Summary
この合理化されたプロトコルは、組織の固定から、その場で蛍光を伴う微生物の染色まで、複雑な組織サンプル 中の 細菌を検出し、画像化するワークフローを詳述しています。
Abstract
生体内のコンテキスト内での微生物の局在を測定することは、微生物叢と脊椎動物の腸との間の機能的関係を明らかにする上で不可欠なステップです。腸内微生物叢の空間的景観は、腸管粘液、納骨堂、折り目などの物理的特徴によって厳しく制御され、pH、酸素の入手可能性、免疫因子などの宿主制御特性の影響を受ける。これらの特性は、腸を安定的に植民地化するコメンサル微生物と病原体の能力を制限する。微生物群では、微生物の異なる微生物間の近距離相互作用と、微生物とその宿主との相互作用を決定します。これらの相互作用は、大規模な臓器機能と宿主の健康に影響を与えます。
このプロトコルは、細胞間の距離から臓器全体のスケールまでの腸内微生物叢空間組織の可視化を可能にする。この方法は、腸の構造と粘液の特性を維持しながら腸組織を固定することに基づいています。その後、固定サンプルを埋め込み、切り離し、染色して、蛍光を通して特定の細菌種 を ハイライトします。粘液および宿主細胞成分などの宿主特徴は、蛍光標識されたレクチンで標識される。最後に、染色された切片は、高倍率でタイルスキャンイメージングを利用した共焦点顕微鏡を使用して、ミクロンをセンチメートルの長さのスケールに橋渡しします。このタイプのイメージングは、動物モデルの腸管の切片やヒト組織の生検に適用して、健康と病気の腸内の微生物叢の生物地理学を決定することができる。
Introduction
微生物の視覚化技術は、アントニー・ヴァン・レーウェンフックが顕微鏡を使って17世紀 に歯垢と便から細菌(「動物性」と呼ばれる)を観察した時に、微生物学そのものと同じくらい古い起源を持っています。それ以来、宿主微生物叢1に関連する細菌、真菌、ウイルスのコンソーシアムの空間的組織を可視化する技術が数多く開発されてきました。これらの微生物の局在化を解明することは、動物宿主内でのそれらの機能を決定するために不可欠である。細菌の生物地理学は、特定の場所(例えば上皮)、栄養基質、および特定の微生物が種間および王国間相互作用の基礎となる代謝産物の細菌産生を指示する可能性があるため、コメンサルおよび病原性分類において同様に重要である。
口腔、腸、肺など、いくつかの異なる身体部位で細菌と宿主組織を分離する重要な構造は、宿主上皮細胞への微生物転位を防ぎ、微生物叢の栄養資源として機能する宿主産生層である粘液である2,3,4.この障壁の違反や変化を特徴付けることが重要であり、シーケンシングだけでは得られない宿主微生物叢相互作用に対する機械主義的洞察につながる5,6,7。例えば、イメージングは、抗生物質暴露が粘液層および微生物叢組織7,8を破壊し、下剤が粘液を枯渇させ、免疫パラメータ5の大きな変化と相関する可能性があるという発見を可能にした。
このプロトコルは、ヨハンソンとハンソン9の仕事に基づいて構築された微生物叢と宿主組織(図1)を固定、染色、およびイメージングするための一般的な枠組みを概説する。このプロトコルは腸管のセクションのコンテキストでモデル化されるが、他の組織タイプに容易に適応することができる。このプロトコルは、実験動物またはヒト臨床サンプルの処理を可能にします。両方のタイプのサンプルを処理するためのノートが含まれています。ここで示した例では、宿主上皮と発光細菌は、4′、6-ジミジノ-2-フェニリンドール(DAPI)染色、フルオレセイン(FITC)を用いた粘液、ウレックス・エウロペウス・アググルチンI(UEA-1)、およびFISHを使用する特異的なバクセクソンで同時に標識されています。FISHプローブは通常、高コピーの転写物を結合することから高いシグナルを確実にするために、分類の16S rRNA遺伝子に対して設計されています。
この例では、プローブは、ムリバクシアセ菌の細菌群の16S rRNAを標的とする(図2)。しかし、この染色は、適切な生物学的問題に対応するために、異なるFISHプローブおよび/またはレクチンで容易に置換されます。以前に検証されたFISHプローブは、rRNA標的オリゴヌクレオチドプローブのオンラインリソースであるProbeBase10またはリボソームRNAデータベースであるSILVA11で見つけることができます。新しいプローブの設計では、リーダーは HiPR-FISH8 や Oligominer12 などの新しいパイプラインを参照できます。このプロトコルを使用して、腸管腔内の細菌の密な充填と消化管全体の腸粘液の異なる特徴を観察することが可能です。ここで説明するワークフローは、宿主環境の空間的な文脈における微生物叢の定量的分析を可能にする。
Protocol
このプロトコルに記載されているすべての動物実験および組織収集は、カナダ動物ケア評議会(CCAC)ガイドラインに従って実施され、ブリティッシュコロンビア大学の動物ケア委員会によって承認されました。無菌スイスウェブスターマウスを使用した。すべての動物は8〜10週齢であり、両方の男女が使用され、すべてのマウスはケージあたり少なくとも2匹のマウスと共収容された。動物は二次頸部脱臼または心臓穿刺で二酸化炭素を使用して安楽死させた。
1. イメージング実験の設計:考慮事項とサンプル収集
- FISHプローブ設計
- 適切な FISH プローブが存在する場合は、背景と比較してラベル付きセルに強いシグナルを示す、既存の公開済みプローブを選択します。
- 新しいプローブを インビトロで 検証し、標的菌の固定サンプルへの結合の効率と他の細菌へのオフターゲット結合の効率を決定する。
- ターゲット生物の16S配列に対して、または分析するサンプルからの16S rRNAシーケンシングに対して使用されるすべての16S FISHプローブをチェックして、期待される正の一致の割合が存在し、プローブが他の微生物叢メンバーに非特異的に結合しないことを確認します。
- Clustal Omega13 などのツールを使用して、FISH プローブを全長配列またはアンプリコン配列バリアントに合わせて調整し、プローブとそのターゲットの潜在的な結合を評価します。
- インシリコ試験に加えて、純粋な培養物8,14で未検証プローブのFISH染色の精度とレベルをテストします。
注:複数のコミュニティメンバーを染色する場合、使用されるフルオロフォアが励起および発光スペクトルに重ならない場合(線形非混合を行うシステム上でイメージングしない限り)プローブを組み合わせて使用することができます(例えば、家族固有のプローブと属特異的プローブの組み合わせ)。また、特異性は、特異性制御/スクランブルプローブを含めること、または非蛍光プローブとの競合によって実証することができます。
- サンプルタイプと組織コレクション
- 鋭くて清潔なツールを使用して、画像処理のためにグノトビオティックスイスウェブスターマウスから腸管セグメントを切断する。サンプルの邪魔をできるだけ最小限に抑え、そのエッジでセクションを処理して、イメージング領域に影響を与えないようにします。分解後できるだけ早くサンプルを修正し、劣化を防ぎます。
注:動物研究のために、無傷で、洗い流されていない腸のセクションが好ましいです。膜は、発光および粘膜組織をそのまま維持するのに役立ちます。 - サンプルとサイトの間に70%エタノールでそれらを拭くことによって、ツールをきれいにします。粘液および腸のアーキテクチャと微生物叢が異なる場所で大きく変化するので、一貫した腸の位置をサンプリングするように注意して、腸のセクション/生検の場所ごとに少なくとも3つの生物学的複製を取得します。
- 鋭くて清潔なツールを使用して、画像処理のためにグノトビオティックスイスウェブスターマウスから腸管セグメントを切断する。サンプルの邪魔をできるだけ最小限に抑え、そのエッジでセクションを処理して、イメージング領域に影響を与えないようにします。分解後できるだけ早くサンプルを修正し、劣化を防ぎます。
2. 組織サンプルの固定と浸潤
- 固定
- 60%絶対メタノール、30%クロロホルム、10%の氷酢酸の対応容器に新鮮なメタカーンを調製します。煙のフードにこれらの化学物質のそれぞれを分配します。蓋を開けて割れて通気できる容器を選ぶ。メタカーンはポリスチレンと互換性がないため、クロロホルムおよび氷河酢酸用のガラス相次ぐシリンダー/血清学的ピペットを使用して、ポリエチレン容器に入れて準備してください。
注:混合中、煙が発生し、容器の中に圧力が蓄積する可能性があります。サンプルが積極的に添加されていない場合は、フームフードから取り外した後、容器を比較的密閉しておくことをお勧めします。クロロホルムは有毒です。皮膚を吸い込んだり、飲み込んだり、吸収したりしないでください。メタノールは毒性が高く、可燃性が高い。皮膚を吸い込んだり、飲み込んだり、吸収したりしないでください。氷酢酸は可燃性で、皮膚や目に対して腐食性が高い。 - 分配した後、容器を閉め、混ぜ合わせてから通気します。オフガスが停止するまでこれを繰り返します(そして、圧力が蓋の下に大きくなりなくなります)。
注意: 排水管にメタカーンを処分しないでください。制度上のガイドラインに従って有害な化学物質廃棄物として回収し、廃棄する。メタカーン溶液で多くのペンインクが外れるので、神学のカセットにラベルを付ける鉛筆を使用してください。 - 組織の端をピンセットで繊細に保持することにより、組織学的カセットに腸のセクションを配置します。カセットを閉じ、新鮮なメタカーン溶液に完全に沈めます。カセットを浸した場合、溶液が数時間より古くないことを確認してください。
- ヒュームフードにアクセスせずに臨床スイートで収集される臨床サンプルの場合、フラップを蓋に切り取ったポリエチレン貯蔵容器を使用して、占体カセットの通過を可能にします。有毒な煙の脱出を防ぐためにサンプルを渡さないときに、このフラップを閉じたテープ。
注:マスキングテープを使用して、容器に接着剤が溶け込むのを避けるために重要です- いくつかのタイプのテープ(例えば、プラスチック包装テープ)は、メタカーンの煙にうまく持ちこたえないかもしれません。 - 最小 3 時間と最大 2 週間のサンプルを修正します。
注: 厚いサンプルは3時間より長い固定時間を必要とする場合があります。固定時間は、異なるメタカーン溶液に固定されたカセットに対する同時パラフィン浸潤処理を可能にするように選択することができる(例えば、収集されたサンプル群にパラフィン浸潤を2週間にわたって同時に実施する)。
- 60%絶対メタノール、30%クロロホルム、10%の氷酢酸の対応容器に新鮮なメタカーンを調製します。煙のフードにこれらの化学物質のそれぞれを分配します。蓋を開けて割れて通気できる容器を選ぶ。メタカーンはポリスチレンと互換性がないため、クロロホルムおよび氷河酢酸用のガラス相次ぐシリンダー/血清学的ピペットを使用して、ポリエチレン容器に入れて準備してください。
- パラフィン浸潤と埋め込み
- パラフィンを耐熱容器に入れ、オーブンで一晩60°Cで溶かします。パラフィンペレットは溶融前により多くのスペースを取るように、十分なパラフィンが溶融してすべてのカセットを覆うようにしてください。
注:温度は、アーティファクトを発生させることができるので、60°Cより高くすることはできません。 - 適切な廃棄物容器に液体を注ぎ出し、すぐに次の化学物質に交換して、組織を洗浄します。
- 絶対メタノールで30分間インキュベートし、1回繰り返します。
- 20分間絶対エタノールでインキュベートし、1回繰り返します。
- キシレンで15分間インキュベートし、1回繰り返します。
- カセットを乾燥させないように注意して、すぐにすすりを交換します。各洗浄がビーカーまたは容器のカセットを完全に覆っていることを確認してください。
注:キシレンは可燃性であり、吸入すると、高濃度(>200 ppm)への暴露時に潜在的な長期的な神経学的影響を伴う中枢神経系を圧迫する可能性があります。ヒュームフード内でのみキシレンを扱います。キシレンは危険なので、組織学的カセットをカバーするために必要な最小限の量を使用するように注意してください。
- 埋め込み中に、ピンセットを使用してカセットの長さに平行に腸セグメントを向け、断面ドーナツの代わりに縦方向の横断断面を提供し、定量的イメージングのためのより多くの潜在的なサンプル領域を提供します(図1B)。
- カセットをわずかに開け(1〜2cmまたは0.5インチ)、組織セグメントを失うことなくパラフィンが入るようにします。このステップには二重手袋を使用するか、ピンセットを使用して、過熱や指の軽度の燃焼を防ぎます。溶解したパラフィンの容器にカセットを沈め、閉じ、容器を60°Cのオーブンに戻します。カセットがパラフィンで満たされ、大きな気泡が残らないようにしてください。
- 60°Cで2時間インキュベートした後、オーブンから容器を取り出します。鉗子を使用して、慎重にカセットを取り出し、冷却するためにアルミニウム箔の一部に個別に置きます。埋め込みと切り離しの準備ができるまで、室温で保管してください。
- パラフィンブロックをミクロトームで切り離し、発光内容物が露出するブロックに十分に深く切り離し、発光内容物および粘液に加えて絨毛および/またはクリプトの縦断面を可能にする。骨の材料が組織に比べて急速に刃を鈍らせるので、ブレードを交換するように注意してください。画像の最適なシャープネスを得るために、セクションを4μmの厚さにカットします。セクションを通常のコーティングされていないスライドに転送します。
- FISH染色の場合は、できるだけ早く腸の切片を染色する(すなわち、断面から数週間以内に)強力なFISHシグナルを得る。FISH染色を省略する場合、レクチン+DAPI染色は、シグナルの大幅な損失なしに、より新鮮な(すなわち、数ヶ月)のサンプルに対して行うことができる。
- パラフィンを耐熱容器に入れ、オーブンで一晩60°Cで溶かします。パラフィンペレットは溶融前により多くのスペースを取るように、十分なパラフィンが溶融してすべてのカセットを覆うようにしてください。
3. 細菌や宿主の特徴を染色する
- 準備
- オーブンを60°Cに加熱します。 空のコプリン瓶とガラス瓶のガラススライドをガラス瓶の中のキシレンで2回覆うのに十分な量を事前に温め、キシレンの蒸発を防ぐために蓋の周りのパラフィルムに注意してください。キシレンの温度を60°Cに達させます。
注:標準的なCoplinの瓶は8枚のスライドに合い、スライドはおよそ50 mLの液体で覆うことができる(ブランドによって40から60 mLの間で変わるかもしれない)。キシレンの代替品は毒性が低く、脱ワックス工程(ステップ3.2)8,9のために他のグループによって正常に使用されています。 - 別のオーブンが利用可能な場合は、50°Cにハイブリダイゼーションオーブンを事前に温めます。 それ以外の場合、ステップ3.2.3の後にスライドを焼くのに使用されるのと同じオーブンでこのステップを行うことができる。
- FISHハイブリダイゼーションソリューションを準備する:20 mMトリス-HCl、pH 7.4;0.9 M NaCl;0.01%26 - 0.1%9 (w/v) ヌクレアーゼを含まない水中のドデシル硫酸ナトリウム (SDS)必要に応じて、5~50%(v/v)のフォルマミドを追加します。このハイブリダイゼーション液を脱パラフィン時に50°Cで予温する。
注意: フォルマミドはテラトゲンとして機能するアミドです。手袋とゴーグルでフォームアミドを扱う。少量で眼、皮膚、または粘膜への曝露時に、それは刺激性である。大量に、ホルムアミド蒸気は医学的介入を必要とすることができる。ホルムアミドは-20°Cの冷凍庫に100%で保存することができる。
- オーブンを60°Cに加熱します。 空のコプリン瓶とガラス瓶のガラススライドをガラス瓶の中のキシレンで2回覆うのに十分な量を事前に温め、キシレンの蒸発を防ぐために蓋の周りのパラフィルムに注意してください。キシレンの温度を60°Cに達させます。
- 染色用のスライドの準備:脱パラフィン化
- コップリンの瓶にスライドを置き、セクションが他のスライドや瓶に接触しないようにし、60°Cでスライドを10分間焼きます。
- ヒュームフードで、コプリン瓶にオーブンから事前に温められたキシレンを充填し、サンプルの上に直接注ぎ込まないように注意し、組織を取り除く可能性があります。60°Cのオーブンにコプリン瓶を戻します。残りのキシレンをフームフードに入れてボトルを残します。
- 使用済みのキシレンを処分用の適切な廃棄物容器に注ぎ、ガラススライドの組織切片を乱さないように注意し、一対の鉗子を使用してスライドがコプリン瓶から落ちないようにします。コプリンの瓶に残りのキシレンを補充し、フームフードの室温で10分間インキュベートします。
- 99.5%エタノールで室温で5分間インキュベートします。このインキュベーションステップの後、コプリン瓶からスライドを取り出し、実験室のワイプまたはペーパータオルでスライドの背面を拭き取り、エタノールの液滴がなくなるまで一時的に空気乾燥します。
注: スライドの背面を拭くにより、乾燥の進行状況をよりよく視覚化できます。
- 魚で細菌染色
- 各組織セクションの領域を周回することにより、液体膨張の領域を制限するために、液体ブロッカーまたはPAPペンを使用してください。インクがセクション自体に接触していないことを確認します。組織に接触することなく、各組織セクションにできるだけ近い円を作成し、ハイブリダイゼーション溶液で覆う必要がある表面積を最小限に抑えます。
- ハイブリダイゼーションソリューションを準備する:50 μLの事前温めハイブリダイゼーションソリューションごとに、0.5 μgプローブ(例えば、1 μg/μLプローブの0.5 μL)を追加します。ハイブリダイゼーションソリューションをスライド上のセクションにピペットします(セクション/円サイズに応じて、〜20 μL/セクション)。インキュベーションステップとストレージ中に、この点から光からハイブリダイゼーションソリューションとスライドを保護します。
- 使用される液体の容積が、柔軟なプラスチックカバースリップで重ね合わせている時にセクション全体を覆うことを確認してください。蒸し暑いチャンバーにスライドをインキュベートして、蒸発を減らします。余分なハイブリダイゼーション溶液またはリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で浸した下部にワイプまたはペーパータオルを入れたピペットチップボックスを備えた湿度の高いチャンバーを作成し、湿度を提供します。45〜50°Cでセクションをインキュベートし、プローブセットに応じて、>3時間用に。
- FISH洗浄バッファーをウォームアップ:20 mMトリス-HCl、pH 7.4;インキュベーション期間中に0.9 M NaClを50°Cにする。コプリン瓶のスライドを覆うのに十分な洗浄バッファーを準備します。
- プラスチック製のカバーリップを取り外します。FISH洗浄バッファーのスライドをコプリン瓶にインキュベートし、両方とも50°Cに予め温めます。 コプリン瓶を50°Cのオーブンに戻して10〜20分間置きます。厚いサンプルの場合は、バッファーを追加してコプリン瓶のカバーリップを取り外し、スライスを塗りつぶさないようにカバーリップをそっと取り外します。
- 粘液と宿主の特徴を染色する
- PBSで一般的なDNA/粘液カウンターステインを調製:最終10 μg/mL DAPI + 40 μg/mL粘液染色UEA-1.カバースリップがない場合にスポットをカバーするのに十分なカウンターステインを準備して、追加のカバーリップで組織を損傷しないようにします。
注:カバースリップがない場合にスポットを覆うには、3.3.2で使用されている20 μLよりも大きなボリュームが必要です。平均サイズのセクション(直径10mm程度)では、200 μLで1つのスポットをカバーできます。このボリュームを事前にダミースライドでテストしてください。 - FISH洗浄バッファーを取り出し、コプリン瓶のPBSと交換します。コプリン瓶をPBSで補充した直後に、PBSをデカントします。
- 瓶からスライドを取り出し、セクションの上にカウンターステインをピペットし、ピペットチップで組織に触れないようにします。バブルでセクション全体を覆います。暗闇の中で45分間4°Cでインキュベートします。
- 新鮮なPBSで3回素子を洗う:ピンセットを使用してスライドを所定の位置に保持しながら、シンクにPBSを注ぎ、すぐに新鮮なPBSで補充します。
- スライドの背面をワイプまたはペーパータオルに拭き取り、ほとんどのPBSは、ピペットチップに接続された真空ラインに助けられ、セクションから蒸発させます。もう一度、ピペットチップでセクションに触れないようにしてください。
- 取り付け媒体(DAPIなし)を使用してセクションを取り付け、ガラスカバーリップで覆われた室温で設定し、カバーリップが平らで、取り付け媒体に気泡がないことを確認します。
- カバースリップの端に沿って明確なマニキュアで塗り、スライドの端から離れて、イメージング中にスライドが顕微鏡スライドホルダーのレベルに収まるように注意して、スライドにカバースリップを貼り付けます。
- 蛍光が消耗する前に、スライドを暗闇の中で4°Cで数週間保存してください。
- PBSで一般的なDNA/粘液カウンターステインを調製:最終10 μg/mL DAPI + 40 μg/mL粘液染色UEA-1.カバースリップがない場合にスポットをカバーするのに十分なカウンターステインを準備して、追加のカバーリップで組織を損傷しないようにします。
4. 画像解析と画像解析
- 汚れを視覚化する
- 組織と内腔の両方を含む組織の領域を選択して、微生物叢-宿主界面を画像化します。粘液の厚さと明るさの生物地理学の定量的イメージングでは、上皮絨毛および/または陰窩のスライスが縦方向であり、断面ではない視野を選択します。切除物を避けるために、粘液と上皮の間に大きな隙間がある領域を避けてください。
- FISH蛍光信号の光の漂白を避けるために位置及び焦点を合わせるためのDAPI信号を利用して、組織を見つけて焦点面を修正する。
- イメージング設定を調整します。細菌のDAPI染色を視覚化するには、レーザーパワーを高め、上皮細胞からのDAPI信号が過飽和または「吹き飛ばされる」ポイントまでゲインします。
注: これは、回復できない核内の光の漂白や視覚的なアーティファクトにつながるので、過度に飽和しないでください。 - 他のすべてのチャンネルでは、バックグラウンドの上に明確な信号を提供するレーザーパワーの最小量を使用し、過飽和しないように注意してください。
注: タイル間のオーバーラップがイメージ化される場合、フォトブリーチが問題となるため、タイルスキャンを実行する場合、これは特に重要です。 - 個々の細菌を画像化するために40倍以上の倍率を使用してください。
- 画像を取得します。
- タイルスキャンを取得して、粘液の厚さと内腔内の微生物の空間分布に関する定量的データを取得します。タイル間で15%の重なり合っていることを確認し、<1倍ズームによって悪化する可能性のあるビネット/不均一な照明を確認します。タイル スキャンを設定する場合は、ぼやけた/焦点が合っていない画像を分析できないため、すべてのタイルで組織がフォーカスされているかどうかに細心の注意を払ってください(図 3B)。
- 可能であれば、上皮と粘液層がタイルと平行であり、角度ではなくタイルに平行になるようにスキャン領域を回転させることによって、特定の長さの上皮を画像化するのに必要なタイルの数を最小限に抑えます。それ以外の場合は、同様の効果を達成するために、画像領域に平行または垂直である上皮のセクションを見つける。
Representative Results
マウス腸内の特定の腸内細菌の局在を調べるには、個々の細菌分離株で植民地化された無菌スイスウェブスターマウスをこの研究で使用した。この実験では、標識された細菌種は、i)ムリバクロセ科5、ムリバキュラム腸管、マウス微生物叢15の豊富で流行の細菌ファミリー、ならびにii)細菌のテタイオタオミクロン、遺伝的に難調で一般的な腸細菌であった。2週間の平衡後、マウスを安楽死させ、そして、大便ペレットを含む結腸の一部を切り離し、調製したメタカーンに固定した。2日間の固定後、メタノール、エタノール、キシレンを介して処理してセクションを脱水し、パラフィンを浸潤し、埋め込み、4μmの薄膜スライスに切り離した。これらのサンプルは、オリゴミナーソフトウェア12を使用して設計されたムリバキュラム分離物に特異的なFISHプローブ(3'Cy3タグ付き)で染色され、NuPACKとmathFISH16,17を使用して二次および三次構造および最小非特異的結合をチェックした。また、ローダミン結合レクチンUEA-1(粘液中のフコシル化グリカンを染色する)およびDAPIで対向したサンプルを示した。染色されたセクションは、40倍の油の目的および超決断モジュールを使用してイメージ化された。
図1:腸内の微生物叢-宿主界面の可視化のワークフロー(A)パイプラインの図示されたワークフロー。(B) 2 つの断面平面は、横断断面(このパイプラインで推奨される)または断面「ドーナツ」のどちらかになります。(C)非常に異なる厚さの組織を埋め込むと、1つの組織または別の組織にのみ最適なスライスが生じる可能性があります。略語: FISH = その場合の蛍光のハイブリダイゼーション;DAPI = 4′,6-ジミディノ-2-フェニリンドール.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:結腸をイメージングすると、ビトビオティックマウスモデルにおける粘液に対するムリバキュラム腸管の局在化を示す。 切片はDAPI(青)、ムリバクラセエFISHプローブ(赤)、UEA-1(緑色)で染色した。(A)ムリバキュラム腸管と(B)ムリバキュラム腸管とバクテロイデステタイオタオミクロンと二コロニー化マウスの遠位コロニーとマウスの単一コロニー形成の遠位結腸。スケールバー=20μm(CおよびD)Cy3-FISH(左)、DAPI(中央)、および(A)と(B)の発光インセット部分に対するCy3-FISH +DAPIチャネルをそれぞれ組み合わせた。スケールバー= 5 μm(A)および(C)では、すべての細菌形および細菌サイズのDAPIシグナルはCy3(単一矢印頭)で標識され、(B)および(D)では、これらのCy3-およびDAPI二重陽性細胞(単一矢印状)に加えて、Cy3陰性(二重矢印)であるDAPI染色細菌細胞が存在する。長い糸状細菌を除いて、より大きな(長さ>4 μm)DAPI陽性構造(鈍い矢印)は、宿主細胞からの植物材料または核である。略語: FISH = その場合の蛍光のハイブリダイゼーション;DAPI = 4′,6-ジミディノ-2-フェニリンドール.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:一般的な問題. (A)浅い切片は腸の発光スライスを提供しない。(左)上皮の縦方向の見解だけでなく、内腔のビューを提供する深さで切除された腸管セグメント。(右)あまりにも浅く切り離された腸管セグメントは、納骨堂の断面のみを明らかにし、一定の粘液層または細菌を明らかにしていない。(B) 不均一な組織/カバースリップの被覆は、ぼやけて不均等に照らされたタイルスキャンを引き起こします。タイルスキャンは、フォーカスが合っていない位置(右上隅)で設定されました。(C)通常の背景(左)と高い背景(右)の例。この例では、DAPIシグナルノートについては、上皮から来るシグナルを、核の外側に示す。すべてのスケールバー= 20 μm。略語: DAPI = 4′,6-ジミディノ-2-フェニリンドール. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
上述のプロトコルは、宿主微生物叢界を可視化する再現可能な方法を提供する。これらのアッセイは、FISH標識18 の最適化から粘液保存およびimaging9に始まるプロトコル開発からかなり恩恵を受けています。固定と埋め込みもサンプルの有用なストレージを提供します。さらに、パラフィン浸潤カセットは、サンプルが完全に固定され、不活性であるとして、制限なしに郵送することができます。
有意性と代替方法
FISHと粘液染色の組み合わせは、特定の組織の場所での微生物叢組成の分析と、個々の細菌と宿主との相互作用を可能にする。マイクロビオタ内の特定の部位の分析を含む代替技術は、通常、シーケンシング19と結合されたレーザー捕捉マイクロ解剖の場合のような、これらの相互作用の単細胞性を探索することができない。しかし、シーケンシングベースの技術は、16S rRNAプローブよりも細かいレベルで、より広く微生物叢の遺伝的構成を捕捉することができるという利点を有する。
提示されるプロトコルの落とし穴は、宿主に関連してマイクロビオタの単回スナップショットを提供することです。生きた動物におけるリアルタイムイメージングでは、深部組織における蛍光シグナルの取得を容易にする特別なイメージング技術が必要です(例えば、生体内2光子顕微鏡および光シート蛍光顕微鏡20,21)。これらの方法では、モデル生物は、そのエンベロープ20に結合する分子で染色された細菌または蛍光タンパク質21を収容する遺伝子組み換え細菌でコロニー形成される。後者の場合、蛍光タンパク質の成熟は、ほとんどの標準的な蛍光タンパク質が光を放出するために酸素を必要とするので、重要な問題です。したがって、少なくともnan好気環境(酸素のナノモル濃度)を有するモデル生物が必要とされ、好気性ゼブラフィッシュgut21などが必要である。
このプロトコルでは、メタノールカルノイは、パラホルムアルデヒドまたはホルマリンの代わりに固定剤として使用されます。これにより、処理中の粘液層の水分補給、脱水、崩壊を防止し、粘液の厚さの正確な測定を容易にします。メタカーンの固定化とパラフィン埋め込みは分野の標準となっているが、粘液保存を最適化するための異なる固定剤および埋め込み技術が検討されており、樹脂がパラフィン埋め込みよりも優れている可能性が示されている。パラフィン埋め込みおよびメタカーン固定に対するもう一つの重要な制限は、蛍光タンパク質の消失であり、これは、代替固定剤(例えば、ホルマリンまたはパラホルムアルデヒド(PFA))または改変埋め込み技術23を用いて回避できる。各固定剤には利点と欠点があり、固定性の選択はイメージングの優先順位に依存します。PFAとメタカーンのどちらでも生物学的複製が固定され、両方のサンプルから画像が得られた場合、イメージングモダリティを組み合わせることができます。
FISHは、特異的抗Muc2C3ウサギポリクローナル抗体を有する単離された例において免疫蛍光と組み合わされている。これらの結果は、他のMuc2抗体と共に広く再現されておらず、FISH免疫蛍光の組み合わせの成功において抗体の選択が重要であり得る可能性があることを示している。特定の抗体に対する抗体染色が成功する条件は、FISH染色の保持を許可しない場合があります。
トラブルシューティング
このプロトコルでは、サンプルの収集、断面化、および染色は、イメージングアーティファクトの作成を防ぐための重要な手順を表します。例えば、採取時および埋め込み前に組織を押すと、微生物叢の誤局在化を招き、粘液の品質に影響を与える可能性があります。もう一つの重要な考慮事項は、小腸の比較的空の部分と遠位結腸内のペレットなど、単一のカセットで非常に異なる厚さのセグメントを組み合わせることを避けることです。異なる厚さはイメージングの困難につながる:埋め込んだ後、1つのセグメントの特定の深さでの横断断面は、他のセグメントのイメージングのために間違った深さにある可能性があります(例えば、ルーメンは組織ごとに異なる深さになります)(図1B、C および 図3A)。さらに、画像化動物モデル便ペレットについては、腹膜24に包んでもよい。この技術では、新たに分離された腹陰の小さな部分が便の周りに穏やかに折り畳まれ、プロトコルで概説されている洗浄段階の間にペレットの構造を保存します。
内容物を含む動物組織の処理とは異なり、ヒト腸管サンプルをイメージングすることはいくつかの課題を提示する。具体的には、腸内腔内の内容物および粘膜内層は、腸内生検または切除処置の前に通常行われる大腸内視鏡検査腸製剤によって破壊される可能性が高い。さらに、生検が収集されるとき、腸内含量がない場合に特定の特徴(例えば、内腔と粘膜の)の同定に役立つ組織の向きに注意することが有用である。3%寒天および/または寒天で事前埋め込み:ゼラチン混合物は、組織の極性を維持するのに有用であり得る25;しかし、文献に記載されているように寒天の脱水と断方に問題があり、処理時間を変更する必要があります。
良いFISH染色を達成するための重要な側面は、特定のFISHプローブのホルムアミド濃度を調整することから来る。Formamideは、FISHプローブのターゲットへのハイブリダイゼーションストリンジェンシーを制御します。a)適切なホルムアミド濃度が所定のコミュニティを染色するために選択されていること、およびb)適切なホルムアミド濃度が利用されているプローブの組み合わせに対しても可能であることを確認することが重要です。mathFISH(http://mathfish.cee.wisc.edu/)などのウェブサイトは、所定のプローブの適切なホルムアミド濃度を計算するのに役立ちます。適切なホルムアミド濃度に関する情報がない場合、このプロトコルは0%および10%ホルムアミドで試験することができる。
埋め込まれたサンプルを切り離すには、ブロックに浅く切り込みすぎると、明るい内容のない絨毛/納骨堂の断面図が得られるため、ブロックを十分な深さまで切る必要があります(図3A)。最適なFISH信号のために切り離した直後にサンプルを染色し、新鮮なDAPI(または-20°Cに保存されたDAPI)を使用してバックグラウンドの問題を解決します(図3C)。1ヶ月以上前の部分のFISH染色は、汚れが悪い/矛盾する可能性があります。
組織またはカバースリップがスライドに対して完全に平坦でない場合、サンプルはタイルスキャン内のすべての位置に焦点を合わせることができない可能性があります(図3B)。.は、無駄な労力と潜在的な光の漂白につながります。これは、すべての位置が焦点を合わせられたことを確認した、より小さなタイルスキャンを取ることによって解決できます。鈍い刃で切り離す場合、粘液や光度の内容物の剥離にもつながり、イメージング中に大きな暗い領域として表示されます。最後に、ハイブリダイゼーション工程中の溶液または気泡の蒸発は、組織におけるFISHプローブの不均一な染色につながる可能性があります。
FISHプローブ結合の効率に影響を与えるもう1つの重要なパラメータは、異なるプローブ間の競争です。FISHプローブが細菌に標識していることを確認するのに役立つチェックは、FISHプローブからのシグナルの共局在化をDAPIで調べることです(図2C,D)。複数のrRNAプローブを使用する必要があるサンプルでは、ハイブリダイゼーション温度、プローブ濃度、およびホルムアミドなどのパラメータを調整することが重要になり、プローブが正しい種に効率的に結合していることを確認することが重要になります18。
イメージングに関する注意事項
魚染色細菌は、共焦点顕微鏡と少なくとも40倍の倍率の目的を使用して最もよく視覚化されます。63倍の倍率は単細胞レベルでの画像細菌に好ましいが、40倍倍倍はデジタルズームを最大化するか、または超解像系を採用することによっても使用することができる。超分解能を備えたシステムは、個々の細菌細胞の細胞下解像度を提供する可能性もあります。低倍率目標は、細菌の局在および粘液の厚さの一般的な感覚を得るために利用され得る。
高いダイナミックレンジは、上皮の非常に明るい核と発光細菌の比較的弱い信号からDAPI信号の広い範囲をキャプチャするのに役立ちますので、8ビット画像の代わりに16ビット画像を取得することも強くお勧めします。上記のイメージング設定を使用する以外に、イメージングの重要な考慮事項は、フルオロフォアの選択です。細菌タイプ間の最良の分離のために、使用されるフルオロフォアが励起および発光スペクトルで重ならないようにしてください(線形アンミックスを行う能力を持つシステム上でイメージングしない限り)。さらに、プローブは、追加のコミュニティメンバーを識別するために、組み合わせて使用することができます(例えば、家族固有のプローブと属特異的プローブの組み合わせ)。線形非混合または未検証プローブを使用する場合、純粋な培養物8,14でのFISH染色の精度とレベルをテストすることが不可欠です。
画像が収集されると、BacSpace26、HiPR-FISH8、およびその他のセグメンテーションツール27などのホスト・マイクロビオタ・インターフェースの定量分析に複数のツールが使用できます。BacSpaceは、組織と発光成分のセグメンテーションと、images26からの植物材料の除去を可能にするMATLABソフトウェアです。プログラムはまた、2Dの粘液の厚さの分析と異なるチャネル26のピクセル距離に基づいて空間分布の定量化を提供します。逆に、HiPR-FISH画像解析ソフトウェアは、FISH染色細胞8のセグメンテーションを可能にする。最後に、in vitro実験27用に最適化された他の細菌セグメンテーションツールもこのアプリケーションに適応することができる。
結論
その場で イメージングは、他のコミュニティメンバーと食事、粘液、および宿主上皮陰窩によって作成された様々な微小環境のコンテキストで個々の微生物分類の定量分析を可能にする。生物間の相互作用は、宿主関連微生物系の生物学を決定し、健康に影響を及ぼす摂動中のこれらの構造の変化の本質的な分析を提供する。特に、上記のプロトコルを介して その場所で 微生物叢を画像化する能力は、動物宿主に関連して微生物叢の生物地理学に信じられないほどの窓を提供する。
Disclosures
著者には利益相反はありません。
Acknowledgments
著者らは、クリステン・アール博士の貴重な技術開発、トラブルシューティングの助けを求めるアンバー・ハン、原稿の批判的なレビューに対するジェン・グエン博士とディアナ・ペパン博士、顕微鏡アクセスを提供してくれたブリティッシュコロンビア大学のヘシャム・ソリマン博士とロッシ研究所に感謝したいと考えています。著者らは、CIHRチームグラント:カナダマイクロバイオームイニシアチブ2(C.T.)、クローン病と大腸炎カナダ(C.T.とK.M.N.)、CIFAR(C.T.とK.M.N.)、マイケル・スミス健康研究学者賞(C.T.へ)、ウェストン財団:ウェストン・ファミリー・マイクロバイオーム・イニシアチブ(C.T.T.)、ポール・アレン・アクト・アワードからの支援を認めています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum foil | |||
| Chloroform | Fisher | C298-500 | Toxic |
| Coplin jar | Fisher | 08-813E | |
| Cover glass, 22 × 22 mm, no #1 | VWR | CA48366-227-1 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Resuspended to 5 mg/mL |
| Empty pipette tip box(es) | To melt paraffin | ||
| Ethanol, anhydrous, molecular grade | -- | -- | |
| FISH probes | |||
| FISH hybridization solution | -- | -- | 20 mM Tris–HCl pH 7.4, 0.9 M NaCl, 0.01% (w/v) SDS in nuclease-free water. Optional addition of 5–50% (v/v) formamide |
| FISH washing buffer | -- | -- | 20 mM Tris–HCl pH 7.4, 0.9 M NaCl |
| Fluorescently-labeled Ulex Europaeus Agglutinin (UEA-1) lectin | Vector Laboratories | FL-1061 (Fluorescein-labeled) or RL-1062-2 (Rhodamine-labeled) | UEA-1 labels fucosylated glycans, so it is not appropriate for germ-free mice or for samples from fucosyltransferase 2 (FUT2)-deficient hosts. |
| Forceps | |||
| Formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | |
| Fumehood | |||
| Glacial Acetic Acid | Fisher | A38-212 | Corrosive and flammable |
| HybriSlip flexible plastic cover slips, 22 x 22 mm × 0.25 mm | Sigma Aldrich | GBL722222 | for FISH hybridization steps, can substitute glass coverslips |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Kimwipes | |||
| Methanol | Fisher | A412 | Toxic and flammable |
| Microtome | for sectioning | ||
| Multipurpose Specimen Storage Containers, 473 mL | Fisher | 14-955-117A | Can substitute with a glass or polyethylene container of your choice. Methacarn is not compatible with polystyrene or metal. |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | Any nail polish should work |
| Oven | Necessary range: 45-60 °C | ||
| Paraffin: Leica Paraplast | Leica | 39601006 | |
| PBS, Phosphate-buffered Saline (10x solution) | Fisher | BP3991 | Dilute to 1x for protocol |
| Sodium chloride | Fisher | S271 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), 20% Solution, RNase-free | Invitrogen | AM9820 | |
| Tissue-Loc HistoScreen Cassettes | Thermo Scientific | CA83009-999 | |
| Trizma hydrochloride solution, 1M Tris-HCl, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2663-1L | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Water, nuclease-free | Fisher | BP2484100 | |
| Xylenes | Fisher | X3P-1GAL | Toxic and flammable |
References
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