Summary
يفصل هذا البروتوكول المبسط سير العمل للكشف عن البكتيريا في عينات الأنسجة المعقدة وصورها ، من إصلاح الأنسجة إلى تلطيخ الميكروبات بالفلورسنت في التهجين الموقعي .
Abstract
قياس توطين الميكروبات داخل سياقها في الجسم الحي هو خطوة أساسية في الكشف عن العلاقات الوظيفية بين الميكروبات والأمعاء الفقارية. يتم التحكم في المناظر الطبيعية المكانية للميكروبات الأمعاء بإحكام من خلال الميزات المادية - المخاط المعوي ، سرداب ، وطيات - ويتأثر الخصائص التي يسيطر عليها المضيف مثل الحموضة ، وتوافر الأكسجين ، والعوامل المناعية. تحد هذه الخصائص من قدرة الميكروبات ومسببات الأمراض على حد سواء على استعمار الأمعاء بشكل ثابت. على نطاق ميكرون، تحدد المنظمة الميكروبية التفاعلات القريبة المدى بين الميكروبات المختلفة وكذلك التفاعلات بين الميكروبات ومضيفها. ثم تؤثر هذه التفاعلات على وظيفة الجهاز على نطاق واسع وصحة المضيف.
يمكن هذا البروتوكول من تصور التنظيم المكاني للكائنات الحية المجهرية للأمعاء من المسافات بين الخلايا إلى المقاييس على نطاق الجهاز. وتستند هذه الطريقة على إصلاح أنسجة الأمعاء مع الحفاظ على بنية الأمعاء وخصائص المخاط. ثم يتم تضمين العينات الثابتة ومقسمة وملطخة لتسليط الضوء على أنواع بكتيرية محددة من خلال الفلورسينس في التهجين الموقعي (FISH). يتم تسمية ميزات المضيف ، مثل المخاط ومكونات الخلية المضيفة ، بالليكتينات المسماة بالفلورسنت. وأخيرا، يتم تصوير المقاطع الملطخة باستخدام مجهر كونفوج باستخدام التصوير بمسح البلاط عند التكبير العالي لسد موازين طول الميكرون إلى سنتيمتر. يمكن تطبيق هذا النوع من التصوير على أقسام الأمعاء من النماذج الحيوانية والخزعات من الأنسجة البشرية لتحديد الجغرافيا الحيوية للميكروبات في الأمعاء في الصحة والمرض.
Introduction
تقنيات التصور الميكروبي لها أصول قديمة قدم علم الأحياء المجهرية نفسه ، عندما استخدم أنتوني فان ليوينهوك مجهره لمراقبة البكتيريا (التي أطلق عليها اسم "الحيوانات") من لوحة الأسنان والبراز في القرن السابع عشر . ومنذ ذلك الحين، تم تطوير العديد من التقنيات لتصور التنظيم المكاني لاتحاد البكتيريا والفطريات والفيروسات التي تعيش مرتبطة بمضيف الكائنات الحية الدقيقة1. توضيح توطين هذه الميكروبات أمر ضروري لتحديد وظيفتها داخل مضيفها الحيواني. الجغرافيا الحيوية للبكتيريا مهمة في التصنيفات المشتركة والإمراضية على حد سواء ، حيث أن القرب من مواقع محددة (على سبيل المثال ، الظهارة) ، والركائز الغذائية ، والميكروبات المحددة قد يملي الإنتاج البكتيري من الأيض الكامنة وراء الأنواع والتفاعلات بين المملكة.
هيكل رئيسي يفصل بين البكتيريا والأنسجة المضيفة في العديد من مواقع الجسم المتباينة ، مثل تجويف الفم أو الأمعاء أو الرئة ، هو المخاط - طبقة منتجة من المضيف تمنع نقل الميكروبات إلى الخلايا الظهارية المضيفة وتعمل كمورد غذائي للميكروبات2،3،4 . ويتسم توصيف الخروقات والتغيرات في هذا الحاجز بأهمية رئيسية، مما يؤدي إلى نظرة آلية إلى التفاعلات بين المضيف والميكروبيوتا التي لن يتم الحصول عليها عن طريق التسلسل وحده5،6،7. على سبيل المثال، مكن التصوير من اكتشاف أن التعرض للمضادات الحيوية يمكن أن يعطل طبقة المخاط ومنظمة الكائنات الحية الدقيقة7،8، وأن المسهلات قد تستنفد المخاط، وترتبط بتغيرات كبيرة في المعلمات المناعية5.
يحدد هذا البروتوكول إطارا عاما لإصلاح وتلطيخ وتصوير الكائنات الحية المجهرية والأنسجة المضيفة (الشكل 1) ، المبني على عمل يوهانسون وهانسون9. في حين أن هذا البروتوكول على غرار في سياق الأقسام المعوية، فإنه يمكن تكييفها بسهولة لأنواع الأنسجة الأخرى. ويمكن هذا البروتوكول من تجهيز عينات سريرية تجريبية من الحيوانات أو الإنسان؛ وقد أدرجت ملاحظات لمعالجة كلا النوعين من العينات. في المثال المعروض هنا ، تم تسمية ظهارة المضيف والبكتيريا الإنارة في وقت واحد مع 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) تلطيخ, المخاط مع الفلورسين (FITC) - الليكتين المقترنة, Ulex europaeus agglutinin I (UEA-1), وتصنيف بكتيري محدد باستخدام FISH. عادة ما يتم تصميم تحقيقات FISH مقابل جينات 16S rRNA الخاصة بالتصنيف لضمان الإشارة العالية من ربط نسخة عالية.
في هذا المثال، يستهدف المسبار 16S rRNA من عائلة موريباكولاسا البكتيرية (الشكل 2). ومع ذلك ، يتم استبدال البقع بسهولة بمسابير FISH مختلفة و / أو lectins لاستيعاب السؤال البيولوجي المناسب. يمكن العثور على تحقيقات FISH التي تم التحقق من صحتها سابقا على ProbeBase10 ، وهو مورد عبر الإنترنت لمسابير أوليغونوكليوتيد المستهدفة من rRNA ، أو على SILVA11 ، وهي قاعدة بيانات الحمض النووي الريبي الريبوسومي. لتصميم تحقيقات جديدة، يمكن للقارئ الرجوع إلى خطوط أنابيب جديدة مثل HiPR-FISH8 أو Oligominer12. باستخدام هذا البروتوكول ، من الممكن مراقبة التعبئة الدقيقة للبكتيريا في التجويف المعوي والميزات المختلفة للمخاط المعوي في جميع أنحاء الجهاز الهضمي. ويمكن سير العمل الموصوف هنا من التحليل الكمي للكائنات الحية المجهرية في السياق المكاني للبيئة المضيفة لها.
Protocol
أجريت جميع التجارب على الحيوانات وجمع الأنسجة الموصوفة في هذا البروتوكول وفقا للمبادئ التوجيهية للمجلس الكندي لرعاية الحيوان (CCAC) ووافقت عليها لجنة رعاية الحيوان في جامعة كولومبيا البريطانية. تم استخدام فئران ويبستر السويسرية الخالية من الجراثيم. كانت جميع الحيوانات في الأسبوع 8-10 من العمر ، واستخدمت كلا الجنسين ، وشارك في إيواء جميع الفئران مع ما لا يقل عن اثنين من الفئران في القفص الواحد. تم قتل الحيوانات باستخدام ثاني أكسيد الكربون مع خلع عنق الرحم الثانوي أو ثقب القلب.
1. تصميم تجربة التصوير: الاعتبارات وجمع العينات
- تصميم مسبار FISH
- إذا كان هناك مسبار FISH مناسب، حدد مسبارا منشورا موجودا مسبقا يظهر إشارة قوية في الخلايا المسماة مقارنة بالخلفية.
- التحقق من صحة المسابير الجديدة في المختبر لتحديد كفاءتها في الربط لعينات ثابتة من البكتيريا المستهدفة وربطها خارج الهدف بالبكتيريا الأخرى.
- تحقق من جميع مسابير FISH 16S لاستخدامها ضد تسلسل 16S من الكائن المستهدف أو ضد تسلسل 16S rRNA من العينات التي سيتم تحليلها لضمان وجود النسبة المتوقعة من المطابقات الإيجابية ، وأن المسابير لن ترتبط بشكل غير محدد بأعضاء الكائنات الحية الدقيقة الآخرين.
- محاذاة تحقيقات FISH ضد تسلسل كامل الطول أو المتغيرات تسلسل amplicon باستخدام أداة، مثل أوميغا 13 كلوستال، لتقييم الربط المحتمل للمسابير وأهدافها.
- بالإضافة إلى اختبار السيليكو، اختبر دقة ومستوى تلطيخ الأسماك للمسابير غير المناسخ على الثقافات النقية8,14.
ملاحظة: عند تلطيخ العديد من أفراد المجتمع، يمكن استخدام المسابير بشكل مشترك (على سبيل المثال، الجمع بين مسبار خاص بالعائلة ومسبار خاص بالجنس) إذا لم تتداخل الفلوروفوريس المستخدمة في أطياف الإثارة والانبعاثات (ما لم يكن التصوير على نظام لديه القدرة على أداء التوليف الخطي). وبالإضافة إلى ذلك، يمكن إثبات خصوصية من خلال تضمين ضوابط خصوصية / تحقيقات مشوشة أو عن طريق المنافسة مع مسابير غير فلورية.
- أنواع العينة وجمع الأنسجة
- باستخدام أدوات حادة ونظيفة، وقطع شرائح الأمعاء من الفئران ويبستر السويسرية الغنوتوبيوتك للتصوير. تقليل إزعاج العينة قدر الإمكان، والتعامل مع المقاطع من حوافها لتجنب التأثير على منطقة التصوير. إصلاح العينة في أقرب وقت ممكن بعد تشريح لمنع تدهور.
ملاحظة: بالنسبة للدراسات الحيوانية، يفضل وجود أقسام معوية سليمة وغير مطوقة؛ سيساعد الغشاء في الحفاظ على التنظيم الإنارة والملموس سليم. - تنظيف الأدوات عن طريق مسحها مع الإيثانول 70٪ بين العينات والمواقع. الحصول على ما لا يقل عن ثلاثة تكرارات بيولوجية لكل قسم معوي / موقع خزعة ، مع الحرص على عينة مواقع الأمعاء متسقة ، كما المخاط والهندسة المعمارية المعوية ، فضلا عن الكائنات الحية الدقيقة تتغير بشكل كبير في مواقع مختلفة.
- باستخدام أدوات حادة ونظيفة، وقطع شرائح الأمعاء من الفئران ويبستر السويسرية الغنوتوبيوتك للتصوير. تقليل إزعاج العينة قدر الإمكان، والتعامل مع المقاطع من حوافها لتجنب التأثير على منطقة التصوير. إصلاح العينة في أقرب وقت ممكن بعد تشريح لمنع تدهور.
2. تثبيت عينة الأنسجة والتسلل
- تثبيت
- إعداد methacarn الطازجة في حاوية متوافقة مع النسب التالية: 60٪ الميثانول المطلق، 30٪ الكلوروفورم، و 10٪ حمض الخليك الجليدي. الاستغناء عن كل من هذه المواد الكيميائية في غطاء الدخان. اختر حاوية يمكن تنفيسها عن طريق فتح الغطاء. بما أن الميثاكارن غير متوافق مع البوليسترين ، قم بإعداده في حاوية البولي إيثيلين ، باستخدام اسطوانات زجاجية متخرجة / ماصة مصلية لحمض الخليك الكلوروفورم والجليدي.
ملاحظة: أثناء الخلط، يتم إنتاج الأبخرة وقد تتسبب في تراكم الضغط داخل الحاوية. من المستحسن إبقاء الحاوية مغلقة بإحكام نسبيا بمجرد إزالتها من غطاء الدخان إذا لم يتم إضافة العينات بنشاط. الكلوروفورم سامة. لا تستنشق أو تبتلع أو تمتص من خلال الجلد. الميثانول سامة واشتعالا عاليا. لا تستنشق أو تبتلع أو تمتص من خلال الجلد. حمض الخليك الجليدي قابل للاشتعال وتآكل شديد في الجلد والعينين. - بعد الاستغناء، وإغلاق الحاوية، دوامة لخلط ثم تنفيس. كرر هذا حتى توقف خارج الغاز (والضغط لم يعد يتراكم بشكل ملحوظ تحت الغطاء).
ملاحظة: لا تتخلص من الميثاكارن في المصارف؛ جمع النفايات الكيميائية الخطرة والتخلص منها وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية. استخدام قلم رصاص لتسمية أشرطة الأنسجة، كما العديد من الأحبار القلم سوف تأتي قبالة في حل ميثاكارن. - ضع أقسام الأمعاء في أشرطة الأنسجة عن طريق عقد بدقة حافة الأنسجة مع ملاقط. إغلاق كاسيت وغمر تماما في محلول ميثاكارن الطازجة. تأكد من أن الحل لا يزيد عن بضع ساعات عند غمر أشرطة الكاسيت.
- بالنسبة للعينات السريرية التي سيتم جمعها في جناح سريري دون الوصول إلى غطاء الدخان ، استخدم حاوية تخزين البولي إيثيلين مع قطع رفرف في الغطاء الذي سيسمح بمرور أشرطة الأنسجة. الشريط هذا رفرف اغلاق عند عدم تمرير العينات لمنع هروب الأبخرة السامة.
ملاحظة: من المهم استخدام الشريط اخفاء لتجنب انحلال الغراء على الحاوية بعض أنواع الشريط (على سبيل المثال، شريط التعبئة البلاستيكية) قد لا تصمد جيدا لأبخرة ميثاكارن. - إصلاح عينات لمدة لا تقل عن 3 ساعة و بحد أقصى أسبوعين.
ملاحظة: قد تتطلب عينات أكثر سمكا مرات التثبيت أطول من 3 ساعة. ويمكن اختيار وقت التثبيت لتمكين معالجة تسلل البارافين المتزامنة للأشرطة المثبتة في حلول مختلفة للميثاكارن (على سبيل المثال، إجراء تسلل البارافين في وقت واحد على مجموعات من العينات التي تم جمعها وإصلاحها على مدى أسبوعين).
- إعداد methacarn الطازجة في حاوية متوافقة مع النسب التالية: 60٪ الميثانول المطلق، 30٪ الكلوروفورم، و 10٪ حمض الخليك الجليدي. الاستغناء عن كل من هذه المواد الكيميائية في غطاء الدخان. اختر حاوية يمكن تنفيسها عن طريق فتح الغطاء. بما أن الميثاكارن غير متوافق مع البوليسترين ، قم بإعداده في حاوية البولي إيثيلين ، باستخدام اسطوانات زجاجية متخرجة / ماصة مصلية لحمض الخليك الكلوروفورم والجليدي.
- تسلل البارافين وتضمينه
- ضعي البارافين في وعاء مقاوم للحرارة وذابه في فرن عند 60 درجة مئوية بين عشية وضحاها. كما الكريات البارافين تأخذ مساحة أكبر قبل ذوبان, ضمان أن يتم إذابة البارافين كافية لتغطية جميع أشرطة الكاسيت.
ملاحظة: يجب أن لا تكون درجة الحرارة أعلى من 60 درجة مئوية لأنها يمكن أن تؤدي إلى القطع الأثرية. - غسل الأنسجة عن طريق صب السائل في وعاء النفايات المناسبة واستبداله فورا مع المواد الكيميائية التالية.
- احتضان في الميثانول المطلق لمدة 30 دقيقة كرر مرة واحدة.
- احتضان الإيثانول المطلق لمدة 20 دقيقة.
- احتضان في xylenes لمدة 15 دقيقة.
- تبادل يغسل بسرعة، مع الحرص على تجنب السماح للأشرطة الجافة. تأكد من أن كل غسل يغطي تماما أشرطة في الكأس أو الحاوية.
ملاحظة: الزيلين قابل للاشتعال، وإذا تم استنشاقه، قد تضعف الأبخرة الجهاز العصبي المركزي مع عواقب عصبية محتملة على المدى الطويل عند التعرض لتركيزات عالية (>200 ppm). التعامل مع xylenes فقط داخل غطاء الدخان. كما xylenes خطرة، والحرص على استخدام الحد الأدنى من المبلغ اللازم لتغطية أشرطة النسيجية.
- أثناء التضمين، وجه الأجزاء المعوية الموازية لطول الكاسيت (بدلا من الاستقامة) باستخدام ملاقط لتوفير مقاطع طولية عرضية بدلا من الدونات المقطعية لتوفير مساحة عينة محتملة أكثر للتصوير الكمي (الشكل 1B).
- فتح أشرطة قليلا (~ 1-2 سم أو 0.5 بوصة) للسماح للبارافين للدخول دون فقدان شرائح الأنسجة. استخدم قفازات مزدوجة لهذه الخطوة أو الملاقط لمنع ارتفاع درجة الحرارة أو حرق خفيف للأصابع. غمر وإغلاق أشرطة في حاوية من البارافين الذائب، ووضع الحاوية مرة أخرى في الفرن 60 درجة مئوية. تأكد من أن أشرطة مملوءة البارافين، وتبقى أي فقاعات الهواء الكبيرة.
- بعد الحضانة لمدة 2 ساعة في 60 درجة مئوية، قم بإزالة الحاوية من الفرن. باستخدام ملقط، وإزالة بعناية كاسيت ووضعها بشكل فردي على قطعة من رقائق الألومنيوم لتبرد. تخزينها في درجة حرارة الغرفة حتى تصبح جاهزة لتضمين والتقسم.
- قسم كتل البارافين مع microtome، مقطعة عميقا بما فيه الكفاية في كتلة أن تتعرض محتويات مضيئة، وتمكين قسم طولي من الزغب و / أو سرداب بالإضافة إلى محتويات مضيئة والمخاط. الحرص على استبدال ريش كما مواد البراز مملة شفرة بسرعة بالمقارنة مع الأنسجة. قطع المقاطع إلى 4 ميكرومتر من سمك للحدة الأمثل للصور. نقل المقاطع إلى الشرائح العادية غير المصقول.
- لتلطيخ الأسماك، وصمة عار في أقسام الأمعاء في أقرب وقت ممكن (أي، في غضون أسابيع قليلة من المقطع) لتحقيق إشارة الأسماك قوية. إذا حذف تلطيخ الأسماك، lectin + DAPI تلطيخ يمكن أن يؤديها على عينات أقل الطازجة (أي أشهر من العمر) دون فقدان كبير للإشارة.
- ضعي البارافين في وعاء مقاوم للحرارة وذابه في فرن عند 60 درجة مئوية بين عشية وضحاها. كما الكريات البارافين تأخذ مساحة أكبر قبل ذوبان, ضمان أن يتم إذابة البارافين كافية لتغطية جميع أشرطة الكاسيت.
3. تلطيخ البكتيريا وميزات المضيف
- اعداد
- سخني الفرن إلى 60 درجة مئوية. ما قبل الحارة جرة كوبلين فارغة وحجم كاف لتغطية الشرائح الزجاجية في جرة مرتين مع xylenes في زجاجة، مع الحرص على parafilm حول الغطاء لمنع تبخر xylenes. السماح لدرجة حرارة xylenes لتصل إلى 60 درجة مئوية.
ملاحظة: تناسب جرة كوبلين القياسية 8 شرائح، ويمكن تغطية الشرائح بما يقرب من 50 مل من السائل (قد تتراوح بين 40 و60 مل اعتمادا على العلامة التجارية). بدائل الزيلين أقل سمية وقد استخدمت بنجاح من قبل مجموعات أخرى لخطوة إزالة الصبح (الخطوة 3.2)8,9. - إذا كان هناك فرن منفصل متوفر، قم بتدفئة فرن التهجين مسبقا إلى 50 درجة مئوية. وإلا، يمكن تنفيذ هذه الخطوة مع نفس الفرن المستخدم في خبز الشرائح بعد الخطوة 3.2.3.
- إعداد حل التهجين FISH: 20 mM تريس-HCl، pH 7.4; 0.9 م كلوريد الناكل; 0.01٪ 26 - 0.1٪9 (ث/5) دودسيلسلبريتات الصوديوم (SDS) في مياه خالية من النيوكليز. إذا لزم الأمر، إضافة 5-50٪ (v/v) formamide. قبل الحارة هذا الحل التهجين في 50 درجة مئوية أثناء إزالة البارافينين.
ملاحظة: Formamide هو وسطي يعمل كمسخ; التعامل مع فورماميد مع قفازات ونظارات واقية. في جرعات صغيرة وعند التعرض للعيون والجلد، أو الأغشية المخاطية، فإنه مزعج. وبكميات كبيرة، يمكن أن يتطلب بخار الفورماميد تدخلا طبيا. يمكن تخزين فورماميد بنسبة 100٪ في ثلاجة -20 درجة مئوية.
- سخني الفرن إلى 60 درجة مئوية. ما قبل الحارة جرة كوبلين فارغة وحجم كاف لتغطية الشرائح الزجاجية في جرة مرتين مع xylenes في زجاجة، مع الحرص على parafilm حول الغطاء لمنع تبخر xylenes. السماح لدرجة حرارة xylenes لتصل إلى 60 درجة مئوية.
- إعداد الشرائح للتلطيخ: إزالة التلطيخ
- ضع الشرائح في جرة كوبلين، مع التأكد من أن الأقسام لا تتصل بالشرائح الأخرى أو الجرة، واخبز الشرائح عند 60 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- في غطاء الدخان، وملء جرة كوبلين مع xylenes قبل الحارة من الفرن، مع الحرص على عدم صب مباشرة على رأس العينات ويحتمل أن طرد الأنسجة. ضع جرة كوبلين مرة أخرى في الفرن 60 درجة مئوية. اترك الزجاجة مع الزيلين المتبقية في غطاء الدخان.
- صب xylenes المستخدمة في حاوية النفايات المناسبة للتخلص منها، مع الحرص على عدم تعكير صفو أقسام الأنسجة على الشرائح الزجاجية واستخدام زوج من ملقط للحفاظ على الشرائح من السقوط من جرة كوبلين. تجديد جرة كوبلين مع xylenes المتبقية واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في غطاء محرك السيارة الدخان.
- احتضان الأقسام في الإيثانول 99.5٪ لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد خطوة الحضانة هذه، قم بإزالة الشرائح من جرة كوبلين، ومسح الجزء الخلفي من الشرائح على مسح مختبر أو منشفة ورقية، وتجفيف الهواء لفترة وجيزة حتى تختفي قطرات الإيثانول.
ملاحظة: مسح الجزء الخلفي من الشرائح يتيح تصور أفضل للتقدم التجفيف.
- تلطيخ البكتيريا مع FISH
- استخدم مانع سائل أو قلم PAP للحد من مساحة التوسع السائل عن طريق الدوران حول منطقة كل قسم من أقسام الأنسجة. تأكد من عدم اتصال الحبر بالقسم نفسه. إنشاء دائرة أقرب إلى كل قسم الأنسجة ممكن دون الاتصال الأنسجة لتقليل مساحة السطح التي تحتاج إلى أن تغطيها الحل التهجين.
- إعداد حل التهجين: لكل 50 ميكرولتر من محلول التهجين قبل الإحماء، أضف مسبار 0.5 ميكروغرام (على سبيل المثال، 0.5 ميكرولتر من مسبار 1 ميكروغرام/ميكرولتر). ماصة حل التهجين على المقاطع على الشريحة (~ 20 ميكرولتر / مقطع، اعتمادا على حجم القسم / الدائرة). حماية حل التهجين والشرائح من الضوء من هذه النقطة فصاعدا خلال خطوات الحضانة والتخزين.
- تأكد من أن حجم السائل المستخدم يغطي القسم بأكمله عند التراكب مع غطاء بلاستيكي مرن. احتضان الشريحة في غرفة رطبة للحد من التبخر. إنشاء غرفة رطبة مع مربع تلميح ماصة مع مناديل أو مناشف ورقية في الجزء السفلي التي تم غارقة مع محلول التهجين الزائد أو المالحة الفوسفات المخزنة (PBS) لتوفير الرطوبة. احتضان الأقسام في 45-50 درجة مئوية، اعتمادا على مجموعة التحقيق، لمدة >3 ساعة.
- الاحماء المخزن المؤقت غسل الأسماك: 20 mM تريس-HCl، درجة الحموضة 7.4؛ 0.9 م NaCl إلى 50 درجة مئوية خلال فترة الحضانة. إعداد ما يكفي من العازلة الغسيل لتغطية الشرائح في جرة كوبلين.
- إزالة الأغطية البلاستيكية؛ احتضان الشرائح في المخزن المؤقت غسل FISH في جرة كوبلين، وكلاهما مسبقا تدفأ إلى 50 درجة مئوية. ضعي جرة كوبلين مرة أخرى في فرن 50 درجة مئوية لمدة 10-20 دقيقة. بالنسبة للعينات السميكة، قم بإزالة الأغطية في جرة كوبلين عن طريق إضافة العازلة وإزاحة الأغطية بلطف لتجنب تلطيخ الشريحة.
- تلطيخ المخاط وميزات المضيف
- إعداد مضاد الحمض النووي / المخاط العاموقع في برنامج تلفزيوني: النهائي 10 ميكروغرام / مل DAPI + 40 ميكروغرام / مل مخاط وصمة عار UEA-1. إعداد ما يكفي من مضادة لتغطية البقع في غياب غطاء لتجنب تلف الأنسجة مع coverlips إضافية.
ملاحظة: يتطلب تغطية البقع في حالة عدم وجود غطاء أحجام أكبر من 20 ميكرولتر المستخدمة في 3.3.2. بالنسبة للأقسام متوسطة الحجم (قطرها 10 مم تقريبا)، فإن 200 ميكرولتر كافية لتغطية بقعة واحدة؛ اختبار وحدة التخزين هذه مسبقا على شريحة وهمية. - إزالة المخزن المؤقت غسل FISH واستبداله برنامج تلفزيوني في جرة كوبلين. مباشرة بعد إعادة ملء جرة كوبلين مع برنامج تلفزيوني ، decant برنامج تلفزيوني.
- إزالة الشرائح من جرة وماصة العداداتعلى رأس القسم مع ضمان عدم لمس الأنسجة مع طرف ماصة. تغطية القسم بأكمله مع فقاعة. حضانة في 4 °C لمدة 45 دقيقة في الظلام.
- غسل البقع 3 مرات بسرعة مع برنامج تلفزيوني جديد: في حين عقد الشرائح في مكان باستخدام ملاقط، صب برنامج تلفزيوني في بالوعة وإعادة ملء فورا مع برنامج تلفزيوني جديد.
- مسح الجزء الخلفي من الشرائح ضد مسح أو منشفة ورقية، والسماح لمعظم برنامج تلفزيوني تتبخر قبالة الأقسام، بمساعدة خط فراغ متصلة تلميح ماصة. مرة أخرى، تجنب لمس القسم مع طرف ماصة.
- قم بتركيب المقاطع باستخدام وسيطة تركيب (بدون DAPI) والسماح لها بتعيين درجة حرارة الغرفة التي تغطيها الأغطية الزجاجية ، مما يضمن أن الأغطية مسطحة ولا توجد فقاعات هواء في الوسط المتصاعد.
- ألصق الأغطية على الشريحة عن طريق الرسم على طول حواف الغطاء مع طلاء الأظافر الواضح ، مع الحرص على الابتعاد عن حافة الشريحة لضمان أن الشريحة ستجلس على مستوى حامل الشريحة المجهر أثناء التصوير.
- تخزين الشرائح في 4 درجة مئوية في الظلام لبضعة أسابيع قبل أن يتم استنفاد الفلورسينس.
- إعداد مضاد الحمض النووي / المخاط العاموقع في برنامج تلفزيوني: النهائي 10 ميكروغرام / مل DAPI + 40 ميكروغرام / مل مخاط وصمة عار UEA-1. إعداد ما يكفي من مضادة لتغطية البقع في غياب غطاء لتجنب تلف الأنسجة مع coverlips إضافية.
4. التصوير وتحليل الصور
- تصور البقع
- حدد منطقة من الأنسجة التي تحتوي على كل من الأنسجة والتجويف لتصوير واجهة الكائنات الحية المجهرية المضيفة. للتصوير الكمي لسمك المخاط والجغرافيا الحيوية الإنارة، حدد مجالات الرؤية حيث تكون شرائح الزغب الظهاري و/أو السراديب طولية وليست مقطعية. تجنب المناطق التي بها فجوات كبيرة بين المخاط والظهارة لتجنب تقسيم القطع الأثرية.
- تحديد موقع الأنسجة وتصحيح المستوى البؤري، وذلك باستخدام إشارة DAPI لتحديد موقع والتركيز لتجنب تبييض الصور من إشارة مضان السمك.
- ضبط إعدادات التصوير. لتصور وصمة عار DAPI البكتيرية ، وزيادة قوة الليزر والحصول على النقطة التي تكون فيها إشارة DAPI من الخلايا الظهارية مشبعة أو "في مهب".
ملاحظة: لا تفرط في التشبع، لأن هذا سيؤدي إلى photobleaching والتحف البصرية في النوى التي لا يمكن استردادها. - لجميع القنوات الأخرى، استخدم الحد الأدنى من طاقة الليزر التي من شأنها أن توفر إشارة واضحة فوق الخلفية، وتوخي الحذر من عدم الإفراط في التشبع.
ملاحظة: هذا مهم بشكل خاص عند إجراء عمليات مسح الإطارات المتجانبة، حيث أن إعادة اللؤم الضوئي ستكون مشكلة عند تصوير التداخل بين الإطارات المتجانبة. - استخدام 40x أو أعلى التكبير لتصوير البكتيريا الفردية.
- الحصول على الصور.
- الحصول على مسح البلاط للحصول على بيانات كمية عن سمك المخاط والتوزيع المكاني للميكروبات داخل التجويف. تأكد من تداخل 15٪ بين البلاط والتحقق من الإضاءة التظليل / متفاوتة، والتي قد تتفاقم بسبب التكبير <1x. عند إعداد مسح البلاط، انتبه عن كثب إلى ما إذا كان النسيج في بؤرة التركيز في جميع المربعات، حيث لا يمكن تحليل الصور الضبابية/الخارجة عن التركيز (الشكل 3B).
- إذا كان ذلك ممكنا، تقليل عدد البلاط اللازمة لتصوير طول معين من الظهارة عن طريق تدوير منطقة المسح الضوئي بحيث طبقة الظهارة والمخاط موازية للبلاط وليس في زاوية. خلاف ذلك، ابحث عن جزء من الظهارة المتوازية أو المتعامدة مع منطقة التصوير لتحقيق تأثير مماثل.
Representative Results
للتحقيق في توطين البكتيريا commensal الأمعاء محددة في أمعاء الماوس، استخدمت الفئران السويسرية ويبستر خالية من الجراثيم التي كانت مستعمرة مع عزل البكتيرية الفردية في هذه الدراسة. لهذه التجربة، كانت الأنواع البكتيرية المسماة 1) عزل الإنسان من الأسرة Muribaculaceae5، Muribaculum المعوية، عائلة وفيرة وشائعة من البكتيريا في ميكروبيوتا 15 مورين، وكذلك 2) بكتيريا ثيتايوتاوميكرون، بكتيريا الأمعاء القابلة للسحب وراثيا وشائعة. بعد أسبوعين من التوازن ، تم قتل الفئران ، وتم تقسيم جزء من القولون يحتوي على بيليه البراز وإصلاحه في الميثاكارن الطازج. بعد يومين من التثبيت ، تم جفاف الأقسام عن طريق المعالجة من خلال الميثانول والإيثانول والزيلين ، وتسللت مع البارافين ، جزءا لا يتجزأ ، ثم قسمت إلى شرائح 4 ميكرومتر مضيئة. ثم لطخت هذه العينات مع مسبار FISH (3 'Cy3 الموسومة) محددة لعزل Muribaculum، مصممة باستخدام برنامج أوليغومينر12، وفحص للبنية الثانوية والثالثية والحد الأدنى من الربط غير محددة باستخدام NuPACK و mathFISH16،17. كما كانت العينات ملطخة بالليكتين UEA-1 المرتبط بالرودامين (الذي يلطخ الجليكانات المكواة في المخاط) وDAPI. تم تصوير المقاطع الملطخة باستخدام هدف زيت 40x ووحدة فائقة الدقة.
الشكل 1: سير عمل التصور للواجهة الميكروبيوتا المضيفة في الأمعاء. (أ) سير عمل مصور لخط الأنابيب. (ب) سوف ينتج عن مستويي المقطع إما مقاطع عرضية (مفضلة لخط الأنابيب هذا) أو "دونات" مقطعية. (ج) قد يؤدي تضمين أنسجة ذات سماكة مختلفة جدا إلى شرائح مثالية فقط لنسيج أو آخر. المختصرات: FISH = الفلورسينس في التهجين الموقعي ؛ DAPI = 4′,6-دياميدينو-2-فينيليندول. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تصوير القولون يظهر توطين الأمعاء Muribaculum بالنسبة للمخاط في نموذج الماوس الغنوتوبيوتك. كانت الأقسام ملطخة DAPI (الأزرق) ، Muribaculaceae FISH التحقيق (الأحمر) ، وUEA - 1 (الأخضر). (أ) القولون البعيدة من الماوس أحادية المستعمر مع الأمعاء Muribaculum و (ب) القولون البعيدة من الماوس ثنائي المستعمر مع الأمعاء Muribaculum وbacteroides thetaiotaomicron. شريط المقياس = 20 ميكرومتر (C و D) Cy3-FISH (يسار) و DAPI (وسط) وقنوات Cy3-FISH + DAPI المدمجة لأجزاء الإنشاء من (A) و (B) على التوالي. شريط المقياس = 5 ميكرومتر. في (A) و (C) ، يتم تسمية جميع إشارات DAPI على شكل بكتيريا وحجم البكتيريا مع Cy3 (رؤوس الأسهم الفردية) ، وفي (B) و (D) ، بالإضافة إلى هذه الخلايا الإيجابية المزدوجة Cy3 و DAPI (رؤوس الأسهم الفردية) ، هناك خلايا بكتيرية ملطخة ب DAPI تكون سالبة Cy3 (رؤوس الأسهم المزدوجة) ، كما هو متوقع للدول أحادية والاستعمار الثنائي. وباستثناء البكتيريا الخيطية الأطول، فإن الهياكل الإيجابية (السهام الحادة) الأكبر حجما (>4 ميكرومتر) هي مواد نباتية أو نواة من الخلايا المضيفة. المختصرات: FISH = الفلورسينس في التهجين الموقعي؛ DAPI = 4′,6-دياميدينو-2-فينيليندول. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: المشاكل الشائعة. (أ) لن يوفر المقطع الضحل شرائح مضيئة من الأمعاء. (يسار) مقطع معوي تم تقسيمه على عمق يوفر إطلالة على التجويف بالإضافة إلى وجهات النظر الطولية للظهارة. (يمين) شريحة معوية تم تقسيمها بشكل ضحل للغاية ، مما يكشف فقط عن مقاطع عرضية من سرداب ولا توجد طبقة مخاط ثابتة أو بكتيريا. (ب) قد تؤدي تغطية الأنسجة/الأغطية غير المتساوية إلى مسح البلاط الباهت وغير المضاء بشكل غير متساو. تم إعداد فحص البلاط مع المواقف التي كانت خارج التركيز (الزاوية اليمنى العليا). (ج) مثال على الخلفية العادية (يسار) والخلفية العالية (يمين). في هذا المثال، لملاحظة إشارة DAPI الإشارة القادمة من الظهارة، خارج النوى. جميع أشرطة المقياس = 20 ميكرومتر. اختصار: DAPI = 4′,6-دياميدينو-2-فينيليندول. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
يوفر البروتوكول الموضح أعلاه طريقة قابلة للاستنساخ لتصور واجهة المضيف-الكائنات الحية الدقيقة. وقد استفادت هذه المقايسات إلى حد كبير من تطوير البروتوكول ، بدءا من تحسين وضع العلامات FISH18 إلى الحفاظ على المخاط والتصوير9. كما يوفر التثبيت والتضمين تخزينا مفيدا للعينات؛ وعلاوة على ذلك، يمكن إرسال أشرطة البارافين المتسللة بالبريد دون أي قيود، حيث أن العينات ثابتة تماما وغير خاملة.
الأهمية والطرق البديلة
مزيج من الأسماك وتلطيخ المخاط تمكن من تحليل تكوين الكائنات الحية الدقيقة في مواقع الأنسجة محددة والتفاعل بين البكتيريا الفردية والمضيف. التقنيات البديلة التي تنطوي على تحليل مواقع محددة داخل الكائنات الحية الدقيقة عادة ما تكون غير قادرة على استكشاف طبيعة الخلية الواحدة من هذه التفاعلات، كما هو الحال في الالتصاق الدقيق التقاط الليزر إلى جانب التسلسل19. ومع ذلك ، فإن التقنيات القائمة على التسلسل لديها ميزة القدرة على التقاط التركيبة الوراثية للميكروبات على مستوى أدق وعلى نطاق أوسع من مسابير rRNA 16S.
ومن عثرات البروتوكول المقدم أنه يوفر لقطة لمرة واحدة للكائنات الحية المجهرية فيما يتعلق بالمضيف. بالنسبة للتصوير في الوقت الحقيقي في الحيوانات الحية، يلزم استخدام تقنيات تصوير خاصة لتسهيل الحصول على إشارة مضان في الأنسجة العميقة (مثل المجهر ثنائي الفوتونات ومجهر مضان الورقة الخفيفة20,21). في هذه الطرق ، يتم استعمار الكائن الحي النموذجي إما بالبكتيريا الملطخة بالجزيئات التي ترتبط ب envelope20 أو البكتيريا المعدلة وراثيا التي تؤوي بروتينات فلورية21. في الحالة الأخيرة ، فإن نضوج البروتينات الفلورية هو قضية رئيسية لأن معظم البروتينات الفلورية القياسية تتطلب الأكسجين لتنبعث منها الضوء. لذلك ، هناك حاجة إلى كائنات نموذجية لديها بيئات غير نانايروبية على الأقل (تركيز الأكسجين النانوي) ، مثل gut21 حمار وحشي هوائي.
في هذا البروتوكول، يستخدم الميثانول-Carnoy كمثبت بدلا من البارافورمالديهايد أو الفورمالين لأنه لا يحتوي على الماء. وهذا يمنع الترطيب والجفاف وانهيار طبقة المخاط أثناء المعالجة ويسهل القياسات الدقيقة لسمك المخاط. في حين أصبح تثبيت الميثاكارن وتضمين البارافين معيارا في هذا المجال ، فقد تم التحقيق في مثبتات وتقنيات تضمين مختلفة لتحسين الحفاظ على المخاط9،22 ، مع بعض الدراسات التي تشير إلى أن الراتنجات قد تكون متفوقة على البارافين embedding22. وثمة قيد هام آخر على تضمين البارافين والتثبيت الميثاكارن هو فقدان فلورية البروتين الفلوري، التي يمكن تجنبها باستخدام مثبتات بديلة (مثل الفورمالين أو البارافورمالديهايد (PFA)) أو تقنيات التضمين المعدلة23. كل مثبت له فوائد وعيوب ، واختيار المثبت يعتمد على أولويات التصوير. ويمكن الجمع بين طرائق التصوير إذا تم إصلاح التكاثر البيولوجي في كل من PFA و methacarn وتم الحصول على الصور من كلتا العينتين.
وقد تم الجمع بين الأسماك مع immunofluorescence في حالات معزولة مع محددة مضادة لل Muc2C3 أرنب الأجسام المضادة متعددة النسيلة9،24. لم يتم استنساخ هذه النتائج على نطاق واسع مع الأجسام المضادة Muc2 الأخرى ، مما يشير إلى أن اختيار الأجسام المضادة قد يكون حاسما في نجاح تركيبة الفلورسينس المناعية FISH. شروط تلطيخ الأجسام المضادة الناجحة لأجسام مضادة معينة قد لا تسمح بالاحتفاظ بتلطيخ الأسماك.
استكشاف الاخطاء
في هذا البروتوكول، يمثل جمع العينات والأقسام والتلطيخ خطوات هامة لمنع إنشاء صور فنية. على سبيل المثال ، يمكن أن يؤدي الضغط على الأنسجة عند الجمع وقبل التضمين إلى سوء تقدير الكائنات الحية الدقيقة ويؤثر على جودة المخاط. وثمة اعتبار هام آخر هو تجنب الجمع بين شرائح من سمك مختلفة جدا في كاسيت واحد، مثل قطعة فارغة نسبيا من الأمعاء الدقيقة والكريه داخل القولون البعيدة. تؤدي السمكات المختلفة إلى صعوبات في التصوير: بعد التضمين، قد يكون المقطع العرضي على عمق محدد لشريحة واحدة في العمق الخاطئ للتصوير للجزء الآخر (على سبيل المثال، سيكون التجويف في أعماق مختلفة لكل نسيج) (الشكل 1B وC والشكل 3A). وعلاوة على ذلك، لتصوير الكريات البراز نموذج الحيوان، فإنها قد تكون ملفوفة في الغشاء البريتوني24. في هذه التقنية، يتم طي جزء صغير من الصفاق المعزول حديثا بلطف حول البراز ويحافظ على بنية الكريات أثناء خطوات الغسيل الموضحة في البروتوكول.
على عكس معالجة الأنسجة الحيوانية ذات المحتويات ، يمثل تصوير عينات الأمعاء البشرية بعض التحديات. على وجه التحديد، من المرجح أن تتعطل المحتويات الإنارة والبطانة المخاطية بسبب إعداد الأمعاء تنظير القولون الذي يتم إجراؤه عادة قبل خزعات الأمعاء أو إجراءات استئصال الأمعاء. بالإضافة إلى ذلك ، عندما يتم جمع الخزعات ، من المفيد ملاحظة اتجاه الأنسجة للمساعدة في تحديد ميزات محددة (على سبيل المثال ، التجويف مقابل الغشاء المخاطي) في غياب محتويات معوية. قد يكون التضمين المسبق مع 3٪ أجار و / أو أغار: خليط الجيلاتين مفيدا في الحفاظ على قطبية الأنسجة25؛ ومع ذلك ، هناك مشاكل مع الجفاف وتقسم أجار ، كما ورد في الأدبيات ، وأوقات المعالجة قد تحتاج إلى تغيير.
الجانب الرئيسي لتحقيق تلطيخ السمك جيدة يأتي من ضبط تركيز فورماميد لتحقيقات الأسماك محددة. سوف Formamide السيطرة على التهجين stringency من تحقيقات FISH إلى أهدافهم. من المهم التأكد من أن أ) يتم اختيار تركيز فورماميد السليم لتلطيخ مجتمع معين، وب) أن تركيز فورماميد مناسب ممكن حتى لتركيبة المسبار التي يتم استخدامها-وهذا قد يؤثر على اختيار المسبار الأمثل عند استخدام تحقيقات متعددة. مواقع مثل mathFISH (http://mathfish.cee.wisc.edu/) قد تساعد في حساب تركيزات فورماميد المناسبة لتحقيق معين. في غياب معلومات حول تركيزات فورماميد المناسبة، يمكن اختبار هذا البروتوكول مع 0٪ و 10٪ فورماميد.
يتطلب تقسيم العينات المضمنة قطع الكتلة إلى عمق كاف للحصول على شرائح مضيئة ، حيث سيؤدي القسمة الضحلة جدا إلى كتلة إلى عرض مقطعي للزغب / سرداب بدون محتويات مضيئة (الشكل 3A). قم بتلطيخ العينات بعد فترة وجيزة من تقسيمها للحصول على إشارة FISH المثلى، واستخدم DAPI الطازج (أو DAPI المخزن عند -20 درجة مئوية) لحل مشكلات الخلفية (الشكل 3C). قد يؤدي تلطيخ الأسماك للأقسام التي يزيد عمرها عن شهر إلى تلطيخ أكثر فقرا / عدم اتساق.
إذا لم يكن النسيج أو غطاء الأغطية مسطحا تماما فيما يتعلق بالشريحة ، فقد لا تكون العينة في التركيز على كل موضع داخل مسح البلاط (الشكل 3B) ، مما يؤدي إلى إهدار الجهد والbleaching المحتمل. يمكن حل هذا عن طريق إجراء مسح البلاط أصغر التي تم التحقق من جميع المواقف لتكون في التركيز. يمكن أن يؤدي القسمة بشفرات باهتة أيضا إلى انفصال المخاط والمحتويات الإنارة ، والتي تظهر كمنااطق مظلمة كبيرة أثناء التصوير. وأخيرا، يمكن أن يؤدي تبخر المحلول أو الفقاعات أثناء خطوة التهجين إلى تلطيخ غير متساو لمسابير FISH في الأنسجة.
معلمة حاسمة أخرى تؤثر على كفاءة ربط مسبار FISH هي المنافسة بين المسابير المختلفة. فحص مفيد للتحقق من أن المسبار FISH هو وضع العلامات البكتيريا لفحص كولوكالينج الإشارة من التحقيق الأسماك مع DAPI (الشكل 2C، D). في العينات التي تتطلب استخدام مسابير rRNA متعددة ، يصبح ضبط المعلمات مثل درجة حرارة التهجين وتركيز المسبار والفورماميد أمرا حاسما لضمان أن المسابير ملزمة للأنواع الصحيحة بكفاءة18.
ملاحظات حول التصوير
من الأفضل تصور البكتيريا الملطخة بالأسماك باستخدام المجهر الكونفوجكال وهدف التكبير 40x على الأقل. في حين يفضل التكبير 63x لتصوير البكتيريا على مستوى خلية واحدة، يمكن أيضا استخدام التكبير 40x عن طريق تعظيم التكبير الرقمي أو استخدام نظام فائق الدقة. كما أن الأنظمة المجهزة بقدرات فائقة الدقة قد توفر دقة خلوية فرعية للخلايا البكتيرية الفردية. ويمكن استخدام أهداف التكبير أقل للحصول على شعور عام من توطين البكتيريا وسماكة المخاط.
كما يوصى بشدة بالحصول على صور 16 بت بدلا من الصور ذات ال 8 بت ، حيث سيساعد النطاق الديناميكي الأعلى في التقاط النطاق الواسع لإشارة DAPI من النوى الساطعة للغاية للظهارة والإشارة الضعيفة نسبيا للبكتيريا الإنارة. وبصرف النظر عن استخدام إعداد التصوير المذكور أعلاه ، فإن أحد اعتبارات التصوير الهامة هو اختيار الفلوروفوريس. للحصول على أفضل فصل بين الأنواع البكتيرية، تأكد من عدم تداخل الفلوروفوريس المستخدم في أطياف الإثارة والانبعاثات (ما لم يكن التصوير على نظام لديه القدرة على أداء التمثيل الخطي). بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام المسابير في تركيبة (على سبيل المثال، الجمع بين مسبار خاص بالأسرة وتحقيق خاص بالجنس) لتحديد أفراد المجتمع الإضافيين. إذا كان استخدام مسابير خطي أو غير قابلة للتأكد، فمن الضروري لاختبار دقة ومستوى تلطيخ الأسماك على الثقافات النقية8،14.
بمجرد جمع الصور، تتوفر أدوات متعددة للتحليل الكمي للواجهة بين المضيف والميكروبيوتا، مثل BacSpace26 و HiPR-FISH8 وأدوات التقسيم الأخرى27. BacSpace هو برنامج MATLAB يسمح بتقسيم الأنسجة والمكونات الإنارة وإزالة المواد النباتية من images26. كما يقدم البرنامج تحليلا لسماكة المخاط في 2D وكمية التوزيع المكاني على أساس مسافات بكسل في قنوات مختلفة26. وعلى العكس من ذلك، يسمح برنامج تحليل الصور HiPR-FISH بتقسيم الخلايا الملطخة بالأسماك8. وأخيرا، يمكن أيضا تكييف أدوات التقسيم البكتيرية الأخرى التي تم تحسينها للتجارب المختبرية27 لهذا التطبيق.
استنتاج
في التصوير الموقعي تمكن التحليل الكمي للضريبة الميكروبية الفردية في سياق أعضاء المجتمع الآخرين والبيئات الدقيقة المختلفة التي تم إنشاؤها بواسطة النظام الغذائي والمخاط والسراديب الظهارية المضيفة. ويملي التفاعل بين الكائنات الحية بيولوجيا النظم الميكروبية المرتبطة بالمضيف ويوفر تحليلا أساسيا للتغيير في هذه الهياكل أثناء الاضطرابات التي لها آثار على الصحة. وتجدر الإشارة إلى أن القدرة على تصوير الكائنات الحية المجهرية في الموقع من خلال البروتوكول المذكور أعلاه توفر نافذة لا تصدق على الجغرافيا الحيوية للكائنات الحية المجهرية فيما يتعلق بمضيف الحيوان.
Disclosures
ولا يوجد بين أصحاب البلاغ تضارب في المصالح.
Acknowledgments
ويود المؤلفون أن يشكروا الدكتورة كريستين إيرل على تطوير التقنية التي لا تقدر بثمن، وآمبر هان على المساعدة في استكشاف الأخطاء وإصلاحها، والدكتورة جين نغوين وديانا بيبين على المراجعة النقدية للمخطوطة، والدكتور هشام سليمان ومختبر روسي في جامعة كولومبيا البريطانية لتوفير الوصول إلى المجهر. ويعترف المؤلفون بالدعم المقدم من فريق CIHR Grant: المبادرة الكندية للميكروبيوم 2 (C.T.) وكرون والتهاب القولون كندا (إلى C.T. وK.M.N.) ، CIFAR (إلى C.T. و K.M.N.) ، جائزة مايكل سميث للباحثين في مجال البحوث الصحية (إلى C.T.) ، ومؤسسة ويستون: مبادرة الميكروبيوم العائلية ويستون (إلى C.T.) ، جائزة بول ألن المحقق المتميز (إلى C.T.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum foil | |||
| Chloroform | Fisher | C298-500 | Toxic |
| Coplin jar | Fisher | 08-813E | |
| Cover glass, 22 × 22 mm, no #1 | VWR | CA48366-227-1 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Resuspended to 5 mg/mL |
| Empty pipette tip box(es) | To melt paraffin | ||
| Ethanol, anhydrous, molecular grade | -- | -- | |
| FISH probes | |||
| FISH hybridization solution | -- | -- | 20 mM Tris–HCl pH 7.4, 0.9 M NaCl, 0.01% (w/v) SDS in nuclease-free water. Optional addition of 5–50% (v/v) formamide |
| FISH washing buffer | -- | -- | 20 mM Tris–HCl pH 7.4, 0.9 M NaCl |
| Fluorescently-labeled Ulex Europaeus Agglutinin (UEA-1) lectin | Vector Laboratories | FL-1061 (Fluorescein-labeled) or RL-1062-2 (Rhodamine-labeled) | UEA-1 labels fucosylated glycans, so it is not appropriate for germ-free mice or for samples from fucosyltransferase 2 (FUT2)-deficient hosts. |
| Forceps | |||
| Formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | |
| Fumehood | |||
| Glacial Acetic Acid | Fisher | A38-212 | Corrosive and flammable |
| HybriSlip flexible plastic cover slips, 22 x 22 mm × 0.25 mm | Sigma Aldrich | GBL722222 | for FISH hybridization steps, can substitute glass coverslips |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Kimwipes | |||
| Methanol | Fisher | A412 | Toxic and flammable |
| Microtome | for sectioning | ||
| Multipurpose Specimen Storage Containers, 473 mL | Fisher | 14-955-117A | Can substitute with a glass or polyethylene container of your choice. Methacarn is not compatible with polystyrene or metal. |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | Any nail polish should work |
| Oven | Necessary range: 45-60 °C | ||
| Paraffin: Leica Paraplast | Leica | 39601006 | |
| PBS, Phosphate-buffered Saline (10x solution) | Fisher | BP3991 | Dilute to 1x for protocol |
| Sodium chloride | Fisher | S271 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), 20% Solution, RNase-free | Invitrogen | AM9820 | |
| Tissue-Loc HistoScreen Cassettes | Thermo Scientific | CA83009-999 | |
| Trizma hydrochloride solution, 1M Tris-HCl, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2663-1L | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Water, nuclease-free | Fisher | BP2484100 | |
| Xylenes | Fisher | X3P-1GAL | Toxic and flammable |
References
- Tropini, C., Earle, K. A., Huang, K. C., Sonnenburg, J. L. The gut microbiome: connecting spatial organization to function. Cell Host and Microbe. 21 (4), 433-442 (2017).
- Hansson, G. C., Johansson, M. E. V. The inner of the two Muc2 mucin-dependent mucus layers in colon is devoid of bacteria. Gut Microbes. 1 (1), 51-54 (2010).
- Johansson, M. E. V., et al. Normalization of host intestinal mucus layers requires long-term microbial colonization. Cell Host and Microbe. 18 (5), 582-592 (2015).
- Jakobsson, H. E., et al. The composition of the gut microbiota shapes the colon mucus barrier. EMBO Reports. 16 (2), 164-177 (2015).
- Tropini, C., et al. Transient osmotic perturbation causes long-term alteration to the aut microbiota. Cell. 173 (7), 1742-1754 (2018).
- Desai, M. S., et al. A dietary fiber-deprived gut microbiota degrades the colonic mucus barrier and enhances pathogen susceptibility. Cell. 167 (5), 1339-1353 (2016).
- Ng, K. M., et al. Recovery of the gut microbiota after antibiotics depends on host diet, community context, and environmental reservoirs. Cell Host and Microbe. 26 (5), 650-665 (2019).
- Shi, H., et al. Highly multiplexed spatial mapping of microbial communities. Nature. 588 (7839), 676-681 (2020).
- Johansson, M. E. V., Hansson, G. C. Preservation of mucus in histological sections, immunostaining of mucins in fixed tissue, and localization of bacteria with FISH. Methods in Molecular Biology. 842, 229-235 (2012).
- Greuter, D., Loy, A., Horn, M., Rattei, T. ProbeBase-an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes and primers: New features 2016. Nucleic Acids Research. 44 (1), 586-589 (2016).
- Quast, C., et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: Improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Research. 41 (1), 590-596 (2013).
- Beliveau, B. J., et al. OligoMiner provides a rapid, flexible environment for the design of genome-scale oligonucleotide in situ hybridization probes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2183-2192 (2018).
- Madeira, F., et al. The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019. Nucleic Acids Research. 47 (1), 636-641 (2019).
- Welch, J. L. M., Hasegawa, Y., McNulty, N. P., Gordon, J. I., Borisy, G. G. Spatial organization of a model 15-member human gut microbiota established in gnotobiotic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (43), 9105-9114 (2017).
- Lagkouvardos, I., et al. Sequence and cultivation study of Muribaculaceae reveals novel species, host preference, and functional potential of this yet undescribed family. Microbiome. 7 (1), 28 (2019).
- Zadeh, J. N., et al. NUPACK: Analysis and design of nucleic acid systems. Journal of Computational Chemistry. 32 (1), 170-173 (2011).
- Yilmaz, L. S., Parnerkar, S., Noguera, D. R. MathFISH, a web tool that uses thermodynamics-based mathematical models for in silico evaluation of oligonucleotide probes for fluorescence in situ hybridization. Applied and Environmental Microbiology. 77 (3), 1118-1122 (2011).
- Huber, D., Voith von Voithenberg, L., Kaigala, G. V. Fluorescence in situ hybridization (FISH): History, limitations and what to expect from micro-scale FISH. Micro and Nano Engineering. 1, 15-24 (2018).
- Wang, Y., et al. Laser capture microdissection and metagenomic analysis of intact mucosa-associated microbial communities of human colon. Applied Microbiology and Biotechnology. 88 (6), 1333-1342 (2010).
- Geva-Zatorsky, N., et al. In vivo imaging and tracking of host–microbiota interactions via metabolic labeling of gut anaerobic bacteria. Nature medicine. 21 (9), 1091-1100 (2015).
- Jemielita, M., et al. Spatial and temporal features of the growth of a bacterial species colonizing the zebrafish gut. mBio. 5 (6), 01751 (2014).
- Hasegawa, Y., Mark Welch, J. L., Rossetti, B. J., Borisy, G. G. Preservation of three-dimensional spatial structure in the gut microbiome. PLoS ONE. 12 (11), 0188257 (2017).
- Zhanmu, O., et al. Maintenance of fluorescence during paraffin embedding of fluorescent protein-labeled specimens. Frontiers in Neuroscience. 13, 752 (2019).
- Bergstrom, K., et al. Proximal colon-derived O-glycosylated mucus encapsulates and modulates the microbiota. Science. 370 (6515), 467-472 (2020).
- Jones, M. V., Calabresi, P. A. Agar-gelatin for embedding tissues prior to paraffin processing. BioTechniques. 42 (5), 569-570 (2007).
- Earle, K. A., et al. Quantitative imaging of gut microbiota spatial organization. Cell Host and Microbe. 18 (4), 478-488 (2015).
- Jeckel, H., Drescher, K. Advances and opportunities in image analysis of bacterial cells and communities. FEMS Microbiology Reviews. , (2020).
