered Saline (10x solution) | Fisher | BP3991 | Dilute to 1x for protocol |
| Sodium chloride | Fisher | S271 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), 20% Solution, RNase-free | Invitrogen | AM9820 | |
| Tissue-Loc HistoScreen Cassettes | Thermo Scientific | CA83009-999 | |
| Trizma hydrochloride solution, 1M Tris-HCl, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2663-1L | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Water, nuclease-free | Fisher | BP2484100 | |
| Xylenes | Fisher | X3P-1GAL | Toxic and flammable |
References
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