Summary
Этот упрощенный протокол детализирует рабочий процесс для обнаружения и изображения бактерий в сложных образцах тканей, от фиксации ткани до окрашивания микробов флуоресцентной гибридизацией in situ .
Abstract
Измерение локализации микробов в их контексте in vivo является важным шагом в выявлении функциональных отношений между микробиотой и кишечником позвоночных. Пространственный ландшафт кишечной микробиоты жестко контролируется физическими особенностями - кишечной слизью, криптами и складками - и зависит от контролируемых хозяином свойств, таких как рН, доступность кислорода и иммунные факторы. Эти свойства ограничивают способность комменсальных микробов и патогенов стабильно колонизировать кишечник. В микронном масштабе микробная организация определяет близкие взаимодействия между различными микробами, а также взаимодействия между микробами и их хозяином. Эти взаимодействия затем влияют на крупномасштабную функцию органов и здоровье хозяина.
Этот протокол позволяет визуализировать пространственную организацию микробиоты кишечника от расстояний между клетками до общеорганных масштабов. Метод основан на фиксации тканей кишечника при сохранении структуры кишечника и свойств слизи. Фиксированные образцы затем встраиваются, секционируются и окрашиваются, чтобы выделить конкретные виды бактерий посредством флуоресцентной гибридизации in situ (FISH). Особенности хозяина, такие как слизь и компоненты клетки-хозяина, помечены флуоресцентно мечеными лектинами. Наконец, окрашенные участки визуализируются с помощью конфокального микроскопа, использующего визуализацию сканирования плитки с большим увеличением, чтобы соединить микронные и сантиметровые масштабы. Этот тип визуализации может быть применен к участкам кишечника из животных моделей и биопсии из тканей человека для определения биогеографии микробиоты в кишечнике в области здоровья и заболеваний.
Introduction
Методы микробной визуализации имеют происхождение, которое так же старо, как и сама микробиология, когда Антони Ван Левенгук использовал свой микроскоп для наблюдения бактерий (которые он назвал «animalcules») из зубного налета и стула в 17 веке. С тех пор были разработаны многочисленные методы визуализации пространственной организации консорциума бактерий, грибов и вирусов, которые живут, связанные с хозяином -микробиотой1. Выяснение локализации этих микробов имеет важное значение для определения их функции в организме животного хозяина. Биогеография бактерий важна как у комменсальных, так и у патогенных таксонов, поскольку близость к определенным местам (например, эпителию), питательным субстратам и специфическим микробам может диктовать бактериальную продукцию метаболитов, лежащих в основе межвидовых и межкорейных взаимодействий.
Ключевой структурой, разделяющей бактерии и ткани хозяина в нескольких разрозненных участках тела, таких как ротовая полость, кишечник или легкое, является слизь - слой, продуцируемый хозяином, который предотвращает микробную транслокацию на эпителиальные клетки хозяина и служит питательным ресурсом для микробиоты2,3,4 . Характеристика нарушений и изменений в этом барьере имеет ключевое значение, что приводит к механистическому пониманию взаимодействий хозяина и микробиоты, которое не было бы получено только путем секвенирования5,6,7. Например, визуализация позволила обнаружить, что воздействие антибиотиков может нарушить слой слизи и организацию микробиоты7,8, и что слабительные средства могут истощать слизь, коррелируя с большими изменениями иммунных параметров5.
Этот протокол описывает общую структуру для фиксации, окрашивания и визуализации микробиоты и ткани хозяина (рисунок 1), построенную на работе Йоханссона и Ханссона9. Хотя этот протокол моделируется в контексте кишечных отделов, он может быть легко адаптирован к другим типам тканей. Этот протокол позволяет обрабатывать либо экспериментальные образцы животных, либо клинические образцы человека; были включены примечания по обработке обоих типов образцов. В примере, представленном здесь, эпителий хозяина и просветные бактерии были одновременно помечены окрашиванием 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI), слизью с флуоресцеином (FITC)-конъюгированным лектином, Ulex europaeus agglutinin I (UEA-1) и специфическим бактериальным таксоном с использованием FISH. Зонды FISH обычно разрабатываются против генов 16S рРНК таксона, чтобы обеспечить высокий сигнал от связывания транскрипта с высокой копией.
В этом примере зонд нацелен на 16S рРНК семейства бактериальных Muribaculaceae (рисунок 2). Тем не менее, пятна легко заменяются различными зондами FISH и / или лектинами для удовлетворения соответствующего биологического вопроса. Ранее проверенные зонды FISH можно найти на ProbeBase10, онлайн-ресурсе для олигонуклеотидных зондов, нацеленных на рРНК, или на SILVA11, базе данных рибосомных РНК. Для проектирования новых зондов считыватель может ссылаться на новые трубопроводы, такие как HiPR-FISH8 или Oligominer12. Используя этот протокол, можно наблюдать близкое скопление бактерий в просвете кишечника и различные особенности кишечной слизи по всему пищеварительному тракту. Рабочий процесс, описанный здесь, позволяет проводить количественный анализ микробиоты в пространственном контексте среды хозяина.
Protocol
Все эксперименты на животных и сбор тканей, описанные в этом протоколе, были выполнены в соответствии с руководящими принципами Канадского совета по уходу за животными (CCAC) и были одобрены Комитетом по уходу за животными в Университете Британской Колумбии. Использовались швейцарские мыши Вебстера без микробов. Все животные были в возрасте 8-10 недель, использовались оба пола, и все мыши были размещены совместно с по крайней мере с двумя мышами на клетку. Животных усыпляли с использованием углекислого газа с вторичным вывихом шейки матки или проколом сердца.
1. Разработка эксперимента по визуализации: соображения и сбор образцов
- Конструкция зонда FISH
- Если существует соответствующий зонд FISH, выберите уже существующий опубликованный зонд, который показывает сильный сигнал в меченых ячейках по сравнению с фоном.
- Проверьте новые зонды in vitro , чтобы определить их эффективность связывания с фиксированными образцами бактерий-мишеней и нецелевого связывания с другими бактериями.
- Проверьте все зонды 16S FISH, которые будут использоваться против последовательностей 16S из целевого организма или против секвенирования 16S рРНК из анализируемых образцов, чтобы убедиться, что ожидаемая доля положительных совпадений присутствует, и что зонды не будут связываться неспецифически с другими членами микробиоты.
- Выровняйте зонды FISH по полноразмерным последовательностям или вариантам последовательностей ампликонов с помощью инструмента, такого как Clustal Omega13, для оценки потенциального связывания зондов и их мишеней.
- В дополнение к испытаниям in silico, проверьте точность и уровень окрашивания FISH непроверенных зондов на чистых культурах8,14.
ПРИМЕЧАНИЕ: При окрашивании нескольких членов сообщества зонды могут использоваться комбинаторно (например, комбинация зонда, специфичного для семейства, и зонда, специфичного для рода), если используемые флуорофоры не перекрываются в спектрах возбуждения и излучения (если только визуализация на системе с возможностью выполнения линейного размешивания не перекрывается). Кроме того, специфичность может быть продемонстрирована путем включения контроля специфичности/скремблированных зондов или путем конкуренции с нефлуоресцентными зондами.
- Типы образцов и сбор тканей
- Используя острые и чистые инструменты, вырежьте сегменты кишечника у гнотобиотических швейцарских мышей Вебстера для визуализации. Сведите к минимуму, насколько это возможно, беспокойте образец и обработайте участки по краям, чтобы избежать воздействия на область изображения. Исправьте образец как можно скорее после рассечения, чтобы предотвратить деградацию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для исследований на животных предпочтительны неповрежденные, неиспыляющиеся участки кишечника; мембрана поможет сохранить организацию просвета и слизистой оболочки нетронутой. - Очищайте инструменты, протирая их 70% этанолом между образцами и участками. Получите, по крайней мере, три биологические реплики на участок кишечника / место биопсии, заботясь о том, чтобы образец последовательного расположения кишечника, поскольку слизь и кишечная архитектура, а также микробиота значительно изменяются в разных местах.
- Используя острые и чистые инструменты, вырежьте сегменты кишечника у гнотобиотических швейцарских мышей Вебстера для визуализации. Сведите к минимуму, насколько это возможно, беспокойте образец и обработайте участки по краям, чтобы избежать воздействия на область изображения. Исправьте образец как можно скорее после рассечения, чтобы предотвратить деградацию.
2. Фиксация и инфильтрация образца ткани
- Фиксация
- Приготовьте свежий метакарн в совместимой емкости со следующими соотношениями: 60% абсолютного метанола, 30% хлороформа и 10% ледниковой уксусной кислоты. Распределите каждое из этих химических веществ в вытяжной капюшон. Выберите контейнер, который можно вентилировать, открыв крышку. Поскольку метакарн не совместим с полистиролом, приготовьте его в полиэтиленовом контейнере, используя стеклянные градуированные цилиндры / серологические пипетки для хлороформа и ледниковой уксусной кислоты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Во время перемешивания образуются пары, которые могут вызвать повышение давления внутри контейнера. Желательно держать контейнер относительно плотно закрытым после извлечения из вытяжного шкафа, если образцы не добавляются активно. Хлороформ токсичен; не вдыхайте, не глотите и не впитывайте через кожу. Метанол токсичен и легковоспламеняется; не вдыхайте, не глотите и не впитывайте через кожу. Ледниковая уксусная кислота легковоспламеняется и сильно разъедает кожу и глаза. - После дозирования закройте емкость, закрутите, чтобы перемешать, а затем проветрите; повторяйте это до тех пор, пока не прекратится отходящих газов (и давление больше не будет заметно увеличиваться под крышкой).
ПРИМЕЧАНИЕ: Не утилизируйте метакарн в дренажах; собирать и утилизировать как опасные химические отходы в соответствии с институциональными руководящими принципами. Используйте карандаш для маркировки гистологических кассет, так как многие перьевые чернила будут отрываться в растворе метакарна. - Поместите участки кишечника в гистологические кассеты, деликатно удерживая край ткани пинцетом. Закройте кассету и полностью погрузите ее в свежий метакарновый раствор. Убедитесь, что раствор не старше нескольких часов после погружения кассет.
- Для клинических образцов, которые будут собраны в клиническом кабинете без доступа к вытяжному шкафу, используйте полиэтиленовый контейнер для хранения с клапаном, вырезанным в крышке, который позволит проходить гистологические кассеты. Заклеивайте эту заслонку, когда не проходите мимо образцов, чтобы предотвратить выход токсичных паров.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно использовать маскировочную ленту, чтобы избежать растворения клея на контейнере - некоторые типы ленты (например, пластиковая упаковочная лента) могут плохо удерживать пары метакарна. - Фиксируйте образцы в течение минимум 3 ч и максимум двух недель.
ПРИМЕЧАНИЕ: Более толстые образцы могут потребовать времени фиксации более 3 ч. Время фиксации может быть выбрано для обеспечения одновременной обработки парафиновой инфильтрации для кассет, зафиксированных в различных растворах метакарна (например, для одновременного выполнения инфильтрации парафина на группах образцов, собранных и зафиксированных в течение двух недель).
- Приготовьте свежий метакарн в совместимой емкости со следующими соотношениями: 60% абсолютного метанола, 30% хлороформа и 10% ледниковой уксусной кислоты. Распределите каждое из этих химических веществ в вытяжной капюшон. Выберите контейнер, который можно вентилировать, открыв крышку. Поскольку метакарн не совместим с полистиролом, приготовьте его в полиэтиленовом контейнере, используя стеклянные градуированные цилиндры / серологические пипетки для хлороформа и ледниковой уксусной кислоты.
- Парафиновая инфильтрация и встраивание
- Поместите парафин в термостойкий контейнер и расплавите его в духовке при 60 °C в течение ночи. Поскольку гранулы парафина занимают больше места перед плавлением, убедитесь, что расплавлено достаточное количество парафина, чтобы покрыть все кассеты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Температура не должна быть выше 60 °C, так как это может привести к появлению артефактов. - Промыть ткань, вылив жидкость в соответствующий сосуд для отходов и немедленно заменив ее следующими химическими веществами.
- Инкубировать в абсолютном метаноле в течение 30 мин. Повторить однократно.
- Инкубировать в абсолютном этаноле в течение 20 мин. Повторить однократно.
- Инкубировать в ксилолах в течение 15 мин. Повторить один раз.
- Быстро меняйте стирки, заботясь о том, чтобы кассеты не высохли. Убедитесь, что каждая стирка полностью закрывает кассеты в стакане или контейнере.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ксилолы легковоспламеняются, и при вдыхании пары могут угнетать центральную нервную систему с потенциальными долгосрочными неврологическими последствиями при воздействии высоких концентраций (>200 ppm). Обрабатывайте ксилолы только в вытяжном шкафу. Поскольку ксилолы опасны, позаботьтесь о том, чтобы использовать минимальное количество, необходимое для покрытия гистологических кассет.
- Во время встраивания ориентируйте сегменты кишечника параллельно длине кассеты (в отличие от вертикальной), используя пинцет для обеспечения продольных, поперечных сечений вместо пончиков поперечного сечения, чтобы обеспечить большую потенциальную площадь образца для количественной визуализации (рисунок 1B).
- Слегка откройте кассеты (~ 1-2 см или 0,5 дюйма), чтобы парафин вошел без потери сегментов ткани. Используйте двойные перчатки для этого шага или пинцет, чтобы предотвратить перегрев или легкое жжение пальцев. Погрузите и закройте кассеты в контейнер с расплавленным парафином, поместив контейнер обратно в духовку с температурой 60 °C. Убедитесь, что кассеты заполнены парафином, и не осталось больших пузырьков воздуха.
- После инкубации в течение 2 ч при 60 °C выньте емкость из духовки. Используя щипцы, аккуратно извлеките кассеты и положите их по отдельности на кусок алюминиевой фольги для охлаждения. Храните их при комнатной температуре до готовности к встраиванию и секционированию.
- Разделите парафиновые блоки микротомом, разделяясь достаточно глубоко в блок, чтобы просветное содержимое подвергалось воздействию, что позволяет продольное сечение ворсинок и / или крипт в дополнение к просветному содержимому и слизи. Позаботьтесь о замене лезвий, так как фекальный материал быстро притупляет лезвие по сравнению с тканью. Вырежьте участки до толщины 4 мкм для оптимальной резкости изображений. Перенесите секции на обычные немеловированные слайды.
- Для окрашивания FISH окрашивайте участки кишечника как можно скорее (т. Е. В течение нескольких недель после секционирования), чтобы получить сильный сигнал FISH. При отсутствии окрашивания FISH окрашивание лектином + DAPI может быть выполнено на менее свежих (т.е. многомесячных) образцах без значительной потери сигнала.
- Поместите парафин в термостойкий контейнер и расплавите его в духовке при 60 °C в течение ночи. Поскольку гранулы парафина занимают больше места перед плавлением, убедитесь, что расплавлено достаточное количество парафина, чтобы покрыть все кассеты.
3. Окрашивание бактерий и особенностей хозяина
- Подготовка
- Разогрейте духовку до 60 °C. Предварительно разогрейте пустую банку Коплина и достаточный объем, чтобы дважды покрыть стеклянные слайды в банке ксилолами в стеклянной бутылке, позаботившись о парапленке вокруг крышки, чтобы предотвратить испарение ксилолов. Позвольте температуре ксилолов достичь 60 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартная банка Coplin подходит для 8 слайдов, и слайды могут быть покрыты примерно 50 мл жидкости (может варьироваться от 40 до 60 мл в зависимости от марки). Заменители ксилола менее токсичны и успешно используются другими группами для стадии деаперации (стадия 3.2)8,9. - Если имеется отдельная печь, предварительно разогрейте печь гибридизации до 50 °C. В противном случае этот этап может быть выполнен с помощью той же печи, которая используется для выпечки горок после этапа 3.2.3.
- Приготовьте гибридизационный раствор FISH: 20 мМ Tris-HCl, рН 7,4; 0,9 М NaCl; 0,01%26 - 0,1%9 (мас./об.) додецилсульфата натрия (SDS) в воде, не содержащей нуклеазы. При необходимости добавляют 5-50% (v/v) формамида. Предварительно нагрейте этот гибридизационный раствор при 50 °C во время депарафинизации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Формамид представляет собой амид, который действует как тератоген; обрабатывать формамид перчатками и очками. В малых дозах и при воздействии на глаза, кожу или слизистые оболочки он раздражает. В больших количествах пары формамида могут потребовать медицинского вмешательства. Формамид может храниться при 100% в морозильной камере -20 °C.
- Разогрейте духовку до 60 °C. Предварительно разогрейте пустую банку Коплина и достаточный объем, чтобы дважды покрыть стеклянные слайды в банке ксилолами в стеклянной бутылке, позаботившись о парапленке вокруг крышки, чтобы предотвратить испарение ксилолов. Позвольте температуре ксилолов достичь 60 °C.
- Подготовка слайдов к окрашиванию: депарафинизация
- Поместите слайды в банку Coplin, следя за тем, чтобы секции не соприкасались с другими слайдами или банкой, и выпекайте слайды при 60 °C в течение 10 минут.
- В вытяжке наполните банку Coplin предварительно подогретыми ксилолами из духовки, следя за тем, чтобы не вылить непосредственно поверх образцов и потенциально не выбить ткани. Поместите банку Coplin обратно в духовку с температурой 60 °C. Оставьте бутылку с оставшимися ксилолами в вытяжном шкафу.
- Вылейте использованные ксилолы в надлежащий контейнер для отходов для утилизации, заботясь о том, чтобы не потревожить участки тканей на стеклянных слайдах и используя пару щипцов, чтобы слайды не выпали из банки Коплина. Наполните банку Коплина оставшимися ксилолами и высиживайте в течение 10 минут при комнатной температуре в вытяжном шкафу.
- Инкубировать срезы в 99,5% этаноле в течение 5 мин при комнатной температуре. После этого этапа инкубации извлеките слайды из банки Coplin, протрите заднюю часть слайдов на лабораторной салфетке или бумажном полотенце и ненадолго высушите на воздухе, пока капли этанола не исчезнут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протирание задней части слайдов позволяет лучше визуализировать ход сушки.
- Бактериальное окрашивание с помощью FISH
- Используйте блокатор жидкости или ручку PAP, чтобы ограничить площадь расширения жидкости, обводя область каждого участка ткани. Убедитесь, что чернила не соприкасаются с самим разделом. Создайте круг как можно ближе к каждому участку ткани, не контактируя с тканью, чтобы минимизировать площадь поверхности, которую необходимо покрыть раствором гибридизации.
- Приготовьте гибридизационный раствор: на каждые 50 мкл предварительно нагретого гибридизационного раствора добавьте 0,5 мкг зонда (например, 0,5 мкл зонда 1 мкг/мкл). Пипетка гибридизационного решения на секции на слайде (~20 мкл/сечение, в зависимости от размера сечения/круга). Защитите решение для гибридизации и слайды от света с этой точки во время инкубационных этапов и хранения.
- Убедитесь, что объем используемой жидкости покрывает всю секцию при наложении гибкой пластиковой крышки. Инкубируйте горку во влажной камере, чтобы уменьшить испарение. Создайте влажную камеру с наконечником пипетки с салфетками или бумажными полотенцами на дне, которые были пропитаны избыточным раствором гибридизации или фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) для обеспечения влажности. Инкубируют секции при температуре 45-50 °C, в зависимости от набора зондов, в течение >3 ч.
- Разогрейте промывочный буфер FISH: 20 мМ Tris-HCl, рН 7,4; от 0,9 М NaCl до 50 °C в течение инкубационного периода. Подготовьте достаточное количество промывочного буфера, чтобы покрыть слайды в банке Coplin.
- Снимите пластиковые чехлы; инкубировать слайды в буфере для промывки FISH в банке Coplin, предварительно нагретой до 50 °C. Поместите банку Coplin обратно в духовку с температурой 50 °C на 10-20 минут. Для толстых образцов удалите крышки в банке Coplin, добавив буфер и аккуратно сместив крышки, чтобы избежать размазывания среза.
- Окрашивание слизи и особенностей хозяина
- Подготовьте общий контрокрашен ДНК/слизь в PBS: конечные 10 мкг/мл DAPI + 40 мкг/мл слизистого пятна UEA-1. Подготовьте достаточно встречного пятна, чтобы покрыть пятна в отсутствие покровного листа, чтобы избежать повреждения ткани дополнительными покровами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Покрытие пятен в отсутствие чехлового листа потребует больших объемов, чем 20 мкл, используемых в разделе 3.3.2. Для секций среднего размера (диаметр ~10 мм) достаточно 200 мкл, чтобы покрыть одно пятно; заранее протестируйте этот объем на фиктивном слайде. - Извлеките буфер промывки FISH и замените его PBS в банке Coplin. Сразу после заправки банки Coplin PBS декантируйте PBS.
- Извлеките слайды из банки и выпейте контрразмах сверху секции, следя за тем, чтобы ткань не касалась кончиком пипетки. Накройте весь раздел пузырьком. Инкубировать при 4 °C в течение 45 мин в темноте.
- Вымойте пятна 3 раза быстро свежим PBS: удерживая слайды на месте с помощью пинцета, вылейте PBS в раковину и сразу же заправьте свежим PBS.
- Протирая заднюю часть слайдов о салфетку или бумажное полотенце, позвольте большей части PBS испариться с секций, чему способствует вакуумная линия, подключенная к наконечнику пипетки. Еще раз, избегайте прикосновения к секции с наконечником пипетки.
- Установите секции с помощью монтажного носителя (без DAPI) и дайте ему установить комнатную температуру, покрытую стеклянными крышками, гарантируя, что крышки плоские и в монтажной среде нет пузырьков воздуха.
- Прикрепите обшивки к слайду, рисуя по краям крышки прозрачным лаком для ногтей, следя за тем, чтобы держаться подальше от края слайда, чтобы гарантировать, что слайд будет находиться на одном уровне в держателе слайда микроскопа во время визуализации.
- Храните слайды при температуре 4 °C в темноте в течение нескольких недель, прежде чем флуоресценция истощится.
- Подготовьте общий контрокрашен ДНК/слизь в PBS: конечные 10 мкг/мл DAPI + 40 мкг/мл слизистого пятна UEA-1. Подготовьте достаточно встречного пятна, чтобы покрыть пятна в отсутствие покровного листа, чтобы избежать повреждения ткани дополнительными покровами.
4. Визуализация и анализ изображений
- Визуализация пятен
- Выберите область ткани, которая содержит как ткань, так и просвет, чтобы визуализировать интерфейс микробиота-хозяин. Для количественной визуализации толщины слизи и люминальной биогеографии выберите поля зрения, где срезы эпителиальных ворсинок и /или крипт являются продольными, а не поперечными. Избегайте областей с большими промежутками между слизью и эпителием, чтобы избежать разрезания артефактов.
- Найдите ткань и скорректируйте фокальную плоскость, используя сигнал DAPI для определения местоположения и фокусировки, чтобы избежать фотоотбеливания флуоресцентного сигнала FISH.
- Настройте параметры изображения. Чтобы визуализировать бактериальное окрашивание DAPI, увеличьте мощность лазера и доведите его до такой степени, что сигнал DAPI от эпителиальных клеток перенасыщен или «выдувается».
ПРИМЕЧАНИЕ: Не перенасыщайте чрезмерно, так как это приведет к фотоотбеливанию и визуальным артефактам в ядрах, которые не могут быть восстановлены. - Для всех остальных каналов используйте минимальное количество мощности лазера, которое обеспечит четкий сигнал над фоном, и будьте осторожны, чтобы не перенасытиться.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это особенно важно при выполнении сканирования плиток, так как фотоотбеливание будет проблематичным при изображении перекрытия между плитками. - Используйте 40-кратное или более высокое увеличение для изображения отдельных бактерий.
- Получите изображения.
- Получите сканирование плитки для получения количественных данных о толщине слизи и пространственном распределении микробов в просвете. Обеспечьте перекрытие плитки на 15% и проверьте виньетирование/ неравномерное освещение, которое может усугубиться при увеличении <1x. При настройке сканирования плитки обратите пристальное внимание на то, находится ли ткань в фокусе во всех плитках, так как размытые / нефокусированные изображения не могут быть проанализированы (рисунок 3B).
- Если возможно, сведите к минимуму количество плиток, необходимых для изображения заданной длины эпителия, повернув область сканирования так, чтобы эпителий и слой слизи были параллельны плитке, а не под углом. В противном случае найдите участок эпителия, который параллельен или перпендикулярен области визуализации, чтобы достичь аналогичного эффекта.
Representative Results
Чтобы исследовать локализацию специфических комменсальных бактерий кишечника в кишечнике мыши, в этом исследовании использовались свободные от микробов мыши Swiss Webster, которые были колонизированы отдельными бактериальными изолятами. Для этого эксперимента помеченными видами бактерий были i) человеческий изолят семейства Muribaculaceae5, Muribaculum intestinale, обильное и распространенное семейство бактерий в мышиной микробиоте15, а также ii) Bacteroides thetaiotaomicron, генетически поддающаяся лечению и распространенная кишечная бактерия. После двух недель уравновешивания мышей усыпили, а сегмент толстой кишки, содержащий фекальную гранулу, разделили и закрепили в свежеприготовленном метакарне. После двух дней фиксации срезы обезвоживали путем обработки через метанол, этанол и ксилолы, инфильтрировали парафином, встраивали, а затем разрезали на люминальные 4 мкм срезы. Затем эти образцы были окрашены зондом FISH (3' Cy3-меткой), специфичным для изолята Muribaculum, разработанным с использованием программного обеспечения Oligominer12, и проверены на вторичную и третичную структуру и минимальное неспецифическое связывание с использованием NuPACK и mathFISH16,17. Образцы также были контрокрашены связанным с родамином лектином UEA-1 (который окрашивает фукозилированные гликаны в слизь) и DAPI. Окрашенные участки были сфотографированы с использованием 40-кратного масляного объектива и модуля сверхвысокого разрешения.
Рисунок 1: Рабочий процесс визуализации интерфейса микробиота-хозяин в кишечнике. (A) Иллюстрированный рабочий процесс для конвейера. (B) Две плоскости сечения дадут либо поперечные сечения (предпочтительные для этого трубопровода), либо поперечные «пончики». (C) Встраивание тканей очень разной толщины может привести к образованию срезов, которые являются оптимальными только для той или иной ткани. Сокращения: FISH = флуоресцентная гибридизация in situ ; DAPI = 4′,6-диамидин-2-фенилиндол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Визуализация толстой кишки показывает локализацию Muribaculum intestinale относительно слизи в гнотобиотической мышиной модели. Секции были окрашены зондом DAPI (синий), Muribaculaceae FISH (красный) и UEA-1 (зеленый). (A) Дистальная толстая кишка мыши моноколонизирована Muribaculum intestinale и (B) дистальная толстая кишка мыши биколонизирована Muribaculum intestinale и Bacteroides thetaiotaomicron. Шкала бара = 20 мкм. (C и D) Cy3-FISH (слева), DAPI (средняя) и комбинированные каналы Cy3-FISH + DAPI для просветных вставных частей (A) и (B) соответственно. Шкала бара = 5 мкм. В (A) и (C) все сигналы DAPI в форме бактерий и размером с бактерию помечены Cy3 (одиночные наконечники стрел), а в (B) и (D), в дополнение к этим Cy3- и DAPI-двойным положительным клеткам (одиночные наконечники стрел), существуют окрашенные DAPI бактериальные клетки, которые являются Cy3-отрицательными (двойные наконечники стрел), как и ожидалось для моно- и биколонизационных состояний. За исключением более длинных нитевидных бактерий, более крупные (>4 мкм в длину) DAPI-положительные структуры (тупые стрелки) являются растительным материалом или ядрами из клеток-хозяев. Сокращения: FISH = флуоресцентная гибридизация in situ ; DAPI = 4′,6-диамидин-2-фенилиндол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Распространенные проблемы. (А) Мелкое сечение не обеспечит просветные срезы кишечника. (Слева) Сегмент кишечника, который был разделен на глубине, которая обеспечивает вид просвета, а также продольные виды эпителия. (Справа) Сегмент кишечника, который был разрезан слишком мелко, обнажая только поперечные сечения крипт и отсутствие постоянного слоя слизи или бактерий. (B) Неравномерное покрытие тканей/обшивки может привести к размытому и неравномерно освещенному сканированию плитки. Было настроено сканирование плитки с позициями, которые были не в фокусе (верхний правый угол). (C) Пример нормального фона (слева) и высокого фона (справа). В этом примере для сигнала DAPI обратите внимание на сигнал, поступающий из эпителия, вне ядер. Все шкалы = 20 мкм. Аббревиатура: DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Discussion
Протокол, описанный выше, обеспечивает воспроизводимый метод визуализации интерфейса хозяин-микробиота. Эти анализы значительно выиграли от разработки протокола, начиная от оптимизации маркировки FISH18 до сохранения слизи и визуализации9. Фиксация и встраивание также обеспечивают полезное хранение образцов; кроме того, кассеты с парафиновой инфильтрацией могут быть отправлены по почте без каких-либо ограничений, так как образцы полностью фиксированы и инертны.
Значение и альтернативные методы
Сочетание FISH и окрашивания слизи позволяет анализировать состав микробиоты в определенных местах ткани и взаимодействие между отдельными бактериями и хозяином. Альтернативные методы, которые включают анализ конкретных участков в микробиоте, обычно не могут исследовать одноклеточную природу этих взаимодействий, например, в случае микродиссекции лазерного захвата в сочетании с секвенированием19. Тем не менее, методы, основанные на секвенировании, имеют преимущество в том, что они могут захватывать генетический состав микробиоты на более тонком уровне и в более широком смысле, чем зонды 16S рРНК.
Подводным камнем представленного протокола является то, что он обеспечивает одноразовый снимок микробиоты по отношению к хозяину. Для визуализации в реальном времени у живых животных требуются специальные методы визуализации, облегчающие получение флуоресцентного сигнала в глубоких тканях (например, прижизненная двухфотонная микроскопия и флуоресцентная микроскопия легкого листа20,21). В этих методах модельный организм либо колонизируется бактериями, которые окрашены молекулами, которые связываются с их оболочкой20, либо генетически модифицированными бактериями, которые содержат флуоресцентные белки21. В последнем случае созревание флуоресцентных белков является ключевой проблемой, поскольку большинству стандартных флуоресцентных белков требуется кислород для излучения света. Поэтому требуются модельные организмы, которые имеют, по крайней мере, нанаэробную среду (наномолярная концентрация кислорода), такие как аэробный кишечник рыбок данио21.
В этом протоколе метанол-Карной используется в качестве фиксатора вместо параформальдегида или формалина, поскольку он не содержит воды. Это предотвращает гидратацию, обезвоживание и разрушение слоя слизи во время обработки и облегчает точные измерения толщины слизи. В то время как фиксация метакарна и встраивание парафина стали стандартом в этой области, были исследованы различные фиксаторы и методы встраивания для оптимизации сохранения слизи9,22, причем некоторые исследования указывают на то, что смолы могут превосходить встраивание парафина22. Другим важным ограничением для встраивания парафина и фиксации метакарна является потеря флуоресцентной флуоресценции белка, чего можно избежать, используя альтернативные фиксаторы (например, формалин или параформальдегид (PFA)) или модифицированные методы внедрения23. Каждый фиксатор имеет свои преимущества и недостатки, а выбор фиксатора зависит от приоритетов визуализации. Методы визуализации могут быть объединены, если биологические реплики зафиксированы либо в PFA, либо в метакарне, и изображения получены из обоих образцов.
FISH был объединен с иммунофлуоресценцией в отдельных случаях со специфическими анти-Muc2C3 кроличьими поликлональными антителами9,24. Эти результаты не были широко воспроизведены с другими антителами Muc2, что указывает на то, что выбор антител может иметь решающее значение для успеха комбинации FISH-иммунофлуоресценция. Условия для успешного окрашивания антител для данного антитела могут не допускать сохранения окрашивания FISH.
Устранение неполадок
В этом протоколе сбор образцов, секционирование и окрашивание представляют собой критические шаги для предотвращения создания артефактов изображения. Например, надавливание на ткань при сборе и перед встраиванием может привести к неправильной локализации микробиоты и повлиять на качество слизи. Другим важным соображением является избегание объединения сегментов очень разной толщины в одной кассете, таких как относительно пустой кусок тонкой кишки и гранула в дистальной толстой кишке. Различные толщины приводят к трудностям в визуализации: после встраивания поперечное сечение на определенной глубине для одного сегмента может быть на неправильной глубине для визуализации другого (например, просвет будет находиться на разной глубине для каждой ткани) (рисунок 1B, C и рисунок 3A). Кроме того, для визуализации гранул стула животной модели они могут быть обернуты в перитонеальную мембрану24. В этой технике небольшой участок свежеизолированной брюшины аккуратно складывается вокруг стула и сохраняет структуру гранулы во время этапов промывки, изложенных в протоколе.
В отличие от обработки тканей животных с содержимым, визуализация образцов кишечника человека представляет некоторые проблемы. В частности, просветное содержимое и слизистая оболочка, вероятно, будут нарушены подготовкой к колоноскопии кишечника, обычно выполняемой перед биопсией кишечника или процедурами резекции. Кроме того, при сборе биопсии полезно отметить ориентацию ткани, чтобы помочь в идентификации специфических признаков (например, просвет против подслизистой оболочки) при отсутствии кишечного содержимого. Предварительное встраивание с 3% агаром и/или агаром:желатиновые смеси могут быть полезны для поддержания полярности тканей25; однако существуют проблемы с обезвоживанием и секционированием агара, о которых сообщается в литературе, и время обработки, возможно, потребуется изменить.
Ключевым аспектом для достижения хорошего окрашивания FISH является регулировка концентрации формамида для конкретных зондов FISH. Формамид будет контролировать гибридизацию зондов FISH к их целям. Важно убедиться, что а) правильная концентрация формамида выбрана для окрашивания данного сообщества и б) что подходящая концентрация формамида возможна даже для используемой комбинации зондов - это может повлиять на оптимальный выбор зонда при использовании нескольких зондов. Веб-сайты, такие как mathFISH (http://mathfish.cee.wisc.edu/), могут помочь в расчете надлежащих концентраций формамида для данного зонда. При отсутствии информации о соответствующих концентрациях формамида этот протокол может быть протестирован с 0% и 10% формамидом.
Секционирование встроенных образцов требует разрезания блока на достаточную глубину для получения просветных срезов, так как слишком поверхностное сечение в блок приведет к поперечному сечению ворсинок/ крипт без просветного содержимого (рисунок 3A). Окрашивайте образцы вскоре после секционирования для оптимального сигнала FISH и используйте свежий DAPI (или DAPI, хранящийся при -20 °C) для решения фоновых проблем (рисунок 3C). Окрашивание FISH участков, которым более месяца, может привести к более плохому / непоследовательному окрашиванию.
Если ткань или крышка не идеально плоские по отношению к слайду, образец может быть не в фокусе в каждом положении при сканировании плитки (рисунок 3B), что приводит к напрасным усилиям и потенциальному фотоотбеливанию. Это может быть решено путем сканирования небольших плиток, в которых все позиции были проверены, чтобы быть в фокусе. Секционирование тусклыми лезвиями также может привести к отслоению слизи и просветного содержимого, которые выглядят как большие темные области во время визуализации. Наконец, испарение раствора или пузырьков на стадии гибридизации может привести к неравномерному окрашиванию зондов FISH в ткани.
Другим критическим параметром, влияющим на эффективность связывания зонда FISH, является конкуренция между различными зондами. Полезной проверкой для проверки того, что зонд FISH маркирует бактерии, является изучение колокализации сигнала от зонда FISH с помощью DAPI (рисунок 2C, D). В образцах, требующих использования нескольких рРНК-зондов, регулировка таких параметров, как температура гибридизации, концентрация зонда и формамид, становится критически важной для обеспечения эффективного связывания зондов с правильными видами18.
Примечания по визуализации
Окрашенные РЫБой бактерии лучше всего визуализируют с помощью конфокального микроскопа и объектива не менее 40-кратного увеличения. В то время как 63-кратное увеличение предпочтительнее, чем изображение бактерий на уровне одной клетки, 40-кратное увеличение также может быть использовано путем максимизации цифрового зума или использования системы сверхвысокого разрешения. Системы, оснащенные возможностями сверхвысокого разрешения, могут также обеспечивать субклеточное разрешение отдельных бактериальных клеток. Более низкие цели увеличения могут быть использованы для получения общего представления о локализации бактерий и толщине слизи.
Приобретение 16-битных изображений вместо 8-битных изображений также настоятельно рекомендуется, так как более высокий динамический диапазон поможет захватить широкий диапазон сигнала DAPI от чрезвычайно ярких ядер эпителия и относительно слабый сигнал просветных бактерий. Помимо использования настройки визуализации, описанной выше, важным соображением визуализации является выбор флуорофоров. Для наилучшего разделения между типами бактерий убедитесь, что используемые флуорофоры не перекрывают спектры возбуждения и излучения (если только визуализация не на системе с возможностью выполнения линейного размешивания). Кроме того, зонды могут быть использованы в комбинации (например, комбинация зонда, специфичного для семейства, и зонда, специфичного для рода) для идентификации дополнительных членов сообщества. При использовании линейных несмешанных или непроверенных зондов важно проверить точность и уровень окрашивания FISH на чистых культурах8,14.
После сбора изображений доступны несколько инструментов для количественного анализа интерфейса хозяин-микробиота, таких как BacSpace26, HiPR-FISH8 и другие инструменты сегментации27. BacSpace - это программное обеспечение MATLAB, которое позволяет сегментировать тканевые и просветные компоненты и удалять растительный материал из изображений26. Программа также обеспечивает анализ толщины слизи в 2D и количественную оценку пространственного распределения на основе расстояний пикселей в разных каналах26. И наоборот, программное обеспечение HiPR-FISH Image Analysis позволяет сегментировать окрашенные FISH клетки8. Наконец, другие инструменты бактериальной сегментации, которые были оптимизированы для экспериментов in vitro27, также могут быть адаптированы к этому приложению.
Заключение
Визуализация in situ позволяет проводить количественный анализ отдельных микробных таксонов в контексте других членов сообщества и различных микросред, созданных диетой, слизью и эпителиальными криптами хозяина. Взаимодействие между организмами диктует биологию микробных систем, связанных с хозяином, и обеспечивает существенный анализ изменений в этих структурах во время возмущения, что имеет последствия для здоровья. Примечательно, что способность визуализировать микробиоту in situ через протокол, описанный выше, обеспечивает невероятное окно в биогеографию микробиоты по отношению к животному-хозяину.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить доктора Кристен Эрл за бесценную разработку техники, Эмбер Ханн за помощь в устранении неполадок, доктора Джен Нгуен и Дианну Пепин за критический обзор рукописи, а также доктора Хешама Солимана и лабораторию Росси в Университете Британской Колумбии за предоставление доступа к микроскопу. Авторы признают поддержку со стороны CIHR Team Grant: Canadian Microbiome Initiative 2 (C.T.), Crohn's and Colitis Canada (C.T. and K.M.N.), CIFAR (C.T. и K.M.N.), Michael Smith Foundation for Health Research Scholar Award (C.T.), Weston Foundation: Weston Family Microbiome Initiative (c.T.), Paul Allen Distinguished Investigator Award (C.T.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum foil | |||
| Chloroform | Fisher | C298-500 | Toxic |
| Coplin jar | Fisher | 08-813E | |
| Cover glass, 22 × 22 mm, no #1 | VWR | CA48366-227-1 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Resuspended to 5 mg/mL |
| Empty pipette tip box(es) | To melt paraffin | ||
| Ethanol, anhydrous, molecular grade | -- | -- | |
| FISH probes | |||
| FISH hybridization solution | -- | -- | 20 mM Tris–HCl pH 7.4, 0.9 M NaCl, 0.01% (w/v) SDS in nuclease-free water. Optional addition of 5–50% (v/v) formamide |
| FISH washing buffer | -- | -- | 20 mM Tris–HCl pH 7.4, 0.9 M NaCl |
| Fluorescently-labeled Ulex Europaeus Agglutinin (UEA-1) lectin | Vector Laboratories | FL-1061 (Fluorescein-labeled) or RL-1062-2 (Rhodamine-labeled) | UEA-1 labels fucosylated glycans, so it is not appropriate for germ-free mice or for samples from fucosyltransferase 2 (FUT2)-deficient hosts. |
| Forceps | |||
| Formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | |
| Fumehood | |||
| Glacial Acetic Acid | Fisher | A38-212 | Corrosive and flammable |
| HybriSlip flexible plastic cover slips, 22 x 22 mm × 0.25 mm | Sigma Aldrich | GBL722222 | for FISH hybridization steps, can substitute glass coverslips |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Kimwipes | |||
| Methanol | Fisher | A412 | Toxic and flammable |
| Microtome | for sectioning | ||
| Multipurpose Specimen Storage Containers, 473 mL | Fisher | 14-955-117A | Can substitute with a glass or polyethylene container of your choice. Methacarn is not compatible with polystyrene or metal. |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | Any nail polish should work |
| Oven | Necessary range: 45-60 °C | ||
| Paraffin: Leica Paraplast | Leica | 39601006 | |
| PBS, Phosphate-buffered Saline (10x solution) | Fisher | BP3991 | Dilute to 1x for protocol |
| Sodium chloride | Fisher | S271 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), 20% Solution, RNase-free | Invitrogen | AM9820 | |
| Tissue-Loc HistoScreen Cassettes | Thermo Scientific | CA83009-999 | |
| Trizma hydrochloride solution, 1M Tris-HCl, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2663-1L | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Water, nuclease-free | Fisher | BP2484100 | |
| Xylenes | Fisher | X3P-1GAL | Toxic and flammable |
References
- Tropini, C., Earle, K. A., Huang, K. C., Sonnenburg, J. L. The gut microbiome: connecting spatial organization to function. Cell Host and Microbe. 21 (4), 433-442 (2017).
- Hansson, G. C., Johansson, M. E. V. The inner of the two Muc2 mucin-dependent mucus layers in colon is devoid of bacteria. Gut Microbes. 1 (1), 51-54 (2010).
- Johansson, M. E. V., et al. Normalization of host intestinal mucus layers requires long-term microbial colonization. Cell Host and Microbe. 18 (5), 582-592 (2015).
- Jakobsson, H. E., et al. The composition of the gut microbiota shapes the colon mucus barrier. EMBO Reports. 16 (2), 164-177 (2015).
- Tropini, C., et al. Transient osmotic perturbation causes long-term alteration to the aut microbiota. Cell. 173 (7), 1742-1754 (2018).
- Desai, M. S., et al. A dietary fiber-deprived gut microbiota degrades the colonic mucus barrier and enhances pathogen susceptibility. Cell. 167 (5), 1339-1353 (2016).
- Ng, K. M., et al. Recovery of the gut microbiota after antibiotics depends on host diet, community context, and environmental reservoirs. Cell Host and Microbe. 26 (5), 650-665 (2019).
- Shi, H., et al. Highly multiplexed spatial mapping of microbial communities. Nature. 588 (7839), 676-681 (2020).
- Johansson, M. E. V., Hansson, G. C. Preservation of mucus in histological sections, immunostaining of mucins in fixed tissue, and localization of bacteria with FISH. Methods in Molecular Biology. 842, 229-235 (2012).
- Greuter, D., Loy, A., Horn, M., Rattei, T. ProbeBase-an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes and primers: New features 2016. Nucleic Acids Research. 44 (1), 586-589 (2016).
- Quast, C., et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: Improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Research. 41 (1), 590-596 (2013).
- Beliveau, B. J., et al. OligoMiner provides a rapid, flexible environment for the design of genome-scale oligonucleotide in situ hybridization probes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2183-2192 (2018).
- Madeira, F., et al. The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019. Nucleic Acids Research. 47 (1), 636-641 (2019).
- Welch, J. L. M., Hasegawa, Y., McNulty, N. P., Gordon, J. I., Borisy, G. G. Spatial organization of a model 15-member human gut microbiota established in gnotobiotic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (43), 9105-9114 (2017).
- Lagkouvardos, I., et al. Sequence and cultivation study of Muribaculaceae reveals novel species, host preference, and functional potential of this yet undescribed family. Microbiome. 7 (1), 28 (2019).
- Zadeh, J. N., et al. NUPACK: Analysis and design of nucleic acid systems. Journal of Computational Chemistry. 32 (1), 170-173 (2011).
- Yilmaz, L. S., Parnerkar, S., Noguera, D. R. MathFISH, a web tool that uses thermodynamics-based mathematical models for in silico evaluation of oligonucleotide probes for fluorescence in situ hybridization. Applied and Environmental Microbiology. 77 (3), 1118-1122 (2011).
- Huber, D., Voith von Voithenberg, L., Kaigala, G. V. Fluorescence in situ hybridization (FISH): History, limitations and what to expect from micro-scale FISH. Micro and Nano Engineering. 1, 15-24 (2018).
- Wang, Y., et al. Laser capture microdissection and metagenomic analysis of intact mucosa-associated microbial communities of human colon. Applied Microbiology and Biotechnology. 88 (6), 1333-1342 (2010).
- Geva-Zatorsky, N., et al. In vivo imaging and tracking of host–microbiota interactions via metabolic labeling of gut anaerobic bacteria. Nature medicine. 21 (9), 1091-1100 (2015).
- Jemielita, M., et al. Spatial and temporal features of the growth of a bacterial species colonizing the zebrafish gut. mBio. 5 (6), 01751 (2014).
- Hasegawa, Y., Mark Welch, J. L., Rossetti, B. J., Borisy, G. G. Preservation of three-dimensional spatial structure in the gut microbiome. PLoS ONE. 12 (11), 0188257 (2017).
- Zhanmu, O., et al. Maintenance of fluorescence during paraffin embedding of fluorescent protein-labeled specimens. Frontiers in Neuroscience. 13, 752 (2019).
- Bergstrom, K., et al. Proximal colon-derived O-glycosylated mucus encapsulates and modulates the microbiota. Science. 370 (6515), 467-472 (2020).
- Jones, M. V., Calabresi, P. A. Agar-gelatin for embedding tissues prior to paraffin processing. BioTechniques. 42 (5), 569-570 (2007).
- Earle, K. A., et al. Quantitative imaging of gut microbiota spatial organization. Cell Host and Microbe. 18 (4), 478-488 (2015).
- Jeckel, H., Drescher, K. Advances and opportunities in image analysis of bacterial cells and communities. FEMS Microbiology Reviews. , (2020).
