Summary
وسمح إعداد عينات غنية بالميتوكوندريا من الأنسجة الصلبة المحفوظة المجمدة سابقا للمحققين بإجراء تقييمات وظيفية وتحليلية على حد سواء للميتوكوندريا في مختلف الطرائق التجريبية. توضح هذه الدراسة كيفية إعداد الاستعدادات المخصبة بالميتوكوندريا من أنسجة القلب المجمدة وإجراء تقييمات تحليلية للميتوكوندريا.
Abstract
يتم تعديل ملف تعريف مجمع نقل الإلكترونات الميتوكوندريا (ETC) في أنسجة القلب للنسل المولود لبذر ممارس. كانت الفرضية المقترحة والمختبرة هي أن ممارسة الأمومة المنتظمة للبذر أثناء الحمل من شأنها أن تزيد من كفاءة الميتوكوندريا للذرية الحيوية للقلب. تم اختبار هذه الفرضية عن طريق عزل الميتوكوندريا باستخدام إجراء عزل خفيف لتقييم الميتوكوندريا ETC وملامح supercomplex. سمح الإجراء الموصوف هنا بمعالجة أنسجة القلب المحفوظة المجمدة سابقا وقضى على ضرورة إعداد الميتوكوندريا الطازج لتقييم مجمعات الميتوكوندريا ETC ، والتكتل الفائق ، وملامح النشاط المعقدة ETC. يصف هذا البروتوكول القياس الأمثل لمجمع بروتين ETC في الانتفاخ المناعي متعدد الأجسام المضادة والتقييم المعقد للغاية باستخدام الكهربائي الهلامي الأزرق الأصلي.
Introduction
كان الهدف من هذا البروتوكول هو توفير خطوات مفصلة للحصول على إعداد غني بالميتوكوندريا من أنسجة القلب المجمدة سابقا مع تقنية جديدة من الاضطراب الميكانيكي منخفض الطاقة للأنسجة التي تحسن تحلل الأنسجة واستخراج الميتوكوندريا. مع هذه الطريقة، وتحسين كفاءة استخراج دون توليد إجهاد القص عالية أو ارتفاع درجة الحرارة ووقت التجانس قصيرة (10-12 ق) تصبح قابلة للتحقيق1.
للحصول على الميتوكوندريا من الأنسجة المجمدة المؤرشفة هو رصيدا قيما لإجراء كل من functional2 والدراسات الكيميائية الحيوية3 خلاف ذلك لا يمكن تكرارها بسهولة في ظل الظروف التجريبية الدقيقة. وقد استخدمت الكلاسيكية بوتر-Elvehjem تفلون حشرات الزجاج المتجانس أو Dounce المتجانس ولا يزال يستخدم في مختبرات البحوث لتجانس الأنسجة الرخوة مثل الكبد والكلى والدماغ. ومع ذلك، يتطلب تجانس الأنسجة الصلبة مثل العضلات والقلب المزيد من الوقت للتجانس، وعلاج الإنزيم، والتجانس عالي السرعة، وخبرة واسعة للمستخدم. هذا غير مؤات لاستخراج العضيات سليمة مثل الميتوكوندريا من الأنسجة الصلبة مثل العضلات والقلب. تستخدم الطريقة الموصوفة في هذا البروتوكول للحصول على إعداد عالي الغلة غني بالميتوكوندريا لتحليل مجمعات البروتين في سلسلة نقل الإلكترونات الميتوكوندريا (ETC) وتكوينها الفائق في أنسجة القلب التي يتم حصادها من النسل المولود لزرع التمارين الرياضية والمستقرة ، والمجمدة فلاش في النيتروجين السائل ، وتخزينها عند -80 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل. تسمح هذه الطريقة للمستخدم بعزل إعداد الميتوكوندريا المخصب عن الأنسجة المؤرشفة المجمدة سابقا.
يمكن أن يؤثر التعرض الخارجي للمواد النانوية للقوارض الحامل سلبا على وظيفة القلب والتنفس الميتوكوندريا والجيوجيات الحيوية على السلف أثناء الحمل4. ومع ذلك، لم يتم بعد توثيق التغيرات الإيجابية الناجمة عن التمارين الهوائية في الجيوجيات الحيوية للخلايا العضلية الجنينية أثناء الحمل. ومع ذلك، تقدم الدراسات الناشئة أدلة على أن التمارين الهوائية الأمومية أثناء الحمل لها تأثير إيجابي على وظيفة قلب الجنين5. ومن أجل تقديم المزيد من الأدلة، تم إجراء تحليل للآثار الطولية لممارسة الأمهات على مجمعات سلسلة الميتوكوندريا القلبية للنسل (أي المجمع 1 من خلال المجمع الخامس) أثناء الحمل.
هذه الدراسة لها أهمية صحية كبيرة لأن النتائج قد تشير إلى أن ممارسة الأم يحسن كفاءة إنتاج الطاقة في الميتوكوندريا القلبية للذرية. في هذه الدراسة، تم استخدام البذرات (أنثى الخنزير) كنموذج حيواني لسببين: (1) فسيولوجيا القلب مشابهة ل human6، و (2) حصاد أنسجة القلب من النسل من نقاط زمنية مختلفة ممكن بموجب موافقة IACUC المؤسسية. تهدف الدراسة المقترحة إلى الإجابة على العديد من الأسئلة الأساسية التي تربط بين ممارسة الأم وآثارها الإيجابية المحتملة على التركيب الخلوي والكيميائي الحيوي لأنسجة قلب النسل. يتطلب هذا النهج تقنيات عزل الميتوكوندريا اللطيفة والفعالة من أنسجة القلب المجمدة سابقا التي تم الحصول عليها من الدراسات الطولية الطويلة والمكلفة التي تناولت قضايا التغيرات الحيوية داخل خلايا قلب الجنين أثناء الحمل. تسمح الطريقة الموصوفة في هذه الدراسة باستخدام مبالغ كبيرة من الأنسجة المؤرشفة المجمدة سابقا لإعداد الميتوكوندريا المخصب لكل من الدراسات التحليلية والوظيفية. وستساعد الدراسة أيضا على سد الفجوة المعرفية في هذا المجال من خلال توفير بيانات أولية، مما قد يؤدي إلى دراسات مستقبلية تحدد آثار ممارسة الأمهات على صحة القلب في الرحم وخارجه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم تلقي أنسجة القلب الذرية المجمدة من الدكتور شون الوافد الجديد جنبا إلى جنب مع رسالة موافقة IACUC المؤسسية. تم الحصول على أنسجة القلب من دراسة طولية طويلة الأجل، مجمدة فلاش في النيتروجين السائل، وتخزينها في -80 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل. اتبعت جميع البروتوكولات المتعلقة بمعالجة أنسجة قلب النسل المبادئ التوجيهية للجان جامعة كانساس سيتي IBC و IACUC.
1. إعداد المخازن المؤقتة والكواشف
ملاحظة: تحضير كافة العينات وفقا إرشادات الشركة المصنعة. استخدم المياه فائقة النقاء أو ما يعادلها في جميع الوصفات وخطوات البروتوكول. ارتداء معدات الحماية الشخصية (الشماتة المختبر، قناع الوجه، قفازات، ونظارات واقية / درع الوجه) خلال هذا الإجراء. أحجام المخزن المؤقت مناسبة لمعالجة ست عينات من الأنسجة.
- إعداد 1.5 L الأنسجة العازلة الغسيل عن طريق الجمع بين 154.035 غرام من السكروز (0.3 M النهائي), 3.904 غرام من HEPES (10 MM النهائي), 0.111 غرام من EDTA (0.2 mM النهائي). إضافة المكونات إلى 1.0 لتر من الماء بينما على لوحة اثارة، وضبط درجة الحموضة إلى 7.2 مع HCl المخفف، والماكياج إلى الحجم النهائي إلى 1.5 لتر.
ملاحظة: هناك حاجة إلى ما يقرب من 200 مل من المخزن المؤقت للغسيل لكل عينة (50-300 ملغ). يمكن معالجة ست عينات من الأنسجة في يوم واحد. استخدم المخزن المؤقت المتبقي للغسيل لإنشاء مخزن مؤقت للعزل. - قم بإعداد العازل العزل من المخزن المؤقت للغسيل الموصوف سابقا في الخطوة 1.1 بإضافة 210 ملغ من BSA في 210 مل من مخزن الغسيل المؤقت. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 مع محلول NaOH المخفف.
ملاحظة: هناك حاجة إلى ما يقرب من 35 مل من العازلة العزل لكل عينة من الأنسجة; لذلك، مطلوب 210 مل من العزل المؤقت لست عينات. إعداد هذا المخزن المؤقت بإضافة حل BSA جديدة (1mg/mL النهائي) في يوم التحضير. يستخدم BSA لعزل الميتوكوندريا لأنه يحسن خصائص الميتوكوندريا عن طريق إزالة uncouplers الطبيعية مثل الأحماض الدهنية الحرة. وقد وجد أن BSA نشاط مضاد للأكسدة عن طريق زيادة معدل الأكسدة من الركائز، وخاصة succinate، في الدماغ Mitochondria7. بدلا من ذلك، يمكن استبدال الألبومين مصل البقري من قبل أقل تكلفة التناظرية خالية من الحمض مثل ovalbumin. - إعداد 150 مل من العازلة إعادة الإنفاق عن طريق الجمع بين 0.011 غرام من EDTA (التركيز النهائي من EDTA 0.2 m M أو استخدام 150 ميكرولتر من 200 MM الأسهم EDTA حل ل 200 150 مل من احتياطي إعادة الإنفاق)، 12.836 غرام من السكروز (0.25 M تركيز السكروز النهائي)، و 0.236 غرام من تريس (10 mM تريس-HCl النهائي). ضبط درجة الحموضة إلى 7.8 مع 0.1 N NaOH. أضف 60 ميكرولتر من كوكتيل مثبطات البروتيز قبل الاستخدام مباشرة.
- إعداد الحل تريبسين عن طريق حل 7.5 ملغ من تريبسين في 3.0 مل من 1 مل HCl (2.5 ملغ من تريبسين / مل النهائي). هذا المبلغ يكفي لعينة واحدة.
ملاحظة: إعداد الحل تريبسين استنادا إلى عدد عينات الأنسجة المخطط معالجتها. - إعداد حل مثبط تريبسين من فول الصويا عن طريق الجمع بين 13.0 ملغ من مثبط تريبسين في 20 مل من العازلة العزلة التي تحتوي على BSA (0.65 ملغ / مل من التربسين مثبطات النهائي).
ملاحظة: إعداد محلول مثبط التربسين الطازجة. - إعداد كاشف كبريتات الأمونيوم بإضافة 0.1 غرام من كبريتات الأمونيوم في 1 مل من الماء (10٪ نهائي كبريتات الأمونيوم).
ملاحظة: يجب أن يكون كاشف كبريتات الأمونيوم إما معد طازجا أو يمكن أن يتم اقتباس حجم كبير والاحتفاظ به في ثلاجة -20 درجة مئوية. - إعداد محلول حمض أمينوكابرويك (ACA) عن طريق الجمع بين 0.131 غرام من حمض الكابرويك الأميني 6 في 1.0 مل من المياه فائقة النقاء وتخزينها في 4 درجة مئوية (1 M 6-aminocaproic حمض النهائي).
- إعداد محلول الصبغة الزرقاء الرائعة Coomassie عن طريق حل 1 غرام من كوماسي G-250 في 0.5 مل من الماء، و 0.5 مل من 1 M حمض أمينوكابرويك (10٪ صبغ حل التركيز النهائي).
- إعداد 5٪ Digitonin ل الأزرق الأصلي الصفحة (BN-PAGE). حساب تقريبا كم هو مطلوب digitonin في إعداد العينة بالإضافة إلى بعض حجم إضافي لتعويض أخطاء ماصة (المبالغة من قبل 10 ملغ). ل 15 ملغ: أولا, تمييع 15 ملغ من digitonin في 30 ميكرولتر من 100٪ DMSO. دوامة لمساعدة digitonin للوصول الى الحل. بعد ذلك، أضف المتبقية 90٪ ddH2O (270 ميكرولتر). سخني بلطف لخلط المحلول (الدوامة)، ثم قم بتبريده على الجليد.
- تحضير المخزن المؤقت الأصلي PAGE anode. إضافة 50 مل من 20x الصفحة الأصلية تشغيل المخزن المؤقت إلى 950 مل المياه لجعل حجم النهائي من 1 L. إعداد العازلة أنود الطازجة للاستخدام الفوري. استخدم هذا كحاجز تشغيل 1x.
- قم بإعداد المخزن المؤقت للكاثود الأزرق الداكن. حل 0.0160 غرام من Coomassie الأزرق الرائع G-250 في 80 مل من العازلة أنود PAGE الأصلية; مزيج جيدا.
ملاحظة: تحضير المخزن المؤقت الكاثود الطازج للاستخدام الفوري. قد تكون هناك حاجة فقط 60 مل ولكن جعل 20 مل إضافية في حالة حدوث أي تسرب. - قم بإعداد المخزن المؤقت للكاثود الأزرق الفاتح. إضافة 20 مل من العازلة الكاثود الأزرق الداكن في 180 مل من العازلة أنود PAGE الأصلية وتخلط جيدا.
ملاحظة: يمكن استخدام هذا المخزن المؤقت مرة واحدة فقط. - إعداد 5٪ كوماسي G-250 كمادة مضافة عينة. تمييع 200 ميكرولتر من 10٪ أسهم Coomassie بالفعل (الخطوة 1.8) مع 200 ميكرولتر من 1 M ACA وتخزينها في 4 درجة مئوية.
- إعداد 4x الأصلي PAGE عينة المخزن المؤقت عن طريق الجمع بين 40٪ الجلسرين، 0.04٪ بونسو S، 25 mM تريس-HCl (pH 6.8)، 192 mM الجليسين في 10 مل من الحجم النهائي. Aliquot لهم وتخزينها في -20 درجة مئوية في الثلاجة.
2. عزل الميتوكوندريا من أنسجة القلب المجمدة
ملاحظة: إجراء عملية عزل الميتوكوندريا في غرفة باردة 4 درجة مئوية. ومع ذلك، في حالة عدم توفر الغرفة الباردة، استخدم حمام جليدي كبير الحجم لإجراء العملية.
- أخرج عينات أنسجة القلب المجمدة سابقا من الفريزر -80 درجة مئوية.
ملاحظة: قد تتم معالجة أربع عينات من الأنسجة كحد أقصى بشكل مريح لعزل الميتوكوندريا في يوم معين. - وزن الأنبوب الذي يحتوي على عينة أنسجة القلب وتسجيل الوزن. إعداد ثلاثة أكواب (كل 50 مل) تحتوي على 40 مل من العازلة الغسيل. يبرد كل كوب في حمام الملح الجليدي بكميات متساوية من الثلج والملح الممزوج لمدة 3-5 دقائق قبل الانتقال إلى الخطوة التالية. وضع أشرطة التحريك المغناطيسي في كل كوب وتعيين stirrer لسرعة متوسطة.
ملاحظة: لا تفرط في تجميد الأكواب واستخدامها مباشرة بعد أن تبدأ سحب بلورات الثلج في الظهور. - ضع أنسجة القلب المجمدة مباشرة في محلول البرد الجليدي في الكأس الأول. انتظر حوالي 5 دقائق أثناء تحريك وتطبيق ضغط طفيف على الأنسجة باستخدام ملاقط للخروج من الدم قدر الإمكان.
- وزن أنبوب فارغ وطرح من الوزن الأصلي (الخطوة 2.2) للحصول على وزن صافي من أنسجة القلب.
- أخرج الأنسجة باستخدام ملقط واعصر القلب بمنشفة ورقية نظيفة من ورق التصفية لإزالة الدم. ثم ضع الأنسجة في الكأس الثاني. انتظر حوالي 5 دقائق أثناء التحريك لإزالة الدم الزائد.
- جفف الأنسجة برفق على منشفة ورقية. إزالة جميع الدهون والدم المتخثر والأوريسيل واللفافة (الأنسجة البيضاء). ثم، تجمع الأنسجة البطينية.
- أجاد عينات الأنسجة باستخدام التقطيع باتباع الخطوات 2.7.1-2.7.9.
- ضع أنسجة القلب (~ 50-300 ملغ) في غرفة تقطيع الأنسجة من جانب الكبش.
الشكل 1: غرفة تقطيع الأنسجة (أنبوب) للاستخدام مع التقطيع. يتطلب تجانس الأنسجة في أنبوب التقطيع حوالي 10-12 ق لكل عينة من الأنسجة. يتم الانتهاء من تجانس الأنسجة بمجرد مرور الأنسجة المتجانسة عبر القرص المثقب إلى الغرفة العليا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- إضافة ~ 0.2-0.8 مل من العازلة الغسيل إلى جانب الغطاء من الأنبوب.
ملاحظة: تأكد من أن الحجم الإجمالي للعينة وحاجز الغسيل المدمج أثناء التقطيع لا يتجاوز 0.7-0.8 مل. - استخدام أداة أنبوب لسقف غرفة التقطيع مع غطاء التقطيع بشكل مريح.
ملاحظة: لا تزيد من تشديد غطاء التقطيع. - ضع غرفة التقطيع في وحدة حامل التقطيع مع جانب الكبش لأسفل. سوف الكبش إشراك المناسب في حامل التقطيع.
- إدراج بت من برنامج تشغيل التقطيع؛ دع البتة تتعامل مع غطاء التقطيع. تأكد من أن يتم تأمين بت بشكل مريح في مكانها.
ملاحظة: استخدم دائما برنامج تشغيل التقطيع المشحون بالكامل. - تطبيق الضغط يدويا إلى أسفل إلى التقطيع سائق وغرفة التقطيع حتى مؤشر الضغط على حامل التقطيع تصل إلى إعداد ما يقرب من 2 على حامل التقطيع.
ملاحظة: يمكن أن يكون الإعداد على مستوى أعلى إذا كان تمزيق الأنسجة أكثر ليفية. - تشغيل برنامج تشغيل التقطيع لحوالي 10-12 ق عن طريق الضغط على الزناد من سائق التقطيع، مع الحفاظ على الإعداد في 2.
- انظر إلى الأنبوب للتحقق مما إذا كان يتم تمزيق كل أو معظم الكتلة الصلبة للأنسجة من خلال قرص التحلل وتمريرها إلى الغرفة العليا من غرفة التقطيع من خلال النظر إلى الأنبوب.
ملاحظة: قد يكون من الضروري تمزيق عينة الأنسجة لفترة أطول. ببساطة العودة أنبوب إلى حامل التقطيع ومواصلة العملية. معظم أنواع عينات الأنسجة تتطلب فقط 10-12 ق من تمزيق. في حين أن جميع التقطيع سوف تنتج بعض الحرارة بسبب الاحتكاك، وهذا الوقت معالجة قصيرة لا تسخين العينة بشكل كبير. - بعد تمزيق العينة، ارفع غرفة التقطيع من وحدة الحامل. استخدم أداة الأنبوب لإزالة غطاء التقطيع ووضعه على سطح نظيف للاستخدام لاحقا.
ملاحظة: يجب اعتبار غطاء التقطيع ملوثا باستخراج العينة، وقد يكون ملوثا بمواد معدية اعتمادا على نوع العينة. لا تستخدم نفس غطاء التقطيع لأي عينات أخرى من الأنسجة لمنع التلوث المتبادل.
- نقل أنسجة القلب الممزقة إلى الكأس الثالث مع 40 مل من العازلة الغسيل ويحرك شريط ويحرك الأنسجة لمدة 5 دقائق بسرعة متوسطة بينما على لوحة اثارة.
- تصفية تعليق من خلال شبكة النايلون monofilament (74 ميكرومتر حجم المسام) وتجاهل filtrate. غسل الأنسجة الممزقة على مرشح 3x مع 10 مل من العازلة الغسيل.
ملاحظة: تأكد من أن شبكة النايلون monofilament هو قبل الرطب بالماء. - نقل الأنسجة المغسولة والممزقة إلى كوب 50 مل مع 20 مل من العازلة الغسيل ووضع الكأس في حمام الجليد على stirrer المغناطيسي. إضافة 0.5 مل من محلول تريبسين في حين اثارة باستمرار لمدة 15 دقيقة. في منتصف الطريق تقريبا من خلال الحضانة (في حوالي 7.5 دقيقة)، نقل تعليق الأنسجة إلى متجانس الزجاج على الزجاج المحمولة فضفاضة التي سوف تعقد 0-15 مل من حجم.
الشكل 1: غرفة تقطيع الأنسجة (أنبوب) للاستخدام مع التقطيع. يتطلب تجانس الأنسجة في أنبوب التقطيع حوالي 10-12 ق لكل عينة من الأنسجة. يتم الانتهاء من تجانس الأنسجة بمجرد مرور الأنسجة المتجانسة عبر القرص المثقب إلى الغرفة العليا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- تجانس بلطف مع 4-5 السكتات الدماغية لتفريق التعليق دون إنتاج زبد. ضعي المتجانس في كوب سعة 50 مل واخلطيه برفق على طبق تحريك لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
- بعد 15 دقيقة من الحضانة، أضف 10 مل من حاجز العزل الذي يحتوي على مثبط التريبسين في الكأس الذي يحتوي على المتجانسة واحتضان لمدة دقيقة واحدة عند 4 درجة مئوية أثناء التحريك بلطف.
- تصفية تعليق مرة أخرى من خلال مرشح النايلون وحفظ filtrate في أنبوب مخروطي 50 مل.
- جمع جزء الجسيمات اليسار على مرشح النايلون ووضعه في التجانس الزجاج على الزجاج. إضافة 15-20 مل من العازلة الغسيل وتجانس بلطف باليد لمدة 25-30 ثانية.
ملاحظة: تدفقات الشعيرات ببطء شديد في هذه الخطوة. لزيادة تدفق الخيوط، ضع طرف القمع الذي يلمس داخل الأنبوب المخروطي. - الجمع بين المتجانسة مع filtrate، وتحقيق التوازن بين الأنابيب، والطرد المركزي في 600 × ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية.
- تصفية supernatant الناتجة في أنبوب مخروطي جديد باستخدام مرشح النايلون لتجنب التلوث من قبل بيليه. تشغيل الطرد المركزي مرة أخرى في 8500 × ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية.
ملاحظة: استخدام ماصة نقل البلاستيك لإزالة supernatant والتضحية 0.2 مل من supernatant من الجزء العلوي من بيليه رقيق. - تجاهل supernatant وشطف بيليه 2-3 مرات مع 1 مل من العازلة العزلة. تأكد من تجاهل طبقة الحافة الخارجية البيضاء المنفوشة في كل مرة.
ملاحظة: غسل بيليه بإضافة العازلة العزل باستخدام ماصة مع تلميح 1 مل، أو ماصة نقل جديدة. إضافة العازلة إلى جانب الأنبوب، وليس مباشرة على بيليه، لمنع كسر بيليه ومنع تلوث supernatant. بعد ذلك، يستنشق المخزن المؤقت مع ماصة نقل وتكرار العملية مرتين أكثر. - إضافة 5 مل من العازلة العزل إلى كل أنبوب وتفتيت بيليه باستخدام ماصة مع تلميح 1 مل، أو ماصة نقل جديدة.
- تمييع التعليق مع 20 مل من العازلة العزل إضافية وتشغيل الطرد المركزي مرة أخرى في 8500 × ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية.
- تجاهل supernatant وإعادة إنفاق بيليه في 5 مل من العازلة إعادة تعليق. ثم أضف 15 مل إضافية من العازلة لما مجموعه 20 مل، والطرد المركزي عند 8500 × غرام لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تجاهل الناتنات الفائق. بيليه البني الناتج يحتوي على الميتوكوندريا المغسولة سليمة.
- إعادة إنفاق بيليه الميتوكوندريا المخصب في 250 ميكرولتر من العازلة إعادة تعليق, بما في ذلك مثبطات البروتيز. Aliquot في 25 ميكرولتر، وتجميد سريع في النيتروجين السائل، وتخزينها في -80 درجة مئوية الفريزر العميق لعدة سنوات.
ملاحظة: الغيار 5 ميكرولتر من إعداد الميتوكوندريا المخصب لتحليل البروتين المقايسة. لدراسة BN-PAGE (الأزرق الأصلي الصفحة)، aliquot بيليه resuspended في 50 ميكروغرام من بروتين الميتوكوندريا لكل أنبوب. جهاز طرد مركزي عند 8500 × غرام لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. يستنشق بعناية supernatant وتخزين بيليه الميتوكوندريا (50 ميكروغرام البروتين / aliquot) في الفريزر العميق -80 درجة مئوية لعدة سنوات.
3. تقييم مجمع نقل الإلكترونات الميتوكوندريا (ETC)
ملاحظة: يمكن تقييم بروتينات الميتوكوندريا ETC الفردية (أي Complex-I و II و III و IV و V) عن طريق الفحص المناعي القياسي. نظرا لمجموعة متنوعة من العينات (أربع نقاط زمنية: 48 ساعة، 3 أشهر، 6 أشهر، 9 أشهر)، شرطين تجريبيين (تمارس والمستقرة)، وعدد من الأجسام المضادة المناعية (خمسة أجسام مضادة)، ويوصى ببلوتينج المناعي متعددة. إجراء متعددة المناعة الانتفاخ على النحو التالي.
- حل 50 ميكروغرام من الميتوكوندريا المخصب عينة البروتين / جيدا في 4٪ -20٪ التدرج البولي أكريلاميد هلام الكهربائي (100 V، 90 دقيقة).
- نقل البروتينات إلى غشاء PVDF (75 فولت؛ 60 دقيقة)
- كتلة الغشاء في حل عازلة حجب لمدة لا تقل عن 1 ساعة في 4 درجة مئوية.
ملاحظة: يمكن تمديد فترة الحظر حتى ليلة واحدة عند 4 درجات مئوية. يحتوي حاجز الحجب (جدول المواد) على مكونات غير ثديية (أي بروتينات الأسماك) التي يقل احتمال أن يكون لها تفاعلات ملزمة محددة مع الأجسام المضادة وكذلك بروتينات الثدييات الأخرى الموجودة بطرق نموذجية. - التحقيق في الغشاء مع كوكتيل الأجسام المضادة بما في ذلك المضادة للمجمع الأول والثاني والثالث والرابع والخامس والأجسام المضادة واحتضان بين عشية وضحاها على شاكر المدارية في 4 درجة مئوية.
- في اليوم التالي، اغسل الغشاء والتحقيق مع الأجسام المضادة الثانوية الموسومة بالأشعة تحت الحمراء لمدة 2 ساعة على شاكر مداري في RT (درجة حرارة الغرفة).
- اغسل خمس مرات باستخدام 1x TBS-T (TBS يحتوي على توين 20)، ومرة واحدة مع 1x TBS (Tris المخزنة بالمحلول الملحي).
ملاحظة: بالنسبة للغسيل الأخير، لا تقم بتضمين المنظفات في المخزن المؤقت TBS. - صورة لطخة في محلل الصور.
4. تقييم supercomplex الميتوكوندريا من قبل الأزرق الأصلي بولي أكريلاميد جل Electrophoresis (BN-PAGE)
ملاحظة: يمكن أيضا تقييم ملف تعريف supercomplex من ETC باستخدام تقنية BN-PAGE.
- إعداد كوكتيل العازلة عينة ل20 ميكرولتر لكل 50 ميكروغرام الميتوكوندريا المخصب بيليه البروتين (7 ميكرولتر من الماء + 5 ميكرولتر من 4x الأصلي البولي أكريلاميد هلام الكهربائي عينة تحميل العازلة + 8 ميكرولتر من 5٪ Digitonin + 2 ميكروغرام من Coomassie G-250).
ملاحظة: جعل كوكتيل المخزن المؤقت عينة المخزون اعتمادا على عدد العينات المتاحة (50 ميكروغرام البروتين / عينة). اختر كميات ال digitonin المناسبة استنادا إلى تركيز البروتين في بيليه الميتوكوندريا المخصب (الجدول 1)8. - سخني مرقة digitonin عند 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، واخلطيها، وتبرد على الجليد قبل صنع المزيج الرئيسي.
- أضف إضافة عينة Coomassie G-250 قبل تحميل العينات في الجل.
- إضافة 20 ميكرولتر من كوكتيل العازلة عينة في أنبوب يحتوي على 50 ميكروغرام من بيليه البروتين الميتوكوندريا. Solubilize / resuspend بيليه عن طريق خلط بلطف بيليه مع ماصة دون توليد زبد.
- احتضان الخليط على الجليد لمدة 20 دقيقة لتحقيق أقصى قدر من التشحيم من بيليه الميتوكوندريا المخصب. من وقت لآخر، نفض الغبار بلطف أنابيب لتعزيز solubilization.
- أثناء انتظار الحضانة، قم بإعداد المخزن المؤقت ل PAGE anode/1x الذي يعمل بالمخزن المؤقت وحاجز الكاثود الأزرق الداكن اللون.
- الطرد المركزي بيليه الميتوكوندريا المخصب solubilized في 20،000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية.
- بعد الطرد المركزي، جمع 15 ميكرولتر من supernatant في أنابيب جديدة وضعت على الجليد.
- إضافة المبلغ المناسب من 5٪ كوماسي G-250 كاشف إلى supernatant التي تم الحصول عليها في الخطوة 4.8 (راجع الجدول 1).
ملاحظة: يجب أن يكون حجم 5٪ Coomassie G-250 بحيث يكون التركيز النهائي للصبغة هو تركيز المنظفات. قم بتنفيذ هذه الخطوة قبل تحميل العينات في الجل.
| بروتين | ديجينتونين/بروتين | 4x عينة المخزن المؤقت | 5٪ ديجينتونين | الماء | المجلد النهائي | 5٪ كوماسي جي-250 |
| النسبة (g/g) | عينة المضافة | |||||
| 50 ميكروغرام | 8 | 5 | 8 | 7 | 20 | 2 |
| 50 ميكروغرام | 4 | 5 | 4 | 11 | 20 | 1 |
الجدول 1: إعداد كوكتيل مخزن العينة مع اثنين من المنظفات المختلفة / نسب البروتين. لتحقيق أقصى قدر من التشحيم من البروتينات الغشائية من تعليق الميتوكوندريا، يجب تعديل تركيز بروتين التعليق الرقمي / الميتوكوندريا إلى ما بين 4-8 غرام من ال digitonin / غرام من البروتين. في أنسجة القلب، تم استخدام 400 ميكروغرام من الديجنتونين مقابل 50 ميكروغرام من بروتينات تعليق الميتوكوندريا (أي 8 جرام من بروتين الميتوكوندريا) لتعظيم قابلية الذوبان للتكتل الفائق من تعليق الميتوكوندريا.
- صب هلام التدرج 3٪-8٪، وإزالة المشط، وغسل آبار هلام مع 1x تشغيل العازلة ثلاث مرات.
ملاحظة: هلام أفضل البوليمرات إذا سكب قبل يوم واحد. - إعداد نظام الكهربائي ووضع الجل في الجهاز.
- ملء الآبار عينة مع العازلة الكاثود الأزرق الداكن اللون.
- تحميل 10 ميكرولتر من معيار البروتين غير الملون كعلامة الوزن الجزيئي الأصلي على البئر الأول والأخير من الجل.
- تحميل كامل كمية من عينة supernatant + Coomassie عينة المضافة المعدة في الخطوة 4.9 أعلاه في الآبار باستخدام رأس مسطح هلام تحميل تلميح.
- ملء بعناية سد العازلة الخلية المصغرة مع ما يقرب من 60 مل من العازلة الكاثود الأزرق الداكن اللون دون إزعاج العينات في الآبار، ومن ثم ملء خزان العازلة مع الصفحة الأصلية 1x تشغيل العازلة.
- بدوره على امدادات الطاقة وكهروفوريز العينات في 150 V لمدة 30 دقيقة تقريبا.
- إزالة العازلة الكاثود اللون الأزرق الداكن من السد العازلة (الغرفة الداخلية) مع ماصة نقل أو يستنشق الآبار عينة. ملء الغرفة الداخلية مع 150-200 مل من العازلة الكاثود الأزرق الفاتح اللون وتشغيل الكهربائي في 250 V لمدة 60 دقيقة.
ملاحظة: يمكن تحديد وقت الكهرومورفوريس عن طريق التحقق من متى تهاجر جبهة الصبغة فقط 0.5 سم فوق الجزء السفلي من كاسيت الجل. - إزالة هلام من كاسيت ووضعه في وعاء من البلاستيك نظيفة. غسل هلام مع نوعية جيدة الماء المقطر لمدة 15 دقيقة على الروك / شاكر المدارية.
ملاحظة: لإزالة الجل المتدرجة من كاسيت، التعامل مع كاسيت من أسفل، وهو أقوى، لتقليل فرص الكسر. - صب قبالة الماء، وتزج هلام في كمية كافية من كوماسي GelCode الأزرق وصمة عار كاشف، واحتضان لمدة 1 ساعة على المداري / الروك في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: اخلط محلول كاشف البقع الأزرق (جدول المواد) قبل الاستخدام عن طريق تدوير الزجاجة برفق عدة مرات. - Decant حل صبغ، إضافة الماء المقطر، شطف عدة مرات بالماء، ومن ثم وضعت على المداري / الروك لإزالة النباتات.
ملاحظة: إدراج قطعة من الإسفنج (~ 3 سم × 0.5 سم) في حاوية هلام إزالة التانينج وترك هلام لإزالة التين بين عشية وضحاها. الإسفنج يدهس جزيئات الصبغة دون الحاجة إلى تغييرات المياه متعددة. - تحليل الجل في محلل الصور.
5. تقييم الميتوكوندريا supercomplex عن طريق تحليل لطخة المناعة
- تنفيذ مجموعة جديدة من BN-PAGE دون تلطيخ هلام في نهاية الكهربائي.
- اتبع نفس الإجراء كما هو الحال في القسم 3 (تقييم مجمع نقل الإلكترونات الميتوكوندريا (ETC) لإكمال الانتفاخ المناعي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بعد البروتوكول، تم إعداد غلة جيدة من خليط البروتين المخصب بالميتوكوندريا من أنسجة القلب. تم الحصول على ما يقرب من 15 ملغم / مل من خليط البروتين المخصب بالميتوكوندريا من متوسط 1.2 غرام من أنسجة القلب المجمدة التي تم حصادها من ذرية البذر. كانت كمية إعداد الميتوكوندريا كافية لإجراء (1) تحليل مناعة قياسي لتقييم مجمعات نقل الإلكترونات الفردية (ETC) (أي Complex-I و II و III و IV و Complex-V) ، (2) تقييم supercomplex الميتوكوندريا من قبل تحليل BN-PAGE و immunoblot ، و (3) المقايسات الأنزيمية المحدودة للمجمع المحدد. مزيج من الأجسام المضادة التي أثيرت ضد المجمعات البروتين ETC الفردية يوفر الجدوى التقنية أن كل جسم مضاد سوف تعترف البروتين المستهدفة الخاصة بها في واحد مناعة المقايسة.
تم إعداد البروتين المخصب بالميتوكوندريا من البطين الأيسر للقلب ، الذي تم الحصول عليه من ذرية البذر. تم حصاد أنسجة القلب لكلا المجموعتين في نقاط زمنية مختلفة بعد الولادة (48 ساعة و 3 أشهر و 6 أشهر و 9 أشهر). ما إذا كان لممارسة الأم تأثير إيجابي على الميتوكوندريا ETC من النسل أثناء الحمل كانت الفرضية التي تم اختبارها في هذه الدراسة. تمت معالجة أربعة أنسجة قلب بشكل مريح في أي يوم معين بسبب عملية العزل الطويلة المخصب بالميتوكوندريا.
الشكل 2: ملف المناعة من مجمعات ETC الميتوكوندريا من أنسجة قلب النسل. تم حل خليط البروتين المخصب بالميتوكوندريا في هلام متدرجة 4٪-20٪ في ظل ظروف الحد. تم إنتاج البروتينات مناعة من خلال كوكتيل الأجسام المضادة التجارية ، وتم استخدام الأجسام المضادة ل VDAC للتحكم في التحميل (نطاق اللون الأحمر). وقد أثيرت مزيج من الأجسام المضادة ضد مجمع القلب البقري-I (مستضد NDUFB8)، مجمع القلب البقري-الثاني (مستضد C-II30 (FeS)، مجمع القلب البقري الثاني، الثالث (مستضد C-III-Core 2)، المجمع البشري الرابع، الوحدة الفرعية الثانية (مستضد C-IV-II)، والقلب البقري Complex-V (مستضد C-V-α). تم تسمية الجسم المضاد الثانوي بعلامة الأشعة تحت الحمراء ، وتم تحليل الصورة باستخدام برنامج تحليل الصور. يتم توفير ملفات تعريف المجمع الفردية عبر الفئات العمرية في الشكل التكميلي 1 (A-E). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 يمثل نموذج بروتين ETC نموذجي. كوكتيلات الأجسام المضادة المسموح بها لتثبيط المناعة في شكل متعدد. واعترف كل الأجسام المضادة البروتين المستهدفة الخاصة بها، وتوفير حل مقبول. تم تحليل كثافة نطاق البروتين رقميا. الأنسجة التي تم الحصول عليها من ذرية زرع تمارس قدمت مستويات منخفضة نسبيا في بعض المجمعات ETC (الأرقام التكميلية 1A-E). يجب حل التحضير المخصب بالميتوكوندريا في هلام متدرجة (4٪-20٪) حيث تم إجراء الحماية المناعية في شكل متعدد. هذا النهج سوف يلغي ضرورة تشغيل عدة في المئة ثابتة من المواد الهلامية SDS / PAGE وتقلب التشغيل لتشغيل.
تم حل البروتينات الميتوكوندريا في 3٪ -8٪ تدرج BN-PAGE (الشكل 3A) والمناعة مع كوكتيلات الأجسام المضادة. وفي كل من المجموعات التي تمارس أو المستقرة، لوحظ تشكيل متعدد للضغينة الفائقة (الشكل 3B).
الشكل 3: ملف تعريف الميتوكوندريا فائقة الاتصال من قبل الأزرق الأصلي البولي أكريلاميد هلام electrophoresis (BN-PAGE). تم حل مخاليط البروتين المخصب بالميتوكوندريا في 3٪-8٪ BN-PAGE، وملطخة بكاشف أزرق كوماسي (قانون الجيل، كاشف البقع الزرقاء). (ب). تم حل مخاليط البروتين المخصب بالميتوكوندريا في 3٪ -8٪ BN-PAGE، ونقلها إلى غشاء PVDF، ومناعة مع كوكتيلات الأجسام المضادة لل supercomplexes. في كلا المقايسات، كان حمل البروتين 150 ميكروغرام/جيد. لم يتم تضمين نقطة جمع البيانات لمدة 6 أشهر بسبب عدم كفاية إنتاج البروتين أثناء التحضير. وكانت أبرز زيادة supercomplex لوحظ في 9 أشهر في المجموعة التي تمارس بالمقارنة مع المجموعة المستقرة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تم إعداد تنسيق هلام تدرج مختلف (3٪-8٪) بسبب الحجم الكبير للاكومبلس الفائقة التي يمكن حلها في BN-PAGE. تم استخدام التحضير المخصب بالميتوكوندريا الموصوف في هذا البروتوكول لقياس الأنشطة المعقدة للميتوكوندريا ETC. ويمثل الشكل 4 البيانات المسجلة لتقييم الأنشطة المعقدة من النوع الأول إلى الثاني. وقد أجريت هذه المقايسة وفقا للبروتوكول المنشأ3.
الشكل 4: قياسات النشاط المعقدة من النوع الأول إلى الثاني. تم تحليل مخاليط البروتين المخصب بالميتوكوندريا التي تم الحصول عليها من مختلف الفئات العمرية (48 ساعة و3 أشهر و6 أشهر و9 أشهر) لنشاط I-II المعقد باستخدام المقايسة الحركية. وأظهرت المجموعة التي تمارس زيادة في نشاط المرحلة الأولى والثانية المعقدة بالمقارنة مع نشاط المجموعة المستقرة. ولم يكن الفرق بين المجموعتين ذا دلالة إحصائية وفقا لاختبار t المقترن (P > 0.05). تمثل أشرطة الخطأ الموضحة في الشكل الخطأ القياسي للوضيع (SEM) ل n = 4. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 1: (أ) ملف تعريف معقد-I عبر الفئات العمرية. بشكل عام ، قدم النسل المولود للبذر المجرى بمستويات أقل من Complex-I مقارنة بالمجموعة المستقرة (n = 4). وكان هذا أكثر وضوحا في مجموعة ال 9 أشهر. (ب) ملف تعريفي معقد - الثاني عبر الفئات العمرية. وأظهرت جميع الفئات العمرية مستويات منخفضة من المركبة الثانية في المجموعة التي تمارس باستثناء ثلاثة أشهر من الفوج (ن = 4). (ج) موجز معقد - الثالث عبر الفئات العمرية. وأظهرت الفئة العمرية 9 أشهر فقط مستويات أقل من Complex-III في المجموعة التي تمارس مقارنة بالمجموعة المستقرة (n = 4). (د) موجز معقد - رابع عبر الفئات العمرية. ولوحظت زيادة طفيفة في مستويات البروتين المركبة -IV للمجموعة التي تمارس (ن = 4). (ه) ملف تعريف المركبة - V (ATP synthase) عبر الفئات العمرية. وأظهرت كل من المجموعات التي تمارس والمستقرة مستويات منخفضة من مجمع الخامس إلا عند نقطة البيانات 48 ساعة (ن = 4). الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تتم الإشارة إلى الخطوات الهامة لهذا البروتوكول هنا. أولا، ينبغي التعامل مع تجانس الأنسجة بعناية بحيث لا يتم تطبيق الآثار المفرطة خلال عملية تجانس الأنسجة. وينبغي استخدام التقطيع الأنسجة، وهو جزء من تكنولوجيا ركوب الدراجات الضغط (PCT) لتجانس الأنسجة الأولي9. هذه الخطوة سوف تقلل من دورة السكتة الدماغية المفرطة من التجانس الزجاج على الزجاج (الشكل 1B) التي قد تدمر المزيد من الميتوكوندريا الهشة بالفعل بسبب ظروف الأنسجة المجمدة. ثانيا، وزن الأنسجة المجمدة سوف تكون مهمة للحصول على كميات كافية من إعداد الميتوكوندريا المخصب. سوف تكون كمية الأنسجة الموصى بها أكثر من 0.8 غرام ، اعتمادا على مصدر الأنسجة. أنسجة القلب غنية جدا في الميتوكوندريا10,11; لذلك، فإن المبلغ الموصى به تكون كافية للحصول على إعداد الميتوكوندريا المخصب. ثالثا، يجب إجراء جميع الإجراءات في غرفة باردة. إذا لم تتوفر غرفة باردة، سيكون حمام الجليد بحجم كبير كافيا.
وقد ثبت في هذه الدراسة جدوى الحصول على الاستعدادات المخصبة بالميتوكوندريا من أنسجة القلب المجمدة سابقا. سيكون هذا البروتوكول ضروريا لتوفير الوصول إلى الأنسجة المجمدة المؤرشفة التي يمكن عزل الميتوكوندريا منها والتي يمكن تقييم مجمعات إنزيمات Mitochondrial ETC منها. أظهرت دراسة حديثة أن تنفس الميتوكوندريا من الأنسجة والخلايا المجمدة سابقا يمكن قياسه أيضا2. وبسبب هذا التقدم، سيتمكن المحققون من استخدام الطوابع البيولوجية التي تم جمعها سابقا لإجراء مزيد من التحليلات.
لتقييم ملامح كل فرد من الخ وsupercomplexes يتم أسهل من خلال أداء الانتفاخ المناعي الكلاسيكي في شكل متعددة التي تستخدم الأجسام المضادة متعددة أثناء إجراء immunoblotting على نفس الغشاء PVDH. من المهم للمستخدم تحديد كمية البروتين التي سيتم تحميلها في المواد الهلامية لSDS-PAGE و BN-PAGE. يجب أن يكون حجم إعادة الإنفاق أقل قدر ممكن من أجل الحصول على تركيزات عالية من البروتين بحيث لا يكون لدى المستخدم مشكلة في حجم تحميل العينة. كمية البروتين التي سيتم تحميلها في BN-PAGE يعتمد على غلة إعداد الميتوكوندريا المخصب. تم تحميل 150 ميكروغرام من خليط البروتين المخصب بالميتوكوندريا لكل بئر في BN-PAGE بسبب الكمية الصغيرة من أنسجة القلب الأصلية. فإن 50-150 ميكروغرام الميتوكوندريا المخصب بيليه إعداد تكون كافية ل1 مم هلام سميكة. قد يفضل المستخدم هلام سمكه 1.5 مم لتحميل العينة؛ ومع ذلك، قد لا يكون القرار من عصابات البروتين من نوعية مقبولة. لم يتم اختبار إعادة إنفاق البروتين الميتوكوندريا أقل لكل بئر لأن كوكتيلات الأجسام المضادة المستخدمة في المقايسات المناعية كانت محددة مسبقا في تركيزها. ومع ذلك، يمكن للمستخدمين جعل كوكتيل الأجسام المضادة الخاصة بهم لزيادة معدل الإشارة / الضوضاء.
يوصى بهلام تدرج بلمرة بالكامل (3٪-8٪) لالمواد الهلامية BN-PAGE. المواد الهلامية المتدرجة من 3٪ -8٪ لم تكن متاحة تجاريا؛ لذلك، يمكن استخدام التدرج محلي الصنع (3٪-8٪) المواد الهلامية المصغرة القياسية (9 × 6 سم). صب هلام 24 ساعة من قبل والسماح للهلام لبوليمرة بين عشية وضحاها في RT سوف توفر تشكيل هلام مقبول. إذا كان المستخدم يحتاج إلى فصل أفضل من supercomplexes ، فمن المستحسن استخدام تنسيقات هلام أكبر (إما هلام ميدي 13.5 سم × 6.5 سم أو هلام طويل 28 سم × 16 سم).
سيسمح تطبيق هذا البروتوكول للمحققين بعزل الميتوكوندريا وتحليل ملف ETC وsupercomplexes في الأنسجة المؤرشفة المجمدة سابقا. يحتفظ جميع المودعين من البكيميين البيولوجيين الوطنيين والإقليميين بالطوابع الحيوية في ظروف شديدة التجمد (أي -80 درجة مئوية). وتقوم المؤسسات وشركات الأدوية بأرشفة عدد كبير من الأنسجة لإجراء مزيد من الدراسات وأغراض تقاسم الكواشف. ويفوض المعهد الوطني للصحة بأن أي مشاريع تدعمها المعاهد الوطنية للصحة مطلوبة لتقاسم الكواشف المنتجة من المشاريع المدعومة. هذه الممتلكات الحيوية هي مصادر قيمة جدا للحصول على الأنسجة المحفوظة المجمدة للحصول على البيانات الأولية لطلبات المنح. لتحليل أنشطة إنزيم supercomplexes لم يتم تنفيذها في هذه الدراسة; ومع ذلك، تتوفر بروتوكولات لتنفيذ مثل assays8.
باستخدام الأساليب الموصوفة في هذه الورقة ، تم تحليل مجمعات ETC الفردية و supercomplexes من الاستعدادات المخصبة بالميتوكوندريا التي تم الحصول عليها من أنسجة القلب لذرية البذرات. قدم النسل المولود لبذرات تمارس مستويات منخفضة من الخ خلال الأشهر ال 6 الأولى من حياتهم وتسوية في نهاية المطاف بنسبة 9 أشهر.
| مجمع ETC | 48 ساعة | 3 شهر | 6 شهر | 9 شهر |
| مجمع-I | ↓ | ↓ | ↓ | لا تغيير |
| مجمع-II | ↓ | ↓ | لا تغيير | لا تغيير |
| مجمع-III | ↓ | لا تغيير | لا تغيير | ↓ |
| مركب-IV | ↑ | ↑ | ↑ | لا تغيير |
| مركب-V | ↓ | ↓ | ↓ | لا تغيير |
الجدول 2: سلسلة نقل الإلكترونات الميتوكوندريا بروتين مجمعات الملف الشخصي. يلخص الجدول لمحة عن مستويات معقدة ETC الميتوكوندريا في مجموعة تمارس من يزرع. وأظهرت جميع المجمعات، باستثناء المجمع الرابع، نمطا متناقصا عبر الفئات العمرية.
قد تشير هذه الملاحظة إلى أن النسل المولود للبذرات التي تمارس أثناء الحمل يشير إلى مجمعات ETC أقل ولكن أكثر كفاءة في ميتوكوندريا أنسجة القلب (الشكل 4). ومع ذلك، تم العثور على تشكيل supercomplex في 9 أشهر تمارس المجموعة لتكون مرتفعة. قد تؤثر التمارين الرياضية بطريقة أو بأخرى على إعادة ترتيب الكومبليكسات الفائقة في ظروف زيادة الطلب على الطاقة12. وبالإضافة إلى ذلك، أظهرت المركبة-V (ATP synthase) صورة منخفضة في أول 6 أشهر بعد الولادة. قد تكون هذه الاستجابة بسبب احتمال مجمعات بروتين ETC المعدلة وراثيا. ولم يكن حجم العينة الصغير (ن = 4) لهذه الدراسة كافيا للتوصل إلى مثل هذا الاستنتاج؛ ومع ذلك ، فإن أنماط مستويات البروتين المعقدة المنخفضة ETC ، والنشاط العالي المعقد I-II ، وتكوين supercomplex المرتفع قد تشير إلى أن الجيوجيات الحيوية في أنسجة القلب من ذرية البذرات التي تمارس تتأثر بممارسة الرياضة. أقل ولكن أكثر كفاءة تعمل الميتوكوندريا ETC المجمعات وتشكيل زيادة supercomplexes هي الظواهر المثيرة للاهتمام التي يتعين التحقيق فيها. ولا يزال هذا المشروع قيد التنفيذ.
باختصار، يوفر هذا البروتوكول إعداد عينات بسيطة ومباشرة غنية بالميتوكوندريا من أنسجة القلب المحفوظة سابقا. يمكن تحليل مجمعات Mitochondrial ETC عن طريق الانتفاخ المناعي القياسي مع كوكتيلات الأجسام المضادة المتعددة. BN-PAGE تليها immunoblotting يمكن تحليل وجود supercomplexes. هذا الإعداد يمكن أن تسمح أيضا للمستخدمين لتقييم الأنشطة المعقدة ETC الميتوكوندريا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا العمل ماليا من خلال منحة جامعة كانساس سيتي الداخلية لعبد الباقي أغباس وزمالة أبحاث الصيف لدانيال باريرا. المؤلفون ممتنون لعمل الدكتور جان تالي التحريري.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amino caproic acid | Sigma/Aldrich | A2504-100G | |
| Anti-Hu Total OxPhos complex kit | Invitrogen | 458199 | |
| anti-VDAC antibody | abcam | ab15895 | use 1 µg/mL |
| Coomassie G-250 | ThermoSientific | 20279 | |
| Coomassie GelCode Blue | ThermoScientific | 24592 | |
| Digitonin | Cabiochem | 300410 | |
| Glass-Glass pestle homogenizer | VWR | KT885451-0020 | |
| Image Studio | LICOR | ||
| IR-Dye conjugated anti-Rabbit Ab | LICOR | LC0725 | |
| Multiwell plate reader | BioTek | Synergy HT | |
| Native molecular weight marker | ThermoFisher | BN2001 | |
| Nylon mesh monofilament | Small Part Inc | CMN-74 | |
| Orbital shaker | ThermoScientfic | ||
| PCT Shredder | Pressure Bioscience Inc | ||
| SEA BLOCK Blocking buffer | ThermoScienctific | 37527 | |
| Shredder PULSE Tube | Pressure Bioscience Inc | FT500-PS | |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5418 | |
| Trypsin | Amresco | M150-1G | |
| Trypsin inhibitor | Amresco | M191-1G | Requires fresh preparation |
References
- Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Analytical Biochemistry. 418 (2), 213-223 (2011).
- Osto, C., et al. Measuring mitochondrial respiration in previously frozen biological samples. Current Protocols in Cell Biology. 89 (1), 116 (2020).
- Agbas, A., et al. Mitochondrial electron transfer cascade enzyme activity assessment in cultured neurons and select brain regions. Current Protocols in Toxicology. 80, 73 (2019).
- Hathaway, Q. A., et al. Maternal-engineered nanomaterial exposure disrupts progeny cardiac function and bioenergetics. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 312 (3), 446-458 (2017).
- May, L. E., et al. Influence of maternal aerobic exercise during pregnancy on fetal cardiac function and outflow. American Journal of Obstetrics & Gynecology MFM. 2 (2), 100095 (2020).
- Ehler, W. J., et al. Avoidance of malignant hyperthermia in a porcine model for experimental open heart surgery. Laboratory Animal Science. 35 (2), 172-175 (1985).
- Panov, A. V., et al. Effect of bovine serum albumin on mitochondrial respiration in the brain and liver of mice and rats. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 149 (2), 187-190 (2010).
- Jha, P., Wang, X., Auwerx, J. Analysis of mitochondrial respiratory chain supercomplexes using blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Current Protocols in Mouse Biology. 6 (1), 1-14 (2016).
- Pressure Biosciences Inc. Isolation of Functional Mitochondria from Whole Rat Heart Using a PBI Shredder and Pressure Cycling Technology (PCT). , South Easton, MA. (2010).
- McLaughlin, K. L., et al. Novel approach to quantify mitochondrial content and intrinsic bioenergetic efficiency across organs. Scientific Reports. 10 (1), 17599 (2020).
- Hom, J., Sheu, S. S. Morphological dynamics of mitochondria--a special emphasis on cardiac muscle cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46 (6), 811-820 (2009).
- Greggio, C., et al. Enhanced respiratory chain supercomplex formation in response to exercise in human skeletal muscle. Cell Metabolism. 25 (2), 301-311 (2017).
