Summary
Denne strømlinede protokol beskriver en arbejdsgang til at opdage og billede bakterier i komplekse vævsprøver, fra fastsættelse af væv til farvning mikrober med fluorescerende in situ hybridisering.
Abstract
Måling af lokalisering af mikrober inden for deres in vivo sammenhæng er et vigtigt skridt i at afsløre de funktionelle relationer mellem mikrobiota og hvirveldyr tarm. Det rumlige landskab i tarmens mikrobiota styres tæt af fysiske træk - tarm slim, krypter og folder - og påvirkes af værtskontrollerede egenskaber som pH, ilttilgængelighed og immunfaktorer. Disse egenskaber begrænser evnen af commensale mikrober og patogener ens at kolonisere tarmen stabilt. På mikron-skalaen bestemmer den mikrobielle organisation tæt-range interaktioner mellem forskellige mikrober samt samspillet mellem mikrober og deres vært. Disse interaktioner påvirker derefter storstilet organfunktion og værtssundhed.
Denne protokol gør det muligt visualisering af tarmen mikrobiota rumlige organisation fra afstande mellem celler til organ-dækkende skalaer. Metoden er baseret på fastsættelse af tarmvæv og samtidig bevare tarmstruktur og slim egenskaber. De faste prøver er derefter indlejret, sektionsopdelt og farves for at fremhæve specifikke bakteriearter gennem fluorescens in situ hybridisering (FISH). Værtsfunktioner, såsom slim og værtscellekomponenter, er mærket med fluorescerende mærket lectins. Endelig er de farvede sektioner afbildet ved hjælp af en konfokal mikroskop udnytte flise-scanning billeddannelse ved høj forstørrelse at bygge bro mikron til centimeter længde skalaer. Denne type billeddannelse kan anvendes på tarmafsnit fra dyremodeller og biopsier fra humane væv for at bestemme mikrobiotaens biogeografi i tarmen i sundhed og sygdom.
Introduction
Mikrobielle visualiseringsteknikker har oprindelse, der er lige så gammel som mikrobiologien selv, da Antonie Van Leeuwenhoek brugte sit mikroskop til at observere bakterier (som han kaldte "animalcules") fra tandplade og afføring i det 17. århundrede . Siden da er der udviklet mange teknikker til at visualisere den rumlige organisering af konsortiet af bakterier, svampe og vira, der lever forbundet med en host-the microbiota1. Belyse lokalisering af disse mikrober er afgørende for at bestemme deres funktion i deres dyrevært. Bakteriernes biogeografi er vigtig i både commensal og patogen taxa, da nærhed til bestemte steder (f.eks. epitelet), ernæringsmæssige substrater og specifikke mikrober kan diktere bakterieproduktion af metabolitter, der ligger til grund for interspecies og interaktioner mellem riget.
En nøglestruktur, der adskiller bakterier og værtsvæv i flere forskellige kropssteder, såsom mundhulen, tarmen eller lungen, er slimet - et værtsproduceret lag, der både forhindrer mikrobiel translokation på værtselelelestrengerne og tjener som en ernæringsmæssig ressource for mikrobiota2,3,4 . Karakterisering brud og ændringer i denne barriere er af afgørende betydning, hvilket fører til mekanistisk indsigt i host-mikrobiota interaktioner, der ikke ville blive opnået ved sekventering alene5,6,7. For eksempel, billeddannelse aktiveret opdagelsen af, at antibiotika eksponering kan forstyrre slim lag og mikrobiota organisation7,8, og at afføringsmidler kan nedbryde slim, korrelerer med store ændringer i immunparametre5.
Denne protokol skitserer en generel ramme for fastsættelse, farvning og billeddannelse af mikrobiota og værtsvæv (figur 1), bygget på Johanssons og Hansson9's arbejde. Mens denne protokol er modelleret i forbindelse med tarm sektioner, det kan nemt tilpasses til andre vævstyper. Denne protokol muliggør behandling af enten eksperimentelle dyreprøver eller humane kliniske prøver. noter til behandling af begge typer prøver er medtaget. I eksemplet her, værten epitel og luminal bakterier er samtidig blevet mærket med 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) farvning, slim med fluorescein (FITC)-konjugeret lectin, Ulex europaeus agglutinin I (UEA-1), og en specifik bakteriel takon ved hjælp af FISK. FISH sonder er normalt designet mod en taxon's 16S rRNA gener for at sikre det høje signal fra bindende en høj kopi udskrift.
I dette eksempel er sonden rettet mod 16S rRNA af Muribaculaceae bakteriefamilien (figur 2). Pletterne erstattes dog let med forskellige FISH-sonder og/eller lectiner for at imødekomme det relevante biologiske spørgsmål. Tidligere validerede FISH sonder kan findes på ProbeBase10, en online ressource for rRNA-målrettede oligonukleotid sonder, eller på SILVA11, en ribosomal RNA database. Til design af nye sonder kan læseren henvise til nye rørledninger som HiPR-FISH8 eller Oligominer12. Ved hjælp af denne protokol er det muligt at observere den tætte pakning af bakterier i tarm lumen og de forskellige funktioner i tarm slim i hele fordøjelseskanalen. Den arbejdsgang, der er beskrevet her, muliggør kvantitativ analyse af mikrobiota i den rumlige sammenhæng med værtsmiljøet.
Protocol
Alle dyreforsøg og vævsindsamling, der er beskrevet i denne protokol, blev udført i overensstemmelse med canadian Council on Animal Care (CCAC) retningslinjer og blev godkendt af Animal Care Committee ved University of British Columbia. Der blev anvendt bakteriefrie schweiziske Webster-mus. Alle dyr var 8-10 uger gamle, begge køn blev brugt, og alle mus blev co-housed med mindst to mus pr. Bur. Dyr blev aflivet ved hjælp af kuldioxid med sekundær cervikal dislokation eller hjertepunktur.
1. Design af et billedeksperiment: overvejelser og stikprøveindsamling
- FISK sonde design
- Hvis der findes en passende FISH-sonde, skal du vælge en allerede eksisterende offentliggjort, der viser et stærkt signal i mærkede celler sammenlignet med baggrunden.
- Valider nye sonder in vitro at bestemme deres effektivitet bindende til faste prøver af målet bakterier og off-target binding til andre bakterier.
- Kontroller alle 16S FISH-sonder, der skal anvendes mod 16S-sekvenser fra målorganismen eller mod 16S rRNA-sekventering fra de prøver, der skal analyseres, for at sikre, at den forventede andel af positive matches er til stede, og at sonder ikke binder ikke specifikt til andre mikrobiotamedlemmer.
- Juster FISH-sonderne i forhold til enten sekvenser i fuld længde eller ampliconsekvensvarianter ved hjælp af et værktøj, såsom Clustal Omega13, til at evaluere den potentielle binding af sonder og deres mål.
- Ud over i silico test, teste nøjagtigheden og niveauet af FISK farvning af unvalidated sonder på rene kulturer8,14.
BEMÆRK: Ved farvning af flere medlemmer af fællesskabet kan sonder anvendes kombinatorisk (f.eks. kombinationen af en familiespecifik sonde og en slægtsspecifik sonde), hvis de anvendte fluorheste ikke overlapper hinanden i excitation og emissionsspektre (medmindre billeddannelse på et system med evnen til at udføre lineær ubblanding). Derudover kan specificitet påvises ved at inkludere specificitetskontrol / forvrængede sonder eller ved konkurrence med ikke-fluorescerende sonder.
- Prøvetyper og vævssamling
- Brug skarpe og rene værktøjer, skære tarm segmenter fra gnotobiotiske schweiziske Webster mus til billeddannelse. Minimer forstyrre prøven så meget som muligt, og håndtere sektionerne ved deres kanter for at undgå at påvirke billedbehandlingsområdet. Fastgør prøven så hurtigt som muligt efter dissektionen for at forhindre nedbrydning.
BEMÆRK: Til dyreforsøg foretrækkes intakte, uflushedede tarmsektioner; membranen vil hjælpe med at holde den lysende og slimhindede organisation intakt. - Rengør værktøj ved at tørre dem af med 70% ethanol mellem prøver og steder. Opnå mindst tre biologiske kopier pr tarm sektion / biopsi placering, der sørger for at prøve konsekvent tarm steder, som slim og tarm arkitektur samt mikrobiota ændringer betydeligt i forskellige steder.
- Brug skarpe og rene værktøjer, skære tarm segmenter fra gnotobiotiske schweiziske Webster mus til billeddannelse. Minimer forstyrre prøven så meget som muligt, og håndtere sektionerne ved deres kanter for at undgå at påvirke billedbehandlingsområdet. Fastgør prøven så hurtigt som muligt efter dissektionen for at forhindre nedbrydning.
2. Vævsprøvefiksering og infiltration
- Fiksation
- Forbered frisk methacarn i en kompatibel beholder med følgende forhold: 60% absolut methanol, 30% chloroform og 10% istidseddikesyre. Dispenser hvert af disse kemikalier i en røghætte. Vælg en beholder, der kan luftes ved at åbne låget. Da methacarn ikke er kompatibel med polystyren, skal den tilberedes i en polyethylenbeholder ved hjælp af glasuddannede cylindre/serologiske pipetter til chloroform og iseddikesyre.
BEMÆRK: Under blanding dannes der dampe, som kan medføre, at der dannes tryk inde i beholderen. Det er tilrådeligt at holde beholderen relativt tæt lukket, når den er fjernet fra røghætten, hvis prøverne ikke tilsættes aktivt. Kloroform er giftigt; ikke indåndes, sluges eller absorberes gennem huden. Methanol er giftigt og meget brandfarligt; ikke indåndes, sluges eller absorberes gennem huden. Iseddikesyre er brandfarlig og meget ætsende for huden og øjnene. - Efter dispensering skal du lukke beholderen, hvirvle for at blande og derefter udlufte; gentag dette, indtil udgasning er stoppet (og trykket ikke længere opbygges mærkbart under låget).
BEMÆRK: Methacarn må ikke bortskaffes i afløb; indsamling og bortskaffelse af så farligt kemisk affald i henhold til de institutionelle retningslinjer. Brug en blyant til mærkning histologi kassetter, som mange pen blæk vil komme ud i methacarn løsning. - Placer tarmsektionerne i histologikassetter ved forsigtigt at holde en kant af vævet med pincet. Luk kassetten og helt nedsænke den i frisk methacarn opløsning. Sørg for, at opløsningen ikke er ældre end et par timer ved nedsænkning af kassetterne.
- For kliniske prøver, der vil blive indsamlet i en klinisk suite uden adgang til en røghætte, skal du bruge en polyethylen opbevaring beholder med en flap skåret i låget, der vil tillade passage af histologi kassetter. Tape denne flap lukket, når der ikke passerer prøver for at forhindre udslip af giftige dampe.
BEMÆRK: Det er vigtigt at bruge afdækningstape for at undgå opløsning af lim på beholderen- nogle typer tape (f.eks plastpakningstape) holder muligvis ikke godt til methacarndampene. - Fix prøver i mindst 3 timer og højst to uger.
BEMÆRK: Tykkere prøver kan kræve fikseringstider, der er længere end 3 timer. Fikseringstid kan vælges for at muliggøre samtidig paraffininfiltrationsbehandling for kassetter, der er fastgjort i forskellige methacarnopløsninger (f.eks. samtidig at udføre paraffininfiltration på grupper af prøver indsamlet og fastgjort over to uger).
- Forbered frisk methacarn i en kompatibel beholder med følgende forhold: 60% absolut methanol, 30% chloroform og 10% istidseddikesyre. Dispenser hvert af disse kemikalier i en røghætte. Vælg en beholder, der kan luftes ved at åbne låget. Da methacarn ikke er kompatibel med polystyren, skal den tilberedes i en polyethylenbeholder ved hjælp af glasuddannede cylindre/serologiske pipetter til chloroform og iseddikesyre.
- Paraffin infiltration og indlejring
- Paraffinen placeres i en varmebestandig beholder, og smelt den i en ovn ved 60 °C natten over. Da paraffinpiller optager mere plads før smeltning, skal du sikre dig, at tilstrækkelig paraffin smeltes til at dække alle kassetterne.
BEMÆRK: Temperaturen må ikke være højere end 60 °C, da den kan give anledning til artefakter. - Vask vævet ved at hælde væsken ud i den relevante affaldsbeholder og straks erstatte det med følgende kemikalier.
- Inkuber i absolut methanol i 30 min. Gentag en gang.
- Inkuber i absolut ethanol i 20 min. Gentag en gang.
- Inkuber i xylener i 15 min. Gentag en gang.
- Byt vaskene hurtigt, og pas på at undgå at lade kassetterne tørre. Sørg for, at hver vask dækker kassetterne fuldt ud i bægerglasset eller beholderen.
BEMÆRK: Xylens er brandfarlige, og hvis de indåndes, kan dampene trykke centralnervesystemet med potentielle langsigtede neurologiske konsekvenser ved udsættelse for høje koncentrationer (>200 ppm). Håndter kun xylener inden for en røghætte. Da xylener er farlige, skal du sørge for at bruge det minimumsbeløb, der er nødvendigt for at dække de histologiske kassetter.
- Under indlejring orienteres tarmsegmenterne parallelt med længden af kassetten (i modsætning til opretstående) ved hjælp af pincet til at give langsgående, tværgående sektioner i stedet for tværsnitsdeuterede for at give mere potentielt prøveområde til kvantitativ billeddannelse (Figur 1B).
- Åbn kassetterne lidt (~ 1-2 cm eller 0,5 tommer) for at tillade paraffin at komme ind uden at miste vævssegmenterne. Brug dobbelthandsker til dette trin eller pincet for at forhindre overophedning eller mild afbrænding af fingre. Dyk ned og luk kassetterne i beholderen med smeltet paraffin, og beholderen placeres tilbage i 60 °C ovnen. Sørg for, at kassetterne er fyldt med paraffin, og der er ingen store luftbobler tilbage.
- Efter inkubation i 2 timer ved 60 °C fjernes beholderen fra ovnen. Brug sammenkrerne, fjern forsigtigt kassetterne og læg dem individuelt på et stykke aluminiumsfolie for at afkøle. Opbevar dem ved stuetemperatur, indtil de er klar til indlejring og sektion.
- Del paraffinblokkene med en mikrotom, der opdeles dybt nok ind i blokken, at luminalt indhold er eksponeret, hvilket muliggør en langsgående del af villi og / eller krypter ud over lysende indhold og slim. Pas på at udskifte knivene, da fækalt materiale sløver klingen hurtigt sammenlignet med væv. Skær sektioner til 4 μm tykkelse for optimal skarphed af billederne. Overfør sektionerne til almindelige ubestrøgede dias.
- For FISH farvning, plette tarm sektioner så hurtigt som muligt (dvs. inden for et par uger efter afsnit) for at opnå en stærk FISK signal. Hvis du udelader FISH farvning, kan lectin + DAPI farvning udføres på mindre friske (dvs. måneder gamle) prøver uden signifikant tab af signal.
- Paraffinen placeres i en varmebestandig beholder, og smelt den i en ovn ved 60 °C natten over. Da paraffinpiller optager mere plads før smeltning, skal du sikre dig, at tilstrækkelig paraffin smeltes til at dække alle kassetterne.
3. Farvning bakterier og vært funktioner
- Præparation
- Varm ovnen op til 60 °C. Forvarm en tom Coplin-krukke og nok volumen til at dække glasrutschebanerne i krukken to gange med xylener i en glasflaske, og sørg for at parafilme rundt om låget for at forhindre fordampning af xylenerne. Lad xylenernes temperatur nå op på 60 °C.
BEMÆRK: En standard Coplin-krukke passer til 8 dias, og diasene kan dækkes med ca. 50 mL væske (kan variere mellem 40 og 60 mL afhængigt af mærket). Xylen substituer er mindre giftige og er blevet anvendt med succes af andre grupper til afvoksning trin (trin 3.2)8,9. - Hvis der er en separat ovn til rådighed, skal du forvarme en hybridiseringsovn til 50 °C. Ellers kan dette trin udføres med den samme ovn, der anvendes til bagning af lysbillederne efter trin 3.2.3.
- Klargør FISH hybridiseringsopløsningen: 20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 0,9 M NaCl; 0,01%26 - 0,1%9 (w/v) natrium dodecylsulat (SDS) i nucleasefrit vand. Hvis det er nødvendigt, tilsættes 5-50% (v/v) formamid. Forvarm denne hybridiseringsopløsning ved 50 °C under deparaffinering.
BEMÆRK: Formamid er et amide, der fungerer som teratogen; håndtere formamid med handsker og beskyttelsesbriller. I små doser og ved udsættelse for øjne, hud eller slimhinder er det irriterende. I store mængder kan formamiddd kræve medicinsk intervention. Formamid kan opbevares ved 100% i en -20 °C fryser.
- Varm ovnen op til 60 °C. Forvarm en tom Coplin-krukke og nok volumen til at dække glasrutschebanerne i krukken to gange med xylener i en glasflaske, og sørg for at parafilme rundt om låget for at forhindre fordampning af xylenerne. Lad xylenernes temperatur nå op på 60 °C.
- Forberedelse af dias til farvning: deparaffinisering
- Placer lysbillederne i Coplin-krukken, så sektionerne ikke kommer i kontakt med andre dias eller krukken, og bag rutsjebanerne ved 60 °C i 10 min.
- Fyld Coplin-krukken med forvarmede xylener fra ovnen i røghætten, og pas på ikke at hælde direkte oven på prøverne og potentielt løsne vævene. Anbring Coplin-krukken tilbage i 60 °C ovnen. Lad flasken stå med de resterende xylener i røghætten.
- Hæld de brugte xylener i en ordentlig affaldsbeholder til bortskaffelse, pas på ikke at forstyrre vævssektionerne på glasrutschebanerne og brug et par sammenkrøser til at forhindre diasene i at falde ud af Coplin-krukken. Genopfyld Coplin-krukken med de resterende xylener, og inkuber i 10 min ved stuetemperatur i røghætten.
- Inkuber sektionerne i 99,5% ethanol i 5 min ved stuetemperatur. Efter dette inkubationstrin skal du fjerne diasene fra Coplin-krukken, tørre bagsiden af diasene på en laboratorievise eller papirhåndklæde og kortvarigt lufttørre, indtil ethanoldråberne er væk.
BEMÆRK: Hvis du tørrer bagsiden af diasene, kan du se en bedre visualisering af tørrefremskridtet.
- Bakteriel farvning med FISK
- Brug en flydende blocker eller PAP pen til at begrænse det område af flydende ekspansion ved at cirkle området af hver væv sektion. Sørg for, at blækket ikke kommer i kontakt med selve sektionen. Opret en cirkel så tæt på hver vævssektion som muligt uden at kontakte vævet for at minimere det overfladeareal, der skal dækkes af hybridiseringsopløsningen.
- Hybridiseringsopløsningen forberedes: For hver 50 μL forvarmet hybridiseringsopløsning tilsættes 0,5 μg sonde (f.eks. 0,5 μL 1 μg/μL sonde). Pipette hybridiseringsopløsningen på sektionerne på diaset (~20 μL/sektion, afhængigt af sektions-/cirkelstørrelsen). Beskyt hybridiseringsopløsningen og lysbillederne mod lys fra dette punkt og fremefter under inkubationstrin og opbevaring.
- Sørg for, at den anvendte væskemængde dækker hele strækningen ved overlejring med en fleksibel plastovertræk. Inkuber diaset i et fugtigt kammer for at reducere fordampning. Opret et fugtigt kammer med en pipettespidskasse med klude eller papirhåndklæder i bunden, der er gennemblødt med overskydende hybridiseringsopløsning eller fosfatbufferet saltvand (PBS) for at give fugtighed. Inkuberes sektionerne ved 45-50 °C, afhængigt af sondesættet, i >3 timer.
- Varm FISKEvaskebufferen op: 20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 0,9 M NaCl til 50 °C i inkubationsperioden. Forbered nok vaskebuffer til at dække diasene i Coplin-krukken.
- Fjern plastdækslerne; inkubere rutsjebanerne i FISH-vaskebufferen i en Coplin-krukke, der begge er forvarmet til 50 °C. Sæt Coplin-krukken tilbage i 50 °C ovnen i 10-20 min. For tykke prøver skal dækslerne fjernes i Coplin-krukken ved at tilsætte bufferen og forsigtigt løsne dækslerne for at undgå at smøre skiven.
- Farvning af slim og værtsfunktioner
- Forbered en generel DNA/slim counterstain i PBS: endelig 10 μg/mL DAPI + 40 μg/mL slim plet UEA-1. Forbered nok counterstain til at dække pletterne i mangel af en coverlip for at undgå at beskadige væv med yderligere coverlips.
BEMÆRK: Hvis pletterne ikke er til stede, vil det kræve større mængder end de 20 μL, der anvendes i punkt 3.3.2. For sektioner i gennemsnit (~10 mm diameter) er 200 μL nok til at dække ét sted. denne diskenhed på forhånd testes på et attrap-dias. - Fjern FISH vaskebufferen, og udskift den med PBS i Coplin-krukken. Umiddelbart efter genopfyldning af Coplin-krukken med PBS skal PBS dekanteres.
- Fjern diasene fra krukken og pipette counterstain på toppen af afsnittet og samtidig sikre, at du ikke røre vævet med pipettespidsen. Dæk hele sektionen med en boble. Inkuberes ved 4 °C i 45 min i mørke.
- Vask pletterne 3 gange hurtigt med frisk PBS: Mens du holder diasene på plads ved hjælp af pincet, hæld PBS ud i en vask og genopfyld straks med frisk PBS.
- Aftørring af bagsiden af dias mod en tørre eller køkkenrulle, lad de fleste af PBS fordampe ud sektioner, hjulpet af et vakuum linje tilsluttet en pipette spids. Undgå endnu en gang at røre ved sektionen med pipettespidsen.
- Monter sektionerne ved hjælp af et monteringsmedium (uden DAPI), og lad det indstilles ved stuetemperatur dækket af glasdæksler, så dækslerne er flade, og at der ikke er luftbobler i monteringsmediet.
- Sæt omslagene på diaset ved at male langs kanterne af dækslet med klar neglelak, idet du sørger for at holde sig væk fra kanten af diaset for at sikre, at diaset vil sidde niveau i mikroskop slideholderen under billeddannelse.
- Gem lysbillederne ved 4 °C i mørke i et par uger, før fluorescensen er udtømt.
- Forbered en generel DNA/slim counterstain i PBS: endelig 10 μg/mL DAPI + 40 μg/mL slim plet UEA-1. Forbered nok counterstain til at dække pletterne i mangel af en coverlip for at undgå at beskadige væv med yderligere coverlips.
4. Billedbehandling og billedanalyse
- Visualisering af pletterne
- Vælg et område af vævet, der indeholder både væv og lumen at billedet mikrobiota-vært interface. For kvantitativ billeddannelse af slimtykkelse og luminal biogeografi skal du vælge synsfelter, hvor udsnit af epitel villi og/ eller krypter er langsgående og ikke tværsnit. Undgå områder med store huller mellem slim og epitel for at undgå at dele artefakter.
- Find væv og korrigere fokusplanet ved hjælp af DAPI-signalet til lokalisering og fokusering for at undgå fotoblegning af FISH fluorescenssignalet.
- Juster billedindstillingerne. For at visualisere den bakterielle DAPI-plet øges lasereffekten og kommer til det punkt, hvor DAPI-signalet fra epitelceller overmættet eller "blæses ud".
BEMÆRK: Overmættes ikke overdrevent, da dette vil føre til fotobleaching og visuelle artefakter i kernerne, der ikke kan gendannes. - For alle andre kanaler skal du bruge den mindste mængde laserkraft, der giver et klart signal over baggrunden, og pas på ikke at overmæde.
BEMÆRK: Dette er især vigtigt, når du udfører flisescanninger, da fotografering vil være problematisk, når overlapningen mellem fliser er afbildet. - Brug 40x eller højere forstørrelse til at afbilde individuelle bakterier.
- Hent billederne.
- Erhverve flise scanninger for at opnå kvantitative data om slim tykkelse og rumlig fordeling af mikrober inden for lumen. Sørg for 15% overlapning mellem fliserne og kontrollere for vignettering / ujævn belysning, som kan blive forværret af <1x zoom. Når du opretter en flisescanning, skal du være meget opmærksom på, om vævet er i fokus i alle fliserne, da slørede/ude af fokusbilleder ikke kan analyseres (Figur 3B).
- Hvis det er muligt, minimere antallet af fliser er nødvendige for at billedet en given længde af epitel ved at dreje scanningsområdet, således at epitel og slim lag er parallelle med flisen og ikke i en vinkel. Ellers skal du finde en del af epitelet, der er parallelt eller vinkelret på billeddannelsesområdet for at opnå en lignende effekt.
Representative Results
For at undersøge lokaliseringen af specifikke tarm commensale bakterier i musen tarmen, kim-fri schweiziske Webster mus, der var blevet koloniseret med individuelle bakteriel isolater blev brugt i denne undersøgelse. Til dette eksperiment var de bakteriearter, der blev mærket, i) et menneskeligt isolate af Muribaculaceae-familien5, Muribaculum intestinal, en rigelig og udbredt familie af bakterier i murinmikrobiota15 samt ii) Bacteroides thetaiotaomicron, en genetisk tilgængelig og almindelig tarmbakterie. Efter to ugers ekvilibrering blev musene aflivet, og et segment af tyktarmen, der indeholder en fækal pellet, blev opdelt og fastgjort i frisklavet methacarn. Efter to dages fiksering blev sektionerne dehydreret ved forarbejdning gennem methanol, ethanol og xylener, infiltreret med paraffin, indlejret og derefter opdelt til lysende 4 μm skiver. Disse prøver blev derefter farves med en FISK sonde (3 'Cy3-tagged) specifikke for Muribaculum isolere, designet ved hjælp af Oligominer software12, og kontrolleres for sekundær og tertiær struktur og minimal ikke-specifik binding ved hjælp af NuPACK og mathFISH16,17. Prøverne blev også modvirket med Rhodamine-bundet lectin UEA-1 (som pletter fucosylated glycaner i slim) og DAPI. De farvede sektioner blev afbildet ved hjælp af et 40x oliemål og superopløsningsmodul.
Figur 1: Arbejdsgang for visualisering af mikrobiota-værtsgrænsefladen i tarmen. (A) En illustreret arbejdsgang for rørledningen. (B) De to sektionsopdelte fly vil give enten tværgående sektioner (foretrækkes til denne rørledning) eller tværsnit "donuts." (C) Indlejring af væv af meget forskellige tykkelser kan resultere i skiver, der kun er optimale for det ene eller det andet væv. Forkortelser: FISK = fluorescens in situ hybridisering; DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Imaging tyktarmen viser lokalisering af Muribaculum intestinale i forhold til slim i en gnotobiotisk mus model. Sektioner blev farves med DAPI (blå), Muribaculaceae FISH sonde (rød), og UEA-1 (grøn). (A) Distal musekolonis monokosoniseret med Muribaculum intestinal og (B) distal musekolonis bikoloniseret med Muribaculum intestinal og Bacteroides thetaiotaomicron. Skalabjælke = 20 μm. (C og D) Cy3-FISH (venstre), DAPI (midten) og kombinerede Cy3-FISH + DAPI-kanaler til lysende inset dele af henholdsvis A og B. Skalalinje = 5 μm. I (A) og (C) er alle bakterieformede og bakterier mellemstore DAPI-signaler mærket med Cy3 (enkelte pilespidser) og i (B) og (D) ud over disse Cy3- og DAPI-dobbelt-positive celler (enkelte pilespidser), der er DAPI-farvede bakterieceller, der er Cy3-negative (dobbelte pilespidser), som forventet for mono- og bikolonialiseringstilstande. Med undtagelse af længere filamentøse bakterier er større (>4 μm i længden) DAPI-positive strukturer (stumpe pile) plantemateriale eller kerner fra værtsceller. Forkortelser: FISK = fluorescens in situ hybridisering; DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Almindelige problemer. (A) Overfladiske snit vil ikke give lysende skiver af tarmen. (Til venstre) Et tarmsegment, der er blevet opdelt i en dybde, der giver udsigt over lumen samt langsgående udsigt over epitelet. (Højre) Et tarmsegment, der er blevet opdelt for lavt, afslører kun tværsnit af krypter og ingen konstant slimlag eller bakterier. (B) Ujævn dækning af væv/dæksler kan resultere i slørede og ujævnt belyste flisescanninger. En flise-scanning blev oprettet med positioner, der var ude af fokus (øverste højre hjørne). (C) Eksempel på normal baggrund (venstre) og høj baggrund (højre). I dette eksempel, for DAPI signal-note signalet kommer fra epitel, uden for kernerne. Alle skalastænger = 20 μm. Forkortelse: DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Den protokol, der er beskrevet ovenfor, giver en reproducerbar metode til at visualisere værtsmikrobiotagrænsefladen. Disse analyser har i høj grad nydt godt af protokol udvikling, startende fra optimering af FISH mærkning18 til slim bevarelse og billeddannelse9. Fiksering og indlejring giver også nyttig opbevaring af prøver; desuden kan paraffininfiltrerede kassetter sendes uden begrænsninger, da prøverne er helt faste og inert.
Betydning og alternative metoder
Kombinationen af FISH og slim farvning muliggør analyse af mikrobiota sammensætning på bestemte væv steder og samspillet mellem de enkelte bakterier og værten. Alternative teknikker, der involverer analyse af specifikke steder inden for mikrobiota er normalt ude af stand til at udforske encellet karakter af disse interaktioner, såsom i tilfælde af laser fange mikroissection kombineret med sekventering19. Men, sekventering-baserede teknikker har den fordel at være i stand til at fange den genetiske sammensætning af mikrobiota på et finere niveau og mere bredt end 16S rRNA sonder.
En faldgrube af den præsenterede protokol er, at det giver en enkelt gang snapshot af mikrobiota i forhold til værten. For realtidsbilleddannelse hos levende dyr kræves der særlige billeddannelsesteknikker for at lette erhvervelsen af et fluorescenssignal i dybt væv (f.eks. intravital to-fotonmikroskopi og lysplade fluorescensmikroskopi20,21). I disse metoder er modelorganismen enten koloniseret med bakterier, der er farvet med molekyler, der binder sig til deres konvolut20 eller genetisk modificerede bakterier, der huser fluorescerende proteiner21. I sidstnævnte tilfælde er modningen af fluorescensproteiner et centralt spørgsmål, da de fleste standard fluorescerende proteiner kræver ilt for at udsende lys. Derfor er modelorganismer, der har mindst nanaerobiske miljøer (nanomolarkoncentration af ilt), påkrævet, såsom aerob zebrafisk gut21.
I denne protokol bruges methanol-Carnoy som fiksativ i stedet for paraformaldehyd eller formalin, fordi det ikke indeholder vand. Dette forhindrer hydrering, dehydrering, og sammenbrud af slim lag under behandlingen og letter nøjagtige målinger af slim tykkelse. Mens methacarn fiksering og paraffin indlejring er blevet en standard på området, forskellige fikseringsmidler og indlejring teknikker er blevet undersøgt for at optimere slim bevarelse9,22, med nogle undersøgelser, der tyder på, at harpikser kan være bedre end paraffin indlejring22. En anden vigtig begrænsning for paraffinindlejring og methacarnfiksering er tabet af fluorescerende protein fluorescens, som kan undgås ved hjælp af alternative fikseringsmidler (f.eks. formalin eller paraformaldehyd (PFA)) eller modificerede indlejringsteknikker23. Hvert fiksativ har fordele og ulemper, og valget af fiksativ afhænger af billedprioriteringerne. Billeddannelsesmetoder kan kombineres, hvis biologiske replikater er fastsat i enten PFA og methacarn, og billeder er opnået fra begge prøver.
FISH er blevet kombineret med immunofluorescence i isolerede tilfælde med specifikke anti-Muc2C3 kanin polyklonale antistoffer9,24. Disse resultater er ikke blevet bredt gengivet med andre Muc2 antistoffer, hvilket indikerer, at valget af antistoffer kan være afgørende for succesen af FISH-immunofluorescence kombination. Betingelserne for vellykket antistoffarvning for et givet antistof tillader muligvis ikke tilbageholdelse af FISH farvning.
Fejlfinding
I denne protokol repræsenterer eksempelsamling, sektionsopdelning og farvning vigtige trin for at forhindre oprettelse af billedartefakter. For eksempel kan det at trykke på vævet ved indsamling og før indlejring føre til fejllocalisering af mikrobiota og påvirke slimkvaliteten. En anden vigtig overvejelse er at undgå at kombinere segmenter af meget forskellige tykkelser i en enkelt kassette, såsom et relativt tomt stykke tyndtarmen og en pellet i distale kolon. De forskellige tykkelser fører til vanskeligheder med billeddannelse: Efter indlejring kan tværgående afsnit på en bestemt dybde for et segment være på den forkerte dybde for billeddannelse for den anden (f.eks. vil lumen være på forskellige dybder for hvert væv) (figur 1B, C og figur 3A). Desuden, for billeddannelse dyr model afføring pellets, de kan være pakket ind i peritoneal membran24. I denne teknik foldes en lille del af friskisolerede bughinden forsigtigt rundt om afføringen og bevarer pelletens struktur under vasketrinene skitseret i protokollen.
I modsætning til behandling af animalsk væv med indhold, billeddannelse menneskelige tarmprøver udgør nogle udfordringer. Specifikt, luminalt indhold og slimhinder foring vil sandsynligvis blive forstyrret af koloskopi tarm forberedelse normalt udføres før intestinale biopsier eller resektion procedurer. Derudover, når biopsier indsamles, er det nyttigt at bemærke vævsorientering for at hjælpe med at identificere specifikke træk (f.eks. lumen vs. submucosa) i mangel af tarmindhold. Præ-indlejring med 3% agar og/eller agar:gelatine blandinger kan være nyttige til at opretholde væv polaritet25; der er dog problemer med dehydrering og afsnit af agar, som rapporteret i litteraturen, og behandlingstider kan være nødvendigt at ændre.
Et centralt aspekt for at opnå god FISH farvning kommer fra justering af formamidkoncentrationen for specifikke FISH-sonder. Formamid vil kontrollere hybridisering stringens af FISK sonder til deres mål. Det er vigtigt at sikre, at a) den korrekte formamidkoncentration vælges til farvning af et givet samfund, og b) at en passende formamidkoncentration endda er mulig for sonden kombination, der udnyttes- dette kan påvirke det optimale sondevalg, når du bruger flere sonder. Websteder som mathFISH (http://mathfish.cee.wisc.edu/) kan hjælpe med at beregne de korrekte formamidkoncentrationer for en given sonde. I mangel af oplysninger om passende formamidkoncentrationer kan denne protokol testes med 0% og 10% formamid.
Ved at opdele de indlejrede prøver skal blokken skæres så meget ned til at opnå lysende skiver, da en sammenstrækning for lavt ind i en blok vil resultere i et tværsnitsbillede af villi/krypterne uden lysende indhold (figur 3A). Plet prøverne kort efter afsnit for optimalt FISH-signal, og brug frisk DAPI (eller DAPI, der opbevares ved -20 °C) for at løse baggrundsproblemer (Figur 3C). FISH farvning af sektioner, der er mere end en måned gammel kan resultere i dårligere / inkonsekvent farvning.
Hvis væv eller coverlip ikke er helt fladt med hensyn til diaset, er prøven muligvis ikke i fokus på alle positioner i en flisescanning (Figur 3B), hvilket fører til spildt indsats og potentiel fotobleaching. Dette kan løses ved at tage mindre flise scanninger, hvor alle positioner er blevet verificeret at være i fokus. Afsnit med kedelige knive kan også føre til løsrivelse af slim og luminalt indhold, der fremstår som store mørke områder, mens billeddannelse. Endelig kan fordampningen af opløsningen eller boblerne under hybridiseringstrinnet føre til ujævn farvning af FISH-sonderne i vævet.
Et andet kritisk parameter, der påvirker effektiviteten af FISH-sondebindingen, er konkurrencen mellem forskellige sonder. En nyttig kontrol for at kontrollere, at FISH-sonden mærker bakterier, er at undersøge colocalization af signalet fra FISH-sonden med DAPI (Figur 2C, D). I prøver, der kræver brug af flere rRNA-sonder, bliver justering af parametre som hybridiseringstemperatur, sondekoncentration og formamid afgørende for at sikre, at sonderne binder sig effektivt til de korrekte arter18.
Bemærkninger om billedbehandling
FISH-farvede bakterier visualiseres bedst ved hjælp af et konfokalt mikroskop og et mål på mindst 40x forstørrelse. Mens 63x forstørrelse foretrækkes frem for billedbakterier på enkeltcelleniveau, kan 40x forstørrelse også bruges ved at maksimere den digitale zoom eller anvende et superopløsningssystem. Systemer udstyret med super-opløsning kapaciteter kan også give sub-cellulær opløsning af de enkelte bakterieceller. Lavere forstørrelse mål kan udnyttes til at få en generel følelse af bakteriel lokalisering og slim tykkelse.
Erhvervelse af 16-bit billeder i stedet for 8-bit billeder anbefales også stærkt, da det højere dynamikområde vil bidrage til at fange den brede vifte af DAPI-signalet fra de ekstremt lyse kerner af epitelet og det relativt svage signal om lysende bakterier. Bortset fra at bruge billeddannelse setup beskrevet ovenfor, en vigtig billedbehandling overvejelse er valget af fluorophores. For at opnå den bedste adskillelse mellem bakterietyper skal du sikre dig, at de anvendte fluorheste ikke overlapper hinanden i excitation og emissionsspektre (medmindre billeddannelse på et system med evnen til at udføre lineær ubblanding). Derudover kan sonder bruges i kombination (f.eks. kombinationen af en familiespecifik sonde og en slægtsspecifik sonde) til at identificere yderligere communitymedlemmer. Hvis du bruger lineære ublandet eller ugyldige sonder, er det vigtigt at teste nøjagtigheden og niveauet af FISH farvning på rene kulturer8,14.
Når billederne er indsamlet, flere værktøjer er tilgængelige for den kvantitative analyse af værten-mikrobiota interface, såsom BacSpace26, HiPR-FISH8, og andre segmentering værktøjer27. BacSpace er en MATLAB-software, der gør det muligt at segmentere vævs- og luminalkomponenterne og fjerne plantemateriale fra images26. Programmet giver også analyse af slim tykkelse i 2D og kvantificering af rumlige fordeling baseret på pixel afstande i forskellige kanaler26. Omvendt tillader HiPR-FISH Image Analysis-softwaren segmentering af FISH-farvede celler8. Endelig kunne andre bakterielle segmenteringsværktøjer, der er optimeret til in vitro-eksperimenter27, også tilpasses denne applikation.
Konklusion
In situ imaging muliggør kvantitativ analyse af individuelle mikrobielle taxa i forbindelse med andre medlemmer af samfundet og de forskellige mikromiljø skabt af kost, slim, og vært epitel krypter. Samspillet mellem organismer dikterer biologien af værtsrelaterede mikrobielle systemer og giver en væsentlig analyse af ændringer i disse strukturer under forstyrrelser, der har konsekvenser for helbredet. Især giver evnen til at afbilde mikrobiota in situ gennem protokollen beskrevet ovenfor et utroligt vindue ind i mikrobiotaens biogeografi i forhold til dyreværten.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Dr. Kristen Earle for uvurderlig teknik udvikling, Amber Hann for fejlfinding hjælp, Dr. Jen Nguyen og Deanna Pepin for kritisk gennemgang af manuskriptet, og Dr. Hesham Soliman og Rossi lab på University of British Columbia for at give mikroskop adgang. Forfatterne anerkender støtte fra CIHR Team Grant: Canadian Microbiome Initiative 2 (C.T.), Crohns og Colitis Canada (til C.T. og K.M.N.), CIFAR (til C.T. og K.M.N.), Michael Smith Foundation for Health Research Scholar Award (til C.T.), Weston Foundation: Weston Family Microbiome Initiative (til C.T.), Paul Allen Distinguished Investigator Award (til C.T.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum foil | |||
| Chloroform | Fisher | C298-500 | Toxic |
| Coplin jar | Fisher | 08-813E | |
| Cover glass, 22 × 22 mm, no #1 | VWR | CA48366-227-1 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Resuspended to 5 mg/mL |
| Empty pipette tip box(es) | To melt paraffin | ||
| Ethanol, anhydrous, molecular grade | -- | -- | |
| FISH probes | |||
| FISH hybridization solution | -- | -- | 20 mM Tris–HCl pH 7.4, 0.9 M NaCl, 0.01% (w/v) SDS in nuclease-free water. Optional addition of 5–50% (v/v) formamide |
| FISH washing buffer | -- | -- | 20 mM Tris–HCl pH 7.4, 0.9 M NaCl |
| Fluorescently-labeled Ulex Europaeus Agglutinin (UEA-1) lectin | Vector Laboratories | FL-1061 (Fluorescein-labeled) or RL-1062-2 (Rhodamine-labeled) | UEA-1 labels fucosylated glycans, so it is not appropriate for germ-free mice or for samples from fucosyltransferase 2 (FUT2)-deficient hosts. |
| Forceps | |||
| Formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | |
| Fumehood | |||
| Glacial Acetic Acid | Fisher | A38-212 | Corrosive and flammable |
| HybriSlip flexible plastic cover slips, 22 x 22 mm × 0.25 mm | Sigma Aldrich | GBL722222 | for FISH hybridization steps, can substitute glass coverslips |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Kimwipes | |||
| Methanol | Fisher | A412 | Toxic and flammable |
| Microtome | for sectioning | ||
| Multipurpose Specimen Storage Containers, 473 mL | Fisher | 14-955-117A | Can substitute with a glass or polyethylene container of your choice. Methacarn is not compatible with polystyrene or metal. |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | Any nail polish should work |
| Oven | Necessary range: 45-60 °C | ||
| Paraffin: Leica Paraplast | Leica | 39601006 | |
| PBS, Phosphate-buffered Saline (10x solution) | Fisher | BP3991 | Dilute to 1x for protocol |
| Sodium chloride | Fisher | S271 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), 20% Solution, RNase-free | Invitrogen | AM9820 | |
| Tissue-Loc HistoScreen Cassettes | Thermo Scientific | CA83009-999 | |
| Trizma hydrochloride solution, 1M Tris-HCl, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2663-1L | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Water, nuclease-free | Fisher | BP2484100 | |
| Xylenes | Fisher | X3P-1GAL | Toxic and flammable |
References
- Tropini, C., Earle, K. A., Huang, K. C., Sonnenburg, J. L. The gut microbiome: connecting spatial organization to function. Cell Host and Microbe. 21 (4), 433-442 (2017).
- Hansson, G. C., Johansson, M. E. V. The inner of the two Muc2 mucin-dependent mucus layers in colon is devoid of bacteria. Gut Microbes. 1 (1), 51-54 (2010).
- Johansson, M. E. V., et al. Normalization of host intestinal mucus layers requires long-term microbial colonization. Cell Host and Microbe. 18 (5), 582-592 (2015).
- Jakobsson, H. E., et al. The composition of the gut microbiota shapes the colon mucus barrier. EMBO Reports. 16 (2), 164-177 (2015).
- Tropini, C., et al. Transient osmotic perturbation causes long-term alteration to the aut microbiota. Cell. 173 (7), 1742-1754 (2018).
- Desai, M. S., et al. A dietary fiber-deprived gut microbiota degrades the colonic mucus barrier and enhances pathogen susceptibility. Cell. 167 (5), 1339-1353 (2016).
- Ng, K. M., et al. Recovery of the gut microbiota after antibiotics depends on host diet, community context, and environmental reservoirs. Cell Host and Microbe. 26 (5), 650-665 (2019).
- Shi, H., et al. Highly multiplexed spatial mapping of microbial communities. Nature. 588 (7839), 676-681 (2020).
- Johansson, M. E. V., Hansson, G. C. Preservation of mucus in histological sections, immunostaining of mucins in fixed tissue, and localization of bacteria with FISH. Methods in Molecular Biology. 842, 229-235 (2012).
- Greuter, D., Loy, A., Horn, M., Rattei, T. ProbeBase-an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes and primers: New features 2016. Nucleic Acids Research. 44 (1), 586-589 (2016).
- Quast, C., et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: Improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Research. 41 (1), 590-596 (2013).
- Beliveau, B. J., et al. OligoMiner provides a rapid, flexible environment for the design of genome-scale oligonucleotide in situ hybridization probes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2183-2192 (2018).
- Madeira, F., et al. The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019. Nucleic Acids Research. 47 (1), 636-641 (2019).
- Welch, J. L. M., Hasegawa, Y., McNulty, N. P., Gordon, J. I., Borisy, G. G. Spatial organization of a model 15-member human gut microbiota established in gnotobiotic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (43), 9105-9114 (2017).
- Lagkouvardos, I., et al. Sequence and cultivation study of Muribaculaceae reveals novel species, host preference, and functional potential of this yet undescribed family. Microbiome. 7 (1), 28 (2019).
- Zadeh, J. N., et al. NUPACK: Analysis and design of nucleic acid systems. Journal of Computational Chemistry. 32 (1), 170-173 (2011).
- Yilmaz, L. S., Parnerkar, S., Noguera, D. R. MathFISH, a web tool that uses thermodynamics-based mathematical models for in silico evaluation of oligonucleotide probes for fluorescence in situ hybridization. Applied and Environmental Microbiology. 77 (3), 1118-1122 (2011).
- Huber, D., Voith von Voithenberg, L., Kaigala, G. V. Fluorescence in situ hybridization (FISH): History, limitations and what to expect from micro-scale FISH. Micro and Nano Engineering. 1, 15-24 (2018).
- Wang, Y., et al. Laser capture microdissection and metagenomic analysis of intact mucosa-associated microbial communities of human colon. Applied Microbiology and Biotechnology. 88 (6), 1333-1342 (2010).
- Geva-Zatorsky, N., et al. In vivo imaging and tracking of host–microbiota interactions via metabolic labeling of gut anaerobic bacteria. Nature medicine. 21 (9), 1091-1100 (2015).
- Jemielita, M., et al. Spatial and temporal features of the growth of a bacterial species colonizing the zebrafish gut. mBio. 5 (6), 01751 (2014).
- Hasegawa, Y., Mark Welch, J. L., Rossetti, B. J., Borisy, G. G. Preservation of three-dimensional spatial structure in the gut microbiome. PLoS ONE. 12 (11), 0188257 (2017).
- Zhanmu, O., et al. Maintenance of fluorescence during paraffin embedding of fluorescent protein-labeled specimens. Frontiers in Neuroscience. 13, 752 (2019).
- Bergstrom, K., et al. Proximal colon-derived O-glycosylated mucus encapsulates and modulates the microbiota. Science. 370 (6515), 467-472 (2020).
- Jones, M. V., Calabresi, P. A. Agar-gelatin for embedding tissues prior to paraffin processing. BioTechniques. 42 (5), 569-570 (2007).
- Earle, K. A., et al. Quantitative imaging of gut microbiota spatial organization. Cell Host and Microbe. 18 (4), 478-488 (2015).
- Jeckel, H., Drescher, K. Advances and opportunities in image analysis of bacterial cells and communities. FEMS Microbiology Reviews. , (2020).
