Summary
Denne strømlinjeformede protokollen beskriver en arbeidsflyt for å oppdage og bildebakterier i komplekse vevsprøver, fra å fikse vevet til farging av mikrober med fluorescerende in situ hybridisering.
Abstract
Måling av lokalisering av mikrober i deres in vivo-kontekst er et viktig skritt i å avsløre de funksjonelle forholdene mellom mikrobiota og virveldyr tarmen. Det romlige landskapet i tarmmikrobiota er tett kontrollert av fysiske egenskaper - tarmslim, krypter og folder - og påvirkes av vertskontrollerte egenskaper som pH, oksygentilgjengelighet og immunfaktorer. Disse egenskapene begrenser evnen til både commensale mikrober og patogener til å kolonisere tarmen stabilt. I mikron-skala bestemmer mikrobiell organisasjon nærområdet interaksjoner mellom forskjellige mikrober, samt samspillet mellom mikrober og deres vert. Disse interaksjonene påvirker deretter storskala organfunksjon og vertshelse.
Denne protokollen muliggjør visualisering av tarmmikrobiota romlig organisering fra avstander mellom celler til organomfattende skalaer. Metoden er basert på å fikse tarmvev samtidig som tarmstruktur og slimegenskaper bevares. De faste prøvene blir deretter innebygd, seksjonert og farget for å markere spesifikke bakteriearter gjennom fluorescens in situ hybridisering (FISH). Vertsfunksjoner, for eksempel slim og vertscellekomponenter, er merket med fluorescerende merkede lectins. Til slutt er de fargede delene avbildet ved hjelp av et konfokalt mikroskop ved hjelp av flisskanningsavbildning ved høy forstørrelse for å bygge bro mellom mikron og centimeter lengdeskalaer. Denne typen avbildning kan brukes på tarmseksjoner fra dyremodeller og biopsier fra humant vev for å bestemme mikrobiotaens biogeografi i tarmen i helse og sykdom.
Introduction
Mikrobielle visualiseringsteknikker har opprinnelse som er like gamle som mikrobiologi selv, da Antonie Van Leeuwenhoek brukte mikroskopet sitt til å observere bakterier (som han kalte "animalcules") fra tannplakk og avføring på 1600-tallet. Siden da har mange teknikker blitt utviklet for å visualisere den romlige organiseringen av konsortiet av bakterier, sopp og virus som lever forbundet med en vert-mikrobiota1. Å belyse lokaliseringen av disse mikrober er viktig for å bestemme deres funksjon i deres dyrevert. Biogeografien til bakterier er viktig i både commensal og patogen taxa, som nærhet til bestemte steder (f.eks. epitelet), ernæringsmessige substrater og spesifikke mikrober kan diktere bakteriell produksjon av metabolitter underliggende interarter og inter-kingdom interaksjoner.
En nøkkelstruktur som skiller bakterier og vertsvevet på flere forskjellige kroppssteder, for eksempel munnhulen, tarmen eller lungen, er slimet - et vertsprodusert lag som begge forhindrer mikrobiell translokasjon på vertsepiteringscellene og fungerer som en ernæringsmessig ressurs for mikrobiota2,3,4 . Karakterisering av brudd og endringer i denne barrieren er av avgjørende betydning, noe som fører til mekanistisk innsikt i vertsmikrobiotainteraksjoner som ikke ville bli oppnådd ved sekvensering alene5,6,7. For eksempel aktiverte avbildning oppdagelsen av at antibiotikaeksponering kan forstyrre slimlaget og mikrobiotaorganisasjonen7,8, og at avføringsmidler kan tømme slimet, korrelere med store endringer i immunparametere5.
Denne protokollen skisserer et generelt rammeverk for å fikse, fargelegge og avbilde mikrobiota og vertsvevet (figur 1), bygget på arbeidet til Johansson og Hansson9. Mens denne protokollen er modellert i sammenheng med tarmseksjoner, kan den lett tilpasses andre vevstyper. Denne protokollen muliggjør behandling av enten eksperimentelle dyr eller menneskelige kliniske prøver; notater for behandling av begge typer prøver er inkludert. I eksemplet som presenteres her, har vertsepitelet og luminalbakteriene samtidig blitt merket med 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) farging, slim med fluorescein (FITC)-konjugert lectin, Ulex europaeus agglutinin I (UEA-1), og en spesifikk bakteriell takson ved hjelp av FISK. FISH-sonder er vanligvis designet mot en taksonons 16S rRNA-gener for å sikre det høye signalet fra å binde en høykopiert transkripsjon.
I dette eksemplet retter sonden seg mot 16S rRNA i Muribaculaceae bakteriefamilien (figur 2). Flekkene erstattes imidlertid lett med forskjellige FISH-sonder og/eller lectins for å imøtekomme det aktuelle biologiske spørsmålet. Tidligere validerte FISH-sonder finnes på ProbeBase10, en online ressurs for rRNA-målrettede oligonukleotidprober, eller på SILVA11, en ribosomal RNA-database. For utforming av nye sonder kan leseren referere til nye rørledninger som HiPR-FISH8 eller Oligominer12. Ved hjelp av denne protokollen er det mulig å observere tett pakking av bakterier i tarmlumen og de forskjellige egenskapene til tarmslim i fordøyelseskanalen. Arbeidsflyten som er beskrevet her, muliggjør kvantitativ analyse av mikrobiota i den romlige konteksten til vertsmiljøet.
Protocol
Alle dyreforsøk og vevsinnsamling som er beskrevet i denne protokollen, ble utført i samsvar med retningslinjene fra Canadian Council on Animal Care (CCAC) og ble godkjent av Animal Care Committee ved University of British Columbia. Bakteriefrie sveitsiske Webster-mus ble brukt. Alle dyrene var 8-10 uker gamle, begge kjønn ble brukt, og alle mus ble co-housed med minst to mus per bur. Dyr ble euthanized ved hjelp av karbondioksid med sekundær cervical dislokasjon eller hjerte punktering.
1. Utforme et bildeeksperiment: hensyn og prøveinnsamling
- DESIGN AV FISH-sonde
- Hvis det finnes en passende FISH-sonde, velger du en eksisterende publisert som viser et sterkt signal i merkede celler sammenlignet med bakgrunnen.
- Valider nye sonder in vitro for å bestemme effektiviteten av binding til faste prøver av målbakteriene og off-target binding til andre bakterier.
- Kontroller alle 16S FISH-sonder som skal brukes mot 16S-sekvenser fra målorganismen eller mot 16S rRNA-sekvensering fra prøvene som skal analyseres for å sikre at den forventede andelen positive treff er til stede, og at sonder ikke vil binde seg spesifikt til andre mikrobiotamedlemmer.
- Juster FISH-sondene mot sekvenser i full lengde eller amplikonsekvensvarianter ved hjelp av et verktøy, for eksempel Clustal Omega13, for å evaluere den potensielle bindingen av sonder og deres mål.
- I tillegg til i silicotesting, test nøyaktigheten og nivået av FISKEfarging av validerte sonder på rene kulturer8,14.
MERK: Ved farging av flere medlemmer av fellesskapet kan sonder brukes kombinatorisk (f.eks. kombinasjonen av en familiespesifikt sonde og en slektsspesifikk sonde) hvis fluoroforene som brukes ikke overlapper i eksitasjons- og utslippsspektra (med mindre avbildning på et system med evnen til å utføre lineær unmixing). I tillegg kan spesifisitet demonstreres ved å inkludere spesifisitetskontroller /krypterte sonder eller ved konkurranse med ikke-fluorescerende sonder.
- Prøvetyper og vevsinnsamling
- Bruk skarpe og rene verktøy, kutt tarmsegmenter fra gnotobiotiske sveitsiske Webster-mus for avbildning. Reduser forstyrrende prøven så mye som mulig, og håndter inndelingene etter kantene for å unngå å påvirke bildeområdet. Reparer prøven så snart som mulig etter avhandlingen for å forhindre nedbrytning.
MERK: For dyrestudier foretrekkes intakte, uflushed tarmseksjoner; membranen vil bidra til å holde luminal og mucosal organisasjon intakt. - Rengjør verktøy ved å tørke dem med 70% etanol mellom prøver og steder. Få minst tre biologiske repliker per intestinal seksjon / biopsi plassering, pass på å prøve konsekvente tarmplasseringer, som slim og tarmarkitektur samt mikrobiota endres betydelig på forskjellige steder.
- Bruk skarpe og rene verktøy, kutt tarmsegmenter fra gnotobiotiske sveitsiske Webster-mus for avbildning. Reduser forstyrrende prøven så mye som mulig, og håndter inndelingene etter kantene for å unngå å påvirke bildeområdet. Reparer prøven så snart som mulig etter avhandlingen for å forhindre nedbrytning.
2. Vevsprøvefiksering og infiltrasjon
- Fiksering
- Forbered fersk methacarn i en kompatibel beholder med følgende forhold: 60% absolutt metanol, 30% kloroform og 10% glasial eddiksyre. Dispenser hvert av disse kjemikaliene i en avtrekkshette. Velg en beholder som kan ventileres ved å åpne lokket. Siden methacarn ikke er kompatibel med polystyren, lag den i en polyetylenbeholder, ved hjelp av glassutdannede sylindere / serologiske pipetter for kloroform og issyre.
MERK: Under blandingen produseres røyk og kan føre til at trykket bygger seg opp inne i beholderen. Det anbefales å holde beholderen relativt tett lukket når den er fjernet fra avtrekkshetten hvis prøver ikke legges aktivt til. Kloroform er giftig; Ikke inhaler, svelg eller absorber gjennom huden. Metanol er giftig og svært brannfarlig; Ikke inhaler, svelg eller absorber gjennom huden. Glasial eddiksyre er brannfarlig og svært korrosiv mot huden og øynene. - Etter dispensering, lukk beholderen, virvle for å blande og deretter ventilere; gjenta dette til off-gassing har stoppet (og trykket bygger seg ikke lenger opp merkbart under lokket).
MERK: Ikke kast methacarn i avløp; innsamling og avhending som farlig kjemisk avfall i henhold til institusjonelle retningslinjer. Bruk en blyant for merking av histologikassetter, da mange penneblekk vil komme av i methacarn-løsningen. - Plasser tarmseksjonene i histologikassetter ved å holde en kant av vevet delikat med pinsett. Lukk kassetten og senk den helt ned i fersk methacarn-løsning. Påse at oppløsningen ikke er eldre enn noen få timer ved nedsenking av kassettene.
- For kliniske prøver som vil bli samlet inn i en klinisk suite uten tilgang til en avtrekkshette, bruk en polyetylenlagringsbeholder med en klaff kuttet i lokket som vil tillate passasje av histologikassettene. Tape denne klaffen lukket når du ikke passerer prøver for å forhindre rømming av giftige røyk.
MERK: Det er viktig å bruke maskeringstape for å unngå oppløsning av lim på beholderen - noen typer tape (f.eks. plastemballasje) holder kanskje ikke godt fast i methacarn-røyken. - Fiks prøver i minst 3 timer og maksimalt to uker.
MERK: Tykkere prøver kan kreve fikseringstider som er lengre enn 3 timer. Fikseringstid kan velges for å muliggjøre samtidig parafininfiltrasjonsbehandling for kassetter som er festet i forskjellige methacarn-løsninger (f.eks. for samtidig å utføre parafininfiltrasjon på grupper av prøver samlet inn og festet over to uker).
- Forbered fersk methacarn i en kompatibel beholder med følgende forhold: 60% absolutt metanol, 30% kloroform og 10% glasial eddiksyre. Dispenser hvert av disse kjemikaliene i en avtrekkshette. Velg en beholder som kan ventileres ved å åpne lokket. Siden methacarn ikke er kompatibel med polystyren, lag den i en polyetylenbeholder, ved hjelp av glassutdannede sylindere / serologiske pipetter for kloroform og issyre.
- Parafininfiltrasjon og innebygging
- Legg parafinen i en varmebestandig beholder og smelt den i en ovn ved 60 °C over natten. Etter hvert som parafinpellets tar mer plass før smelting, må du sørge for at tilstrekkelig parafin smelter for å dekke alle kassettene.
MERK: Temperaturen bør ikke være høyere enn 60 °C, da den kan gi opphav til artefakter. - Vask vevet ved å helle ut væsken i riktig avfallsbeholder og erstatte den umiddelbart med følgende kjemikalier.
- Inkuber i absolutt metanol i 30 min. Gjenta en gang.
- Inkuber i absolutt etanol i 20 min. Gjenta én gang.
- Inkuber i xylenes i 15 min. Gjenta en gang.
- Bytt ut vaskene raskt, pass på at du ikke lar kassettene tørke. Påse at hver vask dekker kassettene helt i begeret eller beholderen.
MERK: Xylener er brannfarlige, og ved innånding kan dampene trykke ned sentralnervesystemet med potensielle langsiktige nevrologiske konsekvenser ved eksponering for høye konsentrasjoner (>200 ppm). Håndter xylenes bare i en avtrekkshette. Siden xylener er farlige, må du passe på å bruke minimumsmengden som er nødvendig for å dekke de histologiske kassettene.
- Under innebyggingen orienterer du tarmsegmentene parallelt med lengden på kassetten (i motsetning til oppreist) ved hjelp av pinsett for å gi langsgående, tverrgående seksjoner i stedet for tverrsnittsdeignøtter for å gi mer potensielt prøveområde for kvantitativ avbildning (figur 1B).
- Åpne kassettene litt (~1-2 cm eller 0,5 tommer) slik at parafinen kan komme inn uten å miste vevssegmentene. Bruk doble hansker for dette trinnet eller pinsett for å forhindre overoppheting eller mild brenning av fingrene. Senk og lukk kassettene i beholderen med smeltet parafin, og legg beholderen tilbake i 60 °C ovnen. Påse at kassettene er fylt med parafin, og at det ikke gjenstår store luftbobler.
- Etter inkubasjon i 2 timer ved 60 °C, fjern beholderen fra ovnen. Bruk tang, fjern kassettene forsiktig og legg dem individuelt på et stykke aluminiumsfolie for å avkjøle. Oppbevar dem ved romtemperatur til de er klare for innbygging og seksjonering.
- Del parafinblokkene med en mikrotom, seksjoner dypt nok inn i blokken at luminalt innhold blir eksponert, noe som muliggjør en langsgående del av villi og / eller krypter i tillegg til lysende innhold og slim. Pass på å erstatte bladene som fekalt materiale sløver bladet raskt sammenlignet med vev. Klipp ut inndelinger til 4 μm tykkelse for optimal skarphet i bildene. Overfør delene til vanlige ubestrøket lysbilder.
- For FISKEfarging, flekk tarmseksjonene så snart som mulig (dvs. innen få uker etter seksjonering) for å oppnå et sterkt FISKE-signal. Ved utelatelse av FISKEfarging kan lectin + DAPI-farging utføres på mindre ferske (dvs. måneder gamle) prøver uten betydelig tap av signal.
- Legg parafinen i en varmebestandig beholder og smelt den i en ovn ved 60 °C over natten. Etter hvert som parafinpellets tar mer plass før smelting, må du sørge for at tilstrekkelig parafin smelter for å dekke alle kassettene.
3. Flekker bakterier og vertsfunksjoner
- Forberedelse
- Varm ovnen til 60 °C. Forvarm en tom Coplin krukke og nok volum til å dekke glasssklier i krukken to ganger med xylenes i en glassflaske, pass på å parafilm rundt lokket for å forhindre fordampning av xylenes. La temperaturen på xylenene nå 60 °C.
MERK: En standard Coplin-krukke passer til 8 lysbilder, og lysbildene kan dekkes med omtrent 50 ml væske (kan variere mellom 40 og 60 ml avhengig av merket). Xylenerstatninger er mindre giftige og har blitt brukt av andre grupper for avvoksingstrinnet (trinn 3.2)8,9. - Hvis en separat ovn er tilgjengelig, forvarm en hybridiseringsovn til 50 °C. Ellers kan dette trinnet utføres med samme ovn som brukes til å bake lysbildene etter trinn 3.2.3.
- Forbered FISH hybridiseringsløsningen: 20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 0,9 M NaCl; 0,01%26 - 0,1%9 (w/v) natriumddecylsulfat (SDS) i nukleasefritt vann. Legg om nødvendig til 5-50% (v / v) formamid. Forvarm denne hybridiseringsløsningen ved 50 °C under de-paraffinisering.
MERK: Formamid er en amid som fungerer som en teratogen; håndtaksformamid med hansker og vernebriller. I små doser og ved eksponering for øyne, hud eller slimhinner er det irriterende. I store mengder kan formamidddamp kreve medisinsk inngrep. Formamid kan oppbevares ved 100% i en -20 °C fryser.
- Varm ovnen til 60 °C. Forvarm en tom Coplin krukke og nok volum til å dekke glasssklier i krukken to ganger med xylenes i en glassflaske, pass på å parafilm rundt lokket for å forhindre fordampning av xylenes. La temperaturen på xylenene nå 60 °C.
- Forbereder lysbildene for farging: deparaffinisering
- Plasser skliene i Coplin-kannen, sørg for at seksjonene ikke kommer i kontakt med andre lysbilder eller krukken, og stek lysbildene ved 60 °C i 10 minutter.
- I avtrekkshetten fyller du Coplin-krukken med forvarmede xylener fra ovnen, pass på at du ikke heller direkte på toppen av prøvene og potensielt løsner vevet. Sett Coplin-kannen tilbake i ovnen på 60 °C. La flasken stå med de resterende xylenene i avtrekkshetten.
- Hell de brukte xylenene i en riktig avfallsbeholder for avhending, pass på at du ikke forstyrrer vevsdelene på glasssklier og bruker et par tang for å forhindre at lysbildene faller ut av Coplin-krukken. Fyll opp Coplin-krukken med de resterende xylenene og inkuber i 10 minutter ved romtemperatur i avtrekkshetten.
- Inkuber seksjonene i 99,5% etanol i 5 min ved romtemperatur. Etter dette inkubasjonstrinnet fjerner du lysbildene fra Coplin-krukken, tørker baksiden av lysbildene på en laboratorieserviett eller papirhåndkle, og tørker kort til etanoldråpene er borte.
MERK: Hvis du tørker av baksiden av lysbildene, blir det bedre visualisering av tørkefremdriften.
- Bakteriell farging med FISK
- Bruk en væskeblokker eller PAP-penn for å begrense væskeutvidelsesområdet ved å sirkle rundt området for hver vevsdel. Pass på at blekket ikke kommer i kontakt med selve delen. Lag en sirkel så nær hver vevsseksjon som mulig uten å kontakte vevet for å minimere overflatearealet som må dekkes av hybridiseringsløsningen.
- Forbered hybridiseringsløsningen: For hver 50 μL for forvarmet hybridiseringsløsning, tilsett 0,5 μg sonde (f.eks. 0,5 μL 1 μg/μL sonde). Pipette hybridiseringsløsningen på delene på lysbildet (~20 μL/seksjon, avhengig av seksjon/sirkelstørrelse). Beskytt hybridiseringsløsningen og lysbildene mot lys fra dette punktet og fremover under inkubasjonstrinn og lagring.
- Påse at volumet av væske som brukes dekker hele delen ved overlegg med en fleksibel plastdekslerlip. Inkuber lysbildet i et fuktig kammer for å redusere fordampning. Lag et fuktig kammer med en pipettespissboks med våtservietter eller papirhåndklær nederst som har blitt gjennomvåt med overflødig hybridiseringsløsning eller fosfatbufret saltvann (PBS) for å gi fuktighet. Inkuber seksjonene ved 45-50 °C, avhengig av probesettet, i >3 timer.
- Varm opp FISH-vaskebufferen: 20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 0,9 M NaCl til 50 °C i inkubasjonsperioden. Forbered nok vaskebuffer til å dekke lysbildene i Coplin-krukken.
- Fjern plastdekslene; inkuber lysbildene i FISH vaskebuffer i en Coplin krukke, begge forvarmet til 50 °C. Sett Coplin-kannen tilbake i ovnen på 50 °C i 10–20 minutter. For tykke prøver, fjern dekslene i Coplin-krukken ved å legge til bufferen og forsiktig løsne dekslene for å unngå å smøre skiven.
- Farging av slim og vertsfunksjoner
- Forbered en generell DNA/slimteller i PBS: endelig 10 μg/ml DAPI + 40 μg/ml slimflekk UEA-1. Forbered nok tellere til å dekke flekkene i fravær av en dekslelip for å unngå å skade vev med ekstra deksler.
MERK: Å dekke flekkene i fravær av deksler vil kreve større volumer enn 20 μL som brukes i 3.3.2. For seksjoner i gjennomsnittlig størrelse (~ 10 mm diameter) er 200 μL nok til å dekke ett sted; test dette volumet på forhånd på et dummy lysbilde. - Fjern FISH-vaskebufferen og erstatt den med PBS i Coplin-krukken. Umiddelbart etter påfylling av Coplin-krukken med PBS, dekanterer du PBS.
- Fjern lysbildene fra kannen og pipette tellerne på toppen av delen samtidig som du sikrer å ikke berøre vevet med pipettespissen. Dekk hele delen med en boble. Inkuber ved 4 °C i 45 minutter i mørket.
- Vask flekkene 3 ganger raskt med fersk PBS: Mens du holder lysbildene på plass ved hjelp av pinsett, hell ut PBS i en vask og fyll umiddelbart på med fersk PBS.
- Tørking av baksiden av lysbildene mot en klut eller et papirhåndkle, la det meste av PBS fordampe av seksjonene, hjulpet av en vakuumlinje koblet til en pipettespiss. Unngå igjen å berøre delen med pipettespissen.
- Monter seksjonene ved hjelp av et monteringsmedium (uten DAPI) og la det stilles inn ved romtemperatur dekket av glassdeksler, og sørg for at dekslene er flate og at det ikke er luftbobler i monteringsmediet.
- Fest dekslene til lysbildet ved å male langs kantene på dekslene med klar neglelakk, pass på at du holder deg borte fra kanten av lysbildet for å sikre at lysbildet sitter jevnt i mikroskopets skyveholder under bildebehandling.
- Oppbevar skliene ved 4 °C i mørket i noen uker før fluorescensen er utarmet.
- Forbered en generell DNA/slimteller i PBS: endelig 10 μg/ml DAPI + 40 μg/ml slimflekk UEA-1. Forbered nok tellere til å dekke flekkene i fravær av en dekslelip for å unngå å skade vev med ekstra deksler.
4. Bilde- og bildeanalyse
- Visualisere flekkene
- Velg et område av vevet som inneholder både vev og lumen for å avbilde mikrobiota-vertgrensesnittet. For kvantitativ avbildning av slimtykkelse og lysende biogeografi, velg synsfelt der skivene i epitelet villi og/eller krypter er langsgående og ikke tverrsnitt. Unngå områder med store hull mellom slimet og epitelet for å unngå å seksjonere artefakter.
- Lokaliser vev og korriger fokusplanet ved hjelp av DAPI-signalet for lokalisering og fokusering for å unngå fotobleking av FISH fluorescenssignalet.
- Juster bildeinnstillingene. For å visualisere bakteriell DAPI-flekk, øk laserkraften og få til det punktet hvor DAPI-signalet fra epitelceller er overmettet eller "blåst ut".
MERK: Ikke overmett for mye, da dette vil føre til fotobleaching og visuelle artefakter i kjernene som ikke kan gjenopprettes. - For alle andre kanaler, bruk den minste mengden lasereffekt som vil gi et klart signal over bakgrunnen, og vær forsiktig så du ikke oversaturate.
MERK: Dette er spesielt viktig når du utfører flisskanning, da fotobleaching vil være problematisk når overlappingen mellom fliser er avbildet. - Bruk 40x eller høyere forstørrelse for å bilde individuelle bakterier.
- Skaff bildene.
- Innhente flisskanninger for å innhente kvantitative data om slimtykkelse og romlig fordeling av mikrober i lumen. Sørg for 15% overlapping mellom flisene og se etter vignettering / ujevn belysning, som kan forverres av <1x zoom. Når du setter opp en flisskanning, må du være oppmerksom på om vevet er i fokus i alle flisene, da uskarpe / ute av fokus bilder ikke kan analyseres (figur 3B).
- Hvis det er mulig, minimerer du antall fliser som trengs for å avbilde en gitt lengde på epitelet ved å rotere skanneområdet slik at epitel- og slimlaget er parallelt med flisen og ikke i vinkel. Ellers finner du en del av epitelet som er parallelt eller vinkelrett på bildeområdet for å oppnå en lignende effekt.
Representative Results
For å undersøke lokaliseringen av spesifikke tarmkommensale bakterier i musetarmen, ble bakteriefrie sveitsiske Webster-mus som hadde blitt kolonisert med individuelle bakterieisolasjoner, brukt i denne studien. For dette eksperimentet var bakterieartene merket i) en menneskelig isolasjon av Muribaculaceae-familien5, Muribaculum intestinale, en rikelig og utbredt familie av bakterier i murinmikrobiota15, samt ii) Bakteroider thetaiotaomicron, en genetisk gjennomførbar og vanlig tarmbakterie. Etter to uker med likevekt ble musene euthanized, og et segment av tykktarmen som inneholder en fekal pellet ble seksjonert og festet i nylaget methacarn. Etter to dager med fiksering ble seksjonene dehydrert ved behandling gjennom metanol, etanol og xylener, infiltrert med parafin, innebygd og deretter seksjonert til lysende 4 μm skiver. Disse prøvene ble deretter farget med en FISH-sonde (3' Cy3-merket) spesifikk for Muribaculum-isolasjonen, designet ved hjelp av Oligominer software12, og sjekket for sekundær og tertiær struktur og minimal ikke-spesifikk binding ved hjelp av NuPACK og mathFISH16,17. Prøvene ble også motarbeidet med rhodaminbundet lectin UEA-1 (som flekker fucosylerte glykaner i slim) og DAPI. De fargede delene ble avbildet ved hjelp av en 40x oljemål og superoppløsningsmodul.
Figur 1: Arbeidsflyt for visualisering av mikrobiota-vertsgrensesnittet i tarmen. (A) En illustrert arbeidsflyt for rørledningen. (B) De to seksjonsplanene vil gi enten tverrgående seksjoner (foretrukket for denne rørledningen) eller tverrsnitt "smultringer". (C) Innebygging av vev med svært forskjellige tykkelser kan resultere i skiver som bare er optimale for ett eller annet vev. Forkortelser: FISH = fluorescens in situ hybridisering; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Avbildning av tykktarmen viser lokaliseringen av Muribaculum intestinale i forhold til slim i en gnotobiotisk musemodell. Seksjonene ble farget med DAPI (blå), Muribaculaceae FISH-sonde (rød) og UEA-1 (grønn). (A) Distal kolon av mus monokolonisert med Muribaculum intestinale og (B) distal kolon av mus bikolonisert med Muribaculum intestinale og Bacteroides thetaiotaomicron. Skalastang = 20 μm. (C og D) Cy3-FISH (venstre), DAPI (midten) og kombinerte Cy3-FISH + DAPI-kanaler for henholdsvis luminal innfelte deler av (A) og (B). Skalastang = 5 μm. I (A) og (C) er alle bakterieformede og bakteriestore DAPI-signaler merket med Cy3 (enkle pilspisser), og i (B) og (D), i tillegg til disse Cy3- og DAPI-dobbeltpositive cellene (enkle pilspisser), er det DAPI-fargede bakterieceller som er Cy3-negative (doble pilspisser), som forventet for mono- og bikoloniseringstilstander. Med unntak av lengre filamentøse bakterier, større (>4 μm i lengde) DAPI-positive strukturer (stumpe piler) er plantemateriale eller kjerner fra vertsceller. Forkortelser: FISH = fluorescens in situ hybridisering; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Vanlige problemer. (A) Grunne seksjonering vil ikke gi lysskiver i tarmen. (Venstre) Et tarmsegment som har blitt seksjonert på en dybde som gir utsikt over lumen samt langsgående utsikt over epitelet. (Høyre) Et tarmsegment som har blitt seksjonert for grunt, avslører bare tverrsnitt av krypter og ingen konstant slimlag eller bakterier. (B) Ujevn vev/deksler kan føre til uklare og ujevnt opplyste flisskanninger. En flisskanning ble satt opp med posisjoner som var ute av fokus (øverste høyre hjørne). (C) Eksempel på normal bakgrunn (venstre) og høy bakgrunn (høyre). I dette eksemplet, for DAPI signal-note signalet som kommer fra epitelet, utenfor kjernen. Alle skalastenger = 20 μm. Forkortelse: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Protokollen beskrevet ovenfor gir en reproduserbar metode for å visualisere host-microbiota-grensesnittet. Disse analysene har hatt stor nytte av protokollutvikling, fra optimalisering av FISH-merking18 til slimbevaring og avbildning9. Fiksering og innebygging gir også nyttig lagring av prøver; Videre kan parafininfiltrerte kassetter sendes uten begrensninger, da prøvene er helt faste og inerte.
Betydning og alternative metoder
Kombinasjonen av FISK og slimfarging muliggjør analyse av mikrobiotasammensetning på bestemte vevssteder og samspillet mellom individuelle bakterier og verten. Alternative teknikker som involverer analyse av spesifikke steder i mikrobiota er vanligvis ikke i stand til å utforske encellet karakter av disse interaksjonene, for eksempel i tilfelle laserfangst mikrodeseksjon kombinert med sekvensering19. Sekvenseringsbaserte teknikker har imidlertid fordelen av å kunne fange den genetiske sminken av mikrobiota på et finere nivå og mer bredt enn 16S rRNA-sonder.
En fallgruve for protokollen som presenteres er at den gir et engangs øyeblikksbilde av mikrobiota i forhold til verten. For sanntidsavbildning hos levende dyr kreves det spesielle avbildningsteknikker for å lette oppkjøpet av et fluorescenssignal i dypt vev (f.eks. intravital tofotonmikroskopi og lysarkfluorescensmikroskopi20,21). I disse metodene er modellorganismen enten kolonisert med bakterier som er farget med molekyler som binder seg til deres konvolutt20 eller genetisk modifiserte bakterier som har fluorescerende proteiner21. I sistnevnte tilfelle er modning av fluorescensproteiner et sentralt problem, da de fleste standard fluorescerende proteiner krever oksygen for å avgi lys. Derfor er det nødvendig med modellorganismer som har minst nanaerobe miljøer (nanomolar konsentrasjon av oksygen), for eksempel den aerobe sebrafisken gut21.
I denne protokollen brukes metanol-Carnoy som et fikseringsmiddel i stedet for paraformaldehyd eller formalin fordi det ikke inneholder vann. Dette forhindrer hydrering, dehydrering og kollaps av slimlaget under behandling og letter nøyaktige målinger av slimtykkelse. Mens methacarn fiksering og parafin innebygging har blitt en standard i feltet, har forskjellige fikseringer og innebyggingsteknikker blitt undersøkt for å optimalisere slimbevaring9,22, med noen studier som indikerer at harpikser kan være bedre enn parafin innebygging22. En annen viktig begrensning for parafininnbygging og methacarnfiksering er tapet av fluorescence proteinfluorescens, som kan unngås ved å bruke alternative fikseringer (f.eks. formalin eller paraformaldehyd (PFA)) eller modifiserte innebyggingsteknikker23. Hvert rettingsmiddel har fordeler og ulemper, og valget av fixative avhenger av bildebehandlingsprioritetene. Bildemodaliteter kan kombineres hvis biologiske replikeringer er festet i enten PFA og methacarn og bilder er hentet fra begge prøvene.
FISK har blitt kombinert med immunfluorescens i isolerte tilfeller med spesifikke anti-Muc2C3 kaninpolyklonale antistoffer9,24. Disse resultatene har ikke blitt mye reprodusert med andre Muc2 antistoffer, noe som indikerer at valget av antistoffer kan være kritisk i suksessen til FISH-immunfluorescence kombinasjonen. Vilkårene for vellykket antistofffarging for et gitt antistoff tillater kanskje ikke oppbevaring av FISKEfarging.
Feilsøking
I denne protokollen representerer utvalgssamling, inndeling og farging kritiske trinn for å forhindre oppretting av bildeartefakter. For eksempel kan trykking på vevet ved innsamling og før innebygging føre til feilfordeling av mikrobiota og påvirke slimkvaliteten. Et annet viktig hensyn er å unngå å kombinere segmenter av svært forskjellige tykkelser i en enkelt kassett, for eksempel et relativt tomt stykke tynntarmen og en pellets i den distale tykktarmen. De forskjellige tykkelsene fører til vanskeligheter med avbildning: Etter innebygging kan tverrsnitt på en bestemt dybde for ett segment være på feil dybde for avbildning for det andre (f.eks. vil lumen være på forskjellige dybder for hvert vev) (figur 1B, C og figur 3A). Videre, for avbildning av dyremodellstolpellets, kan de pakkes inn i bukhinnemembran24. I denne teknikken brettes en liten del av nyisolert bukhinne forsiktig rundt avføringen og bevarer pelletsstrukturen under vasketrinnene som er skissert i protokollen.
I motsetning til behandling av dyrevev med innhold, gir avbildning av menneskelige tarmprøver noen utfordringer. Spesielt vil luminalt innhold og slimhinneforing sannsynligvis bli forstyrret av koloskopi tarmpreparatet som vanligvis utføres før tarmbiopsier eller reseksjonsprosedyrer. I tillegg, når biopsier samles inn, er det nyttig å merke seg vevsorienteringen for å hjelpe til med å identifisere spesifikke egenskaper (f.eks. lumen vs. submucosa) i fravær av tarminnhold. Pre-embedding med 3% agar og / eller agar: gelatin blandinger kan være nyttig for å opprettholde vev polaritet25; Det er imidlertid problemer med dehydrering og seksjonering av agar, som rapportert i litteraturen, og behandlingstidene må kanskje endres.
Et sentralt aspekt ved å oppnå god FISKEfarging kommer ved å justere formamidkonsentrasjonen for spesifikke FISKE-sonder. Formamid vil kontrollere hybridiseringsstrengen til FISH-sonder til sine mål. Det er viktig å sikre at a) riktig formamidkonsentrasjon er valgt for farging av et gitt samfunn, og b) at en passende formamidkonsentrasjon til og med er mulig for sondekombinasjonen som brukes - dette kan påvirke det optimale sondevalget når du bruker flere sonder. Nettsteder som mathFISH (http://mathfish.cee.wisc.edu/) kan hjelpe deg med å beregne de riktige formamidkonsentrasjonene for en gitt sonde. I mangel av informasjon om passende formamidkonsentrasjoner, kan denne protokollen testes med 0% og 10% formamid.
Seksjonering av de innebygde prøvene krever at blokken kuttes til tilstrekkelig dybde for å oppnå lysstykker, da det å dele for grunt inn i en blokk vil resultere i en tverrsnittsvisning av villi/krypter uten lystetthet (figur 3A). Flekk prøvene kort tid etter seksjonering for optimalt FISH-signal, og bruk fersk DAPI (eller DAPI lagret ved -20 °C) for å løse bakgrunnsproblemer (figur 3C). FISKEfarging av seksjoner som er mer enn en måned gammel, kan føre til dårligere/inkonsekvent farging.
Hvis vevet eller dekslene ikke er helt flate med hensyn til lysbildet, kan det hende at prøven ikke er i fokus i alle posisjoner i en flisskanning (figur 3B), noe som fører til bortkastet innsats og potensiell fotobleking. Dette kan løses ved å ta mindre flisskanninger der alle posisjoner er verifisert for å være i fokus. Seksjonering med kjedelige kniver kan også føre til løsrivelse av slim og lysende innhold, som vises som store mørke områder under avbildning. Til slutt kan fordampning av løsningen eller boblene under hybridiseringstrinnet føre til ujevn farging av FISH-sondene i vevet.
En annen kritisk parameter som påvirker effektiviteten til FISH-sondebindingen er konkurransen mellom ulike sonder. En nyttig kontroll for å verifisere at FISH-sonden merker bakterier er å undersøke colokaliseringen av signalet fra FISH-sonden med DAPI (figur 2C, D). I prøver som krever bruk av flere rRNA-sonder, blir justering av parametere som hybridiseringstemperatur, sondekonsentrasjon og formamid avgjørende for å sikre at sondene er bindende for de riktige artene effektivt18.
Merknader om avbildning
FISK-fargede bakterier visualiseres best ved hjelp av et konfokalt mikroskop og et mål om minst 40x forstørrelse. Mens 63x forstørrelse foretrekkes fremfor bildebakterier på enkeltcellenivå, kan 40x forstørrelse også brukes ved å maksimere den digitale zoomen eller bruke et superoppløsningssystem. Systemer utstyrt med superoppløsningsfunksjoner kan også gi sub-cellulær oppløsning av individuelle bakterieceller. Lavere forstørrelsesmål kan brukes for å få en generell følelse av bakteriell lokalisering og slimtykkelse.
Det anbefales også å anskaffe 16-biters bilder i stedet for 8-biters bilder, da det høyere dynamiske området vil bidra til å fange det brede spekteret av DAPI-signalet fra de ekstremt lyse kjernene i epitelet og det relativt svake signalet om lysbakterier. Bortsett fra å bruke bildeoppsettet beskrevet ovenfor, er en viktig bildebehandlingshensyn valget av fluoroforer. For best mulig separasjon mellom bakterielle typer, sørg for at fluoroforene som brukes ikke overlapper i eksitasjons- og utslippsspektra (med mindre avbildning på et system med evnen til å utføre lineær unmixing). I tillegg kan sonder brukes i kombinasjon (f.eks. kombinasjonen av en familiespesifikk sonde og en slektsspesifikk sonde) for å identifisere flere medlemmer av fellesskapet. Ved bruk av lineære, miksende eller validerte sonder er det viktig å teste nøyaktigheten og nivået av FISKEfarging på rene kulturer8,14.
Når bildene er samlet inn, er flere verktøy tilgjengelige for kvantitativ analyse av vertsmikrobiota-grensesnittet, for eksempel BacSpace26, HiPR-FISH8 og andre segmenteringsverktøy27. BacSpace er en MATLAB programvare som tillater segmentering av vev og luminal komponenter og fjerning av plantemateriale fra bilder26. Programmet gir også analyse av slimtykkelse i 2D og kvantifisering av romlig fordeling basert på pikselavstander i forskjellige kanaler26. På den annen side tillater HiPR-FISH Image Analysis-programvaren segmentering av FISH-fargede celler8. Til slutt kan andre bakteriesegmenteringsverktøy som er optimalisert for in vitro-eksperimenter27 også tilpasses denne applikasjonen.
Konklusjon
In situ imaging muliggjør kvantitativ analyse av individuell mikrobiell taxa i sammenheng med andre samfunnsmedlemmer og de ulike mikromiljøete skapt av kosthold, slim og vert epitelkrypter. Samspillet mellom organismer dikterer biologien til vertsrelaterte mikrobielle systemer og gir en viktig analyse av endring i disse strukturene under perturbasjon som har implikasjoner for helsen. Spesielt gir evnen til å avbilde mikrobiota in situ gjennom protokollen beskrevet ovenfor et utrolig vindu inn i mikrobiotaens biogeografi i forhold til dyreverten.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne vil takke Dr. Kristen Earle for uvurderlig teknikkutvikling, Amber Hann for feilsøkingshjelp, Dr. Jen Nguyen og Deanna Pepin for kritisk gjennomgang av manuskriptet, og Dr. Hesham Soliman og Rossi-laboratoriet ved University of British Columbia for å gi mikroskop tilgang. Forfatterne anerkjenner støtte fra CIHR Team Grant: Canadian Microbiome Initiative 2 (C.T.), Crohn's og Colitis Canada (til C.T. og K.M.N.), CIFAR (til C.T. og K.M.N.), Michael Smith Foundation for Health Research Scholar Award (til C.T.), Weston Foundation: Weston Family Microbiome Initiative (til C.T.), Paul Allen Distinguished Investigator Award (til C.T.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum foil | |||
| Chloroform | Fisher | C298-500 | Toxic |
| Coplin jar | Fisher | 08-813E | |
| Cover glass, 22 × 22 mm, no #1 | VWR | CA48366-227-1 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Resuspended to 5 mg/mL |
| Empty pipette tip box(es) | To melt paraffin | ||
| Ethanol, anhydrous, molecular grade | -- | -- | |
| FISH probes | |||
| FISH hybridization solution | -- | -- | 20 mM Tris–HCl pH 7.4, 0.9 M NaCl, 0.01% (w/v) SDS in nuclease-free water. Optional addition of 5–50% (v/v) formamide |
| FISH washing buffer | -- | -- | 20 mM Tris–HCl pH 7.4, 0.9 M NaCl |
| Fluorescently-labeled Ulex Europaeus Agglutinin (UEA-1) lectin | Vector Laboratories | FL-1061 (Fluorescein-labeled) or RL-1062-2 (Rhodamine-labeled) | UEA-1 labels fucosylated glycans, so it is not appropriate for germ-free mice or for samples from fucosyltransferase 2 (FUT2)-deficient hosts. |
| Forceps | |||
| Formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | |
| Fumehood | |||
| Glacial Acetic Acid | Fisher | A38-212 | Corrosive and flammable |
| HybriSlip flexible plastic cover slips, 22 x 22 mm × 0.25 mm | Sigma Aldrich | GBL722222 | for FISH hybridization steps, can substitute glass coverslips |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Kimwipes | |||
| Methanol | Fisher | A412 | Toxic and flammable |
| Microtome | for sectioning | ||
| Multipurpose Specimen Storage Containers, 473 mL | Fisher | 14-955-117A | Can substitute with a glass or polyethylene container of your choice. Methacarn is not compatible with polystyrene or metal. |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | Any nail polish should work |
| Oven | Necessary range: 45-60 °C | ||
| Paraffin: Leica Paraplast | Leica | 39601006 | |
| PBS, Phosphate-buffered Saline (10x solution) | Fisher | BP3991 | Dilute to 1x for protocol |
| Sodium chloride | Fisher | S271 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), 20% Solution, RNase-free | Invitrogen | AM9820 | |
| Tissue-Loc HistoScreen Cassettes | Thermo Scientific | CA83009-999 | |
| Trizma hydrochloride solution, 1M Tris-HCl, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2663-1L | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Water, nuclease-free | Fisher | BP2484100 | |
| Xylenes | Fisher | X3P-1GAL | Toxic and flammable |
References
- Tropini, C., Earle, K. A., Huang, K. C., Sonnenburg, J. L. The gut microbiome: connecting spatial organization to function. Cell Host and Microbe. 21 (4), 433-442 (2017).
- Hansson, G. C., Johansson, M. E. V. The inner of the two Muc2 mucin-dependent mucus layers in colon is devoid of bacteria. Gut Microbes. 1 (1), 51-54 (2010).
- Johansson, M. E. V., et al. Normalization of host intestinal mucus layers requires long-term microbial colonization. Cell Host and Microbe. 18 (5), 582-592 (2015).
- Jakobsson, H. E., et al. The composition of the gut microbiota shapes the colon mucus barrier. EMBO Reports. 16 (2), 164-177 (2015).
- Tropini, C., et al. Transient osmotic perturbation causes long-term alteration to the aut microbiota. Cell. 173 (7), 1742-1754 (2018).
- Desai, M. S., et al. A dietary fiber-deprived gut microbiota degrades the colonic mucus barrier and enhances pathogen susceptibility. Cell. 167 (5), 1339-1353 (2016).
- Ng, K. M., et al. Recovery of the gut microbiota after antibiotics depends on host diet, community context, and environmental reservoirs. Cell Host and Microbe. 26 (5), 650-665 (2019).
- Shi, H., et al. Highly multiplexed spatial mapping of microbial communities. Nature. 588 (7839), 676-681 (2020).
- Johansson, M. E. V., Hansson, G. C. Preservation of mucus in histological sections, immunostaining of mucins in fixed tissue, and localization of bacteria with FISH. Methods in Molecular Biology. 842, 229-235 (2012).
- Greuter, D., Loy, A., Horn, M., Rattei, T. ProbeBase-an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes and primers: New features 2016. Nucleic Acids Research. 44 (1), 586-589 (2016).
- Quast, C., et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: Improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Research. 41 (1), 590-596 (2013).
- Beliveau, B. J., et al. OligoMiner provides a rapid, flexible environment for the design of genome-scale oligonucleotide in situ hybridization probes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2183-2192 (2018).
- Madeira, F., et al. The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019. Nucleic Acids Research. 47 (1), 636-641 (2019).
- Welch, J. L. M., Hasegawa, Y., McNulty, N. P., Gordon, J. I., Borisy, G. G. Spatial organization of a model 15-member human gut microbiota established in gnotobiotic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (43), 9105-9114 (2017).
- Lagkouvardos, I., et al. Sequence and cultivation study of Muribaculaceae reveals novel species, host preference, and functional potential of this yet undescribed family. Microbiome. 7 (1), 28 (2019).
- Zadeh, J. N., et al. NUPACK: Analysis and design of nucleic acid systems. Journal of Computational Chemistry. 32 (1), 170-173 (2011).
- Yilmaz, L. S., Parnerkar, S., Noguera, D. R. MathFISH, a web tool that uses thermodynamics-based mathematical models for in silico evaluation of oligonucleotide probes for fluorescence in situ hybridization. Applied and Environmental Microbiology. 77 (3), 1118-1122 (2011).
- Huber, D., Voith von Voithenberg, L., Kaigala, G. V. Fluorescence in situ hybridization (FISH): History, limitations and what to expect from micro-scale FISH. Micro and Nano Engineering. 1, 15-24 (2018).
- Wang, Y., et al. Laser capture microdissection and metagenomic analysis of intact mucosa-associated microbial communities of human colon. Applied Microbiology and Biotechnology. 88 (6), 1333-1342 (2010).
- Geva-Zatorsky, N., et al. In vivo imaging and tracking of host–microbiota interactions via metabolic labeling of gut anaerobic bacteria. Nature medicine. 21 (9), 1091-1100 (2015).
- Jemielita, M., et al. Spatial and temporal features of the growth of a bacterial species colonizing the zebrafish gut. mBio. 5 (6), 01751 (2014).
- Hasegawa, Y., Mark Welch, J. L., Rossetti, B. J., Borisy, G. G. Preservation of three-dimensional spatial structure in the gut microbiome. PLoS ONE. 12 (11), 0188257 (2017).
- Zhanmu, O., et al. Maintenance of fluorescence during paraffin embedding of fluorescent protein-labeled specimens. Frontiers in Neuroscience. 13, 752 (2019).
- Bergstrom, K., et al. Proximal colon-derived O-glycosylated mucus encapsulates and modulates the microbiota. Science. 370 (6515), 467-472 (2020).
- Jones, M. V., Calabresi, P. A. Agar-gelatin for embedding tissues prior to paraffin processing. BioTechniques. 42 (5), 569-570 (2007).
- Earle, K. A., et al. Quantitative imaging of gut microbiota spatial organization. Cell Host and Microbe. 18 (4), 478-488 (2015).
- Jeckel, H., Drescher, K. Advances and opportunities in image analysis of bacterial cells and communities. FEMS Microbiology Reviews. , (2020).
