Summary
Este protocolo simplificado detalha um fluxo de trabalho para detectar e imaginar bactérias em amostras complexas de tecido, desde a fixação do tecido até micróbios de coloração com hibridização fluorescente in situ .
Abstract
Medir a localização de micróbios dentro de seu contexto in vivo é um passo essencial para revelar as relações funcionais entre a microbiota e o intestino vertebrado. A paisagem espacial da microbiota intestinal é fortemente controlada por características físicas - muco intestinal, criptas e dobras - e é afetada por propriedades controladas pelo hospedeiro, como pH, disponibilidade de oxigênio e fatores imunológicos. Essas propriedades limitam a capacidade de micróbios e patógenos commensais para colonizar o intestino compunhally. Na escala de micróbios, a organização microbiana determina as interações de close-range entre diferentes micróbios, bem como as interações entre micróbios e seu hospedeiro. Essas interações, então, afetam a função dos órgãos em larga escala e a saúde do hospedeiro.
Este protocolo permite a visualização da organização espacial de microbiota intestinal a partir de distâncias entre células para escalas de órgãos. O método baseia-se na fixação de tecidos intestinais, preservando a estrutura intestinal e as propriedades do muco. As amostras fixas são então incorporadas, seccionadas e manchadas para destacar espécies bacterianas específicas através da fluorescência na hibridização situ (FISH). Os recursos do host, como muco e componentes de células hospedeiras, são rotulados com lectinas fluorescentes. Finalmente, as seções manchadas são imagens usando um microscópio confocal utilizando imagens de tomografia computadorizada em alta ampliação para fazer a ponte entre as escamas de comprimento de míccro a centímetros. Esse tipo de imagem pode ser aplicada em seções intestinais de modelos animais e biópsias de tecidos humanos para determinar a biogeografia da microbiota no intestino em saúde e doença.
Introduction
As técnicas de visualização microbiana têm origens tão antigas quanto a microbiologia em si, quando Antonie Van Leeuwenhoek usou seu microscópio para observar bactérias (que ele chamou de "animalcules") de placa dentária e fezes no século XVII . Desde então, inúmeras técnicas foram desenvolvidas para visualizar a organização espacial do consórcio de bactérias, fungos e vírus que vivem associados a uma microbiota1 hospedeira. Elucidar a localização desses micróbios é essencial para determinar sua função dentro de seu hospedeiro animal. A biogeografia das bactérias é importante tanto na taxa commensal quanto patogênica, pois a proximidade com locais específicos (por exemplo, o epitélio), substratos nutricionais e micróbios específicos podem ditar a produção bacteriana de metabólitos subjacentes às interespécies e intercontrações entre reinos.
Uma estrutura-chave que separa bactérias e os tecidos hospedeiros em vários locais diferentes do corpo, como a cavidade oral, intestino ou pulmão, é o muco - uma camada produzida por hospedeiro que tanto previne a translocação microbiana para as células epiteliais hospedeiras e serve como um recurso nutricional para a microbiota2,3,4 . Caracterizar violações e mudanças nessa barreira é de fundamental importância, levando a uma visão mecanicista das interações hospedeira-microbiota que não seriam obtidas apenas por sequenciamento apenas5,6,7. Por exemplo, a imagem permitiu a descoberta de que a exposição a antibióticos pode interromper a camada de muco e a organização da microbiota7,8, e que os laxantes podem esgotar o muco, correlacionando-se com grandes alterações nos parâmetros imunológicos5.
Este protocolo descreve uma estrutura geral para fixação, coloração e imagem da microbiota e do tecido hospedeiro (Figura 1), construída sobre o trabalho de Johansson e Hansson9. Embora este protocolo seja modelado no contexto das seções intestinais, ele pode ser facilmente adaptado a outros tipos de tecidos. Este protocolo permite o processamento de amostras clínicas experimentais de animais ou humanos; foram incluídas notas para o processamento de ambos os tipos de amostras. No exemplo aqui apresentado, as bactérias hospedeiras de epitélio e luminal foram rotuladas simultaneamente com coloração de 4′,6-diamidino-2-fenilôdole (DAPI), muco com a lectina conjugada por fluoresceína (FITC), ulex europaeus agglutinina I (UEA-1), e um taxon bacteriano específico usando FISH. As sondas FISH geralmente são projetadas contra os genes rRNA 16S de um taxon para garantir o sinal alto de vincular uma transcrição de alta cópia.
Neste exemplo, a sonda tem como alvo o rRNA 16S da família bacteriana Muribaculaceae (Figura 2). No entanto, as manchas são prontamente substituídas por diferentes sondas FISH e/ou lectinas para acomodar a questão biológica apropriada. Testes FISH validados anteriormente podem ser encontrados no ProbeBase10, um recurso on-line para sondas oligonucleotídeos direcionadas a rRNA ou no SILVA11, um banco de dados RNA ribossômico. Para o design de novas sondas, o leitor pode se referir a novos pipelines como HiPR-FISH8 ou Oligominer12. Usando este protocolo, é possível observar a embalagem próxima de bactérias no lúmen intestinal e as diferentes características do muco intestinal em todo o trato digestivo. O fluxo de trabalho descrito aqui permite a análise quantitativa da microbiota no contexto espacial de seu ambiente hospedeiro.
Protocol
Todos os experimentos em animais e coleta de tecidos descritos neste protocolo foram realizados em conformidade com as diretrizes do Conselho Canadense de Cuidados com Animais (CCAC) e foram aprovados pelo Comitê de Cuidados com Animais da Universidade da Colúmbia Britânica. Foram usados camundongos Webster suíços sem germes. Todos os animais tinham de 8 a 10 semanas de idade, ambos os sexos foram usados, e todos os ratos foram co-alojados com pelo menos dois ratos por gaiola. Os animais foram eutanizados usando dióxido de carbono com luxação cervical secundária ou punção cardíaca.
1. Projetando um experimento de imagem: considerações e coleta de amostras
- Design da sonda FISH
- Se existir uma sonda FISH apropriada, selecione uma publicada pré-existente que mostre um sinal forte em células rotuladas em comparação com o fundo.
- Validar novas sondas in vitro para determinar sua eficiência de ligação a amostras fixas das bactérias alvo e ligação fora do alvo a outras bactérias.
- Verifique todas as sondas FISH 16S a serem usadas contra sequências 16S do organismo alvo ou contra o sequenciamento de rRNA 16S das amostras a serem analisadas para garantir que a proporção esperada de correspondências positivas esteja presente, e que as sondas não se vinculem não especificamente a outros membros da microbiota.
- Alinhe as sondas FISH contra sequências de comprimento total ou variantes de sequência de amplicon usando uma ferramenta, como o Ômega13 Clustal, para avaliar a potencial ligação de sondas e seus alvos.
- Além dos testes de silico, teste a precisão e o nível de coloração de PEIXEs de sondas não validadas em culturas puras8,14.
NOTA: Ao colorar vários membros da comunidade, as sondas podem ser usadas combinatorialmente (por exemplo, a combinação de uma sonda específica da família e uma sonda específica do gênero) se os fluoroforos utilizados não se sobrepõem em espectros de excitação e emissão (a menos que imagens em um sistema com a capacidade de executar de mistura linear). Além disso, a especificidade pode ser demonstrada incluindo controles de especificidade/sondas mexidas ou por concorrência com sondas não fluorescentes.
- Tipos de amostras e coleta de tecidos
- Usando ferramentas afiadas e limpas, corte segmentos intestinais de camundongos gnotobióticos suíços Webster para imagem. Minimize perturbar a amostra o máximo possível e manuseie as seções por suas bordas para evitar afetar a área de imagem. Fixar a amostra o mais rápido possível após a dissecação para evitar a degradação.
NOTA: Para estudos em animais, são preferidas seções intestinais intactas e sem abafadas; a membrana ajudará a manter intacta a organização luminal e mucosa. - Ferramentas limpas limpando-as com 70% de etanol entre amostras e locais. Obtenha pelo menos três réplicas biológicas por seção intestinal/local de biópsia, tomando cuidado para amostrar locais intestinais consistentes, como o muco e a arquitetura intestinal, bem como alterações de microbiota significativamente em diferentes locais.
- Usando ferramentas afiadas e limpas, corte segmentos intestinais de camundongos gnotobióticos suíços Webster para imagem. Minimize perturbar a amostra o máximo possível e manuseie as seções por suas bordas para evitar afetar a área de imagem. Fixar a amostra o mais rápido possível após a dissecação para evitar a degradação.
2. Fixação e infiltração da amostra de tecido
- Fixação
- Prepare o methacarn fresco em um recipiente compatível com as seguintes razões: 60% de metanol absoluto, 30% clorofórmio e 10% ácido acético glacial. Dispense cada um desses produtos químicos em um capô de fumaça. Escolha um recipiente que possa ser ventilado abrindo a tampa. Como o metacarn não é compatível com poliestireno, prepare-o em um recipiente de polietileno, usando cilindros graduados em vidro/tubos sorológicos para o clorofórmio e ácido acético glacial.
NOTA: Durante a mistura, os vapores são produzidos e podem causar pressão dentro do recipiente. É aconselhável manter o recipiente relativamente fechado uma vez removido do capô da fumaça se as amostras não estiverem sendo adicionadas ativamente. Clorofórmio é tóxico; não inalar, engolir ou absorver através da pele. O metanol é tóxico e altamente inflamável; não inalar, engolir ou absorver através da pele. O ácido acético glacial é inflamável e altamente corrosivo para a pele e os olhos. - Após a dispensa, feche o recipiente, gire para misturar e depois desafo). repita isso até que o off-gassing pare (e a pressão não se acumule mais consideravelmente sob a tampa).
NOTA: Não descarte o methacarn em drenos; coletar e descartar resíduos químicos perigosos conforme as diretrizes institucionais. Use um lápis para rotular de histologia, como muitas tintas de caneta sairão na solução de methacarn. - Coloque as seções intestinais em fitas histologias segurando delicadamente uma borda do tecido com pinças. Feche o e submerse completamente em uma solução de methacarn fresco. Certifique-se de que a solução não é mais antiga do que algumas horas após a imersão das fitas.
- Para amostras clínicas que serão coletadas em um conjunto clínico sem acesso a um capô de fumaça, use um recipiente de armazenamento de polietileno com um retalho cortado na tampa que permitirá a passagem dos de histologia. Fita esta aba fechada quando não passa amostras para evitar a fuga de fumaça tóxica.
NOTA: É importante usar fita adesiva para evitar a dissolução da cola no recipiente - alguns tipos de fita (por exemplo, fita de embalagem de plástico) podem não aguentar bem a fumaça de methacarn. - Fixar amostras por um mínimo de 3h e no máximo duas semanas.
NOTA: Amostras mais grossas podem exigir tempos de fixação maiores que 3h. O tempo de fixação pode ser escolhido para permitir o processamento simultâneo de infiltração de parafina para fitas fixadas em diferentes soluções de methacarn (por exemplo, para realizar simultaneamente a infiltração de parafina em grupos de amostras coletadas e fixadas ao longo de duas semanas).
- Prepare o methacarn fresco em um recipiente compatível com as seguintes razões: 60% de metanol absoluto, 30% clorofórmio e 10% ácido acético glacial. Dispense cada um desses produtos químicos em um capô de fumaça. Escolha um recipiente que possa ser ventilado abrindo a tampa. Como o metacarn não é compatível com poliestireno, prepare-o em um recipiente de polietileno, usando cilindros graduados em vidro/tubos sorológicos para o clorofórmio e ácido acético glacial.
- Infiltração e incorporação de parafina
- Coloque a parafina em um recipiente resistente ao calor e derreta-a em um forno a 60 °C durante a noite. À medida que as pelotas de parafina tomam mais espaço antes do derretimento, certifique-se de que a parafina suficiente seja derretida para cobrir todas as fitas.
NOTA: A temperatura não deve ser superior a 60 °C, pois pode dar origem a artefatos. - Lave o tecido derramando o líquido no recipiente de resíduos apropriado e substituindo-o imediatamente pelos seguintes produtos químicos.
- Incubar em metanol absoluto por 30 minutos. Repita uma vez.
- Incubar em etanol absoluto por 20 minutos. Repita uma vez.
- Incubar em xileno por 15 minutos. Repita uma vez.
- Troque as lavagens rapidamente, tomando cuidado para evitar deixar as fitas secas. Certifique-se de que cada lavagem cubra totalmente as fitas no béquer ou recipiente.
NOTA: Os xilenos são inflamáveis e, se inalados, os vapores podem deprimir o sistema nervoso central com potenciais consequências neurológicas a longo prazo após a exposição a altas concentrações (>200 ppm). Manuseie xilenos apenas dentro de um capô de fumaça. Como os xilenos são perigosos, tome cuidado para usar a quantidade mínima necessária para cobrir as fitas histológicas.
- Durante a incorporação, oriente os segmentos intestinais paralelos ao comprimento do (em oposição à vertical) usando pinças para fornecer seções longitudinal e transversais em vez de rosquinhas transversais para fornecer mais área de amostra potencial para imagens quantitativas (Figura 1B).
- Abra ligeiramente as fitas (~1-2 cm ou 0,5 polegadas) para permitir que a parafina entre sem perder os segmentos teciduais. Use luvas duplas para este passo ou pinça para evitar superaquecimento ou queima leve de dedos. Submerso e feche as fitas no recipiente de parafina derretida, colocando o recipiente de volta no forno de 60 °C. Certifique-se de que as fitas estão cheias de parafina, e não restam grandes bolhas de ar.
- Após a incubação por 2h a 60 °C, retire o recipiente do forno. Usando fórceps, remova cuidadosamente as fitas e coloque-as individualmente em um pedaço de papel alumínio para esfriar. Armazene-os à temperatura ambiente até que estejam prontos para incorporar e seccionar.
- Se se sectionia os blocos de parafina com um microtome, secionando fundo o suficiente para o bloco que os conteúdos luminosos estão expostos, permitindo uma seção longitudinal de villi e/ou criptas, além de conteúdo luminal e muco. Tome cuidado para substituir as lâminas, pois o material fecal entorpece rapidamente a lâmina em comparação com o tecido. Corte seções para 4 μm de espessura para a nitidez ideal das imagens. Transfira as seções para slides não revestidos regulares.
- Para a coloração de PEIXEs, colori as seções intestinais o mais rápido possível (ou seja, dentro de algumas semanas de secção) para obter um forte sinal de PEIXE. Se omitir a coloração de PEIXE, a coloração de lectina + DAPI pode ser realizada em amostras menos frescas (ou seja, meses de idade) sem perda significativa de sinal.
- Coloque a parafina em um recipiente resistente ao calor e derreta-a em um forno a 60 °C durante a noite. À medida que as pelotas de parafina tomam mais espaço antes do derretimento, certifique-se de que a parafina suficiente seja derretida para cobrir todas as fitas.
3. Manchas de bactérias e características do hospedeiro
- Preparação
- Aqueça o forno a 60 °C. Pré-aqueça um frasco de Coplin vazio e volume suficiente para cobrir os slides de vidro no frasco duas vezes com xileno em uma garrafa de vidro, tomando o cuidado de parafilmar ao redor da tampa para evitar a evaporação dos xilenos. Deixe a temperatura dos xilenos chegar a 60 °C.
NOTA: Um frasco coplin padrão encaixa 8 slides, e os slides podem ser cobertos com cerca de 50 mL de líquido (pode variar entre 40 e 60 mL, dependendo da marca). Os substitutos do xileno são menos tóxicos e têm sido usados com sucesso por outros grupos para a etapa de depilação (passo 3.2)8,9. - Se estiver disponível um forno separado, pré-aqueça um forno de hibridização a 50 °C. Caso contrário, esta etapa pode ser realizada com o mesmo forno usado para assar as lâminas após a etapa 3.2.3.
- Preparar a solução de hibridização FISH: 20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 0,9 M NaCl; 0,01%26 - 0,1%9 (w/v) dodecylsulfate de sódio (SDS) em água sem nuclease. Se necessário, adicione formamida de 5-50% (v/v). Pré-aqueça esta solução de hibridização a 50 °C durante a desofiação.
NOTA: A formamida é uma amida que age como um teratogens; lidar formamide com luvas e óculos. Em pequenas doses e após a exposição a olhos, pele ou membranas mucosas, é irritante. Em grandes quantidades, o vapor formamida pode exigir intervenção médica. A formamida pode ser armazenada a 100% em um congelador de -20 °C.
- Aqueça o forno a 60 °C. Pré-aqueça um frasco de Coplin vazio e volume suficiente para cobrir os slides de vidro no frasco duas vezes com xileno em uma garrafa de vidro, tomando o cuidado de parafilmar ao redor da tampa para evitar a evaporação dos xilenos. Deixe a temperatura dos xilenos chegar a 60 °C.
- Preparando os slides para coloração: desparafinação
- Coloque os slides no frasco Coplin, garantindo que as seções não entrem em contato com outros slides ou o frasco, e asse os slides a 60 °C por 10 minutos.
- No capô da fumaça, encha o frasco de Coplin com xilenos pré-aquecidos do forno, tomando cuidado para não derramar diretamente em cima das amostras e potencialmente desalojar os tecidos. Coloque o frasco de Coplin de volta no forno de 60 °C. Deixe a garrafa com os xilenos restantes no capô da fumaça.
- Despeje os xilenos usados em um recipiente de lixo adequado para descarte, tomando cuidado para não perturbar as seções de tecido nas lâminas de vidro e usando um par de fórceps para evitar que os slides caiam do frasco de Coplin. Reponha o frasco de Coplin com os xilenos restantes e incubar por 10 minutos à temperatura ambiente no capô da fumaça.
- Incubar as seções em 99,5% de etanol por 5 min a temperatura ambiente. Após esta etapa de incubação, remova os slides do frasco de Coplin, limpe a parte de trás dos slides em um lenço de laboratório ou toalha de papel, e seque brevemente até que as gotículas de etanol se vão.
NOTA: Limpar a parte de trás dos slides permite uma melhor visualização do progresso da secagem.
- Coloração bacteriana com PEIXES
- Use um bloqueador líquido ou caneta PAP para limitar a área de expansão líquida circulando a área de cada seção de tecido. Certifique-se de que a tinta não entre em contato com a seção em si. Crie um círculo o mais próximo possível de cada seção de tecido sem entrar em contato com o tecido para minimizar a área da superfície que precisa ser coberta pela solução de hibridização.
- Prepare a solução de hibridização: para cada 50 μL de solução de hibridização pré-aquecida, adicione sonda de 0,5 μg (por exemplo, 0,5 μL de 1 μg/μL). Pipeta a solução de hibridização nas seções do slide (~20 μL/seção, dependendo do tamanho da seção/círculo). Proteja a solução de hibridização e os slides da luz a partir deste ponto durante as etapas de incubação e armazenamento.
- Certifique-se de que o volume de líquido usado cubra toda a seção após a sobreposição com um deslizamento de tampas de plástico flexível. Incubar o slide em uma câmara úmida para reduzir a evaporação. Crie uma câmara úmida com uma caixa de ponta de pipeta com lenços ou toalhas de papel na parte inferior que foram encharcadas com solução de hibridização em excesso ou soro fisiológico tamponado (PBS) para fornecer umidade. Incubar as seções a 45-50 °C, dependendo do conjunto da sonda, por >3 h.
- Aqueça o tampão de lavagem FISH: 20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 0,9 M NaCl a 50 °C durante o período de incubação. Prepare o tampão de lavagem suficiente para cobrir os slides no frasco de Coplin.
- Remover as tampas plásticas; incubar os slides em tampão de lavagem FISH em um frasco de Coplin, ambos pré-aquecidos a 50 °C. Coloque o frasco de Coplin de volta no forno de 50 °C por 10-20 min. Para amostras grossas, remova as tampas no frasco de Coplin adicionando o tampão e desalojando suavemente as tampas para evitar manchar a fatia.
- Manchando o muco e características do hospedeiro
- Prepare uma contra-mancha geral de DNA/muco na PBS: 10 μg/mL DAPI final + 40 μg/mL mucus stain UEA-1. Prepare contra-mancha suficiente para cobrir as manchas na ausência de uma mancha de cobertura para evitar danificar o tecido com tampas adicionais.
NOTA: Cobrir as manchas na ausência de um deslizamento de cobertura exigirá volumes maiores do que os 20 μL utilizados em 3.3.2. Para seções de tamanho médio (~10 mm de diâmetro), 200 μL é suficiente para cobrir um ponto; teste este volume de antemão em um slide manequim. - Remova o tampão de lavagem FISH e substitua-o por PBS no frasco Coplin. Imediatamente após reabastecendo o frasco de Coplin com PBS, decante o PBS.
- Remova as lâminas do frasco e pipeta a contra-mancha em cima da seção, garantindo não tocar no tecido com a ponta da pipeta. Cubra toda a seção com uma bolha. Incubar a 4 °C por 45 min no escuro.
- Lave as manchas 3 vezes rapidamente com PBS fresco: enquanto segura os slides no lugar usando pinças, despeje o PBS em uma pia e reabasteça imediatamente com PBS fresco.
- Limpando a parte de trás dos slides contra uma toalha de limpeza ou papel, deixe a maior parte do PBS evaporar das seções, auxiliado por uma linha de vácuo conectada a uma ponta de pipeta. Mais uma vez, evite tocar na seção com a ponta da pipeta.
- Monte as seções usando um meio de montagem (sem DAPI) e deixe-a fixada à temperatura ambiente coberta por tampas de vidro, garantindo que as tampas sejam planas e não haja bolhas de ar no meio de montagem.
- Afixe as tampas no slide pintando ao longo das bordas do deslizamento com esmalte claro, tomando o cuidado de ficar longe da borda do slide para garantir que o slide fique nivelado no suporte de slides do microscópio durante a imagem.
- Armazene os slides a 4 °C no escuro por algumas semanas antes que a fluorescência se espleque.
- Prepare uma contra-mancha geral de DNA/muco na PBS: 10 μg/mL DAPI final + 40 μg/mL mucus stain UEA-1. Prepare contra-mancha suficiente para cobrir as manchas na ausência de uma mancha de cobertura para evitar danificar o tecido com tampas adicionais.
4. Análise de imagens e imagens
- Visualizando as manchas
- Selecione uma área do tecido que contenha tecido e lúmen para imagem da interface microbiota-host. Para imagens quantitativas de espessura de muco e biogeografia luminal, selecione campos de visão onde as fatias do villi epitelial e/ou criptas são longitudinas e não transversais. Evite áreas com grandes lacunas entre o muco e o epitélio para evitar a secção de artefatos.
- Localize o tecido e corrija o plano focal, utilizando o sinal DAPI para localização e foco para evitar o branqueamento fotográfico do sinal de fluorescência do PEIXE.
- Ajuste as configurações de imagem. Para visualizar a mancha de DAPI bacteriana, aumente a potência do laser e ganhe até o ponto em que o sinal DAPI das células epiteliais está supersaturado ou "soprado".
NOTA: Não se saturar excessivamente, pois isso levará a fotobleaching e artefatos visuais nos núcleos que não podem ser recuperados. - Para todos os outros canais, use a quantidade mínima de energia laser que fornecerá um sinal claro acima do fundo, e tenha cuidado para não se sobressaturar.
NOTA: Isso é especialmente importante na realização de tomografias, pois o fotobleaching será problemático quando a sobreposição entre as telhas for imageda. - Use 40x ou mais de ampliação para imagem de bactérias individuais.
- Adquira as imagens.
- Adquira tomografias para obter dados quantitativos sobre a espessura do muco e distribuição espacial de micróbios dentro do lúmen. Certifique-se de sobreposição de 15% entre as telhas e verifique se há iluminação vinheta/desigual, que pode ser exacerbada pelo zoom de <1x. Ao configurar uma varredura de ladrilhos, preste muita atenção se o tecido está em foco em todas as telhas, pois imagens embaçadas/fora de foco não podem ser analisadas (Figura 3B).
- Se possível, minimize o número de telhas necessárias para a imagem de um determinado comprimento de epitélio girando a área de varredura para que a camada de epitélio e muco sejam paralelos ao azulejo e não em um ângulo. Caso contrário, encontre uma seção do epitélio paralela ou perpendicular à área de imagem para obter um efeito semelhante.
Representative Results
Para investigar a localização de bactérias commensais intestinais específicas no intestino do camundongo, foram utilizados camundongos suíços sem germes que haviam sido colonizados com isolados bacterianos individuais. Para este experimento, as espécies bacterianas rotuladas foram i) um isolado humano da família Muribaculaceae5, Muribaculum intestinale, uma abundante e prevalente família de bactérias na microbiota 15 murina, bem como ii) Bacteroides thetaiotaomicron, uma bactéria intestinal geneticamente tratável e comum. Após duas semanas de equilíbrio, os camundongos foram eutanizados, e um segmento do cólon contendo uma pelota fecal foi seccionado e fixado em methacarn recém-preparado. Após dois dias de fixação, as seções foram desidratadas pelo processamento através de metanol, etanol e xileno, infiltrados com parafina, incorporados e, em seguida, seccionados a fatias luminal de 4 μm. Estas amostras foram então manchadas com uma sonda FISH (3' Cy3-tagged) específica para o isolado Muribaculum, projetada usando o software Oligominer12, e verificadas para estrutura secundária e terciária e vinculação mínima não específica usando NuPACK e mathFISH16,17. As amostras também foram contra-manchadas com a lectina ligada a Rhodamine UEA-1 (que mancha glycans fucosylated em muco) e DAPI. As seções manchadas foram imagens utilizando um módulo objetivo de óleo de 40x e super-resolução.
Figura 1: Fluxo de trabalho de visualização da interface microbiota-host no intestino. (A) Um fluxo de trabalho ilustrado para o gasoduto. (B) Os dois planos de secção produzirão seções transversais (preferidas para este gasoduto) ou "donuts" transversais. (C) Incorporar tecidos de espessuras muito diferentes pode resultar em fatias que são ideais apenas para um tecido ou outro. Abreviaturas: PEIXE = fluorescência na hibridização situ ; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenildole. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: A imagem do cólon mostra a localização do muribaculum intestinal em relação ao muco em um modelo de rato gnotobiótico. As seções foram manchadas com DAPI (azul), sonda Muribaculaceae FISH (vermelho) e UEA-1 (verde). (A) Cólon distal de camundongo monocolonizado com muribaculum intestinal e (B) cólon distal de camundongos bi-colonizados com muribaculum intestinal e bacteroides thetaiotaomicron. Barra de escala = 20 μm. (C e D) Cy3-FISH (esquerda), DAPI (meio) e canais combinados Cy3-FISH + DAPI para porções de entrada luminal de (A) e (B), respectivamente. Barra de escala = 5 μm. Em (A) e (C), todos os sinais DAPI em forma de bactérias e do tamanho de bactérias são rotulados com Cy3 (pontas de flecha única), e em (B) e (D), além dessas células Cy3 e DAPI-double-positive (pontas de flecha simples), existem células bacterianas manchadas de DAPI que são Cy3-negativas (pontas de flecha dupla), como esperado para estados mono e bi-colonização. Com exceção de bactérias mais filamentosas, estruturas maiores (>4 μm de comprimento) DOPI -positivas (setas cegas) são material vegetal ou núcleos de células hospedeiras. Abreviaturas: PEIXE = fluorescência na hibridização situ ; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenildole. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Problemas comuns. (A) A secção rasa não fornecerá fatias luminais do intestino. (Esquerda) Um segmento intestinal que foi seccionado a uma profundidade que fornece uma visão do lúmen, bem como visões longitudinais do epitélio. (À direita) Um segmento intestinal que foi seccionado muito rasamente, revelando apenas seções transversais de criptas e nenhuma camada de muco constante ou bactérias. (B) A cobertura desigual de tecido/deslizamento de tampas pode resultar em tomografias de ladrilhos irregulares e irregularmente iluminadas. Uma tomografia foi montada com posições que estavam fora de foco (canto superior direito). (C) Exemplo de fundo normal (esquerda) e fundo alto (direita). Neste exemplo, para o sinal DAPI, note o sinal proveniente do epitélio, fora dos núcleos. Todas as barras de escala = 20 μm. Abreviação: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilôle. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
O protocolo descrito acima fornece um método reprodutível para visualizar a interface host-microbiota. Esses ensaios beneficiaram consideravelmente do desenvolvimento do protocolo, desde a otimização da rotulagem fish18 até a preservação do muco e imagens9. A fixação e a incorporação também fornecem armazenamento útil de amostras; além disso, as fitas infiltradas por parafina podem ser enviadas sem restrições, pois as amostras são completamente fixas e inertes.
Significado e métodos alternativos
A combinação de manchas de PEIXE e muco permite a análise da composição da microbiota em locais específicos do tecido e a interação entre bactérias individuais e o hospedeiro. Técnicas alternativas que envolvem a análise de locais específicos dentro da microbiota geralmente são incapazes de explorar a natureza unicelular dessas interações, como no caso da microdisseção de captura a laser aliada ao sequenciamento19. No entanto, técnicas baseadas em sequenciamento têm a vantagem de serem capazes de capturar a composição genética da microbiota a um nível mais fino e mais amplamente do que as sondas de rRNA 16S.
Uma armadilha do protocolo apresentado é que ele fornece um instantâneo único da microbiota em relação ao hospedeiro. Para imagens em tempo real em animais vivos, técnicas especiais de imagem são necessárias para facilitar a aquisição de um sinal de fluorescência em tecido profundo (por exemplo, microscopia intravital de dois fótons e microscopia de fluorescência de folhas leves20,21). Nesses métodos, o organismo modelo é colonizado com bactérias que são manchadas com moléculas que se ligam ao seu envelope20 ou bactérias geneticamente modificadas que abrigam proteínas fluorescentes21. Neste último caso, o amadurecimento das proteínas de fluorescência é uma questão fundamental, pois a maioria das proteínas fluorescentes padrão requerem oxigênio para emitir luz. Portanto, organismos modelo que tenham pelo menos ambientes nanaeróbicos (concentração nanomolar de oxigênio) são necessários, como o intestino de zebrafish aeróbico21.
Neste protocolo, o metanol-carnoy é usado como fixação em vez de paraformaldeído ou formalina porque não contém água. Isso evita a hidratação, desidratação e colapso da camada de muco durante o processamento e facilita medições precisas da espessura do muco. Embora a fixação de methacarn e a incorporação de parafina tenham se tornado um padrão no campo, diferentes fixações e técnicas de incorporação têm sido investigadas para otimizar a preservação do muco9,22, com alguns estudos indicando que as resinas podem ser superiores à incorporação de parafina22. Outra limitação importante para a incorporação de parafinas e fixação de methacarn é a perda de fluorescência de proteínas fluorescentes, que podem ser evitadas usando fixativos alternativos (por exemplo, formalina ou paraformaldeído (PFA)) ou técnicas modificadas de incorporação23. Cada fixação tem benefícios e desvantagens, e a escolha do fixador depende das prioridades de imagem. As modalidades de imagem podem ser combinadas se as réplicas biológicas forem fixadas em PFA e methacarn e as imagens forem obtidas de ambas as amostras.
Os peixes foram combinados com imunofluorescência em casos isolados com anticorpos policlonais de coelho anti-Muc2C3 específicos9,24. Esses resultados não foram amplamente reproduzidos com outros anticorpos Muc2, indicando que a escolha de anticorpos pode ser fundamental no sucesso da combinação FISH-imunofluorescence. As condições para a coloração bem sucedida de anticorpos para um determinado anticorpo não podem permitir a retenção de manchas de PEIXE.
Solucionando problemas
Neste protocolo, a coleta, a secção e a coloração representam passos críticos para evitar a criação de artefatos de imagem. Por exemplo, pressionar o tecido após a coleta e antes de incorporar pode levar à deslocalização da microbiota e afetar a qualidade do muco. Outra consideração importante é evitar a combinação de segmentos de espessuras muito diferentes em um único, como um pedaço relativamente vazio do intestino delgado e uma pelota dentro do cólon distal. As diferentes espessuras levam a dificuldades na imagem: após a incorporação, a seção transversa em uma profundidade específica para um segmento pode estar na profundidade errada para a imagem para o outro (por exemplo, o lúmen estará em profundidades diferentes para cada tecido) (Figura 1B,C e Figura 3A). Além disso, para a imagem de pelotas de fezes modelo animal, elas podem ser embrulhadas em membrana peritoneal24. Nesta técnica, uma pequena seção de peritônio recém-isolado é gentilmente dobrada ao redor do banco e preserva a estrutura da pelota durante as etapas de lavagem descritas no protocolo.
Ao contrário do processamento do tecido animal com conteúdo, a imagem de amostras intestinais humanas apresenta alguns desafios. Especificamente, o conteúdo luminal e o revestimento mucosal provavelmente serão interrompidos pela preparação intestinal de colonoscopia geralmente realizada antes de biópsias intestinais ou procedimentos de ressecção. Além disso, quando as biópsias são coletadas, é útil observar a orientação tecidual para auxiliar na identificação de características específicas (por exemplo, lúmen vs. submucosa) na ausência de conteúdo intestinal. Pré-incorporação com 3% de ágar e/ou ágar:misturas de gelatina podem ser úteis na manutenção da polaridade tecidual25; no entanto, há problemas com a desidratação e secção do ágar, conforme relatado na literatura, e os tempos de processamento podem precisar ser alterados.
Um aspecto fundamental para alcançar uma boa coloração de PEIXEs vem do ajuste da concentração de formamida para sondas FISH específicas. Formamide controlará a stringency de hibridização das sondas FISH para seus alvos. É importante garantir que a) a concentração de formamide adequada seja escolhida para colorir uma determinada comunidade, e b) que uma concentração de formamida adequada seja possível até mesmo para a combinação da sonda que está sendo utilizada - isso pode afetar a escolha ideal da sonda ao utilizar vários testes. Sites como mathFISH (http://mathfish.cee.wisc.edu/) podem ajudar no cálculo das concentrações de formamida adequadas para uma determinada sonda. Na ausência de informações sobre concentrações de formamide adequadas, este protocolo pode ser testado com 0% e 10% de formamide.
A seção das amostras incorporadas requer cortar o bloco a uma profundidade suficiente para obter fatias luminais, pois a seção muito rasa em um bloco resultará em uma visão transversal das villi/criptas sem conteúdo luminal (Figura 3A). Colora as amostras logo após a seção para obter o sinal de peixe ideal e use DAPI fresco (ou DAPI armazenado a -20 °C) para resolver problemas de fundo (Figura 3C). A coloração de peixes de seções com mais de um mês de idade pode resultar em manchas mais fracas/inconsistentes.
Se o tecido ou deslizamento de tampa não for perfeitamente plano em relação ao slide, a amostra pode não estar em foco em cada posição dentro de uma varredura de ladrilhos (Figura 3B), levando a esforço desperdiçado e fotobleaching potencial. Isso pode ser resolvido fazendo pequenas varreduras de ladrilhos nas quais todas as posições foram verificadas como em foco. A seção com lâminas maçante também pode levar ao desprendimento do muco e do conteúdo luminal, que aparecem como grandes áreas escuras durante a imagem. Finalmente, a evaporação da solução ou bolhas durante a etapa de hibridização pode levar à coloração desigual das sondas FISH no tecido.
Outro parâmetro crítico que afeta a eficiência da ligação da sonda FISH é a competição entre diferentes sondas. Uma verificação útil para verificar se a sonda FISH está rotulando bactérias é examinar a colocalização do sinal da sonda FISH com DAPI (Figura 2C,D). Em amostras que requerem o uso de múltiplos testes de rRNA, ajustar parâmetros como temperatura de hibridização, concentração de sonda e formamida torna-se crítico para garantir que as sondas estejam se ligando às espécies corretas de forma eficiente18.
Notas sobre imagem
As bactérias manchadas de peixe são melhor visualizadas usando um microscópio confocal e um objetivo de pelo menos 40x de ampliação. Embora a ampliação de 63x seja preferida para a imagem de bactérias no nível de célula única, a ampliação de 40x também pode ser usada maximizando o zoom digital ou empregando um sistema de super-resolução. Sistemas equipados com recursos de super-resolução também podem fornecer resolução subcelular de células bacterianas individuais. Objetivos de ampliação mais baixas podem ser utilizados para obter uma noção geral de localização bacteriana e espessura do muco.
A aquisição de imagens de 16 bits em vez de imagens de 8 bits também é altamente recomendada, pois o alcance dinâmico mais alto ajudará a capturar a ampla gama do sinal DAPI a partir dos núcleos extremamente brilhantes do epitélio e do sinal relativamente fraco de bactérias luminais. Além de usar a configuração de imagem descrita acima, uma importante consideração por imagem é a escolha dos fluoroforos. Para uma melhor separação entre os tipos bacterianos, certifique-se de que os fluoroforos utilizados não se sobreponham em excitação e espectros de emissões (a menos que a imagem em um sistema com a capacidade de realizar descompração linear). Além disso, os testes podem ser usados em combinação (por exemplo, a combinação de uma sonda específica da família e uma sonda específica de gênero) para identificar membros adicionais da comunidade. Se usar sondas lineares não misturadas ou não validadas, é essencial testar a precisão e o nível de coloração de PEIXEs em culturas puras8,14.
Uma vez coletadas as imagens, várias ferramentas estão disponíveis para a análise quantitativa da interface host-microbiota, como BacSpace26, HiPR-FISH8 e outras ferramentas de segmentação27. BacSpace é um software MATLAB que permite a segmentação dos componentes teciduais e luminosos e a remoção de material vegetal de imagens26. O programa também fornece análise da espessura do muco em 2D e quantificação da distribuição espacial com base em distâncias de pixels em diferentes canais26. Por outro lado, o software hiPR-FISH Image Analysis permite a segmentação de células manchadas de PEIXE8. Finalmente, outras ferramentas de segmentação bacteriana que foram otimizadas para experimentos in vitro27 também poderiam ser adaptadas a esta aplicação.
Conclusão
A imagem in situ permite a análise quantitativa da taxa microbiana individual no contexto de outros membros da comunidade e dos diversos microambientes criados por dieta, muco e criptas epiteliais hospedeiras. A interação entre organismos dita a biologia dos sistemas microbianos associados ao hospedeiro e fornece uma análise essencial da mudança nessas estruturas durante a perturbação que tem implicações para a saúde. Notavelmente, a capacidade de imagem da microbiota in situ através do protocolo descrito acima fornece uma incrível janela para a biogeografia da microbiota em relação ao hospedeiro animal.
Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Kristen Earle pelo desenvolvimento de técnicas inestimáveis, Amber Hann por ajudar a solução de problemas, a Dra. Os autores reconhecem o apoio da CIHR Team Grant: Canadian Microbiome Initiative 2 (C.T.), Crohn's e Colitis Canada (para C.T. e K.M.N.), CIFAR (para C.T. e K.M.N.), Michael Smith Foundation for Health Research Scholar Award (para C.T.), Weston Foundation: Weston Family Microbiome Initiative (to C.T.), Paul Allen Distinguished Investigator Award (para C.T.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum foil | |||
| Chloroform | Fisher | C298-500 | Toxic |
| Coplin jar | Fisher | 08-813E | |
| Cover glass, 22 × 22 mm, no #1 | VWR | CA48366-227-1 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Resuspended to 5 mg/mL |
| Empty pipette tip box(es) | To melt paraffin | ||
| Ethanol, anhydrous, molecular grade | -- | -- | |
| FISH probes | |||
| FISH hybridization solution | -- | -- | 20 mM Tris–HCl pH 7.4, 0.9 M NaCl, 0.01% (w/v) SDS in nuclease-free water. Optional addition of 5–50% (v/v) formamide |
| FISH washing buffer | -- | -- | 20 mM Tris–HCl pH 7.4, 0.9 M NaCl |
| Fluorescently-labeled Ulex Europaeus Agglutinin (UEA-1) lectin | Vector Laboratories | FL-1061 (Fluorescein-labeled) or RL-1062-2 (Rhodamine-labeled) | UEA-1 labels fucosylated glycans, so it is not appropriate for germ-free mice or for samples from fucosyltransferase 2 (FUT2)-deficient hosts. |
| Forceps | |||
| Formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | |
| Fumehood | |||
| Glacial Acetic Acid | Fisher | A38-212 | Corrosive and flammable |
| HybriSlip flexible plastic cover slips, 22 x 22 mm × 0.25 mm | Sigma Aldrich | GBL722222 | for FISH hybridization steps, can substitute glass coverslips |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Kimwipes | |||
| Methanol | Fisher | A412 | Toxic and flammable |
| Microtome | for sectioning | ||
| Multipurpose Specimen Storage Containers, 473 mL | Fisher | 14-955-117A | Can substitute with a glass or polyethylene container of your choice. Methacarn is not compatible with polystyrene or metal. |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | Any nail polish should work |
| Oven | Necessary range: 45-60 °C | ||
| Paraffin: Leica Paraplast | Leica | 39601006 | |
| PBS, Phosphate-buffered Saline (10x solution) | Fisher | BP3991 | Dilute to 1x for protocol |
| Sodium chloride | Fisher | S271 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), 20% Solution, RNase-free | Invitrogen | AM9820 | |
| Tissue-Loc HistoScreen Cassettes | Thermo Scientific | CA83009-999 | |
| Trizma hydrochloride solution, 1M Tris-HCl, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2663-1L | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Water, nuclease-free | Fisher | BP2484100 | |
| Xylenes | Fisher | X3P-1GAL | Toxic and flammable |
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