Detta strömlinjeformade protokoll beskriver ett arbetsflöde för att upptäcka och avbilda bakterier i komplexa vävnadsprover, från fixering av vävnaden till färgning av mikrober med fluorescerande in situ-hybridisering .
Att mäta lokalisering av mikrober i deras in vivo-sammanhang är ett viktigt steg för att avslöja de funktionella relationerna mellan mikrobiotan och ryggradsdjurens tarm. Tarmflorans rumsliga landskap styrs tätt av fysiska egenskaper – tarmslem, krypter och veck – och påverkas av värdkontrollerade egenskaper som pH, syretillgänglighet och immunfaktorer. Dessa egenskaper begränsar förmågan hos både commensala mikrober och patogener att kolonisera tarmen stabilt. På mikronskalan bestämmer den mikrobiella organisationen närområdets interaktioner mellan olika mikrober samt interaktionerna mellan mikrober och deras värd. Dessa interaktioner påverkar sedan storskalig organfunktion och värdhälsa.
Detta protokoll möjliggör visualisering av den rumsliga organisationen för tarmfloran från avstånd mellan celler till organomfattande skalor. Metoden är baserad på att fixera tarmvävnader samtidigt som tarmstrukturen och slemegenskaperna bevaras. De fasta proverna bäddas sedan in, delas upp och färgas för att belysa specifika bakteriearter genom fluorescens in situ hybridisering (FISH). Värdfunktioner, såsom slem och värdcellskomponenter, är märkta med fluorescerande märkta lektiner. Slutligen avbildas de färgade sektionerna med hjälp av ett konfokalt mikroskop som använder kakel-skanningsavbildning vid hög förstoring för att överbrygga mikron till centimeter längdskalor. Denna typ av avbildning kan tillämpas på tarmsektioner från djurmodeller och tarmbiopsier från mänskliga vävnader för att bestämma mikrobiotans biogeografi i tarmen vid hälsa och sjukdom.
Mikrobiella visualiseringstekniker har ursprung som är lika gamla som mikrobiologin själv, när Antonie Van Leeuwenhoek använde sitt mikroskop för att observera bakterier (som han kallade “animalcules”) från tandplack och avföring på 1600-talet. Sedan dess har många tekniker utvecklats för att visualisera den rumsliga organisationen av konsortiet av bakterier, svampar och virus som lever associerade med en värd-mikrobiota1. Att klargöra lokaliseringen av dessa mikrober är avgörande för att bestämma deras funktion inom deras djurvärd. Bakteriens biogeografi är viktig i både kommensala och patogena taxa, eftersom närheten till specifika platser (t.ex. epitel), näringssubstrat och specifika mikrober kan diktera bakteriell produktion av metaboliter som ligger till grund för interspecies och interaktioner mellan kungariken.
En nyckelstruktur som separerar bakterier och värdvävnader på flera olika kroppsplatser, såsom munhålan, tarmarna eller lungan, är slemmet – ett värdproducerat skikt som både förhindrar mikrobiell flyttning på värdepitetelcellerna och fungerar som en näringsresurs för mikrobiota2,3,4 . Att karakterisera överträdelser och förändringar i denna barriär är av avgörande betydelse, vilket leder till mekanistisk insikt i värd-mikrobiota interaktioner som inte skulle erhållas genom sekvensering ensam5,6,7. Till exempel möjliggjorde avbildning upptäckten att antibiotikaexponering kan störa slemskiktet och mikrobiotaorganisationen7,8, och att laxermedel kan tömma slemmet och korrelera med stora förändringar i immunparametrar5.
Detta protokoll beskriver en allmän ram för fixering, färgning och avbildning av mikrobiotan och värdvävnaden (figur 1), byggd på Johanssons och Hansson9:s arbete. Medan detta protokoll är modellerat i samband med tarmsektioner, kan det enkelt anpassas till andra vävnadstyper. Detta protokoll möjliggör bearbetning av antingen experimentella animaliska eller mänskliga kliniska prover. Anteckningar för bearbetning av båda typerna av prover har inkluderats. I exemplet som presenteras här har värd epitel och luminal bakterier samtidigt märkts med 4′,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) färgning, slem med fluorescein (FITC)-konjugerat lectin, Ulex europaeus agglutinin I (UEA-1), och en specifik bakteriell taxon med FISH. FISH-sonder är vanligtvis utformade mot en taxons 16S rRNA-gener för att säkerställa den höga signalen från att binda en högkopia transkription.
I det här exemplet riktar sonden in sig på 16S rRNA i bakteriefamiljen Muribaculaceae (figur 2). Fläckarna ersätts dock lätt med olika FISH-sonder och/eller lektiner för att tillgodose lämplig biologisk fråga. Tidigare validerade FISH-sonder finns på ProbeBase10, en onlineresurs för rRNA-riktade oligonukleotidsonder, eller på SILVA11, en ribosomal RNA-databas. För konstruktion av nya sonder kan läsaren hänvisa till nya rörledningar som HiPR-FISH8 eller Oligominer12. Med hjälp av detta protokoll är det möjligt att observera den nära packningen av bakterier i tarmlumen och de olika egenskaperna hos tarmslem i hela matsmältningssystemet. Arbetsflödet som beskrivs här möjliggör kvantitativ analys av mikrobiotan i den rumsliga kontexten för dess värdmiljö.
Protokollet som beskrivs ovan ger en reproducerbar metod för att visualisera värd-mikrobiota-gränssnittet. Dessa analyser har avsevärt dragit nytta av protokollutveckling, från optimering av FISH märkning18 till slem bevarande och imaging9. Fixering och inbäddning ger också användbar lagring av prover. Dessutom kan paraffininfiltrerade kassetter skickas utan några begränsningar, eftersom proverna är helt fasta och inert.
Betydelse och alternativa metoder
Kombinationen av FISH och slemfärgning möjliggör analys av mikrobiotasammansättning på specifika vävnadsplatser och interaktionen mellan enskilda bakterier och värden. Alternativa tekniker som involverar analys av specifika platser inom mikrobiotan kan vanligtvis inte utforska encelliga karaktären hos dessa interaktioner, såsom laserfångstmikmikrodissektion i kombination med sekvensering19. Sekvenseringsbaserade tekniker har dock fördelen att kunna fånga den genetiska upptagningen av mikrobiotan på en finare nivå och mer allmänt än 16S rRNA-sonder.
En fallgrop i protokollet som presenteras är att det ger en engångs ögonblicksbild av mikrobiotan i förhållande till värden. För realtidsavbildning hos levande djur krävs särskilda avbildningstekniker för att underlätta förvärvet av en fluorescenssignal i djup vävnad (t.ex. intravital tvåfotonmikroskopi och ljusplåt fluorescensmikroskopi20,21). I dessa metoder koloniseras modellorganismen antingen med bakterier som är färgade med molekyler som binder till deras kuvert20 eller genetiskt modifierade bakterier som hyser fluorescerande proteiner21. I det senare fallet är mognaden av fluorescensproteiner en nyckelfråga eftersom de flesta vanliga fluorescerande proteiner kräver syre för att avge ljus. Därför krävs modellorganismer som har åtminstone nanaeroba miljöer (nanomolekylkoncentration av syre), såsom den aeroba zebrafisken gut21.
I detta protokoll används metanol-Carnoy som fixativ istället för paraformaldehyd eller formalin eftersom det inte innehåller vatten. Detta förhindrar hydrering, uttorkning och kollaps av slemskiktet under bearbetningen och underlättar noggranna mätningar av slemtjocklek. Medan methacarn fixering och paraffin inbäddning har blivit en standard i fältet, olika fixativ och inbäddningstekniker har undersökts för att optimera slem bevarande9,22, med vissa studier som indikerar att hartser kan vara överlägsen paraffin inbäddning22. En annan viktig begränsning för paraffininbäddning och metakarnfixering är förlusten av fluorescerande proteinfluorescens, vilket kan undvikas genom att använda alternativa fixativ (t.ex. formalin eller paraformaldehyd (PFA)) eller modifierade inbäddningstekniker23. Varje fixativ har fördelar och nackdelar, och valet av fixativ beror på bildprioriteringarna. Bildframställning modaliteter kan kombineras om biologiska replikat fixeras i antingen PFA och metaheras och bilder erhålls från båda proverna.
FISH har kombinerats med immunofluorescens i isolerade fall med specifika anti-Muc2C3 kanin polyklonala antikroppar9,24. Dessa resultat har inte reproducerats i stor utsträckning med andra Muc2 antikroppar, vilket tyder på att valet av antikroppar kan vara avgörande för framgången för FISH-immunofluorescens kombinationen. Villkoren för framgångsrik antikroppsfärgning för en given antikropp får inte tillåta kvarhållande av FISH-färgning.
Felsökning
I det här protokollet representerar prov insamling, avsnitt och färgning kritiska steg för att förhindra att avbildnings artefakter skapas. Till exempel kan tryck på vävnaden vid insamling och före inbäddning leda till mislocalization av mikrobiotan och påverka slemkvaliteten. En annan viktig faktor är att undvika att kombinera segment av mycket olika tjocklekar i en enda kassett, såsom en relativt tom bit av tunntarmen och en pellet inom det distala tjocktarmen. De olika tjocklekarna leder till svårigheter vid avbildning: efter inbäddning kan tvärgående sektionering på ett visst djup för ett segment vara på fel djup för avbildning för det andra (t.ex. lumen kommer att vara på olika djup för varje vävnad) (figur 1B, C och figur 3A). För avbildning av djurmodell avföring pellets, de kan också vara inslagna i peritoneal membran24. I denna teknik viks en liten del av nyisolerad bukhinnan försiktigt runt avföringen och bevarar pelletens struktur under de tvättsteg som beskrivs i protokollet.
Till skillnad från bearbetning av djurvävnad med innehåll innebär avbildning av mänskliga tarmprover vissa utmaningar. Specifikt kommer luminal innehåll och slemhinnan foder sannolikt att störas av koloskopi tarm beredning vanligtvis utförs före intestinala tarm tarm tarm eller samband förfaranden. Dessutom, när tarmbiopsier samlas in, är det bra att notera vävnadsorienteringen för att hjälpa till att identifiera specifika egenskaper (t.ex. lumen kontra submucosa) i avsaknad av tarminnehåll. Förinbäddning med 3% agar och/eller agar:gelatin blandningar kan vara användbara för att upprätthålla vävnad polaritet25; Det finns dock problem med uttorkning och utsektion av agar, som rapporterats i litteraturen, och bearbetningstider kan behöva ändras.
En viktig aspekt för att uppnå god FISKfärgning kommer från att justera formamidkoncentrationen för specifika FISH-sonder. Formamid kommer att kontrollera hybridiseringssträngen hos FISH-sonder till sina mål. Det är viktigt att se till att a) rätt formamidkoncentration väljs för att färga ett visst samhälle, och b) att en lämplig formamidkoncentration till och med är möjlig för den sondkombination som används – detta kan påverka det optimala sondvalet vid användning av flera sonder. Webbplatser som mathFISH (http://mathfish.cee.wisc.edu/) kan hjälpa till att beräkna rätt formamidkoncentrationer för en viss sond. I avsaknad av information om lämpliga formamidkoncentrationer kan detta protokoll testas med 0% och 10% formamid.
Om du delar upp de inbäddade proverna måste blocket skäras till ett tillräckligt djup för att erhålla luminalskivor, eftersom sektionering för grunt i ett block resulterar i en tvärsnittsvy av villi/krypterna utan luminalt innehåll (figur 3A). Färga proverna strax efter sektionering för optimal FISH-signal och använd färsk DAPI (eller DAPI lagrad vid -20 °C) för att lösa bakgrundsproblem (figur 3C). FISKfärgning av sektioner som är mer än en månad gamla kan leda till sämre/ inkonsekvent färgning.
Om vävnaden eller täckslipet inte är helt platt med avseende på bilden, kanske provet inte är i fokus på varje position inom en kakelskanning (figur 3B), vilket leder till bortkastad ansträngning och potentiell fotoblekning. Detta kan lösas genom att ta mindre kakel skanningar där alla positioner har verifierats vara i fokus. Sektionering med tråkiga blad kan också leda till att slem och luminalt innehåll lossnar, som visas som stora mörka områden vid avbildning. Slutligen kan avdunstning av lösningen eller bubblorna under hybridiseringssteget leda till ojämn färgning av FISH-sonder i vävnaden.
En annan kritisk parameter som påverkar effektiviteten hos FISH-sondens bindning är konkurrensen mellan olika sonder. En användbar kontroll för att verifiera att FISH-sonden märker bakterier är att undersöka colocalization av signalen från FISH-sonden med DAPI (figur 2C,D). I prover som kräver användning av flera rRNA-sonder blir justering av parametrar som hybridiseringstemperatur, sondkoncentration och formamid avgörande för att säkerställa att sonder är bindande för rätt art effektivt18.
Anteckningar om bildbehandling
FISH-färgade bakterier visualiseras bäst med hjälp av ett konfokalt mikroskop och ett mål på minst 40x förstoring. Medan 63x förstoring föredras framför att avbilda bakterier på encellsnivå, kan 40x förstoring också användas genom att maximera den digitala zoomen eller använda ett superupplösningssystem. System utrustade med superupplösningsfunktioner kan också ge subcellulär upplösning av enskilda bakterieceller. Lägre förstoringsmål kan användas för att få en allmän känsla av bakteriell lokalisering och slemtjocklek.
Att skaffa 16-bitars bilder istället för 8-bitars bilder rekommenderas också starkt, eftersom det högre dynamiska intervallet hjälper till att fånga dapi-signalens breda utbud från epitelets extremt ljusa kärnor och den relativt svaga signalen av luminala bakterier. Förutom att använda bildframställningen som beskrivs ovan är ett viktigt bildbehandlingsövervägande valet av fluoroforer. För bästa separation mellan bakterietyper, se till att de fluoroforer som används inte överlappar vid excitation och emissionsspektra (såvida inte avbildning på ett system med förmåga att utföra linjär blandning). Dessutom kan sonder användas i kombination (t.ex. kombinationen av en familjespecifik sond och en släktspecifik sond) för att identifiera ytterligare samhällsmedlemmar. Om du använder linjära blandningar eller icke-specificerade sonder är det viktigt att testa noggrannheten och nivån av FISH-färgning på rena kulturer8,14.
När bilderna har samlats in är flera verktyg tillgängliga för kvantitativ analys av värd-mikrobiota-gränssnittet, till exempel BacSpace26, HiPR-FISH8 och andra segmenteringsverktyg27. BacSpace är en MATLAB-programvara som möjliggör segmentering av vävnad och luminalkomponenter och avlägsnande av växtmaterial från bilder26. Programmet ger också analys av slemtjocklek i 2D och kvantifiering av rumslig fördelning baserat på pixelavstånd i olika kanaler26. Omvänt tillåter HiPR-FISH Image Analysis-programvaran segmentering av FISH-färgade celler8. Slutligen kan andra bakteriella segmenteringsverktyg som har optimerats för in vitro-experiment27 också anpassas till denna applikation.
Slutsats
In situ imaging möjliggör kvantitativ analys av enskilda mikrobiella taxa i samband med andra samhällsmedlemmar och de olika mikromiljön som skapats av kost, slem och värd epitelial krypter. Interaktionen mellan organismer dikterar biologin hos värdassocierade mikrobiella system och ger en väsentlig analys av förändringar i dessa strukturer under perturbation som har konsekvenser för hälsan. I synnerhet ger förmågan att avbilda mikrobiotan in situ genom protokollet som beskrivs ovan ett otroligt fönster in i mikrobiotans biogeografi i förhållande till djurvärden.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Dr. Kristen Earle för ovärderlig teknikutveckling, Amber Hann för felsökningshjälp, Dr. Jen Nguyen och Deanna Pepin för kritisk granskning av manuskriptet och Dr. Hesham Soliman och Rossi-labbet vid University of British Columbia för att ge mikroskopåtkomst. Författarna bekräftar stöd från CIHR Team Grant: Canadian Microbiome Initiative 2 (C.T.), Crohns och Colitis Canada (till C.T. och K.M.N.), CIFAR (till C.T. och K.M.N.), Michael Smith Foundation for Health Research Scholar Award (till C.T.), Weston Foundation: Weston Family Microbiome Initiative (till C.T.), Paul Allen Distinguished Investigator Award (till C.T.).
Aluminum foil | |||
Chloroform | Fisher | C298-500 | Toxic |
Coplin jar | Fisher | 08-813E | |
Cover glass, 22 × 22 mm, no #1 | VWR | CA48366-227-1 | |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Resuspended to 5 mg/mL |
Empty pipette tip box(es) | To melt paraffin | ||
Ethanol, anhydrous, molecular grade | — | — | |
FISH probes | |||
FISH hybridization solution | — | — | 20 mM Tris–HCl pH 7.4, 0.9 M NaCl, 0.01% (w/v) SDS in nuclease-free water. Optional addition of 5–50% (v/v) formamide |
FISH washing buffer | — | — | 20 mM Tris–HCl pH 7.4, 0.9 M NaCl |
Fluorescently-labeled Ulex Europaeus Agglutinin (UEA-1) lectin | Vector Laboratories | FL-1061 (Fluorescein-labeled) or RL-1062-2 (Rhodamine-labeled) | UEA-1 labels fucosylated glycans, so it is not appropriate for germ-free mice or for samples from fucosyltransferase 2 (FUT2)-deficient hosts. |
Forceps | |||
Formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | |
Fumehood | |||
Glacial Acetic Acid | Fisher | A38-212 | Corrosive and flammable |
HybriSlip flexible plastic cover slips, 22 x 22 mm × 0.25 mm | Sigma Aldrich | GBL722222 | for FISH hybridization steps, can substitute glass coverslips |
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
Kimwipes | |||
Methanol | Fisher | A412 | Toxic and flammable |
Microtome | for sectioning | ||
Multipurpose Specimen Storage Containers, 473 mL | Fisher | 14-955-117A | Can substitute with a glass or polyethylene container of your choice. Methacarn is not compatible with polystyrene or metal. |
Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | Any nail polish should work |
Oven | Necessary range: 45-60 °C | ||
Paraffin: Leica Paraplast | Leica | 39601006 | |
PBS, Phosphate-buffered Saline (10x solution) | Fisher | BP3991 | Dilute to 1x for protocol |
Sodium chloride | Fisher | S271 | |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), 20% Solution, RNase-free | Invitrogen | AM9820 | |
Tissue-Loc HistoScreen Cassettes | Thermo Scientific | CA83009-999 | |
Trizma hydrochloride solution, 1M Tris-HCl, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2663-1L | |
Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
Water, nuclease-free | Fisher | BP2484100 | |
Xylenes | Fisher | X3P-1GAL | Toxic and flammable |