Summary
Fremstilling af mitokondrier-berigede prøver fra tidligere frosne arkiverede faste væv gjorde det muligt for efterforskerne at udføre både funktionelle og analytiske vurderinger af mitokondrier i forskellige eksperimentelle modaliteter. Denne undersøgelse viser, hvordan man forbereder mitokondrier-berigede præparater fra frossen hjertevæv og udfører analytiske vurderinger af mitokondrier.
Abstract
Mitokondrie elektron overførsel kompleks (ETC) profil er ændret i hjertet væv af afkom født til en udøvet so. Den hypotese foreslået og testet var, at en regelmæssig moderens udøvelse af en so under graviditeten ville øge mitokondrie effektiviteten af afkom hjerte bioenergetik. Denne hypotese blev testet ved at isolere mitokondrier ved hjælp af en mild-isolation procedure til at vurdere mitokondrie ETC og supercomplex profiler. Den procedure, der er beskrevet her, gjorde det muligt at behandle tidligere frosne arkiverede hjertevæv og eliminerede nødvendigheden af frisk mitokondrier forberedelse til vurdering af mitokondrie ETC komplekser, superkomplekser og ETC komplekse aktivitetsprofiler. Denne protokol beskriver den optimale ETC protein komplekse måling i multiplexed antistof-baseret immunblotting og super kompleks vurdering ved hjælp af blå-native gel elektroforese.
Introduction
Målet med denne protokol var at give detaljerede skridt til at opnå mitokondrier-beriget præparat fra tidligere frosset hjertevæv med en ny teknologi af lav energi mekanisk forstyrrelse af væv, der forbedrer væv lysis og ekstraktion af mitokondrier. Med denne metode bliver forbedret ekstraktionseffektivitet uden at generere høj forskydningsstress eller høj temperatur og kort homogeniseringstid (10-12 s) opnåelig1.
At opnå mitokondrier fra arkiveret frosset væv er et værdifuldt aktiv til at udføre både funktionelle2 og biokemiske undersøgelser3 ellers ikke let gentages under de nøjagtige eksperimentelle forhold. En klassisk Potter-Elvehjem Teflon støder glas homogenisator eller Dounce homogenisator er blevet brugt og bruges stadig i forskningslaboratorier til at homogenisere blødt væv som lever, nyre og hjerne. Men, homogenisering hårdt væv såsom muskler og hjerte kræver mere homogenisering tid, enzym behandling, høj hastighed homogenisering, og omfattende brugeroplevelse. Dette er ufordelagtigt for udvinding intakte organeller såsom mitokondrier fra hårdt væv såsom muskler og hjerte. Den metode, der er beskrevet i denne protokol, anvendes til at opnå højtydende mitokondrier-beriget præparat til analyse af mitokondrie elektron transportkæde (ETC) proteinkomplekser og deres superkompleks dannelse i hjertevæv høstet fra afkom født til udøvet og stillesiddende so, flash-frosset i flydende nitrogen, og opbevares ved -80 °C til fremtidig brug. Denne metode giver brugeren mulighed for at isolere mitokondrier beriget forberedelse fra tidligere frosne arkiverede væv.
Ekstern nanomaterialeeksponering for gravide gnavere kan have en negativ indvirkning på hjertefunktionen og mitokondrie respiration og bioenergetics på afkom under svangerskab4. Ikke desto mindre, aerob motion-induceret positive ændringer i fosteret myocyt bioenergetics under graviditeten er endnu ikke dokumenteret. Men, nye undersøgelser giver bevis for, at moderens aerob træning under graviditeten har en positiv indflydelse på fosterets hjertefunktion5. For at give yderligere dokumentation blev der foretaget en analyse af de langsgående virkninger af moderøvelse på afkom af hjerte mitokondrie respiratoriske kædekomplekser (dvs. Kompleks I gennem Kompleks V) under graviditeten.
Denne undersøgelse har betydelig sundhedsrelevans, da resultaterne kan tyde på, at moderøvelse forbedrer effektiviteten af energiproduktionen i hjerte mitokondrier af afkom. I denne undersøgelse blev søer (hunsvin) brugt som dyremodel af to grunde: (i) hjertefysiologi ligner human6, og (ii) hjertevævshøst fra afkom fra forskellige tidspunkter er mulig under en institutionel IACUC-godkendelse. Den foreslåede undersøgelse har til formål at besvare mange af de grundlæggende spørgsmål, der forbinder moderlig motion og dens potentielle positive virkninger på den cellulære og biokemiske sammensætning af afkommets hjertevæv. Denne tilgang kræver blide, men effektive mitokondrierisolationsteknikker fra tidligere frosne hjertevæv fra de langvarige og dyre langsgående undersøgelser, der behandlede problemerne med de bioenergetiske ændringer i fostrets hjerte-myocytter under graviditeten. Den metode, der er beskrevet i denne undersøgelse tillader udnytte store summer af tidligere frosne arkiveret væv til mitokondrier-beriget forberedelse til både analytiske og funktionelle undersøgelser. Undersøgelsen vil også bidrage til at udfylde videnskløften på dette område ved at levere foreløbige data, hvilket kan føre til fremtidige undersøgelser, der bestemmer virkningerne af mødres motion på hjertesundhed i livmoderen og videre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Frosne afkom hjertevæv blev modtaget fra Dr. Sean Newcomer sammen med den institutionelle IACUC godkendelse brev. Hjertevævet blev fremstillet af en langvarig langsgående undersøgelse, der var flashfrosset i flydende nitrogen, og opbevaret ved -80 °C til fremtidig brug. Alle protokoller vedrørende behandling af afkom hjertevæv fulgte retningslinjerne fra Kansas City University IBC og IACUC udvalg.
1. Udarbejdelse af buffere og reagenser
BEMÆRK: Forbered alle prøver i henhold til producentens retningslinjer. Brug ultrarenset vand eller tilsvarende i alle opskrifter og protokoltrin. Brug personligt beskyttelsesudstyr (laboratorielige briller, ansigtsmaske, handsker og beskyttelsesbriller/ansigtsskærm) under denne procedure. Buffermængder er velegnede til behandling af seks vævsprøver.
- 1,5 L vævsvaskebuffer ved at kombinere 154.035 g saccharose (0,3 M endelig), 3,904 g HEPES (10 mM endelig), 0,111 g EDTA (0,2 mM endelig). Tilsæt ingredienser til 1,0 L vand, mens du er på rørepladen, juster pH-pladen til 7,2 med fortyndet HCl og makeup til det endelige volumen til 1,5 L.
BEMÆRK: Der kræves ca. 200 mL vaskebuffer pr. prøve (50-300 mg). Seks vævsprøver kan behandles på en dag. Brug den resterende vaskebuffer til at lave en isolationsbuffer. - Isolationsbufferen forberedes fra den vaskebuffer, der tidligere er beskrevet i trin 1.1, ved at tilsætte 210 mg BSA i 210 mL vaskebuffer. PH-funktionen justeres til 7,4 med fortyndet NaOH-opløsning.
BEMÆRK: Der er behov for ca. 35 mL isolationsbuffer pr. vævsprøve. Derfor kræves der 210 mL isolationsbuffer til seks prøver. Forbered denne buffer ved at tilføje frisk BSA-opløsning (1mg/mL endelig) på forberedelsesdagen. BSA bruges til at isolere mitokondrier, da det forbedrer mitokondrie egenskaber ved at fjerne naturlige uncouplers såsom frie fedtsyrer. BSA har vist sig at have antioxidant aktivitet ved at øge oxidationshastigheden af substrater, især succinate, i hjernen mitokondrier7. Alternativt kan kvæg serum albumin erstattes af billigere syrefri analoger såsom ovalbumin. - 150 mL resuspensionsbuffer ved at kombinere 0,011 g EDTA (endelig koncentration på 0,2 mM EDTA eller brug 150 μL på 200 mM lager EDTA-opløsning til 150 mL resuspension buffer), 12.836 g saccharose (0,25 M saccharose endelig koncentration) og 0,236 g Tris (10 mM Tris-HCl endelig). PH-funktionen justeres til 7,8 med 0,1 N NaOH. Der tilsættes 60 μL af proteasehæmmercocktailen lige før brug.
- Trypsinopløsningen forberedes ved at opløse 7,5 mg trypsin i 3,0 mL på 1 mM HCl (2,5 mg trypsin/mL-finale). Dette beløb er tilstrækkeligt til én prøve.
BEMÆRK: Forbered trypsinopløsningen baseret på antallet af vævsprøver, der er planlagt til at blive behandlet. - Trypsinhæmmeropløsningen fra sojabønner kombineres ved at kombinere 13,0 mg trypsin-hæmmer i 20 mL isolationsbuffer, der indeholder BSA (0,65 mg/mL af trypsin-hæmmerfinding).
BEMÆRK: Forbered en frisk trypsinhæmmeropløsning. - Ammonium persulfatreagens ved tilsætning af 0,1 g ammonium persulfat i 1 mL vand (10% ammonium persulfatfinale).
BEMÆRK: Ammonium persulfatreagenset skal enten være frisklavet, eller et stort volumen kan aliquoteres og opbevares i en -20 °C-fryser. - Aminocaproic acid opløsning (ACA) ved at kombinere 0,131 g 6-aminosyre i 1,0 mL ultra-renset vand og opbevares i 4 °C (1 M 6-aminocaproic syre endelig).
- Forbered Coomassie strålende blå farvestof opløsning ved at opløse 1 g Coomassie G-250 i 0,5 mL vand, og 0,5 mL af 1 M aminosyre (10% farvestof opløsning endelig koncentration).
- Forbered 5% Digitonin til Blå native-PAGE (BN-PAGE). Beregn omtrent, hvor meget digitonin der er behov for i prøveforberedelsen plus lidt ekstra volumen for at udligne pipetteringsfejlene (overvurdere med 10 mg). For 15 mg: For det første fortyndes 15 mg digitonin i 30 μL på 100% DMSO. Vortex til at hjælpe digitonin at komme ind i løsningen. Derefter tilsættes de resterende 90% af ddH2O (270 μL). Varm forsigtigt for at blande opløsningen (vortex), og afkøles derefter på is.
- Forbered den oprindelige PAGE anode buffer. Tilføj 50 mL 20x native PAGE løbebuffer til 950 mL vand for at lave et sidste volumen på 1 L. Forbered frisk anodebuffer til øjeblikkelig brug. Brug dette som en 1x kørende buffer.
- Forbered en mørkeblå katode buffer. Opløs 0,0160 g Coomassie strålende blå G-250 i 80 mL af indfødte PAGE anode buffer; bland godt.
BEMÆRK: Forbered frisk katodebuffer til øjeblikkelig brug. Kun 60 mL kan være nødvendig, men lav en ekstra 20 mL i tilfælde af lækager. - Forbered den lyseblå katodebuffer. Tilføj 20 mL mørkeblå katode buffer i 180 mL af indfødte PAGE anode buffer og bland godt.
BEMÆRK: Denne buffer kan kun bruges én gang. - Forbered 5% Coomassie G-250 som prøve additiv. Fortynd 200 μL på 10% Coomassie lager, der allerede er fremstillet (trin 1.8) med 200 μL på 1 M ACA og opbevares ved 4 °C.
- Forbered 4x native PAGE prøve buffer ved at kombinere 40% glycerol, 0,04% Ponceau S, 25 mM Tris-HCl (pH 6,8), 192 mM glycin i 10 mL af den endelige volumen. Aliquot dem og opbevares på -20 °C i fryseren.
2. Mitokondrier isolation fra frosne hjertevæv
BEMÆRK: Udfør mitokondrierisolationsproceduren i et 4 °C koldt rum. Men i tilfælde af utilgængelighed af kølerummet, skal du bruge en stor størrelse isbad til at udføre proceduren.
- Der udtages tidligere frosne hjertevævsprøver fra fryseren på -80 °C.
BEMÆRK: Højst fire vævsprøver kan behandles komfortabelt for mitokondrierisolation på en given dag. - Afvej røret, der indeholder hjertevævsprøven, og registrer vægten. Forbered tre bægerglas (hver 50 mL), der indeholder 40 mL vaskebuffer. Afkøles hvert bæger i issaltbadet med lige store mængder is og salt blandet i 3-5 minutter, før du går videre til næste trin. Sæt magnetiske omrøringsstænger i hvert bægerglas og indstil omrøreren til medium hastighed.
BEMÆRK: Overfrysning ikke bægerglas og brug dem umiddelbart lige efter skyer af iskrystaller begynder at dukke op. - Sæt det frosne hjertevæv direkte i den iskolde opløsning i det første bægerglas. Vent ca 5 minutter under omrøring og anvende let tryk på vævet ved hjælp af pincet at komme ud så meget blod som muligt.
- Det tomme rør vejes og trækkes fra den oprindelige vægt (trin 2.2) for at opnå en nettovægt af hjertevævet.
- Tag vævet ud med sammenkrerne og klem hjertet med et rent papirhåndklæde af filterpapir for at fjerne blod. Læg derefter vævet i det andet bægerglas. Vent ca. 5 min under omrøring for at fjerne overskydende blod.
- Tør forsigtigt vævet på et køkkenrulle. Fjern alt fedt, størknet blod, aurikler, og fasciae (hvidt væv). Derefter samles ventrikulært væv.
- Vævsprøverne ved hjælp af makulatoren ved at følge trin 2.7.1-2.7.9.
- Placer hjertevæv (~ 50-300 mg) i væv shredder kammer fra ram side.
Figur 1: Vævs shredderkammer (rør) til brug sammen med shredderen. Vævs homogenisering i shredderrøret kræver ca. 10-12 s pr. vævsprøve. Vævs homogenisering er afsluttet, når det homogeniserede væv passerer gennem den perforerede disk ind i det øverste kammer. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Tilsæt ~0,2-0,8 mL vaskebuffer til hættesiden af røret.
BEMÆRK: Sørg for, at prøvens samlede volumen og vaskebufferen, der er kombineret under makuleringen, ikke overstiger 0,7-0,8 mL. - Brug rørværktøjet til at hætte shredderkammeret med shredderhætten tæt.
BEMÆRK: Over stram ikke makulatorhætten. - Sæt makulatorkammeret i shredderholderenheden med ram-siden nedad. Ram'en vil aktivere en montering i shredderholderen.
- Indsæt delen af makulatordriveren. lad biden gå i indgreb med makulatorhætten. Sørg for, at boret er tæt låst på plads.
BEMÆRK: Brug altid den fuldt opladede shredderdriver. - Tryk manuelt nedad på shredderdriveren og makulatorkammeret, indtil trykindikatoren på shredderholderen når en indstilling på ca. 2 på shredderholderen.
BEMÆRK: Indstillingen kan være på et højere niveau, hvis makulering væv er mere fibrøst. - Kør shredderdriveren i ca. 10-12 s ved at trykke på makulatordriverens aftrækker, samtidig med at indstillingen bevares ved 2.
- Kig på røret for at kontrollere, om hele eller det meste af den faste masse af vævet er makuleret gennem lysis disken og gik ind i det øverste kammer i shredderkammeret ved at se på røret.
BEMÆRK: Det kan være nødvendigt at makulere vævsprøven i en længere periode. Du skal blot returnere røret til shredderholderen og fortsætte processen. De fleste former for vævsprøver kræver kun 10-12 s makulering. Mens alle makulering vil producere noget varme på grund af friktion, vil denne korte behandlingstid ikke opvarme prøven væsentligt. - Når prøven er makulering, løftes makulatorkammeret ud af holderenheden. Brug rørværktøjet til at fjerne shredderhætten og placere den på en ren overflade til senere brug.
BEMÆRK: Shredderhætten bør betragtes som kontamineret med prøveekstrakt og kan afhængigt af prøvetypen være forurenet med infektiøse materialer. Brug ikke den samme shredderhætte til andre vævsprøver for at forhindre krydskontaminering.
- Overfør det strimlede hjertevæv ind i det tredje bægerglas med 40 mL vaskebuffer og rørstang og rør vævet i 5 minutter ved en medium hastighed, mens du er på rørepladen.
- Suspensionen filtreres gennem en nylonnetmonfilament (74 μm porestørrelse) og kassér glødetråden. Vask det strimlede væv på filteret 3x med 10 mL vaskebuffer.
BEMÆRK: Sørg for, at nylonnetsmonufilamentet er fugtet med vand. - Overfør det vaskede og makulerede væv til et 50 mL bægerglas med 20 mL vaskebuffer, og læg bægerglasset i isbadet på den magnetiske omrører. Tilsæt 0,5 mL trypsinopløsning, mens der konstant omrøres i 15 min. Ca. halvvejs gennem inkubationen (ca. 7,5 min), overføres vævsophænget til en løst monteret håndholdt glas-på-glas homogenisator, der holder 0-15 mL volumen.
Figur 1: Vævs shredderkammer (rør) til brug sammen med shredderen. Vævs homogenisering i shredderrøret kræver ca. 10-12 s pr. vævsprøve. Vævs homogenisering er afsluttet, når det homogeniserede væv passerer gennem den perforerede disk ind i det øverste kammer. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Homogeniser forsigtigt med 4-5 slag for at sprede suspensionen uden at producere skum. Homogenaten placeres i et 50 mL-bægerglas, og bland forsigtigt på en omrøringsplade i 15 min ved 4 °C.
- Efter 15 minutters inkubation tilsættes 10 mL af isolationsbufferen, der indeholder trypsinhæmmeren, i bægerglasbet, der indeholder homogenatet og inkuberer i 1 min ved 4 °C under forsigtigt omrøring.
- Filtrer affjedringen igen gennem et nylonfilter, og gem filtratet i et 50 mL konisk rør.
- Saml den partikelfraktion, der er tilbage på nylonfilteret, og læg den i glas-på-glas homogenisatoren. Tilsættes 15-20 mL af vaskebufferen og homogeniseres forsigtigt manuelt i 25-30 s.
BEMÆRK: Filtratet flyder meget langsomt på dette trin. For at øge filtratstrømmen skal tragtspidsen berøre indersiden af det koniske rør. - Homogenaten kombineres med filtratet, balance rørene og centrifugen ved 600 x g i 15 min ved 4 °C.
- Filtrer det resulterende supernatant i et nyt konisk rør ved hjælp af et nylonfilter for at undgå forurening med pelleten. Kør centrifugen igen ved 8.500 x g i 15 min ved 4 °C.
BEMÆRK: Brug en plastoverførselspipette til at fjerne supernatanten og ofre 0,2 mL supernatant fra toppen af den fluffy pellet. - Kassér supernatanten, og skyl pelleten 2-3 gange med 1 mL af isolationsbufferen. Sørg for at kassere det fluffy hvide ydre randlag hver gang.
BEMÆRK: Vask pelleten ved at tilføje isolationsbufferen ved hjælp af en pipette med 1 mL spids eller en ny overførselspipette. Tilsæt bufferen til siden af røret, ikke direkte over pelleten, for at forhindre at bryde pelleten og forhindre forurening af supernatanten. Derefter aspirere bufferen med en overførsel pipette og gentage processen to gange mere. - Tilsæt 5 mL af isolationsbufferen til hvert rør, og opbryd pelleten ved hjælp af en pipette med en 1 mL spids eller en ny overførselspipette.
- Suspensionen fortyndes med 20 mL ekstra isolationsbuffer, og centrifugen køres igen ved 8.500 x g i 15 min ved 4 °C.
- Kassér supernatanten, og brug pelleten i 5 mL af genoplivningsbufferen. Derefter tilsættes 15 mL mere af bufferen i alt 20 mL og centrifuge ved 8.500 x g i 15 min. ved 4 °C. Kassér supernatanten. Den resulterende brune pellet indeholder vasket intakt mitokondrier.
- Resuspend mitokondrier-beriget pellet i 250 μL af resuspending buffer, herunder protease hæmmere. Aliquot i 25 μL, hurtig fryse i flydende nitrogen, og opbevares i en -80 °C dybfryser i flere år.
BEMÆRK: Ekstra 5 μL mitokondrier-beriget præparat til proteinanalyseanalysen. For en BN-PAGE (Blue native-PAGE) undersøgelse, aliquot den re suspenderede pellet i 50 μg mitokondrie protein pr rør. Centrifuge ved 8.500 x g i 15 min ved 4 °C. Sug forsigtigt supernatanten, og opbevar mitokondriepillen (50 μg protein/aliquot) i en -80 °C dybfryser i flere år.
3. Mitokondrie elektron overførsel kompleks (ETC) vurdering
BEMÆRK: Individuelle mitokondrie ETC-proteiner (dvs. Complex-I, II, III, IV, V) kan vurderes ved standard immunblotteranalyse. På grund af de mange forskellige prøver (fire tidspunkter: 48 timer, 3 måneder,6 måneder, 9 måneder), to eksperimentelle tilstande (udøvet og stillesiddende) og en række immunprobing antistoffer (fem antistoffer), anbefales en multiplexed immunblotter. Udfør multiplexed immunblotting som følger.
- 50 μg mitokondrier beriget proteinprøve/brønd i 4%-20% gradient polyacrylamidgelelektroforese (100 V, 90 min).
- Proteinerne overføres til en PVDF-membran (75 V; 60 min)
- Bloker membranen i en blokerende bufferopløsning i mindst 1 time ved 4 °C.
BEMÆRK: Blokeringstiden kan forlænges med op til natten over ved 4 °C. Blokeringsbufferen (Tabel over materialer) indeholder ikke-pattedyrsingredienser (dvs. fiskeproteiner), som er mindre tilbøjelige til at have specifikke bindende interaktioner med antistoffer samt andre pattedyrproteiner til stede ved typiske metoder. - Sonde membranen med antistofcocktailen, herunder anti-Complex-I, II, III, IV, V-antistoffer og inkuberes natten over på en orbital shaker ved 4 °C.
- Næste dag vaskes membranen og sonden med IR-mærket sekundært antistof i 2 timer på en orbital shaker ved RT (stuetemperatur).
- Vask fem gange med 1x TBS-T (TBS indeholdende Tween 20), og en gang med 1x TBS (Tris buffered saltvand).
BEMÆRK: Ved den sidste vask må vaskemiddel ikke medtages i TBS-bufferen. - Billede blot i et billede analysator.
4. Mitokondrier superkompleks vurdering af Blue Native Poly Acrylamid Gel Elektroforese (BN-PAGE)
BEMÆRK: En superkompleks profil af ETC kan også vurderes ved at anvende BN-PAGE teknikken.
- Prøvens buffercocktail forberedes til 20 μL pr. 50 μg mitokondrier-beriget pelletprotein (7 μL vand + 5 μL af 4x native polyacrylamidgelelektroforeseprøvebelastningsbuffer + 8 μL på 5% Digitonin + 2 μL coomassie G-250).
BEMÆRK: Lav en lagerprøvebuffercocktail afhængigt af antallet af tilgængelige prøver (50 μg protein/prøve). Vælg passende digitoninmængder baseret på proteinkoncentrationen af den mitokondrier-berigede pellet (tabel 1)8. - Opvarm digitoninlageret ved 95 °C i 3 min, bland og afkøles på is, før masterblandingen laves.
- Tilsæt Coomassie G-250 prøvetilsætningsstoffet lige før du lægger prøverne i gelen.
- Der tilsættes 20 μL af prøvebuffercocktailen i et rør, der indeholder 50 μg mitokondrieproteinpille. Opløses/genbruges pellet ved forsigtigt at blande pellet med en pipette uden at generere skum.
- Inkuber blandingen på is i 20 minutter for at opnå maksimal opløselighed af mitokondrier-beriget pellet. Fra tid til anden, forsigtigt svirp rørene for at forbedre opløselighed.
- Mens du venter på inkubation, forberede den oprindelige PAGE anode buffer / 1x kører buffer og den mørkeblå farvet katode buffer.
- Centrifuge den opløselige mitokondrier-beriget pellet ved 20.000 x g i 10 min ved 4 °C.
- Efter centrifugering opsamles 15 μL af supernatanten i nye rør, der er lagt på is.
- Der tilsættes en passende mængde coomassie G-250-reagens på det supernatant, der blev opnået i trin 4.8 (se tabel 1).
BEMÆRK: 5% Coomassie G-250 volumen bør være sådan, at den endelige koncentration af farvestoffet er 1/4 vaskemiddelkoncentrationen. Udfør dette trin lige før du lægger prøverne i gelen.
| Protein | Digitonin/protein | 4x eksempelbuffer | 5% Digitonin | Vand | Slutvolumen | 5% Coomassie G-250 |
| forhold (g/g) | prøve additiv | |||||
| 50 μg | 8 | 5 | 8 | 7 | 20 | 2 |
| 50 μg | 4 | 5 | 4 | 11 | 20 | 1 |
Tabel 1: Prøve buffercocktailpræparat med to forskellige vaske- og proteinforhold. For at opnå maksimal opløselighed af membranproteiner fra mitokondrieaffjedringen skal proteinkoncentrationen af digitalonin/mitokondrie suspension justeres til mellem 4-8 g digitonin/g protein. I hjertevævet blev der anvendt 400 μg digitonin til 50 μg mitokondrieaffjedringsproteiner (dvs. 8 g digitonin/g mitokondrierprotein) for at maksimere superkompleksernes opløselighed fra mitokondrier-suspensionen.
- Hæld en 3%-8% gradient gel, fjern kammen, og vask ud brønde af gelen med 1x kører buffer tre gange.
BEMÆRK: Gelen polymeriseres bedst, hvis den hældes dagen før. - Sæt elektroforesesystemet op, og sæt gelen i apparatet.
- Fyld prøvebjerne med den mørkeblå katodebuffer.
- Læg 10 μL af den ikke-farvede proteinstandard som en oprindelig molekylvægtmarkør på gelens første og sidste brønd.
- Hele prøvens supernatant + Coomassie-prøvetilsætningsstof, der fremstilles i trin 4.9 ovenfor, ind i brøndene ved hjælp af en fladhovedet gellæssespids.
- Fyld forsigtigt minicellebufferdæmningen med ca. 60 mL mørkeblå farvet katodebuffer uden at forstyrre prøverne i brøndene, og fyld derefter buffertanken med den oprindelige SIDE 1x løbebuffer.
- Tænd for strømforsyningen og elektroforese prøverne ved 150 V i ca. 30 min.
- Fjern den mørkeblå katodebuffer fra bufferdæmningen (det indre kammer) med en overførselspipette, eller gsugning af prøvetjerne. Fyld det indre kammer med 150-200 mL lyseblå katode buffer og køre elektroforesen ved 250 V i 60 min.
BEMÆRK: Elektroforesetiden kan bestemmes ved at kontrollere, hvornår farvefronten kun vandrer 0,5 cm over bunden af gelkassetten. - Fjern gelen fra kassetten og læg den i en ren plastbeholder. Vask gelen med god kvalitet destilleret vand i 15 min på en rocker / orbital shaker.
BEMÆRK: Hvis du vil fjerne gradientgelen fra kassetten, skal du håndtere kassetten fra bunden, som er stærkere, for at minimere chancerne for brud. - Hæld vand af, sænk gelen i en tilstrækkelig mængde Coomassie GelCode Blue pletreagens, og inkuber i 1 time på en orbital / rocker ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Bland den blå pletreagens (Materialetabel) før brug ved forsigtigt at hvirvle flasken flere gange. - Dekanter farveopløsningen, tilsæt destilleret vand, skyl flere gange med vand, og sæt derefter orbital / rocker til afsmitning.
BEMÆRK: Sæt et stykke svamp (~3 cm x 0,5 cm) i gelafsmitningsbeholderen, og lad gelen blive afsmittet natten over. Svampen adsorber farvepartiklerne uden at kræve flere vandforandringer. - Analyser gelen i en billedanalysator.
5. Mitokondrier superkompleks vurdering af immunoblot blot analyse
- Udfør et nyt sæt BN-PAGE uden at plette gelen i slutningen af elektroforesen.
- Følg samme procedure som i afsnit 3 (mitokondrie elektronoverførsel kompleks (ETC) vurdering) for at fuldføre immunoblotting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter protokollen blev der forberedt et godt udbytte af mitokondrier-beriget proteinblanding fra hjertevæv. Ca. 15 mg/mL mitokondrier-beriget proteinblanding blev fremstillet af et gennemsnit på 1,2 g frosset hjertevæv høstet fra afkom af soen. Observationer viste, at mindre end 0,5 g frosset hjertevæv ikke gav en tilstrækkelig mængde mitokondrieberiget proteinblanding til at udføre en BN-PAGE-analyse. Mængden af mitokondriepræparat var tilstrækkelig til at udføre (i) en standard immunoblotanalyse til vurdering af de enkelte elektronoverførselskomplekser (ETC) (dvs. Complex-I, II, III, IV og Complex-V), ii) en mitokondrie superkomplex-vurdering ved BN-PAGE- og immunoblotanalyse og (iii) begrænsede enzymatiske analyser for det udvalgte kompleks. Cocktailen af antistoffer rejst mod individuelle ETC protein komplekser giver teknisk gennemførlighed, at hvert antistof vil genkende sit eget mål protein i en enkelt immunoblot assay.
Mitokondrier-beriget protein blev fremstillet af hjertets venstre ventrikel, fremstillet af afkom af soen. Afkomene blev født til to grupper af søer: (1) en gruppe blev udøvet under graviditeten, og (2) en gruppe var stillesiddende. Hjertevævet i begge grupper blev høstet på forskellige tidspunkter efter fødslen (48 timer, 3 måneder, 6 måneder og 9 måneder). Hvorvidt moderlig motion har en positiv indvirkning på mitokondrie ETC af afkom under svangerskabet var den hypotese, der blev testet i denne undersøgelse. Fire hjertevæv blev komfortabelt behandlet på en given dag på grund af den langvarige mitokondrier-beriget isolationsproces.
Figur 2: Immunoblot profil af mitokondrie ETC komplekser fra afkom hjertevæv. Den mitokondrieberigede proteinblanding blev løst i en 4%-20% gradient gel under reducerende forhold. Proteiner blev immunprobed af en kommerciel antistofcocktail, og anti-VDAC antistof blev brugt til lastningskontrol (rødt farvebånd). Cocktailen af antistoffer blev rejst mod kvæghjerte Complex-I (antigen NDUFB8), kvæghjerte Complex-II (antigen C-II30 (FeS), kvæghjerte Complex II, III (antigen C-III-Core 2), human Complex IV, underenhed II (antigen C-IV-II) og kvæghjerte Complex-V (antigen C-V-α). Det sekundære antistof blev mærket med et infrarødt tag, og billedet blev analyseret ved hjælp af en billedanalysesoftware. Individuelle komplekse profiler på tværs af aldersgrupperne findes i supplerende figur 1 (A-E). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 repræsenterer en typisk ETC-proteinprofil. Antistofcocktails tilladt til immunblotter i multiplex-format. Hvert antistof genkendte sit eget målprotein og gav en acceptabel opløsning. Proteinbåndets intensiteter blev analyseret digitalt. Væv fra afkom af motioneret so udgjorde relativt reducerede niveauer i nogle af ETC-komplekserne (supplerende tal 1A-E). Det mitokondrier-berigede præparat skal løses i en gradientgel (4%-20%), da immunprobing blev udført i et multiplexingformat. Denne tilgang vil fjerne nødvendigheden af at køre flere faste procent af SDS / PAGE geler og run-to-run variabilitet.
Mitokondrieproteiner blev løst i en 3%-8% gradient BN-PAGE (Figur 3A) og immunprobed med antistofcocktails. I både udøvede og stillesiddende grupper blev der observeret flere superkompleksdannelser (figur 3B).
Figur 3: Mitokondrie superkompleks profil af Blå-Native Polyacrylamid gel elektroforese (BN-PAGE). Mitokondrie-berigede proteinblandinger blev løst i 3%-8% BN-PAGE, og farves med en Coomassie blå reagens (Gel Code, Blue Stain Reagent). (B). Mitokondrie-beriget protein blandinger blev løst i en 3%-8% BN-PAGE, overført til en PVDF membran, og immunoprobed med antistof cocktails til supercomplexes. I begge analyser var proteinbelastningen 150 μg/brønd. Et 6-måneders dataindsamlingssted blev ikke medtaget på grund af et utilstrækkeligt proteinudbytte under præparatet. Den mest fremtrædende superkomplekse stigning var på 9 måneder i den udøvede gruppe sammenlignet med den stillesiddende gruppe. Klik her for at se en større version af dette tal.
Et andet gradient gel format (3%-8%) blev udarbejdet på grund af den store størrelse af superkomplekser, der kan løses i BN-PAGE. Mitokondrier-beriget præparat beskrevet i denne protokol blev brugt til måling mitokondrie ETC komplekse aktiviteter. Figur 4 repræsenterer data, der er registreret for kompleks I II-aktivitetsvurdering. Denne analyse blev udført i henhold til den etablerede protokol3.
Figur 4: Komplekse I-II-aktivitetsmålinger. Mitokondrier-berigede proteinblandinger fremstillet fra forskellige aldersgrupper (48 timer, 3 måneder, 6 måneder og 9 måneder) blev analyseret for Complex I-II-aktiviteten ved hjælp af en kinetisk analyse. Den udøvede gruppe udviste en øget kompleks I-II-aktivitet i forhold til den stillesiddende gruppes. Forskellen mellem de to grupper var ikke statistisk signifikant i henhold til en parret t-test (P > 0,05). De fejllinjer, der er afbildet i figuren, repræsenterer standardfejlen for middelværdien (SEM) for n = 4. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 1: (A) Kompleks-I profil på tværs af aldersgrupper. Generelt præsenterede afkom født af den udøvede so lavere niveauer af Kompleks-I sammenlignet med den stillesiddende gruppe (n = 4). Dette var mere udtalt i 9-måneders gruppen. (B) Kompleks-II profil på tværs af aldersgrupper. Alle aldersgrupper udviste et lavt niveau af kompleks-II i den udøvede gruppe med undtagelse af tre måneders kohorte (n = 4). (C) Kompleks-III profil på tværs af aldersgrupper. Kun aldersgruppen på 9 måneder udviste lavere niveauer af kompleks III i den udøvede gruppe sammenlignet med niveauet for den stillesiddende gruppe (n = 4). (D) Kompleks-IV profil på tværs af aldersgrupper. Der blev observeret en mindre stigning i kompleks-IV-proteinniveauet i den udøvede gruppe (n = 4). (E) Complex-V (ATP synthase) profil på tværs af aldersgrupper. Både udøvede og stillesiddende grupper udviste lave niveauer af Kompleks-V undtagen ved 48 h datapunktet (n = 4). Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De kritiske trin for denne protokol er angivet her. For det første skal vævs homogenisering håndteres omhyggeligt, således at der ikke påføres for store virkninger under vævs homogeniseringsprocessen. Der bør anvendes en vævs shredder, som er en del af trykcyklingsteknologi (PCT) til indledende vævs homogenisering9. Dette trin vil reducere den overdrevne slagtilfælde cyklus af glas-på-glas homogenisator (Figur 1B), der yderligere kan ødelægge allerede skrøbelige mitokondrier på grund af frosne vævsforhold. For det andet vil den frosne vævsvægt være vigtig for at opnå tilstrækkelige mængder af mitokondrier-beriget præparat. Den anbefalede startvævsmængde vil være større end 0,8 g, afhængigt af vævskilden. Hjertevævet er meget rig på mitokondrier10,11; derfor vil det anbefalede beløb være tilstrækkeligt til at opnå et mitokondrier-beriget præparat. For det tredje skal alle procedurer udføres i et koldt rum. Hvis et koldt rum ikke er tilgængeligt, vil et stort isbad være tilstrækkeligt.
Muligheden for at opnå mitokondrier-berigede præparater fra tidligere frosset hjertevæv er blevet påvist i denne undersøgelse. Denne protokol vil være afgørende for at give adgang til arkiveret frosset væv, hvorfra mitokondrier kan isoleres, og hvorfra mitokondrie ETC enzymkomplekser kan vurderes. En nylig undersøgelse viste, at mitokondrie respiration fra tidligere frosne væv og celler kunne være målbare så godt2. På grund af denne udvikling, efterforskere vil være i stand til at udnytte tidligere indsamlede biosamples til yderligere analyser.
At vurdere profilen af individuelle ETC og superkomplekser gøres lettere ved at udføre klassisk immunblotter i et multiplexing format, der udnytter flere antistoffer under immunblotting proceduren på samme PVDH membran. Det er afgørende for brugeren at bestemme mængden af protein, der skal indlæses i geler til SDS-PAGE og BN-PAGE. Resuspensionsmængden bør være så minimal som muligt for at opnå høje proteinkoncentrationer, så brugeren ikke får problemer med prøveindlæsningsmængden. Proteinmængden, der skal lastes i BN-PAGE, afhænger af udbyttet af det mitokondrier-berigede præparat. En 150 μg mitokondrier-beriget proteinblanding blev lastet pr. brønd i BN-PAGE på grund af den lille mængde originalt hjertevæv. Den 50-150 μg mitokondrier-beriget pellet forberedelse ville være tilstrækkelig til 1 mm tyk gel. Brugeren foretrækker måske en 1,5 mm tyk gel til prøvebelastning; Opløsningen af proteinbånd er dog muligvis ikke af acceptabel kvalitet. Den mindre mitokondrieproteinresuspension pr. brønd blev ikke testet, fordi antistofcocktails, der blev anvendt i immunblodanalyser, var forudbestemt i deres koncentration. Brugere kan dog lave deres egen antistofcocktail for at øge signal-/støjhastigheden.
En fuldt polymeriseret gradientgel (3%-8%) til BN-PAGE geler anbefales. Gradient geler på 3%-8% har ikke været kommercielt tilgængelige; derfor kan hjemmelavet gradient (3%-8%) standard mini geler (9 x 6 cm) bruges. Hælde gel 24 timer før og giver mulighed for gelen til polymerisere natten over i RT vil give en acceptabel gel dannelse. Hvis en bruger har brug for bedre adskillelse af superkomplekser, anbefales det at bruge større gelformater (enten midi gel 13,5 cm x 6,5 cm eller lang gel 28 cm x 16 cm).
Anvendelsen af denne protokol vil gøre det muligt for efterforskere at isolere mitokondrier og analysere profilen af ETC og superkomplekser i tidligere frosne arkiverede væv. Alle nationale og regionale biospecimen depositarer holder biosamplerne under ultrafrysningsforhold (dvs. -80 °C). Et stort antal væv arkiveres af institutioner og medicinalfirmaer til yderligere undersøgelser og reagensdelingsformål. National Institute of Health (NIH) pålægger, at eventuelle NIH-støttede projekter er forpligtet til at dele de reagenser, der produceres fra de støttede projekter. Disse biorepositorier er meget værdifulde kilder til at opnå frossen arkiveret væv til at indhente foreløbige data til tilskudsansøgninger. At analysere enzymaktiviteter af superkomplekser blev ikke udført i denne undersøgelse; dog er protokoller til rådighed til at udføre sådanne assays8.
Ved hjælp af de metoder, der er beskrevet i dette papir, blev individuelle ETC-komplekser og superkomplekser af mitokondrier-berigede præparater fremstillet af hjertevævet hos afkom af søer analyseret. Afkom født til udøvede søer præsenterede lave niveauer af ETC i løbet af de første 6 måneder af deres liv og i sidste ende nivellering op med 9 måneder.
| ETC-kompleks | 48 timer | 3 måneder | 6 måneder | 9 måneder |
| Kompleks-I | ↓ | ↓ | ↓ | Ingen ændring |
| Kompleks-II | ↓ | ↓ | Ingen ændring | Ingen ændring |
| Kompleks-III | ↓ | Ingen ændring | Ingen ændring | ↓ |
| Kompleks-IV | ↑ | ↑ | ↑ | Ingen ændring |
| Kompleks-V | ↓ | ↓ | ↓ | Ingen ændring |
Tabel 2: Mitokondrie elektron transport kæde protein komplekser profil. Tabellen opsummerer profilen af mitokondrie ETC komplekse niveauer i den udøvede gruppe af søer. Alle komplekser, undtagen Complex-IV, viste et faldende mønster på tværs af aldersgrupperne.
Denne observation kan tyde på, at afkom født af de udøvede søer under graviditeten indikerede færre, men mere effektive ETC-komplekser i deres hjertevæv mitokondrier (figur 4). Men, supercomplex formation i 9 måneder udøves gruppe har vist sig at være forhøjet. Motion kan en eller anden måde påvirke omlægningen af superkomplekser under forhold med øget energiefterspørgsel12. Derudover har Complex-V (ATP synthase) udvist en lav profil i de første 6 måneder efter fødslen. Dette svar kan skyldes sandsynligheden for epi genetisk modificerede ETC proteinkomplekser. Den lille stikprøvestørrelse (n = 4) for denne undersøgelse var ikke tilstrækkelig til at nå frem til en sådan konklusion. mønstre med lave ETC-komplekse proteinniveauer, høj kompleks I-II-aktivitet og forhøjet superkompleksdannelse kan imidlertid tyde på, at bioenergetik i hjertevæv af afkom af udøvede søer påvirkes af motion. Færre, men mere effektivt arbejder mitokondrie ETC komplekser og dannelsen af øget supercomplexes er interessante fænomener, der skal undersøges. Dette projekt er stadig i gang.
Sammenfattende giver denne protokol enkel og ligetil mitokondrier-beriget prøvepræparat fra tidligere frosset arkiveret hjertevæv. Mitokondrie ETC komplekser kan analyseres ved standard immunblotting med multiplexed antistof cocktails. BN-PAGE efterfulgt af immunblotting kan analysere tilstedeværelsen af superkomplekser. Dette præparat kan også give brugerne mulighed for at vurdere mitokondrie ETC komplekse aktiviteter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbejde blev økonomisk støttet af Kansas City University's intramural tilskud til Abdulbaki Agbas og Summer Research Fellowship for Daniel Barrera. Forfatterne er taknemmelige for Dr. Jan Talley's redaktionelle arbejde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amino caproic acid | Sigma/Aldrich | A2504-100G | |
| Anti-Hu Total OxPhos complex kit | Invitrogen | 458199 | |
| anti-VDAC antibody | abcam | ab15895 | use 1 µg/mL |
| Coomassie G-250 | ThermoSientific | 20279 | |
| Coomassie GelCode Blue | ThermoScientific | 24592 | |
| Digitonin | Cabiochem | 300410 | |
| Glass-Glass pestle homogenizer | VWR | KT885451-0020 | |
| Image Studio | LICOR | ||
| IR-Dye conjugated anti-Rabbit Ab | LICOR | LC0725 | |
| Multiwell plate reader | BioTek | Synergy HT | |
| Native molecular weight marker | ThermoFisher | BN2001 | |
| Nylon mesh monofilament | Small Part Inc | CMN-74 | |
| Orbital shaker | ThermoScientfic | ||
| PCT Shredder | Pressure Bioscience Inc | ||
| SEA BLOCK Blocking buffer | ThermoScienctific | 37527 | |
| Shredder PULSE Tube | Pressure Bioscience Inc | FT500-PS | |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5418 | |
| Trypsin | Amresco | M150-1G | |
| Trypsin inhibitor | Amresco | M191-1G | Requires fresh preparation |
References
- Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Analytical Biochemistry. 418 (2), 213-223 (2011).
- Osto, C., et al. Measuring mitochondrial respiration in previously frozen biological samples. Current Protocols in Cell Biology. 89 (1), 116 (2020).
- Agbas, A., et al. Mitochondrial electron transfer cascade enzyme activity assessment in cultured neurons and select brain regions. Current Protocols in Toxicology. 80, 73 (2019).
- Hathaway, Q. A., et al. Maternal-engineered nanomaterial exposure disrupts progeny cardiac function and bioenergetics. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 312 (3), 446-458 (2017).
- May, L. E., et al. Influence of maternal aerobic exercise during pregnancy on fetal cardiac function and outflow. American Journal of Obstetrics & Gynecology MFM. 2 (2), 100095 (2020).
- Ehler, W. J., et al. Avoidance of malignant hyperthermia in a porcine model for experimental open heart surgery. Laboratory Animal Science. 35 (2), 172-175 (1985).
- Panov, A. V., et al. Effect of bovine serum albumin on mitochondrial respiration in the brain and liver of mice and rats. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 149 (2), 187-190 (2010).
- Jha, P., Wang, X., Auwerx, J. Analysis of mitochondrial respiratory chain supercomplexes using blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Current Protocols in Mouse Biology. 6 (1), 1-14 (2016).
- Pressure Biosciences Inc. Isolation of Functional Mitochondria from Whole Rat Heart Using a PBI Shredder and Pressure Cycling Technology (PCT). , South Easton, MA. (2010).
- McLaughlin, K. L., et al. Novel approach to quantify mitochondrial content and intrinsic bioenergetic efficiency across organs. Scientific Reports. 10 (1), 17599 (2020).
- Hom, J., Sheu, S. S. Morphological dynamics of mitochondria--a special emphasis on cardiac muscle cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46 (6), 811-820 (2009).
- Greggio, C., et al. Enhanced respiratory chain supercomplex formation in response to exercise in human skeletal muscle. Cell Metabolism. 25 (2), 301-311 (2017).
