Summary
פרוטוקול יעיל זה מפרט זרימת עבודה לזיהוי ותמונה של חיידקים בדגימות רקמות מורכבות, החל מתיקון הרקמה ועד להכתמת חיידקים עם פלואורסצנטיות בהכלאה במקום .
Abstract
מדידת לוקליזציה של חיידקים בתוך ההקשר in vivo שלהם היא צעד חיוני בחשיפת היחסים הפונקציונליים בין המיקרוביוטה למעי החוליות. הנוף המרחבי של המיקרוביוטה במעיים נשלט היטב על ידי תכונות פיזיות - ריר מעיים, קריפטות וקפלים - ומושפע מתכונות הנשלטות על ידי המארח כגון pH, זמינות חמצן וגורמים חיסוניים. תכונות אלה מגבילות את היכולת של חיידקים ופתוגנים קומוניים כאחד ליישב את המעיים ביציבות. בקנה המידה המיקרוני, ארגון מיקרוביאלי קובע את האינטראקציות בטווח הקרוב בין חיידקים שונים, כמו גם את האינטראקציות בין חיידקים למארח שלהם. אינטראקציות אלה משפיעות על תפקוד איברים בקנה מידה גדול ועל בריאות המארח.
פרוטוקול זה מאפשר הדמיה של הארגון המרחבי של מיקרוביוטה במעיים ממרחקים בין תאים לקנה מידה רחב איברים. השיטה מבוססת על תיקון רקמות המעי תוך שמירה על מבנה המעיים ומאפייני הריר. לאחר מכן, הדגימות הקבועות מוטמעות, מנותחות ומוכתמות כדי להדגיש מינים חיידקיים ספציפיים באמצעות פלואורסצנטיות בהכלאה במקום (FISH). תכונות מארח, כגון ריר ורכיבי תא מארח, מסומנים עם lectins פלואורסצנטית. לבסוף, המקטעים המוכתמים מוצגים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי המשתמש בהדמיית סריקת אריחים בהגדלה גבוהה כדי לגשר על קשקשי המיקרון לסנטימטר. סוג זה של הדמיה יכול להיות מיושם על מקטעי מעיים ממודלים של בעלי חיים וביופסיות מרקמות אנושיות כדי לקבוע את הביוגוגרפיה של המיקרוביוטה במעיים בבריאות ובמחלות.
Introduction
לטכניקות הדמיה מיקרוביאלית יש מקורות עתיקים כמו המיקרוביולוגיה עצמה, כאשר אנטוני ואן ליוונהוק השתמש במיקרוסקופ שלו כדי להתבונן בחיידקים (שאותם כינה "בעלי חיים") מפלאק שיניים ושרפרף במאה ה - 17. מאז פותחו טכניקות רבות כדי לדמיין את הארגון המרחבי של הקונסורציום של חיידקים, פטריות ווירוסים שחיים הקשורים למיקרוביוטה 1. ביהר לוקליזציה של חיידקים אלה חיוני לקביעת תפקידם בתוך פונדקאי בעלי החיים שלהם. הביוגמוגרפיה של החיידקים חשובה במסות קומנסליות ופתוגניות כאחד, שכן הקרבה למקומות ספציפיים (למשל, האפיתל), מצעים תזונתיים ומיקרואורגניזמים ספציפיים עשויה להכתיב ייצור חיידקי של מטבוליטים שבבסיסם בין המינים ואינטראקציות בין-ממלכתיות.
מבנה מרכזי המפריד בין חיידקים לבין הרקמות המארחות במספר אתרי גוף שונים, כגון חלל הפה, המעי או הריאה, הוא הריר - שכבה המיוצרת על ידי המארח המונעת טרנסלוקציה מיקרוביאלית לתאי האפיתל המארחים ומשמשת כמשאב תזונתי עבור המיקרוביוטה2,3,4 . אפיון פרצות ושינויים במחסום זה הוא בעל חשיבות מרכזית, מה שמוביל לתובנה מכנית של אינטראקציות מארח-מיקרוביוטה שלא היו מתקבלות על ידי רצף לבד5,6,7. לדוגמה, ההדמיה אפשרה את הגילוי כי חשיפה לאנטיביוטיקה יכולה לשבש את שכבת הריר ואת ארגון המיקרוביוטה7,8, וכי משלשלים עשויים לרוקן את הריר, בקורלציה עם שינויים גדולים בפרמטרים החיסוניים5.
פרוטוקול זה מתאר מסגרת כללית לתיקון, הכתמה והדמיה של המיקרוביוטה והרקמה המארחת (איור 1), הבנויה על עבודתם של ג'והנסון והנסון9. בעוד פרוטוקול זה הוא מודל בהקשר של מקטעי מעיים, זה יכול להיות מותאם בקלות לסוגי רקמות אחרים. פרוטוקול זה מאפשר עיבוד של דגימות קליניות ניסיוניות של בעלי חיים או בני אדם; הערות לעיבוד שני סוגי הדגימות נכללו. בדוגמה המוצגת כאן, האפיתל המארח וחיידקי לומינאליים תויגו בו זמנית עם 4′,6-diamidino-2-פנילינדול (DAPI) כתמים, ריר עם לוציטין פלואורסצין (FITC), Ulex europaeus agglutinin I (UEA-1), וטקסון חיידקי ספציפי באמצעות FISH. בדיקות דגים מתוכננות בדרך כלל נגד הגנים rRNA 16S של טקסון כדי להבטיח את האות הגבוה מ מחייב תעתיק עותק גבוה.
בדוגמה זו, הגשושית מכוונת ל-16S rRNA של משפחת החיידקים Muribaculaceae (איור 2). עם זאת, הכתמים מוחלפים בקלות עם בדיקות דגים שונים ו / או lectins כדי להתאים את השאלה הביולוגית המתאימה. בדיקות FISH שאומתו בעבר ניתן למצוא ב- ProbeBase10, משאב מקוון עבור בדיקות אוליגונוקלאוטיד ממוקדות rRNA, או ב- SILVA11, מסד נתונים של RNA ריבוזומלי. עבור העיצוב של בדיקות חדשות, הקורא עשוי להתייחס צינורות חדשים כגון HiPR-FISH8 או Oligominer12. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן לבחון את האריזה הקרובה של חיידקים בלומן המעי ואת התכונות השונות של ריר המעיים ברחבי מערכת העיכול. זרימת העבודה המתוארת כאן מאפשרת ניתוח כמותי של המיקרוביוטה בהקשר המרחבי של הסביבה המארחת שלה.
Protocol
כל הניסויים בבעלי חיים ואיסוף הרקמות המתוארים בפרוטוקול זה בוצעו בהתאם להנחיות המועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים (CCAC) ואושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת קולומביה הבריטית. נעשה שימוש בעכברים שוויצריים ללא חיידקים. כל בעלי החיים היו בני 8-10 שבועות, שני המינים שימשו, וכל העכברים שוכנו יחד עם לפחות שני עכברים לכלוב. בעלי חיים הומתו באמצעות פחמן דו חמצני עם נקע משני בצוואר הרחם או ניקוב לב.
1. תכנון ניסוי הדמיה: שיקולים ואיסוף דוגמאות
- עיצוב בדיקה דגים
- אם קיימת בדיקה מתאימה של FISH, בחר בדיקה שפורסמה מראש המציגה אות חזק בתאים המסומנים בתווית בהשוואה לרקע.
- לאמת בדיקות חדשות במבחנה כדי לקבוע את יעילותם של כריכה לדגימות קבועות של חיידקי היעד וקשר מחוץ למטרה לחיידקים אחרים.
- בדוק את כל בדיקות הדגים של 16S שישמשו נגד רצפי 16S מהאורגניזם היעד או נגד ריצוף rRNA 16S מהדגימות שיש לנתח כדי להבטיח שהשיעור הצפוי של התאמות חיוביות קיים, וכי בדיקות לא ייקשרו באופן לא ספציפי לחברי מיקרוביוטה אחרים.
- ישר את בדיקות הדגים נגד רצפים באורך מלא או וריאנטים של רצף אמפליסון באמצעות כלי, כגון Clustal Omega13, כדי להעריך את הכריכה הפוטנציאלית של בדיקות ויעדיהם.
- בנוסף בבדיקות סיליקו, בדוק את הדיוק ואת רמת הכתמת FISH של בדיקות ללא תחרות על תרבויות טהורות8,14.
הערה: בעת הכתמת חברי קהילה מרובים, ניתן להשתמש בבדיקות באופן קומבינטורי (למשל, שילוב של בדיקה ספציפית למשפחה וגשוש ספציפי לסוג) אם הפלורופורים המשמשים אינם חופפים בספקטרום עירור ופליטה (אלא אם כן הדמיה במערכת עם היכולת לבצע פירוק ליניארי). בנוסף, ניתן להדגים את הספציפיות על ידי הכללת בקרות ספציפיות / בדיקות מקושקשות או על ידי תחרות עם בדיקות שאינן פלואורסצנטיות.
- סוגי דגימות ואיסוף רקמות
- באמצעות כלים חדים ונקיים, לחתוך מקטעי מעיים מעכברי וובסטר שוויצריים גנופוביים להדמיה. מזער הפרעה לדגימה ככל האפשר, וטפל בסעיפים בקצוות שלהם כדי להימנע מהשפעה על אזור ההדמיה. תקן את המדגם בהקדם האפשרי לאחר ניתוח כדי למנוע השפלה.
הערה: עבור מחקרים בבעלי חיים, חלקים מעיים שלמים, unflushed מועדפים; הממברנה תעזור לשמור על ארגון זוהר ואילי ללא פגע. - כלים נקיים על ידי ניגוב אותם עם 70% אתנול בין דגימות ואתרים. להשיג לפחות שלושה שכפולים ביולוגיים לכל מיקום קטע מעיים / ביופסיה, טיפול לדגום מיקומי מעיים עקביים, כמו ארכיטקטורת ריר ומעיים, כמו גם מיקרוביוטה משתנה באופן משמעותי במקומות שונים.
- באמצעות כלים חדים ונקיים, לחתוך מקטעי מעיים מעכברי וובסטר שוויצריים גנופוביים להדמיה. מזער הפרעה לדגימה ככל האפשר, וטפל בסעיפים בקצוות שלהם כדי להימנע מהשפעה על אזור ההדמיה. תקן את המדגם בהקדם האפשרי לאחר ניתוח כדי למנוע השפלה.
2. קיבעון דגימת רקמות וחדירה
- קיבוע
- הכן מת'קארן טרי במיכל תואם עם היחסים הבאים: 60% מתנול מוחלט, 30% כלורופורם וחומצה אצטית קרחונית 10%. מחלקים כל אחד מהכימיקלים האלה במכסה אדים. בחר מיכל שניתן לפרוק על ידי פיצוח פתח את המכסה. כמו methacarn אינו תואם פוליסטירן, להכין אותו במיכל פוליאתילן, באמצעות גלילים מדורג זכוכית / צינורות סרולוגיים עבור כלורופורם וחומצה אצטית קרחונית.
הערה: במהלך ערבוב, אדים מיוצרים ועלולים לגרום ללחץ להצטבר בתוך המיכל. מומלץ לשמור על המיכל סגור יחסית לאחר שהוסר ממכסה המנוע אם דגימות אינן מתווספות באופן פעיל. כלורופורם רעיל; אין לשאוף, לבלוע או לספוג דרך העור. מתנול רעיל ודליק מאוד; אין לשאוף, לבלוע או לספוג דרך העור. חומצה אצטית קרחונית דליקה ומאכלת מאוד לעור ולעיניים. - לאחר חלוקה, לסגור את המיכל, מערבולת לערבב ולאחר מכן לפרוק; חזור על כך עד שהפסקת הגזים תיפסק (והלחץ כבר לא יצטבר באופן ניכר מתחת למכסה).
הערה: אין להיפטר methacarn בניקוז; לאסוף ולהיפטר כמו פסולת כימית מסוכנת בהתאם להנחיות המוסדיות. השתמש בעיפרון לתיוג קלטות היסתולוגיה, כמו דיו עט רבים ירדו בתמיסת methacarn. - מניחים את חלקי המעיים בקלטות היסתולוגיות על ידי החזקה עדינה של קצה הרקמה עם פינצטה. סוגרים את הקלטת ומטביעים אותה לחלוטין בתמיסת methacarn טרייה. ודא שהפתרון אינו ישן מכמה שעות עם טבילת הקלטות.
- עבור דגימות קליניות שייאספו בסוויטה קלינית ללא גישה למכסה אדים, השתמשו במיכל אחסון פוליאתילן עם דש חתוך למכסה שיאפשר את מעבר קלטות ההיסטיולוגיה. טפטפת את הדש הזה סגור כאשר לא עובר דגימות כדי למנוע את הבריחה של אדים רעילים.
הערה: חשוב להשתמש בסרט מיסוך כדי למנוע פירוק של דבק על המיכל - סוגים מסוימים של סרט הדבק (למשל, סרט אריזה מפלסטיק) לא יכול להחזיק היטב את אדי methacarn. - תקן דגימות למשך 3 שעות לפחות ומקסימום של שבועיים.
הערה: דגימות עבות יותר עשויות לדרוש זמני קיבוע ארוכים מ- 3 שעות. ניתן לבחור זמן קיבוע כדי לאפשר עיבוד חדירת פרפין סימולטני לקלטות קבועות בפתרונות methacarn שונים (למשל, לבצע בו זמנית חדירת פרפין על קבוצות של דגימות שנאספו וקידונו במשך שבועיים).
- הכן מת'קארן טרי במיכל תואם עם היחסים הבאים: 60% מתנול מוחלט, 30% כלורופורם וחומצה אצטית קרחונית 10%. מחלקים כל אחד מהכימיקלים האלה במכסה אדים. בחר מיכל שניתן לפרוק על ידי פיצוח פתח את המכסה. כמו methacarn אינו תואם פוליסטירן, להכין אותו במיכל פוליאתילן, באמצעות גלילים מדורג זכוכית / צינורות סרולוגיים עבור כלורופורם וחומצה אצטית קרחונית.
- חדירה והטבעה של פרפין
- מניחים את הפרפין במיכל עמיד בחום וממיסים אותו בתנור ב 60 °C (60 °F) לילה. כמו כדורי פרפין לתפוס יותר מקום לפני ההיתוך, להבטיח כי פרפין מספיק נמס כדי לכסות את כל הקלטות.
הערה: הטמפרטורה לא צריכה להיות גבוהה מ 60 °C (60 °F) כפי שהוא יכול להוליד חפצים. - לשטוף את הרקמה על ידי שפיכת הנוזל בכלי הקיבול המתאים פסולת והחלפתו מיד עם הכימיקלים הבאים.
- דגירה במתנול מוחלט במשך 30 דקות. חזור פעם אחת.
- דגירה באתנול מוחלט במשך 20 דקות.
- דגירה בקסילן במשך 15 דקות.
- החליפו את הכביסות במהירות, תוך כדי דאגה להימנע מלתת לקלטות להתייבש. ודא כי כל לשטוף מכסה באופן מלא את הקלטות בכוסה או במיכל.
הערה: קסילן הם דליקים, ואם בשאיפה, האדים עלולים לדכא את מערכת העצבים המרכזית עם השלכות נוירולוגיות פוטנציאליות לטווח ארוך עם חשיפה לריכוזים גבוהים (>200 ppm). טפל בקסילן רק בתוך מכסה המנוע של האדים. כמו קסילן הם מסוכנים, הקפד להשתמש בסכום המינימלי הדרוש כדי לכסות את הקלטות היסתולוגיות.
- במהלך ההטבעה, כוונו את מקטעי המעי במקביל לאורך הקלטת (בניגוד לזקיפים) באמצעות פינצטה כדי לספק מקטעים אורך, רוחביים במקום סופגניות חוצות חתך כדי לספק שטח מדגם פוטנציאלי יותר להדמיה כמותית (איור 1B).
- פתחו מעט את הקלטות (כ-1-2 ס"מ או 0.5 אינץ') כדי לאפשר לפרפין להיכנס מבלי לאבד את מקטעי הרקמה. השתמש כפפות כפולות עבור צעד זה או פינצטה כדי למנוע התחממות יתר או צריבה קלה של אצבעות. שקועים וסוגרים את הקלטות במיכל של פרפין מומס, ומניחים את המיכל בחזרה לתנור 60 מעלות צלזיוס. ודא כי הקלטות מלאות בפרפין, ולא נותרו בועות אוויר גדולות.
- לאחר הדגירה במשך 2 שעות ב 60 °C (60 °F), להסיר את המיכל מהתנור. באמצעות מלקחיים, להסיר בזהירות את הקלטות ולהניח אותם בנפרד על פיסת רדיד אלומיניום להתקרר. לאחסן אותם בטמפרטורת החדר עד מוכן להטמעה וחתך.
- קטע את בלוקי הפרפין עם microtome, חתך עמוק מספיק לתוך הבלוק כי תוכן זוהר נחשפים, המאפשר קטע אורך של villi ו / או קריפטות בנוסף לתוכן זוהר וריר. יש לה מקפיד להחליף את הלהבים כאשר חומר צואתי מקהה את הלהב במהירות בהשוואה לרקמה. חותכים מקטעים לעובי של 4 מיקרומטר לחדות אופטימלית של התמונות. העבר את המקטעים לשקופיות רגילות שלא זוהו.
- עבור כתמי דגים, להכתים את קטעי המעי בהקדם האפשרי (כלומר, בתוך כמה שבועות של חתך) כדי להשיג אות דגים חזק. אם השמטת כתמי דגים, ניתן לבצע כתמי לטין + DAPI על דגימות פחות טריות (כלומר, בנות חודשים) ללא אובדן משמעותי של אות.
- מניחים את הפרפין במיכל עמיד בחום וממיסים אותו בתנור ב 60 °C (60 °F) לילה. כמו כדורי פרפין לתפוס יותר מקום לפני ההיתוך, להבטיח כי פרפין מספיק נמס כדי לכסות את כל הקלטות.
3. מכתים חיידקים ותכונות מארח
- הכנה
- מחממים את התנור ל 60 °C (60 °F). מחממים מראש צנצנת קופלין ריקה ומספיק נפח כדי לכסות את מגלשות הזכוכית בצנצנת פעמיים עם קסילן בבקבוק זכוכית, תוך כדי דאגה לנחיתה סביב המכסה כדי למנוע אידוי של קסילן. אפשר לטמפרטורת הקסילן להגיע ל-60 מעלות צלזיוס.
הערה: צנצנת קופלין סטנדרטית מתאימה ל-8 שקופיות, וניתן לכסות את השקופיות בערך 50 מ"ל של נוזל (עשוי להשתנות בין 40 ל-60 מ"ל בהתאם למותג). תחליפי קסילן רעילים פחות ונעשה בהם שימוש מוצלח על ידי קבוצות אחרות לשלב הסרת השעווה (שלב 3.2)8,9. - אם יש תנור נפרד זמין, מחממים מראש תנור היברידיזציה ל-50 מעלות צלזיוס. אחרת, שלב זה עשוי להתבצע עם אותו תנור המשמש לאפיית השקופיות לאחר שלב 3.2.3.
- הכן את פתרון ההכלאה של FISH: 20 מ"מ טריס-HCl, pH 7.4; 0.9 מ' נאקל; 0.01%26 - 0.1%9 (w/v) נתרן דודצילספט (SDS) במים ללא נוקלאז. במידת הצורך, הוסף 5-50% (v/v) formamide. קדם-חם פתרון הכלאה זה ב 50 °C (50 °F) במהלך דה פרפיניזציה.
הערה: פורממיד הוא אמיד הפועל כטרטוגן; להתמודד עם פורממיד עם כפפות ומשקפי מגן. במינונים קטנים ועל חשיפה לעיניים, לעור או לריריות, זה מעצבן. בכמויות גדולות, אדי פורממיד יכולים לדרוש התערבות רפואית. Formamide ניתן לאחסן ב 100% במקפיא -20 °C (70 °F).
- מחממים את התנור ל 60 °C (60 °F). מחממים מראש צנצנת קופלין ריקה ומספיק נפח כדי לכסות את מגלשות הזכוכית בצנצנת פעמיים עם קסילן בבקבוק זכוכית, תוך כדי דאגה לנחיתה סביב המכסה כדי למנוע אידוי של קסילן. אפשר לטמפרטורת הקסילן להגיע ל-60 מעלות צלזיוס.
- הכנת השקופיות להכתמה: דפרפיזציה
- מניחים את השקופיות בצנצנת קופלין, ומבטיחים כי המקטעים לא באים במגע עם שקופיות אחרות או הצנצנת, ואופים את השקופיות ב 60 °C (60 °F) במשך 10 דקות.
- במכסה המנוע האדים, מלאו את צנצנת הקופלין בקסילן שחומם מראש מהתנור, תוך כדי קפיד לא לשפוך ישירות על גבי הדגימות ועלולים להוציא את הרקמות. מחזירים את צנצנת הקופלין לתנור של 60 מעלות צלזיוס. השאירו את הבקבוק עם הקסילן הנותרים במכסה המנוע של האדים.
- יוצקים את הקסילן המשומש למיכל פסולת ראוי לסילוק, דואגים לא להפריע לחלקי הרקמה על מגלשות הזכוכית ומשתמשים בזוג מלקחיים כדי למנוע מהשקופיות ליפול מצנצנת קופלין. לחדש את צנצנת קופלין עם קסילן הנותרים ודגורה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר במכסה המנוע האדים.
- לדגור על החלקים ב 99.5% אתנול במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר שלב הדגירה הזה, להסיר את השקופיות מצנצנת קופלין, לנגב את הגב של השקופיות על מגבת מעבדה או נייר, וייבש אוויר לזמן קצר עד טיפות האתנול נעלמו.
הערה: מחיקת גב השקופיות מאפשרת הדמיה טובה יותר של התקדמות הייבוש.
- כתמי חיידקים עם דגים
- השתמש חוסם נוזל או עט PAP כדי להגביל את שטח הרחבת הנוזל על ידי מקיף את האזור של כל קטע רקמה. ודא שהדיו אינו בא במגע עם המקטע עצמו. צור עיגול קרוב ככל האפשר לכל קטע רקמה מבלי ליצור קשר עם הרקמה כדי למזער את שטח הפנים שצריך להיות מכוסה על ידי פתרון ההכלאה.
- הכן את פתרון ההיברידיזציה: על כל 50 μL של פתרון הכלאה התחמם מראש, להוסיף 0.5 μg בדיקה (למשל, 0.5 μL של 1 מיקרוגרם / μL בדיקה). Pipette פתרון היברידית על המקטעים בשקופית (~ 20 μL / מקטע, בהתאם למקטע / גודל העיגול). הגן על פתרון ההיברידיות ועל השקופיות מהאור מנקודה זו ואילך במהלך שלבי הדגירה והאחסון.
- ודא כי נפח הנוזל המשמש מכסה את כל החלק על כיסוי עם כיסוי פלסטיק גמיש. לדגור על השקופית בתא לח כדי להפחית את האידוי. צרו תא לח עם קופסת טיפים עם מגבונים או מגבות נייר בתחתית שהושרו בתמיסת הכלאה עודפת או תמיסת מלח (PBS) עם אגירת פוספטים כדי לספק לחות. לדגור על החלקים ב 45-50 °C (50 °F), בהתאם ערכת הבדיקה, עבור >3 שעות.
- לחמם את חוצץ שטיפת דגים: 20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 0.9 M NaCl עד 50 °C (50 °F) במהלך תקופת הדגירה. הכינו מספיק חוצץ כביסה כדי לכסות את השקופיות בצנצנת קופלין.
- הסר את כיסויי הפלסטיק; לדגור את השקופיות במאגר כביסה דגים בצנצנת קופלין, שניהם התחמם מראש ל 50 °C (50 °F). מחזירים את צנצנת הקופלין לתנור 50 מעלות צלזיוס למשך 10-20 דקות. לקבלת דוגמאות עבות, להסיר את כיסויים בצנצנת קופלין על ידי הוספת המאגר בעדינות פורק את כיסויי כדי למנוע מריחת הפרוסה.
- מכתים את תכונות הריר והמארח
- הכן DNA כללי / ריר נגד ב- PBS: סופי 10 מיקרוגרם / mL DAPI + 40 מיקרוגרם / mL כתם ריר UEA-1. הכן מספיק טהור כדי לכסות את הכתמים בהיעדר כיסוי כדי למנוע פגיעה ברקמה עם כיסויים נוספים.
הערה: כיסוי הכתמים בהיעדר כיסוי ידרוש נפחים גדולים יותר מאשר 20 μL בשימוש ב 3.3.2. עבור חלקים בגודל ממוצע (~ 10 מ"מ קוטר), 200 μL מספיק כדי לכסות נקודה אחת; בדוק אמצעי אחסון זה מראש בשקופית דמה. - הסר את חיץ שטיפת דגים ולהחליף אותו עם PBS בצנצנת קופלין. מיד לאחר מילוי צנצנת קופלין עם PBS, decant PBS.
- מוציאים את השקופיות מהצנצנת ומפילים את הדלפק על גבי החלק תוך הקפדה לא לגעת ברקמה עם קצה הפיפטה. מכסים את כל החלק בבועה. דגירה ב 4 °C (4 °F) במשך 45 דקות בחושך.
- לשטוף את הכתמים 3 פעמים במהירות עם PBS טרי: תוך החזקת השקופיות במקום באמצעות פינצטה, לשפוך את PBS בכיור ומיד למלא עם PBS טרי.
- מנגבים את גב המגלשות כנגד מגבת או נייר, מאפשרים לרוב ה-PBS להתאדות מהקטעים, בסיוע קו ואקום המחובר לקצה פיפטה. שוב, להימנע מלגעת בקטע עם קצה פיפטה.
- הר את המקטעים באמצעות מדיום הרכבה (ללא DAPI) ולתת לו להגדיר בטמפרטורת החדר מכוסה כיסויי זכוכית, להבטיח כי כיסויים שטוחים ואין בועות אוויר במדיום הרכבה.
- הצמד את כיסויי השער לשקופית על ידי צביעה לאורך קצות כיסוי עם לק ברור, הקפד להתרחק מקצה השקופית כדי להבטיח כי השקופית תשב רמה במחזיק שקופית מיקרוסקופ במהלך הדמיה.
- יש לאחסן את השקופיות ב-4 מעלות צלזיוס בחושך במשך מספר שבועות לפני שהפלואורסצנטיות מתרוקנת.
- הכן DNA כללי / ריר נגד ב- PBS: סופי 10 מיקרוגרם / mL DAPI + 40 מיקרוגרם / mL כתם ריר UEA-1. הכן מספיק טהור כדי לכסות את הכתמים בהיעדר כיסוי כדי למנוע פגיעה ברקמה עם כיסויים נוספים.
4. הדמיה וניתוח תמונה
- מדמיין את הכתמים
- בחר אזור ברקמה המכיל הן רקמה והן לומן כדי לדמיין את הממשק של המיקרוביוטה-מארח. להדמיה כמותית של עובי ריר וביוגוגרפיה זוהרת, בחרו שדות מבט שבהם פרוסות הווילי האפיתל ו/או הקריפטות הן אורך ולא חתך רוחבי. הימנע אזורים עם פערים גדולים בין הריר לאפיתל כדי למנוע חתך חפצים.
- אתר רקמה ותקן את מישור המוקד, תוך שימוש באות DAPI לאיתור ומיקוד כדי למנוע הלבנת תמונות של אות הפלואורסצנטיות FISH.
- התאם את הגדרות ההדמיה. כדי לדמיין את כתם DAPI החיידקי, להגביר את כוח הלייזר ולהשיג עד לנקודה שבה אות DAPI מתאי אפיתל הוא רווי יתר על המידה או "פוצץ".
הערה: אין להרוות יתר על המידה, שכן זה יוביל להלבנה וחפצים חזותיים בגרעינים שלא ניתן לשחזר. - עבור כל הערוצים האחרים, השתמש בכמות המינימלית של כוח לייזר שיספק אות ברור מעל הרקע, ולהיזהר לא להרוות יתר על המידה.
הערה: הדבר חשוב במיוחד בעת ביצוע סריקות אריחים, שכן הלבנת תמונות תהיה בעייתית כאשר החפיפה בין האריחים תצטלם. - השתמש בהגדלה של פי 40 ומעלה כדי לדמיין חיידקים בודדים.
- השג את התמונות.
- לרכוש סריקות אריחים כדי לקבל נתונים כמותיים על עובי ריר והתפלגות מרחבית של חיידקים בתוך הלומן. ודא חפיפה של 15% בין האריחים וחפש תאורה מרגיזה/לא אחידה, שעלולה להחריף על ידי זום <1x. בעת הגדרת סריקת אריחים, שים לב אם הרקמה נמצאת במוקד בכל האריחים, מכיוון שלא ניתן לנתח תמונות מטושטשות/לא ממוקדות (איור 3B).
- במידת האפשר, מזער את מספר האריחים הדרושים כדי לדמיין אורך נתון של אפיתל על ידי סיבוב אזור הסריקה כך שאפיתל ושכבת ריר מקבילים לאריח ולא בזווית. אחרת, למצוא קטע של האפיתל כי הוא מקביל או מאונך לאזור ההדמיה כדי להשיג אפקט דומה.
Representative Results
כדי לחקור את הלוקליזציה של חיידקים קומנסליים במעיים ספציפיים במעי העכבר, עכברי וובסטר שוויצריים ללא חיידקים שהיו מיושבים עם מבודדים חיידקיים בודדים שימשו במחקר זה. לניסוי זה, מינים חיידקיים שכותרתו היו i) מבודד אנושי של משפחת Muribaculaceae5, מעי Muribaculum, משפחה שופעת ונפוצה של חיידקים במיקרוביוטה המורינית15, כמו גם ii) Bacteroides thetaiotaumicron, חיידק מעיים מתמשך גנטית ונפוץ. לאחר שבועיים של השתוקות, העכברים הומתו, וחלק מהמעי הגס המכיל גלולה צואתית נחתך והתוקן במתקרן טרי. לאחר יומיים של קיבעון, החלקים התייבשו על ידי עיבוד באמצעות מתנול, אתנול, קסילן, חדר עם פרפין, מוטבע, ולאחר מכן חתך לפרוסות 4 מיקרומטר זוהר. דגימות אלה הוכתמו אז עם בדיקה FISH (3 ' Cy3 מתויג) ספציפי עבור בידוד Muribaculum, תוכנן באמצעות תוכנת Oligominer12, ונבדק עבור מבנה משני ושלישוני וכריכה מינימלית לא ספציפית באמצעות NuPACK ו MATHFISH16,17. הדגימות היו גם נגד עם לציטין קשור רודמין UEA-1 (אשר מכתים גליקנים fucosylated ריר) ו DAPI. המקטעים המוכתמים צולמו באמצעות מודול אובייקט שמן 40x ורזולוציית סופר.
איור 1: זרימת עבודה של הדמיה של ממשק המיקרוביוטה-מארח במעי. (A) זרימת עבודה מאוירת עבור הצינור. (ב) שני מישורי החתך יניבו מקטעים רוחביים (המועדפים על צינור זה) או "סופגניות" חוצות חתך. (C) הטמעת רקמות בעוביים שונים מאוד עלולה לגרום לפרוסות אופטימליות רק לרקמה זו או אחרת. קיצורים: דגים = פלואורסצנטיות בהכלאה במקום ; DAPI = 4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הדמיית המעי הגס מראה את הלוקליזציה של מעי מוריבקולום ביחס לריק במודל עכבר גנוביוטי. חלקים היו מוכתמים עם DAPI (כחול), Muribaculaceae דגים בדיקה (אדום), ו UEA-1 (ירוק). (A) המעי הגס דיסטלי של עכבר מונו-קולוניאלי עם מעי Muribaculum ו -(B) המעי הגס דיסטלי של עכבר דו קולוניאלי עם מעי Muribaculum ו Bacteroides תיטאיוטאומיקרון. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. (C ו - D) Cy3-FISH (משמאל), DAPI (אמצע) וערוצי Cy3-FISH + DAPI משולבים עבור חלקים של (A) ו- (B), בהתאמה. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. ב- (A) ו- (C), כל אותות DAPI בצורת חיידקים ובסיס חיידקים מסומנים עם Cy3 (ראשי חץ בודדים), וב- (B) ו- (D), בנוסף לתאים אלה של Cy3- ו- DAPI כפול-חיובי (ראשי חץ בודדים), ישנם תאי חיידקים מוכתמים DAPI שהם Cy3-negative (ראשי חץ כפולים), כצפוי במדינות מונו ודו-קולוניזציה. למעט חיידקים חוטיים ארוכים יותר, מבנים גדולים יותר (באורך >4 מיקרומטר) DAPI חיובי (חצים קהים) הם חומר צמחי או גרעינים מתאים מארחים. קיצורים: דגים = פלואורסצנטיות בהכלאה במקום ; DAPI = 4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: בעיות נפוצות. (א) חתך רדוד לא יספק פרוסות זוהרות של המעי. (משמאל) קטע מעיים שנחתך בעומק המספק מבט על הלומן, כמו גם תצוגות אורך של האפיתל. (מימין) קטע מעיים שנחתך באופן רדוד מדי, חושף רק חתך רוחב של קריפטות וללא שכבת ריר או חיידקים קבועים. (B) כיסוי רקמות/כיסויים לא אחידים עלול לגרום לסריקות אריחים מטושטשות ומוארות בצורה לא אחידה. סריקת אריחים הוגדרה עם מיקומים שלא היו ממוקדים (בפינה הימנית העליונה). (ג) דוגמה לרקע רגיל (משמאל) ורקע גבוה (מימין). בדוגמה זו, עבור הערה אות DAPI האות מגיע האפיתל, מחוץ הגרעינים. כל הפסים בקנה מידה = 20 מיקרומטר. קיצור: DAPI = 4′,6-דימידינו-2-פנילינדול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
הפרוטוקול המתואר לעיל מספק שיטה ניתנת לשחזור כדי לדמיין את ממשק המיקרוביוטה המארחת. מבאיות אלה נהנו במידה ניכרת מפיתוח פרוטוקולים, החל מאופטימיזציה של תיוג FISH18 לשימור ריר והדמיה9. קיבוע והטבעה מספקים גם אחסון שימושי של דוגמאות; יתר על כן, קלטות הסתננות פרפין ניתן לשלוח ללא כל הגבלות, כמו הדגימות קבועות לחלוטין אינרטי.
שיטות מובהקות ואלטרנטיביות
השילוב של כתמי דגים וריר מאפשר ניתוח של הרכב מיקרוביוטה במיקומי רקמות ספציפיים ואת האינטראקציה בין חיידקים בודדים למארח. טכניקות חלופיות הכרוכות בניתוח של אתרים ספציפיים בתוך המיקרוביוטה אינן מסוגלות בדרך כלל לחקור את טבעם של תאים בודדים של אינטראקציות אלה, כגון במקרה של מיקרו-דיקציה של לכידת לייזר בשילוב עם רצף19. עם זאת, טכניקות מבוססות רצף יש את היתרון של היכולת ללכוד את האיפור הגנטי של המיקרוביוטה ברמה עדינה יותר באופן רחב יותר מאשר 16S בדיקות rRNA.
מלכודת של הפרוטוקול המוצג היא שהוא מספק תמונה חד פעמית של המיקרוביוטה ביחס למחשב המארח. עבור הדמיה בזמן אמת בבעלי חיים, טכניקות הדמיה מיוחדות נדרשות כדי להקל על רכישת אות פלואורסצנטיות ברקמה עמוקה (למשל, מיקרוסקופיה תוך-ויאלית דו-פוטונית ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית קלה20,21). בשיטות אלה, האורגניזם המודל הוא גם קולוניאלי עם חיידקים מוכתמים במולקולות שנקשרות למעטפת שלהם20 או חיידקים מהונדסים גנטית המכילים חלבונים פלואורסצנטיים21. במקרה האחרון, ההבשלה של חלבוני פלואורסצנטיות היא בעיה מרכזית שכן רוב החלבונים הפלואורסצנטיים הסטנדרטיים דורשים חמצן כדי לפלוט אור. לכן, מודל אורגניזמים שיש להם לפחות סביבות נאירוביות (ריכוז ננומולרי של חמצן) נדרשים, כגון המעיים של דגי הזברה האירוביים21.
בפרוטוקול זה, מתנול-קרנוי משמש כקיבעון במקום paraformaldehyde או פורמלין כי זה לא מכיל מים. זה מונע הידרציה, התייבשות, קריסה של שכבת הריר במהלך העיבוד ומאפשר מדידות מדויקות של עובי ריר. בעוד קיבוע methacarn והטבעת פרפין הפכו לסטנדרט בתחום, קיבועים שונים וטכניקות הטמעה נחקרו כדי לייעל שימור ריר9,22, עם כמה מחקרים המצביעים על כך ששסמים עשויים להיות עדיפים על הטמעת פרפין22. מגבלה חשובה נוספת להטמעת פרפין ותיעוד מתגלארן היא אובדן פלואורסצנטיות של חלבון פלואורסצנטי, שניתן להימנע מהם באמצעות קיבעונים חלופיים (למשל, פורמלין או פרפורמלדהיד (PFA)) או טכניקות הטמעה מותאמות23. לכל קיבוע יש יתרונות וחסרונות, והבחירה של הקיבעון תלויה בסדר העדיפויות של ההדמיה. ניתן לשלב שיטות הדמיה אם שכפולים ביולוגיים קבועים ב- PFA ובמת'קארן ותמונות מתקבלות משתי הדגימות.
FISH שולב עם אימונופלואורסצנטיות במקרים בודדים עם נוגדנים פוליקלונליים ספציפיים נגד Muc2C3 ארנב9,24. תוצאות אלה לא שוחזרו באופן נרחב עם נוגדני Muc2 אחרים, מה שמצביע על כך שבחירת הנוגדנים עשויה להיות קריטית בהצלחת השילוב של FISH-immunofluorescence. התנאים להכתמת נוגדנים מוצלחת לנוגדן נתון עשויים שלא לאפשר שמירה על כתמי דגים.
פתרון בעיות
בפרוטוקול זה, איסוף, חתך והכתמה לדוגמה מייצגים שלבים קריטיים למניעת יצירת ממצאי הדמיה. לדוגמה, לחיצה על הרקמה בעת איסוף ולפני ההטבעה עלולה להוביל לאיתור שגוי של המיקרוביוטה ולהשפיע על איכות הריר. שיקול חשוב נוסף הוא להימנע משילוב מקטעים של עוביים שונים מאוד בקלטת אחת, כגון חתיכה ריקה יחסית של המעי הדק וכדור בתוך המעי הגס הדיסטלי. העוביים השונים מובילים לקשיים בהדמיה: לאחר ההטבעה, החלקה הרוחבת בעומק מסוים של מקטע אחד עשויה להיות בעומק הלא נכון להדמיה עבור השני (לדוגמה, הלומן יהיה בעומקים שונים עבור כל רקמה) (איור 1B, C ואיור 3A). יתר על כן, עבור הדמיה בעלי חיים מודל כדורי צואה, הם עשויים להיות עטופים קרום צפק24. בטכניקה זו, חלק קטן של צפק מבודד טרי מקופל בעדינות סביב השרפרף ושומר על מבנה הכדור במהלך שלבי הכביסה המתוארים בפרוטוקול.
שלא כמו עיבוד רקמת בעלי חיים עם תוכן, הדמיית דגימות מעיים אנושיות מציבה כמה אתגרים. באופן ספציפי, תוכן זוהר רירית סביר ישבשו על ידי הכנת מעי קולונוסקופיה מבוצע בדרך כלל לפני ביופסיות מעיים או נהלי כריתה. בנוסף, כאשר ביופסיות נאספים, כדאי לציין את כיוון הרקמה כדי לסייע בזיהוי תכונות ספציפיות (למשל, לומן לעומת תת-מקומה) בהיעדר תוכן מעיים. הטמעה מראש עם 3% אגר ו/או אגר:תערובות ג'לטין עשויות להיות שימושיות בשמירה על קוטביות רקמות25; עם זאת, יש בעיות עם התייבשות וחתך של אגר, כפי שדווח בספרות, זמני עיבוד ייתכן שיהיה צורך לשנות.
היבט מרכזי להשגת כתמי דגים טובים מגיע מהתאמת ריכוז פורממיד לבדיקות דגים ספציפיות. פורממיד ישלוט בשרשרת ההכלאה של בדיקות הדגים ליעדים שלהם. חשוב לוודא כי א) נבחר ריכוז פורממיד תקין להכתמת קהילה נתונה, ו- ב) כי ריכוז פורממיד מתאים אפשרי אפילו עבור שילוב הבדיקה המנוצל - זה עשוי להשפיע על בחירת הבדיקה האופטימלית בעת שימוש בבדיקות מרובות. אתרי אינטרנט כגון mathFISH (http://mathfish.cee.wisc.edu/) עשויים לסייע בחישוב ריכוזי פורממיד מתאימים עבור בדיקה נתונה. בהיעדר מידע על ריכוזי פורממיד מתאימים, פרוטוקול זה יכול להיבדק עם 0% ו 10% פורממיד.
חתך הדגימות המוטבעות מחייב חיתוך הבלוק לעומק מספיק כדי להשיג פרוסות זוהרות, שכן חתך רדוד מדי לבלוק יגרום לתצוגה חוצה חתך של הווילי/קריפטות ללא תוכן זוהר (איור 3A). הכתים את הדגימות זמן קצר לאחר החלוקה לאות FISH אופטימלי והשתמש ב- DAPI טרי (או DAPI המאוחסן ב- -20 °C) כדי לפתור בעיות רקע (איור 3C). כתמי דגים של חלקים בני יותר מחודש עלולים לגרום להכתמת כתמים ירודים/לא עקביים.
אם הרקמה או כיסוי אינו שטוח לחלוטין ביחס לשקופית, ייתכן שהדגימה לא תהיה ממוקדת בכל תנוחה בסריקת אריחים (איור 3B), מה שיוביל למאמץ מבוזבז ולהלבנת פוטופוט פוטנציאלית. ניתן לפתור זאת על-ידי לקיחת סריקות אריחים קטנות יותר שבהן כל המיקומים אומתו להיות במוקד. חתך עם להבים עמומים יכול גם להוביל לניתוק הריר והתכולה הזוהרת, המופיעים כאזורים כהים גדולים בעת הדמיה. לבסוף, אידוי של הפתרון או בועות במהלך שלב ההכלאה יכול להוביל להכתמה לא אחידה של בדיקות FISH ברקמה.
פרמטר קריטי נוסף המשפיע על היעילות של כריכת הגשושית FISH הוא התחרות בין בדיקות שונות. בדיקה שימושית כדי לוודא כי הבדיקה FISH הוא תיוג חיידקים היא לבחון את colocalization של האות מן הבדיקה דגים עם DAPI (איור 2C, D). בדגימות הדורשות שימוש בבדיקות rRNA מרובות, התאמת פרמטרים כגון טמפרטורת הכלאה, ריכוז בדיקה ו formamide הופך קריטי כדי להבטיח כי הבדיקות מחייבות את המינים הנכונים ביעילות18.
הערות אודות הדמיה
חיידקים מוכתמים בדגים מוצגים בצורה הטובה ביותר באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי ומטרה של הגדלה של פי 40 לפחות. בעוד שהגדלה של פי 63 עדיפה על חיידקים בתמונה ברמת התא הבודד, הגדלה של פי 40 יכולה לשמש גם על ידי מיקסום הזום הדיגיטלי או שימוש במערכת ברזולוציית-על. מערכות המצוידות ביכולות סופר-רזולוציה עשויות לספק גם רזולוציה תת-תאית של תאים חיידקיים בודדים. מטרות הגדלה נמוכות יותר עשויות להיות מנוצלות כדי לקבל תחושה כללית של לוקליזציה חיידקית ועובי ריר.
רכישת תמונות של 16 סיביות במקום תמונות של 8 סיביות מומלצת גם היא מאוד, שכן הטווח הדינמי הגבוה יותר יעזור ללכוד את הטווח הרחב של אות DAPI מהגרעין הבהיר ביותר של האפיתל והאות החלש יחסית של חיידקים זוהרים. מלבד השימוש במערך ההדמיה המתואר לעיל, שיקול הדמיה חשוב הוא הבחירה של פלואורופורים. להפרדה מיטבית בין סוגי חיידקים, ודאו כי הפלורופורים המשמשים אינם חופפים בספקטרום עירור ופליטה (אלא אם כן הדמיה במערכת עם היכולת לבצע פירוק ליניארי). בנוסף, ניתן להשתמש בבדיקות בשילוב (למשל, שילוב של בדיקה ספציפית למשפחה וגשוש ספציפי לסוג) כדי לזהות חברי קהילה נוספים. אם משתמשים בגילוי ליניארי או בבדיקות ללא תחרות, חיוני לבדוק את הדיוק ואת רמת הכתמת הדגים על תרבויות טהורות8,14.
לאחר איסוף התמונות, כלים מרובים זמינים לניתוח כמותי של ממשק המיקרוביוטה המארח, כגון BacSpace26, HiPR-FISH8 וכלי פילוח אחרים27. BacSpace היא תוכנת MATLAB המאפשרת פילוח של הרקמה ורכיבים זוהרים והסרת חומר צמחי מתמונות26. התוכנית מספקת גם ניתוח של עובי ריר ב 2D וכימות של הפצה מרחבית המבוססת על מרחקי פיקסלים בערוצים שונים26. לעומת זאת, תוכנת ניתוח התמונה HiPR-FISH מאפשרת פילוח של תאים מוכתמים בדג8. לבסוף, כלי פילוח חיידקיים אחרים שעברו אופטימיזציה לניסויי במבחנה27 יכולים גם הם להיות מותאמים ליישום זה.
מסקנה
בהדמיה במקום ניתן לנתח כמותי של מסה מיקרוביאלית בודדת בהקשר של חברי קהילה אחרים ואת המיקרו-סביבה השונה שנוצרת על ידי דיאטה, ריר, וקריפטות אפיתל מארחות. האינטראקציה בין אורגניזמים מכתיבה את הביולוגיה של מערכות מיקרוביאליות הקשורות לפונדקאי ומספקת ניתוח חיוני של שינוי במבנים אלה במהלך התפשטות שיש לו השלכות על הבריאות. ראוי לציין שהיכולת לדמיין את המיקרוביוטה במקום באמצעות הפרוטוקול המתואר לעיל מספקת חלון מדהים לביוגוגרפיה של המיקרוביוטה ביחס למארח בעלי החיים.
Disclosures
למחברים אין ניגודי אינטרסים.
Acknowledgments
המחברים רוצים להודות לד"ר קריסטן ארל על פיתוח טכניקה רבת ערך, אמבר האן על העזרה בפתרון בעיות, ד"ר ג'ן נגוין ודיאנה פפין על סקירה ביקורתית של כתב היד, וד"ר השאם סולימן ומעבדת רוסי באוניברסיטת קולומביה הבריטית על מתן גישה למיקרוסקופ. המחברים מכירים בתמיכתם של CIHR Team Grant: יוזמת המיקרוביום הקנדית 2 (C.T.), קרוהן וקוליטיס קנדה (ל- C.T. ו- K.M.N.), CIFAR (ל- C.T. ו- K.M.N.), פרס מייקל סמית לחוקר מחקר בריאות (ל- C.T.), קרן ווסטון: יוזמת המיקרוביום של משפחת ווסטון (ל- C.T.), פרס החוקר המכובד של פול אלן (ל- C.T.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum foil | |||
| Chloroform | Fisher | C298-500 | Toxic |
| Coplin jar | Fisher | 08-813E | |
| Cover glass, 22 × 22 mm, no #1 | VWR | CA48366-227-1 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Resuspended to 5 mg/mL |
| Empty pipette tip box(es) | To melt paraffin | ||
| Ethanol, anhydrous, molecular grade | -- | -- | |
| FISH probes | |||
| FISH hybridization solution | -- | -- | 20 mM Tris–HCl pH 7.4, 0.9 M NaCl, 0.01% (w/v) SDS in nuclease-free water. Optional addition of 5–50% (v/v) formamide |
| FISH washing buffer | -- | -- | 20 mM Tris–HCl pH 7.4, 0.9 M NaCl |
| Fluorescently-labeled Ulex Europaeus Agglutinin (UEA-1) lectin | Vector Laboratories | FL-1061 (Fluorescein-labeled) or RL-1062-2 (Rhodamine-labeled) | UEA-1 labels fucosylated glycans, so it is not appropriate for germ-free mice or for samples from fucosyltransferase 2 (FUT2)-deficient hosts. |
| Forceps | |||
| Formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | |
| Fumehood | |||
| Glacial Acetic Acid | Fisher | A38-212 | Corrosive and flammable |
| HybriSlip flexible plastic cover slips, 22 x 22 mm × 0.25 mm | Sigma Aldrich | GBL722222 | for FISH hybridization steps, can substitute glass coverslips |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Kimwipes | |||
| Methanol | Fisher | A412 | Toxic and flammable |
| Microtome | for sectioning | ||
| Multipurpose Specimen Storage Containers, 473 mL | Fisher | 14-955-117A | Can substitute with a glass or polyethylene container of your choice. Methacarn is not compatible with polystyrene or metal. |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | Any nail polish should work |
| Oven | Necessary range: 45-60 °C | ||
| Paraffin: Leica Paraplast | Leica | 39601006 | |
| PBS, Phosphate-buffered Saline (10x solution) | Fisher | BP3991 | Dilute to 1x for protocol |
| Sodium chloride | Fisher | S271 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), 20% Solution, RNase-free | Invitrogen | AM9820 | |
| Tissue-Loc HistoScreen Cassettes | Thermo Scientific | CA83009-999 | |
| Trizma hydrochloride solution, 1M Tris-HCl, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2663-1L | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Water, nuclease-free | Fisher | BP2484100 | |
| Xylenes | Fisher | X3P-1GAL | Toxic and flammable |
References
- Tropini, C., Earle, K. A., Huang, K. C., Sonnenburg, J. L. The gut microbiome: connecting spatial organization to function. Cell Host and Microbe. 21 (4), 433-442 (2017).
- Hansson, G. C., Johansson, M. E. V. The inner of the two Muc2 mucin-dependent mucus layers in colon is devoid of bacteria. Gut Microbes. 1 (1), 51-54 (2010).
- Johansson, M. E. V., et al. Normalization of host intestinal mucus layers requires long-term microbial colonization. Cell Host and Microbe. 18 (5), 582-592 (2015).
- Jakobsson, H. E., et al. The composition of the gut microbiota shapes the colon mucus barrier. EMBO Reports. 16 (2), 164-177 (2015).
- Tropini, C., et al. Transient osmotic perturbation causes long-term alteration to the aut microbiota. Cell. 173 (7), 1742-1754 (2018).
- Desai, M. S., et al. A dietary fiber-deprived gut microbiota degrades the colonic mucus barrier and enhances pathogen susceptibility. Cell. 167 (5), 1339-1353 (2016).
- Ng, K. M., et al. Recovery of the gut microbiota after antibiotics depends on host diet, community context, and environmental reservoirs. Cell Host and Microbe. 26 (5), 650-665 (2019).
- Shi, H., et al. Highly multiplexed spatial mapping of microbial communities. Nature. 588 (7839), 676-681 (2020).
- Johansson, M. E. V., Hansson, G. C. Preservation of mucus in histological sections, immunostaining of mucins in fixed tissue, and localization of bacteria with FISH. Methods in Molecular Biology. 842, 229-235 (2012).
- Greuter, D., Loy, A., Horn, M., Rattei, T. ProbeBase-an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes and primers: New features 2016. Nucleic Acids Research. 44 (1), 586-589 (2016).
- Quast, C., et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: Improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Research. 41 (1), 590-596 (2013).
- Beliveau, B. J., et al. OligoMiner provides a rapid, flexible environment for the design of genome-scale oligonucleotide in situ hybridization probes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2183-2192 (2018).
- Madeira, F., et al. The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019. Nucleic Acids Research. 47 (1), 636-641 (2019).
- Welch, J. L. M., Hasegawa, Y., McNulty, N. P., Gordon, J. I., Borisy, G. G. Spatial organization of a model 15-member human gut microbiota established in gnotobiotic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (43), 9105-9114 (2017).
- Lagkouvardos, I., et al. Sequence and cultivation study of Muribaculaceae reveals novel species, host preference, and functional potential of this yet undescribed family. Microbiome. 7 (1), 28 (2019).
- Zadeh, J. N., et al. NUPACK: Analysis and design of nucleic acid systems. Journal of Computational Chemistry. 32 (1), 170-173 (2011).
- Yilmaz, L. S., Parnerkar, S., Noguera, D. R. MathFISH, a web tool that uses thermodynamics-based mathematical models for in silico evaluation of oligonucleotide probes for fluorescence in situ hybridization. Applied and Environmental Microbiology. 77 (3), 1118-1122 (2011).
- Huber, D., Voith von Voithenberg, L., Kaigala, G. V. Fluorescence in situ hybridization (FISH): History, limitations and what to expect from micro-scale FISH. Micro and Nano Engineering. 1, 15-24 (2018).
- Wang, Y., et al. Laser capture microdissection and metagenomic analysis of intact mucosa-associated microbial communities of human colon. Applied Microbiology and Biotechnology. 88 (6), 1333-1342 (2010).
- Geva-Zatorsky, N., et al. In vivo imaging and tracking of host–microbiota interactions via metabolic labeling of gut anaerobic bacteria. Nature medicine. 21 (9), 1091-1100 (2015).
- Jemielita, M., et al. Spatial and temporal features of the growth of a bacterial species colonizing the zebrafish gut. mBio. 5 (6), 01751 (2014).
- Hasegawa, Y., Mark Welch, J. L., Rossetti, B. J., Borisy, G. G. Preservation of three-dimensional spatial structure in the gut microbiome. PLoS ONE. 12 (11), 0188257 (2017).
- Zhanmu, O., et al. Maintenance of fluorescence during paraffin embedding of fluorescent protein-labeled specimens. Frontiers in Neuroscience. 13, 752 (2019).
- Bergstrom, K., et al. Proximal colon-derived O-glycosylated mucus encapsulates and modulates the microbiota. Science. 370 (6515), 467-472 (2020).
- Jones, M. V., Calabresi, P. A. Agar-gelatin for embedding tissues prior to paraffin processing. BioTechniques. 42 (5), 569-570 (2007).
- Earle, K. A., et al. Quantitative imaging of gut microbiota spatial organization. Cell Host and Microbe. 18 (4), 478-488 (2015).
- Jeckel, H., Drescher, K. Advances and opportunities in image analysis of bacterial cells and communities. FEMS Microbiology Reviews. , (2020).
