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Biochemistry

बोने की संतानों से पहले जमे हुए कार्डियक ऊतक में माइटोकॉन्ड्रियल इलेक्ट्रॉन ट्रांसफर कॉम्प्लेक्स को मापना: व्यायाम-प्रेरित माइटोकॉन्ड्रियल बायोएनर्जेटिक्स परिवर्तनों का आकलन करने के लिए एक मॉडल

Published: August 16, 2021 doi: 10.3791/62809
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 7, 7,13
1AdventHelath, 2University of Illinois Chicago School of Public Health, 3Lincoln Memorial University, 4Children’s Mercy Hospital, 5Scripps Clinic, 6Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, 7Kansas City University, 8Roblex Rex Veterans Affairs Medical Center, 9California State University San Marcos, 10East Carolina University, 11Massachusetts Institute of Technology, 12Boehringer Ingelheim Norway KS, 13Heartland Center for Mitochondrial Medicine

Summary

पहले जमे हुए संग्रहित ठोस ऊतकों से माइटोकॉन्ड्रिया-समृद्ध नमूनों की तैयारी ने जांचकर्ताओं को विभिन्न प्रयोगात्मक तौर-तरीकों में माइटोकॉन्ड्रिया के कार्यात्मक और विश्लेषणात्मक मूल्यांकन दोनों करने की अनुमति दी। यह अध्ययन दर्शाता है कि जमे हुए दिल के ऊतकों से माइटोकॉन्ड्रिया-समृद्ध तैयारी कैसे तैयार की जाए और माइटोकॉन्ड्रिया के विश्लेषणात्मक मूल्यांकन किए जाएं।

Abstract

माइटोकॉन्ड्रियल इलेक्ट्रॉन ट्रांसफर कॉम्प्लेक्स (ETC) प्रोफ़ाइल को एक व्यायाम बोने के लिए पैदा हुई संतानों के हृदय के ऊतकों में संशोधित किया जाता है। प्रस्तावित और परीक्षण की गई परिकल्पना यह थी कि गर्भावस्था के दौरान बोने का एक नियमित मातृ व्यायाम संतान हृदय बायोएनर्जेटिक्स की माइटोकॉन्ड्रियल दक्षता को बढ़ाएगा। इस परिकल्पना का परीक्षण माइटोकॉन्ड्रियल ईटीसी और सुपरकॉम्प्लेक्स प्रोफाइल का आकलन करने के लिए एक हल्के-अलगाव प्रक्रिया का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रिया को अलग करके किया गया था। यहां वर्णित प्रक्रिया ने पहले जमे हुए संग्रहित हृदय ऊतकों के प्रसंस्करण के लिए अनुमति दी और माइटोकॉन्ड्रियल ईटीसी कॉम्प्लेक्स, सुपरकॉम्प्लेक्स और ईटीसी जटिल गतिविधि प्रोफाइल के मूल्यांकन के लिए ताजा माइटोकॉन्ड्रिया तैयारी की आवश्यकता को समाप्त कर दिया। यह प्रोटोकॉल मल्टीप्लेक्स्ड एंटीबॉडी-आधारित इम्यूनोब्लॉटिंग और नीले-देशी जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करके सुपर जटिल मूल्यांकन में इष्टतम ईटीसी प्रोटीन जटिल माप का वर्णन करता है।

Introduction

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य ऊतक के कम ऊर्जा यांत्रिक व्यवधान की एक नई तकनीक के साथ पहले जमे हुए दिल के ऊतकों से माइटोकॉन्ड्रिया-समृद्ध तैयारी प्राप्त करने के लिए विस्तृत कदम प्रदान करना था जो ऊतक लाइसिस और माइटोकॉन्ड्रिया के निष्कर्षण में सुधार करता है। इस विधि के साथ, उच्च कतरनी तनाव या उच्च तापमान और कम homogenization समय (10-12 s) उत्पन्न किए बिना निष्कर्षण दक्षता में सुधार प्राप्त करने योग्य हो जाते हैं।

संग्रहीत जमे हुए ऊतक से माइटोकॉन्ड्रिया प्राप्त करने के लिए कार्यात्मक 2 और जैव रासायनिक अध्ययन दोनों को निष्पादित करने के लिए एक मूल्यवान संपत्ति है3 अन्यथा सटीक प्रयोगात्मक परिस्थितियों में आसानी से दोहराया जा सकता है। एक क्लासिक पॉटर-Elvehjem Teflon pestle ग्लास homogenizer या Dounce homogenizer का उपयोग किया गया है और अभी भी अनुसंधान प्रयोगशालाओं में जिगर, गुर्दे और मस्तिष्क जैसे नरम ऊतकों को homogenize करने के लिए उपयोग किया जा रहा है। हालांकि, मांसपेशियों और हृदय जैसे कठोर ऊतकों को homogenizing अधिक homogenization समय, एंजाइम उपचार, उच्च गति homogenization, और व्यापक उपयोगकर्ता अनुभव की आवश्यकता होती है। यह मांसपेशियों और हृदय जैसे कठोर ऊतकों से माइटोकॉन्ड्रिया जैसे बरकरार ऑर्गेनेल को निकालने के लिए हानिकारक है। इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधि का उपयोग माइटोकॉन्ड्रियल इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला (ईटीसी) प्रोटीन परिसरों का विश्लेषण करने के लिए उच्च उपज माइटोकॉन्ड्रिया-समृद्ध तैयारी प्राप्त करने के लिए किया जाता है और हृदय के ऊतकों में उनके सुपरकॉम्प्लेक्स गठन का उपयोग किया जाता है, जो व्यायाम और गतिहीन बोने के लिए पैदा हुए संतानों से काटा जाता है, तरल नाइट्रोजन में फ्लैश-जमे हुए, और भविष्य के उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है। यह विधि उपयोगकर्ता को पहले जमे हुए संग्रहीत ऊतकों से माइटोकॉन्ड्रिया समृद्ध तैयारी को अलग करने की अनुमति देती है।

गर्भवती कृन्तकों के लिए बाहरी नैनोमटेरियल एक्सपोजर गर्भावस्था के दौरान संतानों पर कार्डियक फ़ंक्शन और माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन और बायोएनर्जेटिक्स को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकता है। फिर भी, गर्भावस्था के दौरान भ्रूण मायोसाइट्स बायोएनर्जेटिक्स में एरोबिक व्यायाम-प्रेरित सकारात्मक परिवर्तनों को अभी तक प्रलेखित नहीं किया गया है। हालांकि, उभरते हुए अध्ययन इस बात के सबूत प्रदान करते हैं कि गर्भावस्था के दौरान मातृ एरोबिक व्यायाम का भ्रूण के कार्डियक फ़ंक्शन 5 पर सकारात्मक प्रभाव पड़ता है। आगे के सबूत प्रदान करने के लिए, गर्भावस्था के दौरान संतान कार्डियक माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन श्रृंखला परिसरों (यानी, कॉम्प्लेक्स वी के माध्यम से जटिल मैं) पर मातृ व्यायाम के अनुदैर्ध्य प्रभावों का विश्लेषण किया गया था।

इस अध्ययन में महत्वपूर्ण स्वास्थ्य प्रासंगिकता है क्योंकि परिणाम यह सुझाव दे सकते हैं कि मातृ व्यायाम संतानों के कार्डियक माइटोकॉन्ड्रिया में ऊर्जा उत्पादन की दक्षता में सुधार करता है। इस अध्ययन में, बोने (मादा सुअर) का उपयोग दो कारणों से एक पशु मॉडल के रूप में किया गया था: (i) कार्डियक फिजियोलॉजी मानव 6 के समान है, और (ii) विभिन्न समय बिंदुओं से संतानों से दिल के ऊतकों की फसल एक संस्थागत आईएसीयूसी अनुमोदन के तहत संभव है। प्रस्तावित अध्ययन का उद्देश्य मातृ व्यायाम और संतानों के हृदय ऊतक के सेलुलर और जैव रासायनिक मेकअप पर इसके संभावित सकारात्मक प्रभावों को जोड़ने वाले कई मौलिक सवालों के जवाब देना है। इस दृष्टिकोण के लिए लंबे और महंगे अनुदैर्ध्य अध्ययनों से प्राप्त पहले जमे हुए कार्डियक ऊतक से कोमल अभी तक प्रभावी माइटोकॉन्ड्रिया अलगाव तकनीकों की आवश्यकता होती है जो गर्भावस्था के दौरान भ्रूण कार्डियक मायोसाइट्स के भीतर बायोएनर्जेटिक परिवर्तनों के मुद्दों को संबोधित करते हैं। इस अध्ययन में वर्णित विधि विश्लेषणात्मक और कार्यात्मक अध्ययनों दोनों के लिए माइटोकॉन्ड्रिया-समृद्ध तैयारी के लिए पहले से जमे हुए संग्रहीत ऊतक की बड़ी राशि का उपयोग करने की अनुमति देती है। अध्ययन प्रारंभिक डेटा प्रदान करके इस क्षेत्र में ज्ञान के अंतर को भरने में भी मदद करेगा, जिससे गर्भाशय में और उससे परे हृदय स्वास्थ्य पर मातृ व्यायाम के प्रभावों को निर्धारित करने वाले भविष्य के अध्ययन हो सकते हैं।

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Protocol

जमे हुए संतानों के दिल के ऊतकों को संस्थागत आईएसीयूसी अनुमोदन पत्र के साथ डॉ शॉन नवागंतुक से प्राप्त किया गया था। हृदय के ऊतकों को एक दीर्घकालिक अनुदैर्ध्य अध्ययन से प्राप्त किया गया था, तरल नाइट्रोजन में फ्लैश-जमे हुए, और भविष्य के उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया था। संतान हृदय ऊतक के प्रसंस्करण से संबंधित सभी प्रोटोकॉल ने कैनसस सिटी यूनिवर्सिटी आईबीसी और आईएसीयूसी समितियों के दिशानिर्देशों का पालन किया।

1. बफर और अभिकर्मकों की तैयारी

नोट: निर्माता के दिशानिर्देशों के अनुसार सभी नमूने तैयार करें। सभी व्यंजनों और प्रोटोकॉल चरणों में अल्ट्रा-शुद्ध पानी या समकक्ष का उपयोग करें। इस प्रक्रिया के दौरान व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (लैब ग्लोट्स, फेसमास्क, दस्ताने, और चश्मे / फेस शील्ड) पहनें। बफर वॉल्यूम छह ऊतक नमूनों को संसाधित करने के लिए उपयुक्त हैं।

  1. सुक्रोज के 154.035 ग्राम (0.3 एम फाइनल), 3.904 ग्राम HEPES (10 mM अंतिम), 0.111 g EDTA (0.2 mM अंतिम) के संयोजन से 1.5 एल ऊतक धोने बफर तैयार करें। हलचल प्लेट पर रहते हुए 1.0 एल पानी में सामग्री जोड़ें, पतला HCl के साथ 7.2 करने के लिए पीएच को समायोजित करें, और 1.5 एल करने के लिए अंतिम मात्रा के लिए मेकअप।
    नोट: लगभग 200 मिलीलीटर धोने के बफर प्रति नमूना (50-300 मिलीग्राम) की आवश्यकता होती है। एक दिन में छह ऊतक के नमूनों को संसाधित किया जा सकता है। एक अलगाव बफर बनाने के लिए शेष वॉशिंग बफर का उपयोग करें।
  2. वॉश बफर से अलगाव बफर तैयार करें जो पहले चरण 1.1 में वर्णित 210 मिलीग्राम वॉश बफ़र में 210 मिलीलीटर वॉश बफर में बीएसए के 210 मिलीग्राम जोड़कर। तनु NaOH समाधान के साथ 7.4 करने के लिए पीएच समायोजित करें।
    नोट: अलगाव बफर के लगभग 35 मिलीलीटर प्रति ऊतक नमूने की आवश्यकता है; इसलिए, छह नमूनों के लिए 210 मिलीलीटर अलगाव बफर की आवश्यकता होती है। तैयारी के दिन ताजा बीएसए समाधान (1mg / mL अंतिम) जोड़कर इस बफर को तैयार करें। बीएसए का उपयोग माइटोकॉन्ड्रिया को अलग करने के लिए किया जाता है क्योंकि यह मुक्त फैटी एसिड जैसे प्राकृतिक अनकपलर्स को हटाकर माइटोकॉन्ड्रियल गुणों में सुधार करता है। बीएसए को मस्तिष्क माइटोकॉन्ड्रिया 7 में सब्सट्रेट्स, विशेष रूप से सक्सिनेट की ऑक्सीकरण दर में वृद्धि करके एंटीऑक्सिडेंट गतिविधि पाई गई है। वैकल्पिक रूप से, गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन को कम महंगे एसिड-मुक्त एनालॉग्स जैसे कि ओवम्ब्यूमिन द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है।
  3. EDTA के 0.011 ग्राम (0.2 mM EDTA की अंतिम एकाग्रता या 150 mM स्टॉक EDTA समाधान के 150 μL का उपयोग करें 150 mL resuspension buffer), 12.836 g सुक्रोज (0.25 M सुक्रोज अंतिम एकाग्रता), और Tris के 0.236 g (10 mM Tris-HCl अंतिम) के 150 mL के संयोजन से resuspension बफर के 150 mL तैयार करें। 0.1 N NaOH के साथ 7.8 करने के लिए पीएच समायोजित करें। उपयोग करने से ठीक पहले प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल के 60 μL जोड़ें।
  4. 1 mM HCl (ट्रिप्सिन / एमएल फाइनल के 2.5 मिलीग्राम) के 3.0 मिलीलीटर में 7.5 मिलीग्राम ट्रिप्सिन को भंग करके ट्रिप्सिन समाधान तैयार करें। यह राशि एक नमूने के लिए पर्याप्त है।
    नोट:: संसाधित करने के लिए योजनाबद्ध ऊतक नमूनों की संख्या के आधार पर ट्रिप्सिन समाधान तैयार करें।
  5. सोयाबीन से ट्रिप्सिन अवरोधक समाधान तैयार करें, जिसमें बीएसए (ट्रिप्सिन अवरोधक अंतिम के 0.65 मिलीग्राम / एमएल) युक्त अलगाव बफर के 20 मिलीलीटर में ट्रिप्सिन अवरोधक के 13.0 मिलीग्राम के संयोजन से।
    नोट: एक ताजा ट्रिप्सिन अवरोधक समाधान तैयार करें।
  6. 1 मिलीलीटर पानी (10% अमोनियम परसल्फेट फाइनल) में 0.1 ग्राम अमोनियम परसल्फेट जोड़कर अमोनियम परसल्फेट अभिकर्मक तैयार करें।
    नोट: अमोनियम persulfate अभिकर्मक या तो ताजा तैयार किया जाना चाहिए या एक बड़ी मात्रा में एलीकोट किया जा सकता है और एक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रखा जा सकता है।
  7. एमिनोकैप्रोइक एसिड समाधान (एसीए) को अल्ट्रा-शुद्ध पानी के 1.0 मिलीलीटर में 6-एमिनो कैप्रोइक एसिड के 0.131 ग्राम के संयोजन से तैयार करें और इसे 4 डिग्री सेल्सियस (1 एम 6-एमिनोकैप्रोइक एसिड अंतिम) में स्टोर करें।
  8. कूमासी शानदार नीले डाई समाधान को 0.5 मिलीलीटर पानी में कूमासी जी -250 के 1 ग्राम को भंग करके तैयार करें, और 1 एम एमिनोकैप्रोइक एसिड (10% डाई समाधान अंतिम एकाग्रता) के 0.5 मिलीलीटर।
  9. ब्लू नेटिव-पेज (BN-PAGE) के लिए 5% Digitonin तैयार करें। लगभग गणना करें कि नमूना तैयारी में कितना डिजिटोनिन की आवश्यकता है और साथ ही पिपेटिंग त्रुटियों को ऑफसेट करने के लिए कुछ अतिरिक्त मात्रा (10 मिलीग्राम से अधिक महत्व)। 15 मिलीग्राम के लिए: सबसे पहले, 100% डीएमएसओ के 30 μL में 15 मिलीग्राम डिजिटोनिन को पतला करें। भंवर डिजिटोनिन को समाधान में लाने में मदद करने के लिए। इसके बाद, ddH2O (270 μL) का शेष 90% जोड़ें। समाधान (भंवर) को मिलाने के लिए धीरे से गर्म करें, और फिर इसे बर्फ पर ठंडा करें।
  10. मूल पृष्ठ एनोड बफ़र तैयार करें. 1 L की अंतिम मात्रा बनाने के लिए 950 mL पानी के लिए बफ़र चल रहे 20x मूल पृष्ठ के 50 mL जोड़ें। तत्काल उपयोग के लिए ताजा एनोड बफ़र तैयार करें। इसे 1x चल रहे बफ़र के रूप में उपयोग करें.
  11. एक गहरे नीले कैथोड बफर तैयार करें। मूल पृष्ठ एनोड बफर के 80 मिलीलीटर में Coomassie शानदार नीले जी-250 के 0.0160 ग्राम भंग; अच्छी तरह से मिलाएं।
    नोट: तत्काल उपयोग के लिए ताजा कैथोड बफ़र तैयार करें। केवल 60 एमएल की आवश्यकता हो सकती है लेकिन किसी भी लीक की स्थिति में एक अतिरिक्त 20 एमएल बनाएं।
  12. हल्के नीले कैथोड बफर तैयार करें। देशी पृष्ठ एनोड बफर के 180 मिलीलीटर में गहरे नीले कैथोड बफर के 20 मिलीलीटर जोड़ें और अच्छी तरह से मिश्रण करें।
    नोट:: इस बफ़र का उपयोग केवल एक बार किया जा सकता है।
  13. एक नमूना additive के रूप में 5% Coomassie G-250 तैयार करें। 10% Coomassie स्टॉक के 200 μL को पतला करें (चरण 1.8) 1 M ACA के 200 μL के साथ और 4 °C पर स्टोर करें।
  14. 40% ग्लिसरॉल, 0.04% पोंसेउ एस, 25 mM Tris-HCl (pH 6.8), 192 mM ग्लाइसिन के संयोजन से 4x देशी पेज नमूना बफर तैयार करें अंतिम मात्रा के 10 mL में। उन्हें एलीकोट करें और फ्रीजर में -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. जमे हुए दिल के ऊतकों से माइटोकॉन्ड्रिया अलगाव

नोट: एक 4 डिग्री सेल्सियस ठंडे कमरे में माइटोकॉन्ड्रिया अलगाव प्रक्रिया निष्पादित करें। हालांकि, ठंडे कमरे की अनुपलब्धता के मामले में, प्रक्रिया को पूरा करने के लिए एक बड़े आकार के बर्फ स्नान का उपयोग करें।

  1. -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से पहले जमे हुए दिल के ऊतकों के नमूने निकालें।
    नोट: किसी दिए गए दिन में माइटोकॉन्ड्रिया अलगाव के लिए अधिकतम चार ऊतक नमूनों को आराम से संसाधित किया जा सकता है।
  2. हृदय ऊतक के नमूने वाली ट्यूब का वजन करें और वजन रिकॉर्ड करें। तीन बीकर (प्रत्येक 50 मिलीलीटर) तैयार करें जिसमें 40 एमएल वॉशिंग बफर शामिल हैं। अगले चरण पर जाने से पहले 3-5 मिनट के लिए मिश्रित बर्फ और नमक की समान मात्रा के साथ बर्फ-नमक स्नान में प्रत्येक बीकर को ठंडा करें। प्रत्येक बीकर में चुंबकीय सरगर्मी सलाखों रखो और मध्यम गति के लिए हलचल सेट करें।
    नोट: बीकरों को ओवर-फ्रीज न करें और बर्फ क्रिस्टल के बादलों के दिखाई देने के तुरंत बाद उनका उपयोग करें।
  3. जमे हुए दिल के ऊतकों को सीधे पहले बीकर में बर्फ-ठंडे समाधान में रखें। लगभग 5 मिनट प्रतीक्षा करें, जबकि सरगर्मी और चिमटी का उपयोग करके ऊतक पर थोड़ा दबाव लागू करने के लिए जितना संभव हो उतना रक्त बाहर निकलना।
  4. खाली ट्यूब का वजन करें और दिल के ऊतकों का शुद्ध वजन प्राप्त करने के लिए मूल वजन (चरण 2.2) से घटाएं।
  5. संदंश के साथ ऊतक को बाहर निकालें और रक्त को हटाने के लिए फिल्टर पेपर के एक साफ पेपर तौलिया के साथ दिल को निचोड़ें। फिर, ऊतक को दूसरे बीकर में रखें। अतिरिक्त रक्त को हटाने के लिए सरगर्मी करते समय लगभग 5 मिनट प्रतीक्षा करें।
  6. एक कागज तौलिया पर ऊतक को धीरे से सुखाएं। सभी वसा, थक्के वाले रक्त, ऑरिकल्स और प्रावरणी (सफेद ऊतक) को हटा दें। फिर, वेंट्रिकुलर ऊतक पूल करें।
  7. 2.7.1-2.7.9 चरणों का पालन करके श्रेडर का उपयोग करके ऊतक के नमूनों को काट दें।
    1. राम की ओर से ऊतक श्रेडर कक्ष में हृदय ऊतक (~ 50-300 मिलीग्राम) रखें।

Figure 1
चित्रा 1: श्रेडर के साथ उपयोग के लिए ऊतक श्रेडर कक्ष (ट्यूब)। श्रेडर ट्यूब में ऊतक समरूपता के लिए प्रति ऊतक नमूने के बारे में 10-12 सेकंड की आवश्यकता होती है। ऊतक homogenization पूरा हो जाता है एक बार homogenized ऊतक ऊपरी कक्ष में छिद्रित डिस्क के माध्यम से गुजरता है. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

  1. ट्यूब के कैप पक्ष के लिए धोने बफर के ~ 0.2-0.8 mL जोड़ें।
    नोट:: सुनिश्चित करें कि नमूना की कुल मात्रा और shredding के दौरान संयुक्त वाशिंग बफ़र 0.7-0.8 mL से अधिक नहीं है।
  2. श्रेडर कैप snugly के साथ श्रेडर कक्ष टोपी टोपी करने के लिए ट्यूब उपकरण का उपयोग करें।
    नोट: श्रेडर कैप को कसने पर मत करो।
  3. श्रेडर कक्ष को राम पक्ष के नीचे के साथ श्रेडर धारक इकाई में रखें। राम श्रेडर धारक में एक फिटिंग संलग्न करेगा।
  4. श्रेडर ड्राइवर का बिट सम्मिलित करें; थोड़ा श्रेडर टोपी के साथ संलग्न करते हैं. सुनिश्चित करें कि बिट snugly जगह में बंद कर दिया गया है।
    नोट:: हमेशा पूरी तरह से चार्ज श्रेडर ड्राइवर का उपयोग करें।
  5. मैन्युअल रूप से श्रेडर ड्राइवर और श्रेडर चैंबर के लिए नीचे की ओर दबाव लागू करें जब तक कि श्रेडर धारक पर दबाव संकेतक श्रेडर धारक पर लगभग 2 की सेटिंग तक नहीं पहुंच जाता।
    नोट: सेटिंग एक उच्च स्तर पर हो सकता है यदि कटान ऊतक अधिक रेशेदार है।
  6. 2 पर सेटिंग बनाए रखते हुए, श्रेडर ड्राइवर के ट्रिगर को दबाकर लगभग 10-12 सेकंड के लिए श्रेडर ड्राइवर चलाएँ।
  7. ट्यूब को देखें कि क्या ऊतक के सभी या अधिकांश ठोस द्रव्यमान को लाइसिस डिस्क के माध्यम से कटा हुआ है और ट्यूब को देखकर श्रेडर कक्ष के ऊपरी कक्ष में पारित किया गया है।
    नोट: एक लंबी अवधि के लिए ऊतक के नमूने को काटना आवश्यक हो सकता है। बस श्रेडर धारक को ट्यूब वापस करें और प्रक्रिया जारी रखें। अधिकांश प्रकार के ऊतकों के नमूनों को केवल 10-12 सेकंड के श्रेडिंग की आवश्यकता होती है। जबकि सभी श्रेडिंग घर्षण के कारण कुछ गर्मी का उत्पादन करेंगे, यह छोटा प्रसंस्करण समय नमूने को काफी गर्म नहीं करेगा।
  8. नमूने को काटने के बाद, श्रेडर कक्ष को धारक इकाई से बाहर उठाएं। श्रेडर कैप को हटाने के लिए ट्यूब टूल का उपयोग करें और बाद में उपयोग के लिए इसे एक साफ सतह पर रखें।
    नोट: श्रेडर कैप को नमूना निकालने के साथ दूषित माना जाना चाहिए, और नमूना प्रकार के आधार पर, संक्रामक सामग्री से दूषित हो सकता है। क्रॉस-संदूषण को रोकने के लिए किसी भी अन्य ऊतक के नमूनों के लिए एक ही श्रेडर कैप का उपयोग न करें।
  1. वाशिंग बफर और हलचल बार के 40 मिलीलीटर के साथ तीसरे बीकर में कटा हुआ दिल के ऊतकों को स्थानांतरित करें और हलचल प्लेट पर रहते हुए मध्यम गति से 5 मिनट के लिए ऊतक को हिलाएं।
  2. एक नायलॉन जाल monofilament (74 μm ताकना आकार) के माध्यम से निलंबन फ़िल्टर और फिल्टर त्याग. वाशिंग बफर के 10 मिलीलीटर के साथ फिल्टर 3x पर कटा हुआ ऊतक धोएं।
    नोट: सुनिश्चित करें कि नायलॉन जाल monofilament पूर्व पानी के साथ गीला है.
  3. धोया और कटा हुआ ऊतक 20 मिलीलीटर धोने के बफर के साथ एक 50 मिलीलीटर बीकर में स्थानांतरित करें और बीकर को चुंबकीय हलचल पर बर्फ के स्नान में रखें। 15 मिनट के लिए लगातार हिलाते हुए ट्रिप्सिन समाधान के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें। इनक्यूबेशन के माध्यम से लगभग आधे रास्ते (लगभग 7.5 मिनट पर), ऊतक निलंबन को एक ढीले फिट हैंडहेल्ड ग्लास-ऑन-ग्लास होमोजेनाइज़र में स्थानांतरित करें जो 0-15 मिलीलीटर मात्रा रखेगा।

Figure 1
चित्रा 1: श्रेडर के साथ उपयोग के लिए ऊतक श्रेडर कक्ष (ट्यूब)। श्रेडर ट्यूब में ऊतक समरूपता के लिए प्रति ऊतक नमूने के बारे में 10-12 सेकंड की आवश्यकता होती है। ऊतक homogenization पूरा हो जाता है एक बार homogenized ऊतक ऊपरी कक्ष में छिद्रित डिस्क के माध्यम से गुजरता है. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

  1. धीरे से 4-5 स्ट्रोक के साथ homogenize झाग का उत्पादन किए बिना निलंबन को तितर-बितर करने के लिए। होमोजेनेट को 50 एमएल बीकर में रखें और धीरे से 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए एक सरगर्मी प्लेट पर मिलाएं।
  2. इनक्यूबेशन के 15 मिनट के बाद, अलगाव बफर के 10 मिलीलीटर जोड़ें जिसमें ट्रिप्सिन अवरोधक को बीकर में होमोजेनेट युक्त किया जाता है और धीरे-धीरे सरगर्मी करते हुए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया जाता है।
  3. एक नायलॉन फिल्टर के माध्यम से निलंबन फिर से फ़िल्टर करें और एक 50 मिली शंक्वाकार ट्यूब में फिल्टर को बचाने के लिए।
  4. नायलॉन फिल्टर पर छोड़ दिया कण अंश ले लीजिए और यह ग्लास पर ग्लास homogenizer में जगह. वाशिंग बफर के 15-20 मिलीलीटर जोड़ें और 25-30 सेकंड के लिए हाथ से धीरे-धीरे homogenize करें।
    नोट:: फ़िल्टर इस चरण में बहुत धीरे-धीरे बहता है। फिल्टर प्रवाह को बढ़ाने के लिए, फनल टिप को शंक्वाकार ट्यूब के अंदर को छूने के लिए रखें।
  5. फिल्टर के साथ homogenate गठबंधन, ट्यूबों संतुलन, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 600 x g पर सेंट्रीफ्यूज.
  6. गोली द्वारा संदूषण से बचने के लिए एक नायलॉन फिल्टर का उपयोग कर एक नई शंक्वाकार ट्यूब में परिणामी supernatant फ़िल्टर। 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 8,500 x g पर सेंट्रीफ्यूज को फिर से चलाएं।
    नोट: supernatant को हटाने के लिए एक प्लास्टिक स्थानांतरण पिपेट का उपयोग करें और शराबी गोली के शीर्ष से supernatant के 0.2 mL बलिदान।
  7. supernatant त्यागें और अलगाव बफर के 1 मिलीलीटर के साथ छर्रे 2-3 बार कुल्ला। हर बार शराबी सफेद बाहरी रिम परत को त्यागना सुनिश्चित करें।
    नोट:: 1 mL टिप, या एक नया स्थानांतरण पिपेट के साथ एक पिपेट का उपयोग कर अलगाव बफ़र जोड़कर गोली धोएं। ट्यूब के पक्ष में बफर जोड़ें, सीधे गोली पर नहीं, गोली को तोड़ने से रोकने के लिए और supernatant के संदूषण को रोकने के लिए। अगला, एक हस्तांतरण पिपेट के साथ बफर aspirate और दो और बार प्रक्रिया को दोहराने.
  8. प्रत्येक ट्यूब के लिए अलगाव बफर के 5 मिलीलीटर जोड़ें और एक 1 एमएल टिप, या एक नया हस्तांतरण पिपेट के साथ एक पिपेट का उपयोग करके गोली को तोड़ दें।
  9. अतिरिक्त अलगाव बफर के 20 मिलीलीटर के साथ निलंबन को पतला करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 8,500 x g पर फिर से सेंट्रीफ्यूज चलाएं।
  10. supernatant को त्यागें और resuspending बफर के 5 mL में गोली resuspendd. फिर, कुल 20 मिलीलीटर के लिए बफर का 15 एमएल अधिक जोड़ें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 8,500 x जी पर सेंट्रीफ्यूज करें। supernatant को छोड़ दें। परिणामी भूरे रंग के छर्रे में धुला हुआ बरकरार माइटोकॉन्ड्रिया होता है।
  11. प्रोटीज अवरोधकों सहित resuspending बफर के 250 μL में माइटोकॉन्ड्रिया-समृद्ध गोली resuspendd. 25 μL में एलीकोट, तरल नाइट्रोजन में त्वरित फ्रीज, और कई वर्षों के लिए एक -80 डिग्री सेल्सियस गहरे फ्रीजर में स्टोर।
    नोट: प्रोटीन विश्लेषण परख के लिए माइटोकॉन्ड्रिया-समृद्ध तैयारी के 5 μL अतिरिक्त. एक BN-PAGE (ब्लू नेटिव-पेज) अध्ययन के लिए, प्रति ट्यूब माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन के 50 μg में पुन: निलंबित गोली को एलीकोट करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 8,500 x g पर सेंट्रीफ्यूज। सावधानी से supernatant aspirate और माइटोकॉन्ड्रियल गोली (50 μg प्रोटीन /

3. माइटोकॉन्ड्रियल इलेक्ट्रॉन स्थानांतरण परिसर (ईटीसी) मूल्यांकन

नोट: व्यक्तिगत माइटोकॉन्ड्रियल ETC प्रोटीन (यानी, कॉम्प्लेक्स-I, II, III, IV, V) का मूल्यांकन मानक immunoblotting परख द्वारा किया जा सकता है। नमूनों की विविधता (चार समय बिंदु: 48 घंटे, 3 महीने, 6 महीने, 9 महीने), दो प्रयोगात्मक स्थितियों (व्यायाम और गतिहीन), और कई इम्यूनोप्रोबिंग एंटीबॉडी (पांच एंटीबॉडी) के कारण, एक मल्टीप्लेक्स्ड इम्युनोब्लॉटिंग की सिफारिश की जाती है। मल्टीप्लेक्स्ड इम्युनोब्लॉटिंग निम्नानुसार करें।

  1. माइटोकॉन्ड्रिया समृद्ध प्रोटीन नमूना के 50 μg को हल / अच्छी तरह से 4% -20% ग्रेडिएंट polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन (100 V, 90 मिनट) में।
  2. प्रोटीन को एक PVDF झिल्ली पर स्थानांतरित करें (75 V; 60 मिनट)
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 1 घंटे के लिए एक अवरुद्ध बफर समाधान में झिल्ली को ब्लॉक करें।
    नोट: ब्लॉकिंग समय को 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर तक बढ़ाया जा सकता है। अवरुद्ध बफर (सामग्री की तालिका) में गैर-स्तनधारी तत्व (यानी, मछली प्रोटीन) होते हैं जो एंटीबॉडी के साथ-साथ विशिष्ट तरीकों में मौजूद अन्य स्तनधारी प्रोटीन के साथ विशिष्ट बाध्यकारी बातचीत होने की संभावना कम होती है।
  4. एंटी-कॉम्प्लेक्स-I, II, III, IV, V एंटीबॉडी सहित एंटीबॉडी कॉकटेल के साथ झिल्ली की जांच करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर एक कक्षीय शेकर पर रात भर इनक्यूबेट करें।
  5. अगले दिन, झिल्ली को धोएं और आरटी (कमरे के तापमान) पर एक कक्षीय शेकर पर 2 घंटे के लिए आईआर-टैग किए गए माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ जांच करें।
  6. 1x TBS-T (Tween 20 युक्त TBS) के साथ पांच बार धोएं, और एक बार 1x TBS (Tris bufferedsaline) के साथ।
    नोट:: अंतिम धोने के लिए, TBS बफ़र में डिटर्जेंट शामिल न करें।
  7. छवि एक छवि विश्लेषक में धब्बा.

4. ब्लू मूल पॉली एक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (BN-पृष्ठ) द्वारा माइटोकॉन्ड्रिया सुपरकॉम्प्लेक्स मूल्यांकन

नोट: ईटीसी की एक सुपरकॉम्प्लेक्स प्रोफ़ाइल का मूल्यांकन बीएन-पेज तकनीक को नियोजित करके भी किया जा सकता है।

  1. 20 μL प्रति 50 μg माइटोकॉन्ड्रिया-समृद्ध गोली प्रोटीन के लिए नमूना बफर कॉकटेल तैयार करें (पानी के 7 μL + 4x देशी polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन नमूना लोड िंग बफर के 5 μL + 5% Digitonin के 8 μL + Coomassie G-250 के 2 μL)।
    नोट: उपलब्ध नमूनों की संख्या के आधार पर एक स्टॉक नमूना बफर कॉकटेल (50 μg प्रोटीन / माइटोकॉन्ड्रिया-समृद्ध गोली (तालिका 1) 8 की प्रोटीन एकाग्रता के आधार पर उपयुक्त डिजिटोनिन मात्रा चुनें।
  2. 3 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर डिजिटोनिन स्टॉक को गर्म करें, मास्टर मिश्रण बनाने से पहले बर्फ पर मिलाएं, और ठंडा करें।
  3. जेल में नमूनों को लोड करने से पहले Coomassie G-250 नमूना additive जोड़ें।
  4. एक ट्यूब है कि माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन गोली के 50 μg होते हैं में नमूना बफर कॉकटेल के 20 μL जोड़ें. सोल्यूबिलाइज़ / पेग उत्पन्न किए बिना एक पिपेट के साथ गोली को धीरे से मिलाकर गोली को फिर से निलंबित करें।
  5. माइटोकॉन्ड्रिया-समृद्ध गोली के अधिकतम घुलनशीलता को प्राप्त करने के लिए 20 मिनट के लिए बर्फ पर मिश्रण को इनक्यूबेट करें। समय-समय पर, घुलनशीलता को बढ़ाने के लिए ट्यूबों को धीरे से फ्लिक करें।
  6. इनक्यूबेशन की प्रतीक्षा करते समय, मूल पृष्ठ एनोड बफर/1x चल रहे बफर और गहरे नीले रंग के कैथोड बफर को तैयार करें।
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 20,000 x g पर घुलनशील माइटोकॉन्ड्रिया-समृद्ध गोली को सेंट्रीफ्यूज करें।
  8. centrifugation के बाद, बर्फ पर रखी नई ट्यूबों में supernatant के 15 μL इकट्ठा।
  9. चरण 4.8 में प्राप्त supernatant के लिए 5% Coomassie G-250 अभिकर्मक की उपयुक्त राशि जोड़ें ( तालिका 1 देखें)।
    नोट: 5% Coomassie G-250 मात्रा ऐसी होनी चाहिए कि डाई की अंतिम एकाग्रता 1/4 डिटर्जेंट एकाग्रता है। जेल में नमूनों को लोड करने से ठीक पहले इस चरण को निष्पादित करें।
प्रोटीन डिजिटोनिन/प्रोटीन 4x नमूना बफ़र 5% डिजिटोनिन पानी अंतिम वॉल्यूम 5% Coomassie G-250
अनुपात (g/g) प्रतिदर्श योज्य
50 μg 8 5 8 7 20 2
50 μg 4 5 4 11 20 1

तालिका 1: नमूना बफर कॉकटेल दो अलग अलग डिटर्जेंट / प्रोटीन अनुपात के साथ तैयारी। माइटोकॉन्ड्रियल निलंबन से झिल्ली प्रोटीन के अधिकतम घुलनशीलता को प्राप्त करने के लिए, डिजिटोनिन / माइटोकॉन्ड्रियल निलंबन प्रोटीन एकाग्रता को प्रोटीन के 4-8 ग्राम डिजिटोनिन / जी के बीच समायोजित किया जाना चाहिए। हृदय के ऊतकों में, माइटोकॉन्ड्रियल निलंबन प्रोटीन के 50 μg के लिए 400 μg digitonin (यानी, माइटोकॉन्ड्रिया प्रोटीन के 8 g digitonin / g) का उपयोग माइटोकॉन्ड्रिया निलंबन से सुपरकॉम्प्लेक्स की घुलनशीलता को अधिकतम करने के लिए किया गया था।

  1. एक 3% -8% ग्रेडिएंट जेल डालें, कंघी को हटा दें, और जेल के कुओं को 1x चलने वाले बफर के साथ तीन बार धो लें।
    नोट: जेल सबसे अच्छा polymerizes अगर एक दिन पहले डाला.
  2. वैद्युतकणसंचलन प्रणाली स्थापित करें और जेल को उपकरण में रखें।
  3. गहरे नीले रंग के कैथोड बफर के साथ नमूना कुओं को भरें।
  4. जेल के पहले और अंतिम कुएं पर एक देशी आणविक वजन मार्कर के रूप में unstained प्रोटीन मानक के 10 μL लोड करें।
  5. एक फ्लैट-हेड जेल-लोडिंग टिप का उपयोग करके कुओं में ऊपर दिए गए चरण 4.9 में तैयार किए गए नमूना supernatant + Coomassie नमूना additive की पूरी राशि लोड करें।
  6. कुओं में नमूनों को परेशान किए बिना लगभग 60 मिलीलीटर गहरे नीले रंग के कैथोड बफर के साथ मिनी सेल बफर बांध को ध्यान से भरें, और फिर बफर टैंक को देशी पेज 1x चल रहे बफर के साथ भरें।
  7. बिजली की आपूर्ति को चालू करें और लगभग 30 मिनट के लिए 150 वी पर नमूनों को इलेक्ट्रोफोरीज करें।
  8. एक स्थानांतरण पिपेट या नमूना कुओं aspirate के साथ बफर बांध (आंतरिक कक्ष) से गहरे नीले रंग कैथोड बफर निकालें। हल्के नीले रंग के कैथोड बफर के 150-200 मिलीलीटर के साथ आंतरिक कक्ष को भरें और 60 मिनट के लिए 250 वी पर वैद्युतकणसंचलन चलाएं।
    नोट: वैद्युतकणसंचलन समय की जाँच करके निर्धारित किया जा सकता है जब डाई सामने जेल कैसेट के नीचे से सिर्फ 0.5 सेमी ऊपर माइग्रेट करता है।
  9. जेल को कैसेट से निकालें और इसे एक साफ प्लास्टिक कंटेनर में रखें। एक रॉकर / कक्षीय शेकर पर 15 मिनट के लिए अच्छी गुणवत्ता वाले आसुत पानी के साथ जेल को धोएं।
    नोट: कैसेट से ग्रेडिएंट जेल को हटाने के लिए, टूटने की संभावना को कम करने के लिए नीचे से कैसेट को संभालें, जो मजबूत है।
  10. पानी डालें, कूमासी जेलकोड ब्लू स्टेन अभिकर्मक की पर्याप्त मात्रा में जेल को विसर्जित करें, और कमरे के तापमान पर एक कक्षीय / रॉकर पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: धीरे से बोतल कई बार घुमाकर उपयोग करने से पहले ब्लू दाग अभिकर्मक (सामग्री की तालिका) समाधान मिश्रण।
  11. डाई समाधान decant, आसुत पानी जोड़ें, पानी के साथ कई बार कुल्ला, और फिर destaining के लिए कक्षीय / रॉकर पर डाल दिया।
    नोट: स्पंज का एक टुकड़ा डालें (~ 3 सेमी x 0.5 सेमी) जेल destaining कंटेनर में और रात भर destaining के लिए जेल छोड़ दें। स्पंज कई पानी परिवर्तनों की आवश्यकता के बिना डाई कणों adsorbs.
  12. एक छवि विश्लेषक में जेल का विश्लेषण करें।

5. माइटोकॉन्ड्रिया immunoblot धब्बा विश्लेषण द्वारा सुपरकॉम्प्लेक्स मूल्यांकन

  1. वैद्युतकणसंचलन के अंत में जेल को धुंधला किए बिना बीएन-पेज का एक नया सेट करें।
  2. इम्यूनोब्लॉटिंग को पूरा करने के लिए अनुभाग 3 (माइटोकॉन्ड्रियल इलेक्ट्रॉन ट्रांसफर कॉम्प्लेक्स (ईटीसी) मूल्यांकन) के समान प्रक्रिया का पालन करें।

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Representative Results

प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, हृदय के ऊतकों से माइटोकॉन्ड्रिया-समृद्ध प्रोटीन मिश्रण की एक अच्छी उपज तैयार की गई थी। माइटोकॉन्ड्रिया-समृद्ध प्रोटीन मिश्रण का लगभग 15 मिलीग्राम / एमएल बोने की संतानों से काटे गए औसतन 1.2 ग्राम जमे हुए हृदय ऊतक से प्राप्त किया गया था। टिप्पणियों से संकेत मिलता है कि 0.5 ग्राम से कम जमे हुए हृदय ऊतक ने बीएन-पेज परख करने के लिए पर्याप्त मात्रा में माइटोकॉन्ड्रियल-समृद्ध प्रोटीन मिश्रण नहीं दिया। माइटोकॉन्ड्रियल तैयारी की मात्रा (i) व्यक्तिगत इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण परिसरों (ईटीसी) (यानी, कॉम्प्लेक्स-I, II, III, IV, और कॉम्प्लेक्स-V) का आकलन करने के लिए एक मानक इम्यूनोब्लॉट विश्लेषण करने के लिए पर्याप्त थी, (ii) बीएन-पेज और इम्युनोब्लॉट विश्लेषण द्वारा एक माइटोकॉन्ड्रियल सुपरकॉम्प्लेक्स मूल्यांकन, और (iii) चयनित परिसर के लिए सीमित एंजाइमेटिक एसेस। व्यक्तिगत ईटीसी प्रोटीन परिसरों के खिलाफ उठाए गए एंटीबॉडी का कॉकटेल तकनीकी व्यवहार्यता प्रदान करता है कि प्रत्येक एंटीबॉडी एक एकल इम्युनोब्लॉट परख में अपने स्वयं के लक्ष्य प्रोटीन को पहचान लेगा।

माइटोकॉन्ड्रिया-समृद्ध प्रोटीन को हृदय के बाएं वेंट्रिकल से तैयार किया गया था, जो बोने की संतानों से प्राप्त होता है। संतानों का जन्म बोने के दो समूहों में हुआ था: (1) गर्भावस्था के दौरान एक समूह का अभ्यास किया गया था और (2) एक समूह गतिहीन था। दोनों समूहों के दिल के ऊतकों को जन्म के बाद अलग-अलग समय बिंदुओं पर काटा गया था (48 घंटे, 3 महीने, 6 महीने और 9 महीने)। क्या मातृ व्यायाम का गर्भावस्था के दौरान संतानों के माइटोकॉन्ड्रियल ईटीसी पर सकारात्मक प्रभाव पड़ता है, यह परिकल्पना थी जिसका इस अध्ययन में परीक्षण किया गया था। लंबे माइटोकॉन्ड्रिया-समृद्ध अलगाव प्रक्रिया के कारण किसी भी दिन चार दिल के ऊतकों को आराम से संसाधित किया गया था।

Figure 2
चित्रा 2: संतान हृदय ऊतक से माइटोकॉन्ड्रियल ईटीसी परिसरों की इम्यूनोब्लॉट प्रोफ़ाइल। माइटोकॉन्ड्रियल-समृद्ध प्रोटीन मिश्रण को कम करने वाली स्थितियों के तहत 4% -20% ग्रेडिएंट जेल में हल किया गया था। प्रोटीन को एक वाणिज्यिक एंटीबॉडी कॉकटेल द्वारा immunoprobed किया गया था, और एंटी-VDAC एंटीबॉडी का उपयोग लोडिंग नियंत्रण (लाल रंग बैंड) के लिए किया गया था। एंटीबॉडी का कॉकटेल गोजातीय हृदय परिसर-I (एंटीजन NDUFB8), गोजातीय हृदय परिसर-II (एंटीजन C-II30 (FeS), गोजातीय हृदय परिसर II, III (एंटीजन C-III-कोर 2), मानव कॉम्प्लेक्स IV, सबयूनिट II (एंटीजन C-IV-II), और गोजातीय हृदय परिसर-V (एंटीजन C-V-α) के खिलाफ उठाया गया था। द्वितीयक एंटीबॉडी को एक अवरक्त टैग के साथ लेबल किया गया था, और छवि का विश्लेषण एक छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके किया गया था। आयु समूहों में अलग-अलग जटिल प्रोफाइल पूरक चित्र 1 (ए-ई) में प्रदान किए गए हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा 2 एक ठेठ ETC प्रोटीन प्रोफ़ाइल का प्रतिनिधित्व करता है। एक मल्टीप्लेक्स प्रारूप में immunoblotting के लिए एंटीबॉडी कॉकटेल की अनुमति दी. प्रत्येक एंटीबॉडी ने अपने स्वयं के लक्ष्य प्रोटीन को पहचाना, एक स्वीकार्य संकल्प प्रदान किया। प्रोटीन बैंड तीव्रता का डिजिटल विश्लेषण किया गया था। व्यायाम बोने की संतानों से प्राप्त ऊतकों ने कुछ ईटीसी परिसरों (पूरक आंकड़े 1 ए-ई) में अपेक्षाकृत कम स्तर प्रस्तुत किया। माइटोकॉन्ड्रिया-समृद्ध तैयारी को एक ग्रेडिएंट जेल (4% -20%) में हल किया जाना चाहिए क्योंकि इम्युनोप्रोबिंग को मल्टीप्लेक्सिंग प्रारूप में किया गया था। यह दृष्टिकोण एसडीएस / पेज जैल और रन-टू-रन परिवर्तनशीलता के कई निश्चित प्रतिशत चलाने की आवश्यकता को समाप्त कर देगा।

माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन को 3% -8% ग्रेडिएंट बीएन-पेज (चित्रा 3 ए) में हल किया गया था और एंटीबॉडी कॉकटेल के साथ इम्यूनोप्रोबेड किया गया था। दोनों व्यायाम और गतिहीन समूहों में, कई सुपरकॉम्पलेक्स गठन देखा गया था (चित्रा 3 बी)।

Figure 3
चित्रा 3: ब्लू-नेटिव पॉलीएक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (बीएन-पेज) द्वारा माइटोकॉन्ड्रियल सुपरकॉम्प्लेक्स प्रोफ़ाइल। माइटोकॉन्ड्रियल-समृद्ध प्रोटीन मिश्रण को 3% -8% बीएन-पेज में हल किया गया था, और एक कूमासी ब्लू अभिकर्मक (जेल कोड, ब्लू स्टेन अभिकर्मक) के साथ दाग दिया गया था। माइटोकॉन्ड्रियल-समृद्ध प्रोटीन मिश्रण को 3% -8% बीएन-पेज में हल किया गया था, जिसे पीवीडीएफ झिल्ली पर स्थानांतरित किया गया था, और सुपरकॉम्प्लेक्स के लिए एंटीबॉडी कॉकटेल के साथ इम्यूनोप्रोबेड किया गया था। दोनों assays में, प्रोटीन लोड 150 μg / अच्छी तरह से था। तैयारी के दौरान अपर्याप्त प्रोटीन उपज के कारण 6 महीने का डेटा संग्रह बिंदु शामिल नहीं किया गया था। सबसे प्रमुख सुपरकॉम्प्लेक्स वृद्धि गतिहीन समूह की तुलना में अभ्यास किए गए समूह में 9 महीने में देखी गई थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

एक अलग ग्रेडिएंट जेल प्रारूप (3%-8%) सुपरकॉम्प्लेक्स के बड़े आकार के कारण तैयार किया गया था जिसे बीएन-पेज में हल किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में वर्णित माइटोकॉन्ड्रिया-समृद्ध तैयारी का उपयोग माइटोकॉन्ड्रियल ईटीसी जटिल गतिविधियों को मापने के लिए किया गया था। चित्र4 जटिल I-II गतिविधि मूल्यांकन के लिए दर्ज किए गए डेटा का प्रतिनिधित्व करता है। इस परख स्थापित प्रोटोकॉल 3 के अनुसार किया गया था.

Figure 4
चित्रा 4: जटिल I-II गतिविधि माप। विभिन्न आयु समूहों (48 ज, 3 महीने, 6 महीने, और 9 महीने) से प्राप्त माइटोकॉन्ड्रिया-समृद्ध प्रोटीन मिश्रणों का विश्लेषण एक गतिज परख का उपयोग करके जटिल I-II गतिविधि के लिए किया गया था। व्यायाम किए गए समूह ने गतिहीन समूह की तुलना में एक बढ़ी हुई जटिल I-II गतिविधि दिखाई। दो समूहों के बीच का अंतर एक युग्मित टी-टेस्ट (पी > 0.05) के अनुसार सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण नहीं था। चित्र में दर्शाई गई त्रुटि पट्टियाँ n = 4 के लिए माध्य (SEM) की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 1: (ए) जटिल-मैं आयु समूहों में प्रोफ़ाइल. सामान्य तौर पर, व्यायाम बोने के लिए पैदा हुई संतानों को गतिहीन समूह (एन = 4) की तुलना में कॉम्प्लेक्स-I के निचले स्तर के साथ प्रस्तुत किया गया था। यह 9 महीने के समूह में अधिक स्पष्ट था। (बी) आयु समूहों में जटिल-II प्रोफाइल। सभी आयु समूहों ने तीन महीने के समूह (एन = 4) के अपवाद के साथ अभ्यास किए गए समूह में कॉम्प्लेक्स -II के निम्न स्तर को दिखाया। (ग) आयु समूहों में जटिल-III प्रोफाइल। केवल 9 महीने के आयु वर्ग ने गतिहीन समूह (एन = 4) की तुलना में अभ्यास किए गए समूह में कॉम्प्लेक्स -III के निचले स्तर को दिखाया। (घ) आयु समूहों में जटिल-IV प्रोफाइल। व्यायाम किए गए समूह के कॉम्प्लेक्स-IV प्रोटीन के स्तर में थोड़ी वृद्धि देखी गई (n = 4)। (ई) आयु समूहों में कॉम्प्लेक्स-वी (एटीपी सिंथेज़) प्रोफ़ाइल। दोनों व्यायाम और गतिहीन समूहों ने 48 एच डेटा बिंदु (एन = 4) को छोड़कर कॉम्प्लेक्स-वी के निम्न स्तर का प्रदर्शन किया। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल के लिए महत्वपूर्ण चरणों को यहां इंगित किया गया है। सबसे पहले, ऊतक समरूपता को सावधानीपूर्वक संभाला जाना चाहिए ताकि ऊतक समरूपता प्रक्रिया के दौरान अत्यधिक सरासर प्रभाव लागू न किया जा सके। एक ऊतक श्रेडर का उपयोग किया जाना चाहिए, जो प्रारंभिक ऊतक समरूपता 9 के लिए दबाव साइक्लिंग तकनीक (पीसीटी) का एक हिस्सा है। यह कदम ग्लास-ऑन-ग्लास होमोजेनाइज़र (चित्रा 1 बी) के अत्यधिक स्ट्रोक चक्र को कम कर देगा जो जमे हुए ऊतक की स्थिति के कारण पहले से ही नाजुक माइटोकॉन्ड्रिया को और नष्ट कर सकता है। दूसरा, जमे हुए ऊतक वजन माइटोकॉन्ड्रिया-समृद्ध तैयारी की पर्याप्त मात्रा में प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण होगा। अनुशंसित प्रारंभिक ऊतक राशि ऊतक के स्रोत के आधार पर 0.8 ग्राम से अधिक होगी। दिल के ऊतक माइटोकॉन्ड्रिया 10,11 में बहुत समृद्ध हैं; इसलिए, अनुशंसित राशि माइटोकॉन्ड्रिया-समृद्ध तैयारी प्राप्त करने के लिए पर्याप्त होगी। तीसरा, सभी प्रक्रियाओं को ठंडे कमरे में किया जाना चाहिए। यदि एक ठंडा कमरा उपलब्ध नहीं है, तो एक बड़े आकार का बर्फ स्नान पर्याप्त होगा।

पहले से जमे हुए दिल के ऊतकों से माइटोकॉन्ड्रिया-समृद्ध तैयारी प्राप्त करने की व्यवहार्यता को इस अध्ययन में प्रदर्शित किया गया है। यह प्रोटोकॉल संग्रहीत जमे हुए ऊतक तक पहुंच प्रदान करने के लिए आवश्यक होगा जिसमें से माइटोकॉन्ड्रिया को अलग किया जा सकता है और जिसमें से माइटोकॉन्ड्रियल ईटीसी एंजाइम परिसरों का आकलन किया जा सकता है। हाल के एक अध्ययन से पता चला है कि पहले जमे हुए ऊतकों और कोशिकाओं से माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन भी औसत दर्जे का हो सकता है2। इस प्रगति के कारण, जांचकर्ता आगे के विश्लेषण के लिए पहले से एकत्र किए गए बायोसैम्पल्स का उपयोग करने में सक्षम होंगे।

व्यक्तिगत ईटीसी और सुपरकॉम्प्लेक्स की प्रोफ़ाइल का आकलन करने के लिए एक मल्टीप्लेक्सिंग प्रारूप में शास्त्रीय इम्यूनोब्लॉटिंग का प्रदर्शन करके आसान बनाया जाता है जो एक ही पीवीडीएच झिल्ली पर इम्यूनोब्लॉटिंग प्रक्रिया के दौरान कई एंटीबॉडी का उपयोग करता है। उपयोगकर्ता के लिए एसडीएस-पेज और बीएन-पेज के लिए जैल में लोड किए जाने वाले प्रोटीन की मात्रा निर्धारित करना महत्वपूर्ण है। पुन: निलंबन मात्रा उच्च प्रोटीन सांद्रता प्राप्त करने के लिए जितना संभव हो उतना कम से कम होना चाहिए ताकि उपयोगकर्ता को नमूना लोडिंग वॉल्यूम के साथ कोई समस्या न हो। बीएन-पेज में लोड की जाने वाली प्रोटीन की मात्रा माइटोकॉन्ड्रिया-समृद्ध तैयारी की उपज पर निर्भर करती है। माइटोकॉन्ड्रिया-समृद्ध प्रोटीन मिश्रण का एक 150 μg मूल हृदय ऊतक की छोटी मात्रा के कारण बीएन-पेज में प्रति अच्छी तरह से लोड किया गया था। 50-150 μg माइटोकॉन्ड्रिया-समृद्ध गोली तैयारी 1 मिमी मोटी जेल के लिए पर्याप्त होगी। उपयोगकर्ता नमूना लोडिंग के लिए 1.5 मिमी मोटी जेल पसंद कर सकता है; हालांकि, प्रोटीन बैंड का संकल्प स्वीकार्य गुणवत्ता का नहीं हो सकता है। प्रति अच्छी तरह से कम माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन पुनर्सर्पेंस का परीक्षण नहीं किया गया था क्योंकि इम्यूनोब्लॉट एसेस में उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी कॉकटेल उनकी एकाग्रता में पूर्वनिर्धारित थे; हालांकि, उपयोगकर्ता सिग्नल / शोर दर को बढ़ाने के लिए अपने स्वयं के एंटीबॉडी कॉकटेल बना सकते हैं।

बीएन-पेज जैल के लिए एक पूरी तरह से पॉलिमराइज्ड ग्रेडिएंट जेल (3%-8%) की सिफारिश की जाती है। 3% -8% के ग्रेडिएंट जैल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं हैं; इसलिए, घर का बना ढाल (3%-8%) मानक मिनी जैल (9 x 6 सेमी) का उपयोग किया जा सकता है। जेल को 24 घंटे पहले डालना और जेल को आरटी में रातभर पोलीमराइज़ करने की अनुमति देना एक स्वीकार्य जेल गठन प्रदान करेगा। यदि किसी उपयोगकर्ता को सुपरकॉम्प्लेक्स के बेहतर पृथक्करण की आवश्यकता होती है, तो बड़े जेल प्रारूपों (या तो मिडी जेल 13.5 सेमी x 6.5 सेमी या लंबे जेल 28 सेमी x 16 सेमी) का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।

इस प्रोटोकॉल का अनुप्रयोग जांचकर्ताओं को माइटोकॉन्ड्रिया को अलग करने और पहले जमे हुए संग्रहीत ऊतकों में ईटीसी और सुपरकॉम्प्लेक्स की प्रोफ़ाइल का विश्लेषण करने की अनुमति देगा। सभी राष्ट्रीय और क्षेत्रीय biospecimen depositories biosamples अल्ट्रा-फ्रीजिंग स्थितियों (यानी, -80 डिग्री सेल्सियस) में रखते हैं। संस्थानों और दवा कंपनियों द्वारा बड़ी संख्या में ऊतकों को आगे के अध्ययन और अभिकर्मक साझाकरण उद्देश्यों के लिए संग्रहीत किया जा रहा है। राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) का आदेश है कि किसी भी एनआईएच-समर्थित परियोजनाओं को समर्थित परियोजनाओं से उत्पादित अभिकर्मकों को साझा करने की आवश्यकता होती है। ये biorepositories अनुदान अनुप्रयोगों के लिए प्रारंभिक डेटा प्राप्त करने के लिए जमे हुए संग्रहीत ऊतकों को प्राप्त करने के लिए बहुत मूल्यवान स्रोत हैं। सुपरकॉम्प्लेक्स की एंजाइम गतिविधियों का विश्लेषण करने के लिए इस अध्ययन में प्रदर्शन नहीं किया गया था; हालांकि, प्रोटोकॉल इस तरह के assays8 प्रदर्शन करने के लिए उपलब्ध हैं।

इस पेपर में वर्णित तरीकों का उपयोग करते हुए, व्यक्तिगत ईटीसी कॉम्प्लेक्स और माइटोकॉन्ड्रिया-समृद्ध तैयारी के सुपरकॉम्प्लेक्स का विश्लेषण किया गया था जो बोने की संतानों के दिल के ऊतकों से प्राप्त होते हैं। व्यायाम बोने के लिए पैदा हुई संतानों ने अपने जीवन के पहले 6 महीनों के दौरान ईटीसी के निम्न स्तर को प्रस्तुत किया और अंततः 9 महीने तक समतल किया।

ETC कॉम्प्लेक्स 48 घंटे 3 महीने 6 महीने 9 महीने
Complex-I ↓ ↓ ↓ कोई परिवर्तन नहीं
जटिल-II ↓ ↓ कोई परिवर्तन नहीं कोई परिवर्तन नहीं
जटिल-III ↓ कोई परिवर्तन नहीं कोई परिवर्तन नहीं ↓
जटिल-IV ↑ ↑ ↑ कोई परिवर्तन नहीं
जटिल-V ↓ ↓ ↓ कोई परिवर्तन नहीं

तालिका 2: माइटोकॉन्ड्रियल इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला प्रोटीन कॉम्प्लेक्स प्रोफ़ाइल। तालिका बोने के प्रयोग किए गए समूह में माइटोकॉन्ड्रियल ईटीसी जटिल स्तरों की प्रोफ़ाइल को सारांशित करती है। कॉम्प्लेक्स-IV को छोड़कर सभी परिसरों ने आयु समूहों में एक घटता पैटर्न दिखाया।

यह अवलोकन यह सुझाव दे सकता है कि गर्भावस्था के दौरान व्यायाम किए गए बोने के लिए पैदा हुई संतानों ने अपने दिल के ऊतक माइटोकॉन्ड्रिया (चित्रा 4) में कम लेकिन अधिक कुशल ईटीसी कॉम्प्लेक्स का संकेत दिया। हालांकि, 9 महीनों में सुपरकॉम्प्लेक्स गठन का प्रयोग किया गया समूह ऊंचा पाया गया है। व्यायाम किसी भी तरह से बढ़ी हुई ऊर्जा मांग की स्थिति में सुपरकॉम्प्लेक्स की पुनर्व्यवस्था को प्रभावित कर सकता है12। इसके अलावा, कॉम्प्लेक्स-वी (एटीपी सिंथेज़) ने जन्म के बाद पहले 6 महीनों में कम प्रोफ़ाइल का प्रदर्शन किया है। यह प्रतिक्रिया एपिजेनेटिक रूप से संशोधित ईटीसी प्रोटीन कॉम्प्लेक्स की संभावना के कारण हो सकती है। इस अध्ययन के लिए छोटा नमूना आकार (एन = 4) इस तरह के निष्कर्ष पर पहुंचने के लिए पर्याप्त नहीं था; हालांकि, कम ईटीसी जटिल प्रोटीन के स्तर, उच्च जटिल I-II गतिविधि, और ऊंचा सुपरकॉम्प्लेक्स गठन के पैटर्न यह सुझाव दे सकते हैं कि व्यायाम किए गए बोने की संतानों के हृदय ऊतकों में बायोएनर्जेटिक्स व्यायाम से प्रभावित होते हैं। कम लेकिन अधिक कुशलता से काम कर रहे माइटोकॉन्ड्रियल ईटीसी कॉम्प्लेक्स और बढ़े हुए सुपरकॉम्प्लेक्स के गठन की जांच की जानी वाली दिलचस्प घटनाएं हैं। यह परियोजना अभी भी प्रगति पर है।

संक्षेप में, यह प्रोटोकॉल पहले जमे हुए संग्रहीत हृदय ऊतक से सरल और सीधा माइटोकॉन्ड्रिया-समृद्ध नमूना तैयारी प्रदान करता है। माइटोकॉन्ड्रियल ईटीसी कॉम्प्लेक्स का विश्लेषण मल्टीप्लेक्स एंटीबॉडी कॉकटेल के साथ मानक इम्यूनोब्लॉटिंग द्वारा किया जा सकता है। बीएन-पेज के बाद इम्यूनोब्लॉटिंग सुपरकॉम्प्लेक्स की उपस्थिति का विश्लेषण कर सकता है। यह तैयारी उपयोगकर्ताओं को माइटोकॉन्ड्रियल ईटीसी जटिल गतिविधियों का आकलन करने की अनुमति भी दे सकती है।

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Disclosures

लेखकों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस काम को डैनियल बैरेरा के लिए अब्दुलबाकी एजबास और ग्रीष्मकालीन अनुसंधान फैलोशिप के लिए कैनसस सिटी यूनिवर्सिटी के इंट्राम्यूरल अनुदान द्वारा वित्तीय रूप से समर्थित किया गया था। लेखक डॉ जान टैली के संपादकीय काम के लिए आभारी हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amino caproic acid Sigma/Aldrich A2504-100G
Anti-Hu Total OxPhos complex kit Invitrogen 458199
anti-VDAC antibody abcam ab15895 use 1 µg/mL
Coomassie G-250 ThermoSientific 20279
Coomassie GelCode Blue ThermoScientific 24592
Digitonin Cabiochem 300410
Glass-Glass pestle homogenizer VWR KT885451-0020
Image Studio LICOR
IR-Dye conjugated anti-Rabbit Ab LICOR LC0725
Multiwell plate reader BioTek Synergy HT
Native molecular weight marker ThermoFisher BN2001
Nylon mesh monofilament Small Part Inc CMN-74
Orbital shaker ThermoScientfic
PCT Shredder Pressure Bioscience Inc
SEA BLOCK Blocking buffer ThermoScienctific 37527
Shredder PULSE Tube Pressure Bioscience Inc FT500-PS
Table top centrifuge Eppendorf 5418
Trypsin Amresco M150-1G
Trypsin inhibitor Amresco M191-1G Requires fresh preparation

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References

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जैव रसायन अंक 174
बोने की संतानों से पहले जमे हुए कार्डियक ऊतक में माइटोकॉन्ड्रियल इलेक्ट्रॉन ट्रांसफर कॉम्प्लेक्स को मापना: व्यायाम-प्रेरित माइटोकॉन्ड्रियल बायोएनर्जेटिक्स परिवर्तनों का आकलन करने के लिए एक मॉडल
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Barrera, D., Upton, S., Rauch, M.,… More

Barrera, D., Upton, S., Rauch, M., Notarianni, T., Eum, K. S., Liberty, M., Sah, S. V., Liu, R., Newcomer, S., May, L. E., Agbas, E., Sage, J., Kosa, E., Agbas, A. Measuring Mitochondrial Electron Transfer Complexes in Previously Frozen Cardiac Tissue from the Offspring of Sow: A Model to Assess Exercise-Induced Mitochondrial Bioenergetics Changes. J. Vis. Exp. (174), e62809, doi:10.3791/62809 (2021).

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