Summary
Detta strömlinjeformade protokoll beskriver ett arbetsflöde för att upptäcka och avbilda bakterier i komplexa vävnadsprover, från fixering av vävnaden till färgning av mikrober med fluorescerande in situ-hybridisering .
Abstract
Att mäta lokalisering av mikrober i deras in vivo-sammanhang är ett viktigt steg för att avslöja de funktionella relationerna mellan mikrobiotan och ryggradsdjurens tarm. Tarmflorans rumsliga landskap styrs tätt av fysiska egenskaper - tarmslem, krypter och veck - och påverkas av värdkontrollerade egenskaper som pH, syretillgänglighet och immunfaktorer. Dessa egenskaper begränsar förmågan hos både commensala mikrober och patogener att kolonisera tarmen stabilt. På mikronskalan bestämmer den mikrobiella organisationen närområdets interaktioner mellan olika mikrober samt interaktionerna mellan mikrober och deras värd. Dessa interaktioner påverkar sedan storskalig organfunktion och värdhälsa.
Detta protokoll möjliggör visualisering av den rumsliga organisationen för tarmfloran från avstånd mellan celler till organomfattande skalor. Metoden är baserad på att fixera tarmvävnader samtidigt som tarmstrukturen och slemegenskaperna bevaras. De fasta proverna bäddas sedan in, delas upp och färgas för att belysa specifika bakteriearter genom fluorescens in situ hybridisering (FISH). Värdfunktioner, såsom slem och värdcellskomponenter, är märkta med fluorescerande märkta lektiner. Slutligen avbildas de färgade sektionerna med hjälp av ett konfokalt mikroskop som använder kakel-skanningsavbildning vid hög förstoring för att överbrygga mikron till centimeter längdskalor. Denna typ av avbildning kan tillämpas på tarmsektioner från djurmodeller och tarmbiopsier från mänskliga vävnader för att bestämma mikrobiotans biogeografi i tarmen vid hälsa och sjukdom.
Introduction
Mikrobiella visualiseringstekniker har ursprung som är lika gamla som mikrobiologin själv, när Antonie Van Leeuwenhoek använde sitt mikroskop för att observera bakterier (som han kallade "animalcules") från tandplack och avföring på 1600-talet. Sedan dess har många tekniker utvecklats för att visualisera den rumsliga organisationen av konsortiet av bakterier, svampar och virus som lever associerade med en värd-mikrobiota1. Att klargöra lokaliseringen av dessa mikrober är avgörande för att bestämma deras funktion inom deras djurvärd. Bakteriens biogeografi är viktig i både kommensala och patogena taxa, eftersom närheten till specifika platser (t.ex. epitel), näringssubstrat och specifika mikrober kan diktera bakteriell produktion av metaboliter som ligger till grund för interspecies och interaktioner mellan kungariken.
En nyckelstruktur som separerar bakterier och värdvävnader på flera olika kroppsplatser, såsom munhålan, tarmarna eller lungan, är slemmet - ett värdproducerat skikt som både förhindrar mikrobiell flyttning på värdepitetelcellerna och fungerar som en näringsresurs för mikrobiota2,3,4 . Att karakterisera överträdelser och förändringar i denna barriär är av avgörande betydelse, vilket leder till mekanistisk insikt i värd-mikrobiota interaktioner som inte skulle erhållas genom sekvensering ensam5,6,7. Till exempel möjliggjorde avbildning upptäckten att antibiotikaexponering kan störa slemskiktet och mikrobiotaorganisationen7,8, och att laxermedel kan tömma slemmet och korrelera med stora förändringar i immunparametrar5.
Detta protokoll beskriver en allmän ram för fixering, färgning och avbildning av mikrobiotan och värdvävnaden (figur 1), byggd på Johanssons och Hansson9:s arbete. Medan detta protokoll är modellerat i samband med tarmsektioner, kan det enkelt anpassas till andra vävnadstyper. Detta protokoll möjliggör bearbetning av antingen experimentella animaliska eller mänskliga kliniska prover. Anteckningar för bearbetning av båda typerna av prover har inkluderats. I exemplet som presenteras här har värd epitel och luminal bakterier samtidigt märkts med 4′,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) färgning, slem med fluorescein (FITC)-konjugerat lectin, Ulex europaeus agglutinin I (UEA-1), och en specifik bakteriell taxon med FISH. FISH-sonder är vanligtvis utformade mot en taxons 16S rRNA-gener för att säkerställa den höga signalen från att binda en högkopia transkription.
I det här exemplet riktar sonden in sig på 16S rRNA i bakteriefamiljen Muribaculaceae (figur 2). Fläckarna ersätts dock lätt med olika FISH-sonder och/eller lektiner för att tillgodose lämplig biologisk fråga. Tidigare validerade FISH-sonder finns på ProbeBase10, en onlineresurs för rRNA-riktade oligonukleotidsonder, eller på SILVA11, en ribosomal RNA-databas. För konstruktion av nya sonder kan läsaren hänvisa till nya rörledningar som HiPR-FISH8 eller Oligominer12. Med hjälp av detta protokoll är det möjligt att observera den nära packningen av bakterier i tarmlumen och de olika egenskaperna hos tarmslem i hela matsmältningssystemet. Arbetsflödet som beskrivs här möjliggör kvantitativ analys av mikrobiotan i den rumsliga kontexten för dess värdmiljö.
Protocol
Alla djurförsök och vävnadssamling som beskrivs i detta protokoll utfördes i enlighet med Canadian Council on Animal Care (CCAC) riktlinjer och godkändes av Animal Care Committee vid University of British Columbia. Bakteriefria schweiziska Webster möss användes. Alla djur var 8-10 veckor gamla, båda könen användes och alla möss var samhyst med minst två möss per bur. Djur avlivades med hjälp av koldioxid med sekundär massundersökning förskjutning eller hjärt punktering.
1. Utforma ett bildexperiment: överväganden och provsamling
- FISH-sonddesign
- Om det finns en lämplig FISH-avsökning väljer du en befintlig publicerad som visar en stark signal i märkta celler jämfört med bakgrunden.
- Validera nya sonder in vitro för att bestämma deras effektivitet av bindning till fasta prover av målbakterierna och utanför målet som binder till andra bakterier.
- Kontrollera alla 16S FISH-sonder som ska användas mot 16S-sekvenser från målorganismen eller mot 16S rRNA-sekvensering från de prover som ska analyseras för att säkerställa att den förväntade andelen positiva matchningar finns och att sonder inte binder icke-specifikt till andra mikrobiotamedlemmar.
- Rikta FISH-sonder mot antingen fullängdssekvenser eller ampliconsekvensvarianter med hjälp av ett verktyg, till exempel Clustal Omega13, för att utvärdera den potentiella bindningen av sonder och deras mål.
- Förutom silico-testning, testa noggrannheten och nivån av FISH-färgning av icke-specificerade sonder på rena kulturer8,14.
OBS: Vid färgning av flera samhällsmedlemmar kan sonder användas kombinat (t.ex. kombinationen av en familjespecifik sond och en släktspecifik sond) om de fluoroforer som används inte överlappar vid excitation och emissionsspektra (såvida inte avbildning på ett system med förmåga att utföra linjär avblandning). Dessutom kan specificitet påvisas genom att inkludera specificitetskontroller/förvrängda sonder eller genom konkurrens med icke-fluorescerande sonder.
- Provtyper och vävnadsinsamling
- Med hjälp av vassa och rena verktyg skär tarmsegment från gnotobiotiska schweiziska Webstermöss för avbildning. Minimera störande av provet så mycket som möjligt och hantera sektionerna i kanterna för att undvika att bildområdet påverkas. Fixera provet så snart som möjligt efter dissekering för att förhindra nedbrytning.
OBS: För djurstudier är intakta, opåverkade tarmsektioner att föredra; membranet hjälper till att hålla den luminal- och slemhinnan intakt. - Rengör verktyg genom att torka dem med 70% etanol mellan prover och platser. Få minst tre biologiska replikat per tarmsektion/biopsi plats, var noga med att prova konsekventa intestinala platser, eftersom slem och intestinal arkitektur samt mikrobiota förändras avsevärt på olika platser.
- Med hjälp av vassa och rena verktyg skär tarmsegment från gnotobiotiska schweiziska Webstermöss för avbildning. Minimera störande av provet så mycket som möjligt och hantera sektionerna i kanterna för att undvika att bildområdet påverkas. Fixera provet så snart som möjligt efter dissekering för att förhindra nedbrytning.
2. Vävnadsprovfixering och infiltration
- Fixering
- Förbered färsk metakarn i en kompatibel behållare med följande förhållanden: 60% absolut metanol, 30% kloroform och 10% glaciär ättiksyra. Dispensera var och en av dessa kemikalier i en rökhuv. Välj en behållare som kan ventileras genom att öppna locket. Eftersom metakarn inte är kompatibelt med polystyren, förbered det i en polyetenbehållare med hjälp av glasutexaminerade cylindrar / serologiska pipetter för kloroform och glaciär ättiksyra.
OBS: Under blandning produceras ångor och kan orsaka tryck att byggas upp inuti behållaren. Det är tillrådligt att hålla behållaren relativt tätt stängd när den har avlägsnats från rökhuven om proverna inte tillsätts aktivt. Kloroform är giftig; andas inte in, svälja eller absorbera genom huden. Metanol är giftigt och mycket brandfarligt; andas inte in, svälja eller absorbera genom huden. Glacial ättiksyra är brandfarlig och mycket frätande för huden och ögonen. - Efter dispensering stänger du behållaren, virvlar runt för att blanda och ventilera sedan; upprepa detta tills avgasningen har upphört (och trycket inte längre byggs upp märkbart under locket).
OBS: Kassera inte metakärn i avlopp; samla in och bortskaffa så farligt kemiskt avfall enligt institutionella riktlinjer. Använd en penna för att märka histologikassetter, eftersom många pennfärger kommer att lossna i metakarnlösningen. - Placera tarmsektionerna i histologikassetter genom att försiktigt hålla en kant av vävnaden med pincett. Stäng kassetten och dränk den helt i färsk metakarnlösning. Se till att lösningen inte är äldre än några timmar efter nedsänkning av kassetterna.
- För kliniska prover som kommer att samlas in i en klinisk svit utan tillgång till en rökhuv, använd en polyetenlagringsbehållare med en lock skuren i locket som tillåter passage av histologikassetterna. Tejpa fast denna flik när du inte passerar prover för att förhindra att giftiga ångor läcker ut.
OBS: Det är viktigt att använda maskeringstejp för att undvika upplösning av lim på behållaren - vissa typer av tejp (t.ex. plastförpackningstejp) kanske inte håller bra till metakarnångorna. - Fixera proverna i minst 3 timmar och högst två veckor.
OBS: Tjockare prover kan kräva fixeringstider längre än 3 h. Fixeringstid kan väljas för att möjliggöra samtidig bearbetning av paraffininfiltration för kassetter som är fasta i olika metavästlösningar (t.ex. för att samtidigt utföra paraffininfiltration på grupper av prover som samlats in och fastställts under två veckor).
- Förbered färsk metakarn i en kompatibel behållare med följande förhållanden: 60% absolut metanol, 30% kloroform och 10% glaciär ättiksyra. Dispensera var och en av dessa kemikalier i en rökhuv. Välj en behållare som kan ventileras genom att öppna locket. Eftersom metakarn inte är kompatibelt med polystyren, förbered det i en polyetenbehållare med hjälp av glasutexaminerade cylindrar / serologiska pipetter för kloroform och glaciär ättiksyra.
- Paraffin infiltration och inbäddning
- Placera paraffinet i en värmebeständig behållare och smält det i en ugn vid 60 °C över natten. Eftersom paraffinpellets tar mer plats innan de smälter, se till att tillräckligt paraffin smälts för att täcka alla kassetter.
OBS: Temperaturen bör inte vara högre än 60 °C eftersom det kan ge upphov till artefakter. - Tvätta vävnaden genom att hälla ut vätskan i lämpligt avfallsbehållare och omedelbart ersätta den med följande kemikalier.
- Inkubera i absolut metanol i 30 minuter.
- Inkubera i absolut etanol i 20 minuter.
- Inkubera i xylener i 15 minuter.
- Byt tvättar snabbt, var försiktig så att kassetterna inte får torka. Se till att varje tvätt helt täcker kassetterna i bägaren eller behållaren.
OBS: Xylenes är brandfarliga, och vid inandning kan ångorna trycka ner centrala nervsystemet med potentiella långsiktiga neurologiska konsekvenser vid exponering för höga koncentrationer (> 200 ppm). Hantera xylener endast i en rökhuv. Eftersom xylener är farliga, var noga med att använda den minsta mängd som krävs för att täcka de histologiska kassetterna.
- Under inbäddningen orienterar du tarmsegmenten parallellt med kassettens längd (i motsats till upprätt) med pincett för att tillhandahålla längsgående tvärgående sektioner i stället för tvärsnittsmunkar för att ge mer potentiellt provområde för kvantitativ avbildning (figur 1B).
- Öppna kassetterna något (~ 1-2 cm eller 0,5 tum) så att paraffinet kan komma in utan att förlora vävnadssegmenten. Använd dubbla handskar för detta steg eller pincett för att förhindra överhettning eller mild bränning av fingrarna. Sänk ned och stäng kassetterna i behållaren med smält paraffin och placera behållaren tillbaka i 60 °C-ugnen. Se till att kassetterna är fyllda med paraffin och att inga stora luftbubblor finns kvar.
- Efter inkubation i 2 h vid 60 °C, ta bort behållaren från ugnen. Använd tång, ta försiktigt bort kassetterna och lägg dem individuellt på en bit aluminiumfolie för att svalna. Förvara dem i rumstemperatur tills de är klara för inbäddning och sektionering.
- Dela upp paraffinblocken med en mikrotom, dela upp tillräckligt djupt i blocket som luminalt innehåll exponeras, vilket möjliggör en längsgående del av villi och/ eller krypter förutom luminalt innehåll och slem. Var noga med att byta ut bladen eftersom fekalt material dämpar bladet snabbt jämfört med vävnad. Kapa sektioner till 4 μm tjocklek för optimal skärpa på bilderna. Överför sektionerna till vanliga obelagda diabilder.
- För FISH-färgning, färga tarmsektionerna så snart som möjligt (dvs. inom några veckor efter sektionering) för att uppnå en stark FISH-signal. Om du utelämnar FISKfärgning kan lectin + DAPI-färgning utföras på mindre färska (dvs. månader gamla) prover utan betydande signalförlust.
- Placera paraffinet i en värmebeständig behållare och smält det i en ugn vid 60 °C över natten. Eftersom paraffinpellets tar mer plats innan de smälter, se till att tillräckligt paraffin smälts för att täcka alla kassetter.
3. Färgning av bakterier och värdfunktioner
- Förberedelse
- Värm ugnen till 60 °C. Förvärm en tom Coplin-burk och tillräckligt med volym för att täcka glasglasglasen i burken två gånger med xytoner i en glasflaska, var noga med att parafilma runt locket för att förhindra avdunstning av xylenerna. Låt temperaturen på xylenerna nå 60 °C.
OBS: En standard Coplin-burk passar 8 diabilder, och bilderna kan täckas med ungefär 50 ml vätska (kan variera mellan 40 och 60 ml beroende på märke). Xylenersättning är mindre giftiga och har framgångsrikt använts av andra grupper för avvaxningsteget (steg 3.2)8,9. - Om en separat ugn finns tillgänglig, förvärm en hybridiseringsugn till 50 °C. Annars kan detta steg utföras med samma ugn som används för att baka rutschkanorna efter steg 3.2.3.
- Förbered FISH-hybridiseringslösningen: 20 mM Tris-HCl, pH 7,4; 0,9 M NaCl; 0,01%26 - 0,1%9 (w/v) natrium dodecylsulfat (SDS) i nukleasfritt vatten. Vid behov, tillsätt 5-50% (v/v) formamid. Förvärm denna hybridiseringslösning vid 50 °C under avparaffinering.
OBS: Formamid är en amid som fungerar som en teratogen; hantera formamid med handskar och skyddsglasögon. I små doser och vid exponering för ögon, hud eller slemhinnor är det irriterande. I stora mängder kan formamidånga kräva medicinsk intervention. Formamid kan förvaras vid 100% i en -20 °C frys.
- Värm ugnen till 60 °C. Förvärm en tom Coplin-burk och tillräckligt med volym för att täcka glasglasglasen i burken två gånger med xytoner i en glasflaska, var noga med att parafilma runt locket för att förhindra avdunstning av xylenerna. Låt temperaturen på xylenerna nå 60 °C.
- Förbereda bilderna för färgning: deparaffinering
- Placera rutschkanorna i Coplin-burken, se till att sektionerna inte kommer i kontakt med andra diabilder eller burken, och grädda rutschkanorna vid 60 °C i 10 min.
- Fyll Coplin-burken med förvärmda xytoner från ugnen i rökhuven, var noga med att inte hälla direkt ovanpå proverna och eventuellt lossa vävnaderna. Placera tillbaka Coplinburken i 60°C-ugnen. Lämna flaskan med de återstående xylenerna i rökhuven.
- Häll de använda xylenerna i en lämplig avfallsbehållare för bortskaffande, var försiktig så att du inte stör vävnadssektionerna på glasrutschbanorna och använd ett par tångar för att förhindra att bilderna faller ut ur Coplin-burken. Fyll på Coplin-burken med de återstående xytonerna och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur i rökhuven.
- Inkubera sektionerna i 99,5% etanol i 5 min vid rumstemperatur. Efter detta inkubationssteg tar du bort bilderna från Coplin-burken, torkar baksidan av bilderna på en laboratorieservett eller pappershandduk och lufttorkar kort tills etanoldropparna är borta.
Om du torkar baksidan av bilderna kan du bättre se till att torkframstegen kan föras.
- Bakteriell färgning med FISK
- Använd en vätskeblockerare eller PAP-penna för att begränsa vätskeexpansionsområdet genom att cirkla runt området för varje vävnadssektion. Se till att bläcket inte kommer i kontakt med själva sektionen. Skapa en cirkel så nära varje vävnadssektion som möjligt utan att kontakta vävnaden för att minimera den yta som behöver täckas av hybridiseringslösningen.
- Förbered hybridiseringslösningen: tillsätt 0,5 μg sond för varje 50 μL förvärmd hybridiseringslösning (t.ex. 0,5 μL 1 μg/μL-sond). Pipettera hybridiseringslösningen på sektionerna på bilden (~20 μL/sektion, beroende på sektionens/cirkelstorleken). Skydda hybridiseringslösningen och bilderna från ljus från denna punkt och framåt under inkubationssteg och lagring.
- Se till att mängden vätska som används täcker hela sektionen vid överläggning med ett flexibelt plastöverdrag. Inkubera glidningen i en fuktig kammare för att minska avdunstningen. Skapa en fuktig kammare med en pipettspetslåda med våtservetter eller pappershanddukar i botten som har blötlagts med överskott av hybridiseringslösning eller fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att ge fuktighet. Inkubera sektionerna vid 45-50 °C, beroende på sondens uppsättning, i >3 h.
- Värm upp FISH tvättbuffert: 20 mM Tris-HCl, pH 7,4; 0,9 M NaCl till 50 °C under inkubationsperioden. Förbered tillräckligt med tvättbuffert för att täcka rutschkanorna i Coplin-burken.
- Ta bort plastöverdragen; inkubera rutschkanorna i FISH tvättbuffert i en Coplin-burk, båda förvärmda till 50 °C. Sätt tillbaka Coplinburken i 50 °C-ugnen i 10-20 min. För tjocka prover, ta bort täckbladen i Coplin-burken genom att tillsätta bufferten och försiktigt lossa täcksläparna för att undvika att smutsa ut skivan.
- Färgning av slem och värdfunktioner
- Förbered en allmän DNA/slemräknare i PBS: slutlig 10 μg/mL DAPI + 40 μg/mL slemfläck UEA-1. Förbered tillräckligt med mottain för att täcka fläckarna i avsaknad av ett täckslip för att undvika att skada vävnad med ytterligare täckslips.
OBS: Att täcka fläckarna i avsaknad av ett täckskydd kräver större volymer än de 20 μL som används i 3.3.2. För medelstora sektioner (~10 mm diameter) räcker 200 μL för att täcka en plats; testa denna volym i förväg på en provdockabild. - Ta bort FISH tvättbufferten och byt ut den mot PBS i Coplin-burken. Omedelbart efter påfyllning av Coplin-burken med PBS, dekantera PBS.
- Ta bort bilderna från burken och pipetten mot motdelen ovanpå sektionen samtidigt som du ser till att inte röra vävnaden med pipettens spets. Täck hela sektionen med en bubbla. Inkubera vid 4 °C i 45 minuter i mörker.
- Tvätta fläckarna 3 gånger snabbt med färsk PBS: medan du håller bilderna på plats med pincett, häll ut PBS i ett handfat och fyll omedelbart på med färsk PBS.
- Torka av baksidan av bilderna mot en våtservett eller pappershandduk, låt det mesta av PBS avdunsta från sektionerna, med hjälp av en vakuumledning ansluten till en pipettspets. Undvik återigen att vidröra sektionen med pipettspetsen.
- Montera sektionerna med ett monteringsmedium (utan DAPI) och låt det ställas in vid rumstemperatur täckt av glasöverdrag, se till att täckbeskeden är platta och att det inte finns några luftbubblor i monteringsmediet.
- Fäst täckglasen på diabilden genom att måla längs kanterna på täcket med klart nagellack, var noga med att hålla dig borta från kanten på bilden för att säkerställa att bilden sitter i nivå i mikroskopets skjuthållare under avbildningen.
- Förvara rutschkanorna vid 4 °C i mörker i några veckor innan fluorescensen är uttömd.
- Förbered en allmän DNA/slemräknare i PBS: slutlig 10 μg/mL DAPI + 40 μg/mL slemfläck UEA-1. Förbered tillräckligt med mottain för att täcka fläckarna i avsaknad av ett täckslip för att undvika att skada vävnad med ytterligare täckslips.
4. Bildbehandling och bildanalys
- Visualisera fläckarna
- Välj ett område i vävnaden som innehåller både vävnad och lumen för att avbilda mikrobiota-värdgränssnittet. För kvantitativ avbildning av slemtjocklek och luminal biogeografi, välj synfält där skivorna i epitel villi och/eller krypter är longitudinella och inte tvärsnitt. Undvik områden med stora mellanrum mellan slemmet och epitelet för att undvika att dela upp artefakter.
- Lokalisera vävnaden och korrigera fokalplanet med hjälp av DAPI-signalen för att lokalisera och fokusera för att undvika fotoblekning av FISH-fluorescenssignalen.
- Justera bildinställningarna. För att visualisera den bakteriella DAPI-fläcken, öka lasereffekten och få till den punkt där DAPI-signalen från epitelceller övermättas eller "blåses ut".
OBS: Övermätta inte överdrivet, eftersom detta leder till fotobleaching och visuella artefakter i kärnorna som inte kan återställas. - För alla andra kanaler, använd minsta mängd lasereffekt som ger en tydlig signal ovanför bakgrunden och var försiktig så att du inte övermättar.
OBS: Detta är särskilt viktigt när du utför kakel-skanningar, eftersom fotobleaching kommer att vara problematiskt när överlappningen mellan plattorna är avbildad. - Använd 40x eller högre förstoring för att avbilda enskilda bakterier.
- Skaffa bilderna.
- Skaffa kakel skanningar för att erhålla kvantitativa data om slemtjocklek och rumslig fördelning av mikrober i lumen. Se till att 15% överlappar plattorna och kontrollera om vignetting / ojämn belysning, vilket kan förvärras av <1x zoom. När du ställer in en panelsökning bör du vara uppmärksam på om vävnaden är i fokus i alla brickor, eftersom suddiga/out-of-focus-bilder inte kan analyseras (bild 3B).
- Om möjligt, minimera antalet plattor som behövs för att avbilda en given längd av epitel genom att rotera skanningsområdet så att epitel- och slemskiktet är parallella med plattan och inte i en vinkel. Annars hittar du en del av epitelet som är parallell eller vinkelrät mot bildområdet för att uppnå en liknande effekt.
Representative Results
För att undersöka lokalisering av specifika tarm commensal bakterier i mustarmen, bakteriefria schweiziska Webster möss som hade koloniserats med enskilda bakteriella isolat användes i denna studie. För detta experiment var bakteriearten märkt i) ett mänskligt isolat av Muribaculaceae-familjen5, Muribaculum intestinale, en riklig och utbredd familj av bakterier i murin microbiota15, liksom ii) Bacteroides thetaiotaomicron, en genetiskt lätthanterlig och vanlig tarmbakteri. Efter två veckors jämvikt avlivades mössen och ett segment av tjocktarmen som innehåller en fekal pellet var indelade och fixerade i nyberedd metakarn. Efter två dagars fixering, sektionerna var uttorkade genom bearbetning genom metanol, etanol och xylenes, infiltreras med paraffin, inbäddat och sedan avsnitt till luminal 4 μm skivor. Dessa prover färgades sedan med en FISH-sond (3' Cy3-märkt) specifik för Muribaculum-isolatet, utformat med hjälp av Oligominer-programvara12, och kontrollerades för sekundär och tertiär struktur och minimal icke-specifik bindning med NuPACK och mathFISH16,17. Proverna var också kontrastained med Rhodamine-bundna lectin UEA-1 (som fläckar fucosylated glykaner i slem) och DAPI. De färgade sektionerna avbildades med hjälp av en 40x olja mål och superupplösning modul.
Bild 1: Arbetsflöde för visualisering av mikrobiota-värdgränssnittet i tarmen. B) De två sektioneringsplanen kommer att ge antingen tvärgående sektioner (föredras för denna rörledning) eller tvärsnitts "munkar". (C) Inbäddning av vävnader av mycket olika tjocklekar kan resultera i skivor som endast är optimala för en eller annan vävnad. Förkortningar: FISH = fluorescens in situ hybridisering; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Imaging kolon visar lokalisering av Muribaculum intestinala i förhållande till slem i en gnotobiotic mus modell. Sektioner var färgade med DAPI (blå), Muribaculaceae FISH sond (röd) och UEA-1 (grön). (A) Distala kolon av mus mono-koloniserade med Muribaculum intestinala och (B) distala kolon av mus bi-koloniserade med Muribaculum intestinala och Bacteroides thetaiotaomicron. Skalstång = 20 μm. (C och D) Cy3-FISH (vänster), DAPI (mitten) och kombinerade Cy3-FISH + DAPI-kanaler för luminala infällda delar av (A) respektive (B). Skalstång = 5 μm. I (A) och (C) är alla bakterieformade och bakteriestora DAPI-signaler märkta med Cy3 (enkel pilspetsar) och i (B) och (D), förutom dessa Cy3- och DAPI-dubbelpositiva celler (enkla pilspetsar), finns dapi-färgade bakterieceller som är Cy3-negativa (dubbla pilspetsar), som förväntat för mono- och bikoloniseringstillstånd. Med undantag för längre filamentösa bakterier är större (>4 μm långa) DAPI-positiva strukturer (trubbiga pilar) växtmaterial eller kärnor från värdceller. Förkortningar: FISH = fluorescens in situ hybridisering; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Vanliga problem. (A) Ytlig sektion ger inte luminalskivor i tarmen. (Vänster) Ett tarmsegment som har delats upp på ett djup som ger en vy över lumen samt längsgående utsikt över epitelet. (Höger) Ett tarmsegment som har delats upp för grunt, avslöjar bara tvärsnitt av krypter och inget konstant slemskikt eller bakterier. B) Ojämn täckning av vävnad/täckslip kan leda till suddiga och ojämnt belysta kakelskanningar. En panelgenomsökning ställdes in med positioner som var ur fokus (övre högra hörnet). (C) Exempel på normal bakgrund (vänster) och hög bakgrund (höger). I det här exemplet, för DAPI-signalnoten, kommer signalen från epitelet, utanför kärnorna. Alla skalstänger = 20 μm. Förkortning: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Discussion
Protokollet som beskrivs ovan ger en reproducerbar metod för att visualisera värd-mikrobiota-gränssnittet. Dessa analyser har avsevärt dragit nytta av protokollutveckling, från optimering av FISH märkning18 till slem bevarande och imaging9. Fixering och inbäddning ger också användbar lagring av prover. Dessutom kan paraffininfiltrerade kassetter skickas utan några begränsningar, eftersom proverna är helt fasta och inert.
Betydelse och alternativa metoder
Kombinationen av FISH och slemfärgning möjliggör analys av mikrobiotasammansättning på specifika vävnadsplatser och interaktionen mellan enskilda bakterier och värden. Alternativa tekniker som involverar analys av specifika platser inom mikrobiotan kan vanligtvis inte utforska encelliga karaktären hos dessa interaktioner, såsom laserfångstmikmikrodissektion i kombination med sekvensering19. Sekvenseringsbaserade tekniker har dock fördelen att kunna fånga den genetiska upptagningen av mikrobiotan på en finare nivå och mer allmänt än 16S rRNA-sonder.
En fallgrop i protokollet som presenteras är att det ger en engångs ögonblicksbild av mikrobiotan i förhållande till värden. För realtidsavbildning hos levande djur krävs särskilda avbildningstekniker för att underlätta förvärvet av en fluorescenssignal i djup vävnad (t.ex. intravital tvåfotonmikroskopi och ljusplåt fluorescensmikroskopi20,21). I dessa metoder koloniseras modellorganismen antingen med bakterier som är färgade med molekyler som binder till deras kuvert20 eller genetiskt modifierade bakterier som hyser fluorescerande proteiner21. I det senare fallet är mognaden av fluorescensproteiner en nyckelfråga eftersom de flesta vanliga fluorescerande proteiner kräver syre för att avge ljus. Därför krävs modellorganismer som har åtminstone nanaeroba miljöer (nanomolekylkoncentration av syre), såsom den aeroba zebrafisken gut21.
I detta protokoll används metanol-Carnoy som fixativ istället för paraformaldehyd eller formalin eftersom det inte innehåller vatten. Detta förhindrar hydrering, uttorkning och kollaps av slemskiktet under bearbetningen och underlättar noggranna mätningar av slemtjocklek. Medan methacarn fixering och paraffin inbäddning har blivit en standard i fältet, olika fixativ och inbäddningstekniker har undersökts för att optimera slem bevarande9,22, med vissa studier som indikerar att hartser kan vara överlägsen paraffin inbäddning22. En annan viktig begränsning för paraffininbäddning och metakarnfixering är förlusten av fluorescerande proteinfluorescens, vilket kan undvikas genom att använda alternativa fixativ (t.ex. formalin eller paraformaldehyd (PFA)) eller modifierade inbäddningstekniker23. Varje fixativ har fördelar och nackdelar, och valet av fixativ beror på bildprioriteringarna. Bildframställning modaliteter kan kombineras om biologiska replikat fixeras i antingen PFA och metaheras och bilder erhålls från båda proverna.
FISH har kombinerats med immunofluorescens i isolerade fall med specifika anti-Muc2C3 kanin polyklonala antikroppar9,24. Dessa resultat har inte reproducerats i stor utsträckning med andra Muc2 antikroppar, vilket tyder på att valet av antikroppar kan vara avgörande för framgången för FISH-immunofluorescens kombinationen. Villkoren för framgångsrik antikroppsfärgning för en given antikropp får inte tillåta kvarhållande av FISH-färgning.
Felsökning
I det här protokollet representerar prov insamling, avsnitt och färgning kritiska steg för att förhindra att avbildnings artefakter skapas. Till exempel kan tryck på vävnaden vid insamling och före inbäddning leda till mislocalization av mikrobiotan och påverka slemkvaliteten. En annan viktig faktor är att undvika att kombinera segment av mycket olika tjocklekar i en enda kassett, såsom en relativt tom bit av tunntarmen och en pellet inom det distala tjocktarmen. De olika tjocklekarna leder till svårigheter vid avbildning: efter inbäddning kan tvärgående sektionering på ett visst djup för ett segment vara på fel djup för avbildning för det andra (t.ex. lumen kommer att vara på olika djup för varje vävnad) (figur 1B, C och figur 3A). För avbildning av djurmodell avföring pellets, de kan också vara inslagna i peritoneal membran24. I denna teknik viks en liten del av nyisolerad bukhinnan försiktigt runt avföringen och bevarar pelletens struktur under de tvättsteg som beskrivs i protokollet.
Till skillnad från bearbetning av djurvävnad med innehåll innebär avbildning av mänskliga tarmprover vissa utmaningar. Specifikt kommer luminal innehåll och slemhinnan foder sannolikt att störas av koloskopi tarm beredning vanligtvis utförs före intestinala tarm tarm tarm eller samband förfaranden. Dessutom, när tarmbiopsier samlas in, är det bra att notera vävnadsorienteringen för att hjälpa till att identifiera specifika egenskaper (t.ex. lumen kontra submucosa) i avsaknad av tarminnehåll. Förinbäddning med 3% agar och/eller agar:gelatin blandningar kan vara användbara för att upprätthålla vävnad polaritet25; Det finns dock problem med uttorkning och utsektion av agar, som rapporterats i litteraturen, och bearbetningstider kan behöva ändras.
En viktig aspekt för att uppnå god FISKfärgning kommer från att justera formamidkoncentrationen för specifika FISH-sonder. Formamid kommer att kontrollera hybridiseringssträngen hos FISH-sonder till sina mål. Det är viktigt att se till att a) rätt formamidkoncentration väljs för att färga ett visst samhälle, och b) att en lämplig formamidkoncentration till och med är möjlig för den sondkombination som används - detta kan påverka det optimala sondvalet vid användning av flera sonder. Webbplatser som mathFISH (http://mathfish.cee.wisc.edu/) kan hjälpa till att beräkna rätt formamidkoncentrationer för en viss sond. I avsaknad av information om lämpliga formamidkoncentrationer kan detta protokoll testas med 0% och 10% formamid.
Om du delar upp de inbäddade proverna måste blocket skäras till ett tillräckligt djup för att erhålla luminalskivor, eftersom sektionering för grunt i ett block resulterar i en tvärsnittsvy av villi/krypterna utan luminalt innehåll (figur 3A). Färga proverna strax efter sektionering för optimal FISH-signal och använd färsk DAPI (eller DAPI lagrad vid -20 °C) för att lösa bakgrundsproblem (figur 3C). FISKfärgning av sektioner som är mer än en månad gamla kan leda till sämre/ inkonsekvent färgning.
Om vävnaden eller täckslipet inte är helt platt med avseende på bilden, kanske provet inte är i fokus på varje position inom en kakelskanning (figur 3B), vilket leder till bortkastad ansträngning och potentiell fotoblekning. Detta kan lösas genom att ta mindre kakel skanningar där alla positioner har verifierats vara i fokus. Sektionering med tråkiga blad kan också leda till att slem och luminalt innehåll lossnar, som visas som stora mörka områden vid avbildning. Slutligen kan avdunstning av lösningen eller bubblorna under hybridiseringssteget leda till ojämn färgning av FISH-sonder i vävnaden.
En annan kritisk parameter som påverkar effektiviteten hos FISH-sondens bindning är konkurrensen mellan olika sonder. En användbar kontroll för att verifiera att FISH-sonden märker bakterier är att undersöka colocalization av signalen från FISH-sonden med DAPI (figur 2C,D). I prover som kräver användning av flera rRNA-sonder blir justering av parametrar som hybridiseringstemperatur, sondkoncentration och formamid avgörande för att säkerställa att sonder är bindande för rätt art effektivt18.
Anteckningar om bildbehandling
FISH-färgade bakterier visualiseras bäst med hjälp av ett konfokalt mikroskop och ett mål på minst 40x förstoring. Medan 63x förstoring föredras framför att avbilda bakterier på encellsnivå, kan 40x förstoring också användas genom att maximera den digitala zoomen eller använda ett superupplösningssystem. System utrustade med superupplösningsfunktioner kan också ge subcellulär upplösning av enskilda bakterieceller. Lägre förstoringsmål kan användas för att få en allmän känsla av bakteriell lokalisering och slemtjocklek.
Att skaffa 16-bitars bilder istället för 8-bitars bilder rekommenderas också starkt, eftersom det högre dynamiska intervallet hjälper till att fånga dapi-signalens breda utbud från epitelets extremt ljusa kärnor och den relativt svaga signalen av luminala bakterier. Förutom att använda bildframställningen som beskrivs ovan är ett viktigt bildbehandlingsövervägande valet av fluoroforer. För bästa separation mellan bakterietyper, se till att de fluoroforer som används inte överlappar vid excitation och emissionsspektra (såvida inte avbildning på ett system med förmåga att utföra linjär blandning). Dessutom kan sonder användas i kombination (t.ex. kombinationen av en familjespecifik sond och en släktspecifik sond) för att identifiera ytterligare samhällsmedlemmar. Om du använder linjära blandningar eller icke-specificerade sonder är det viktigt att testa noggrannheten och nivån av FISH-färgning på rena kulturer8,14.
När bilderna har samlats in är flera verktyg tillgängliga för kvantitativ analys av värd-mikrobiota-gränssnittet, till exempel BacSpace26, HiPR-FISH8 och andra segmenteringsverktyg27. BacSpace är en MATLAB-programvara som möjliggör segmentering av vävnad och luminalkomponenter och avlägsnande av växtmaterial från bilder26. Programmet ger också analys av slemtjocklek i 2D och kvantifiering av rumslig fördelning baserat på pixelavstånd i olika kanaler26. Omvänt tillåter HiPR-FISH Image Analysis-programvaran segmentering av FISH-färgade celler8. Slutligen kan andra bakteriella segmenteringsverktyg som har optimerats för in vitro-experiment27 också anpassas till denna applikation.
Slutsats
In situ imaging möjliggör kvantitativ analys av enskilda mikrobiella taxa i samband med andra samhällsmedlemmar och de olika mikromiljön som skapats av kost, slem och värd epitelial krypter. Interaktionen mellan organismer dikterar biologin hos värdassocierade mikrobiella system och ger en väsentlig analys av förändringar i dessa strukturer under perturbation som har konsekvenser för hälsan. I synnerhet ger förmågan att avbilda mikrobiotan in situ genom protokollet som beskrivs ovan ett otroligt fönster in i mikrobiotans biogeografi i förhållande till djurvärden.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Dr. Kristen Earle för ovärderlig teknikutveckling, Amber Hann för felsökningshjälp, Dr. Jen Nguyen och Deanna Pepin för kritisk granskning av manuskriptet och Dr. Hesham Soliman och Rossi-labbet vid University of British Columbia för att ge mikroskopåtkomst. Författarna bekräftar stöd från CIHR Team Grant: Canadian Microbiome Initiative 2 (C.T.), Crohns och Colitis Canada (till C.T. och K.M.N.), CIFAR (till C.T. och K.M.N.), Michael Smith Foundation for Health Research Scholar Award (till C.T.), Weston Foundation: Weston Family Microbiome Initiative (till C.T.), Paul Allen Distinguished Investigator Award (till C.T.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum foil | |||
| Chloroform | Fisher | C298-500 | Toxic |
| Coplin jar | Fisher | 08-813E | |
| Cover glass, 22 × 22 mm, no #1 | VWR | CA48366-227-1 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Resuspended to 5 mg/mL |
| Empty pipette tip box(es) | To melt paraffin | ||
| Ethanol, anhydrous, molecular grade | -- | -- | |
| FISH probes | |||
| FISH hybridization solution | -- | -- | 20 mM Tris–HCl pH 7.4, 0.9 M NaCl, 0.01% (w/v) SDS in nuclease-free water. Optional addition of 5–50% (v/v) formamide |
| FISH washing buffer | -- | -- | 20 mM Tris–HCl pH 7.4, 0.9 M NaCl |
| Fluorescently-labeled Ulex Europaeus Agglutinin (UEA-1) lectin | Vector Laboratories | FL-1061 (Fluorescein-labeled) or RL-1062-2 (Rhodamine-labeled) | UEA-1 labels fucosylated glycans, so it is not appropriate for germ-free mice or for samples from fucosyltransferase 2 (FUT2)-deficient hosts. |
| Forceps | |||
| Formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | |
| Fumehood | |||
| Glacial Acetic Acid | Fisher | A38-212 | Corrosive and flammable |
| HybriSlip flexible plastic cover slips, 22 x 22 mm × 0.25 mm | Sigma Aldrich | GBL722222 | for FISH hybridization steps, can substitute glass coverslips |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Kimwipes | |||
| Methanol | Fisher | A412 | Toxic and flammable |
| Microtome | for sectioning | ||
| Multipurpose Specimen Storage Containers, 473 mL | Fisher | 14-955-117A | Can substitute with a glass or polyethylene container of your choice. Methacarn is not compatible with polystyrene or metal. |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | Any nail polish should work |
| Oven | Necessary range: 45-60 °C | ||
| Paraffin: Leica Paraplast | Leica | 39601006 | |
| PBS, Phosphate-buffered Saline (10x solution) | Fisher | BP3991 | Dilute to 1x for protocol |
| Sodium chloride | Fisher | S271 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), 20% Solution, RNase-free | Invitrogen | AM9820 | |
| Tissue-Loc HistoScreen Cassettes | Thermo Scientific | CA83009-999 | |
| Trizma hydrochloride solution, 1M Tris-HCl, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2663-1L | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Water, nuclease-free | Fisher | BP2484100 | |
| Xylenes | Fisher | X3P-1GAL | Toxic and flammable |
References
- Tropini, C., Earle, K. A., Huang, K. C., Sonnenburg, J. L. The gut microbiome: connecting spatial organization to function. Cell Host and Microbe. 21 (4), 433-442 (2017).
- Hansson, G. C., Johansson, M. E. V. The inner of the two Muc2 mucin-dependent mucus layers in colon is devoid of bacteria. Gut Microbes. 1 (1), 51-54 (2010).
- Johansson, M. E. V., et al. Normalization of host intestinal mucus layers requires long-term microbial colonization. Cell Host and Microbe. 18 (5), 582-592 (2015).
- Jakobsson, H. E., et al. The composition of the gut microbiota shapes the colon mucus barrier. EMBO Reports. 16 (2), 164-177 (2015).
- Tropini, C., et al. Transient osmotic perturbation causes long-term alteration to the aut microbiota. Cell. 173 (7), 1742-1754 (2018).
- Desai, M. S., et al. A dietary fiber-deprived gut microbiota degrades the colonic mucus barrier and enhances pathogen susceptibility. Cell. 167 (5), 1339-1353 (2016).
- Ng, K. M., et al. Recovery of the gut microbiota after antibiotics depends on host diet, community context, and environmental reservoirs. Cell Host and Microbe. 26 (5), 650-665 (2019).
- Shi, H., et al. Highly multiplexed spatial mapping of microbial communities. Nature. 588 (7839), 676-681 (2020).
- Johansson, M. E. V., Hansson, G. C. Preservation of mucus in histological sections, immunostaining of mucins in fixed tissue, and localization of bacteria with FISH. Methods in Molecular Biology. 842, 229-235 (2012).
- Greuter, D., Loy, A., Horn, M., Rattei, T. ProbeBase-an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes and primers: New features 2016. Nucleic Acids Research. 44 (1), 586-589 (2016).
- Quast, C., et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: Improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Research. 41 (1), 590-596 (2013).
- Beliveau, B. J., et al. OligoMiner provides a rapid, flexible environment for the design of genome-scale oligonucleotide in situ hybridization probes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2183-2192 (2018).
- Madeira, F., et al. The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019. Nucleic Acids Research. 47 (1), 636-641 (2019).
- Welch, J. L. M., Hasegawa, Y., McNulty, N. P., Gordon, J. I., Borisy, G. G. Spatial organization of a model 15-member human gut microbiota established in gnotobiotic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (43), 9105-9114 (2017).
- Lagkouvardos, I., et al. Sequence and cultivation study of Muribaculaceae reveals novel species, host preference, and functional potential of this yet undescribed family. Microbiome. 7 (1), 28 (2019).
- Zadeh, J. N., et al. NUPACK: Analysis and design of nucleic acid systems. Journal of Computational Chemistry. 32 (1), 170-173 (2011).
- Yilmaz, L. S., Parnerkar, S., Noguera, D. R. MathFISH, a web tool that uses thermodynamics-based mathematical models for in silico evaluation of oligonucleotide probes for fluorescence in situ hybridization. Applied and Environmental Microbiology. 77 (3), 1118-1122 (2011).
- Huber, D., Voith von Voithenberg, L., Kaigala, G. V. Fluorescence in situ hybridization (FISH): History, limitations and what to expect from micro-scale FISH. Micro and Nano Engineering. 1, 15-24 (2018).
- Wang, Y., et al. Laser capture microdissection and metagenomic analysis of intact mucosa-associated microbial communities of human colon. Applied Microbiology and Biotechnology. 88 (6), 1333-1342 (2010).
- Geva-Zatorsky, N., et al. In vivo imaging and tracking of host–microbiota interactions via metabolic labeling of gut anaerobic bacteria. Nature medicine. 21 (9), 1091-1100 (2015).
- Jemielita, M., et al. Spatial and temporal features of the growth of a bacterial species colonizing the zebrafish gut. mBio. 5 (6), 01751 (2014).
- Hasegawa, Y., Mark Welch, J. L., Rossetti, B. J., Borisy, G. G. Preservation of three-dimensional spatial structure in the gut microbiome. PLoS ONE. 12 (11), 0188257 (2017).
- Zhanmu, O., et al. Maintenance of fluorescence during paraffin embedding of fluorescent protein-labeled specimens. Frontiers in Neuroscience. 13, 752 (2019).
- Bergstrom, K., et al. Proximal colon-derived O-glycosylated mucus encapsulates and modulates the microbiota. Science. 370 (6515), 467-472 (2020).
- Jones, M. V., Calabresi, P. A. Agar-gelatin for embedding tissues prior to paraffin processing. BioTechniques. 42 (5), 569-570 (2007).
- Earle, K. A., et al. Quantitative imaging of gut microbiota spatial organization. Cell Host and Microbe. 18 (4), 478-488 (2015).
- Jeckel, H., Drescher, K. Advances and opportunities in image analysis of bacterial cells and communities. FEMS Microbiology Reviews. , (2020).
