Summary
以前に凍結したアーカイブされた固体組織からのミトコンドリア濃縮サンプルを調製し、研究者は様々な実験モダリティでミトコンドリアの機能的および分析的評価を行うことを可能にした。この研究は、凍結した心臓組織からミトコンドリア濃縮製剤を調製し、ミトコンドリアの分析評価を行う方法を示す。
Abstract
ミトコンドリア電子移動複合体(ETC)プロファイルは、運動した種まきに生まれた子孫の心臓組織で修飾され、提案され、テストされた仮説は、妊娠中の種まきの定期的な母親の運動は、子孫の心臓の生体エネルギーのミトコンドリア効率を増加させるだろうという仮説でした。この仮説は、ミトコンドリアETCおよび超複合体プロファイルを評価するための軽度の分離手順を用いてミトコンドリアを単離することによって試験された。ここで説明した手順は、以前に凍結されたアーカイブされた心臓組織の処理を可能にし、ミトコンドリアETC複合体、超複合体、およびETC複合体の評価のための新鮮なミトコンドリア調製の必要性を排除した。このプロトコルは、青色天然ゲル電気泳動を用いた多重化抗体ベースの免疫ブロット法および超複合評価における最適なETCタンパク質複合体測定について説明する。
Introduction
このプロトコルの目的は、以前に凍結した心臓組織からミトコンドリア濃縮製剤を得るための詳細なステップを提供し、組織のリシスとミトコンドリアの抽出を改善する組織の低エネルギー機械的破壊の新技術を提供することであった。この方法により、高い剪断応力や高温と短い均質化時間(10-12s)を発生させることなく抽出効率が向上する1。
アーカイブされた凍結組織からミトコンドリアを得ることは、機能的2 および生化学的研究の両方を行う貴重な資産である3 それ以外の場合は、正確な実験条件下で容易に再現できない。古典的なポッター・エルフェイェム・テフロン・ペスルガラスホモジナイザーまたはDounceホモジナイザーが使用されており、肝臓、腎臓、脳などの軟部組織を均質化するために研究ラボで使用されています。しかし、筋肉や心臓などの硬い組織を均質化するには、より均質化時間、酵素処理、高速均質化、および広範なユーザー体験が必要です。これは、筋肉や心臓などの硬い組織からミトコンドリアなどの無傷のオルガネラを抽出する場合には不利です。本プロトコルに記載されている方法は、ミトコンドリア電子輸送鎖(ETC)タンパク質複合体およびそれらの超錯体形成を、生まれた子孫から採取した心臓組織中の超錯体形成を分析するための高収量ミトコンドリア濃縮製剤を得るために使用され、運動および座りっぱなしの種まき、液体窒素中でフラッシュ凍結、および-80°Cで保存され、将来の使用のために保存される。この方法により、ユーザは、以前に凍結されたアーカイブ組織からミトコンドリア濃縮製剤を分離することができる。
妊娠中のげっ歯類への外部ナノ材料暴露は、妊娠4の間に心機能およびミトコンドリア呼吸および生物エネルギーに悪影響を及ぼす可能性がある。それにもかかわらず、妊娠中の胎児筋細胞生物エネルギーの有酸素運動誘発陽性変化はまだ文書化されていない。しかし、新たな研究は、妊娠中の母親の有酸素運動が胎児の心機能にプラスの影響を与える証拠を提供する5。さらなる証拠を提供するために、妊娠中の母体運動が胎児の心臓ミトコンドリア呼吸鎖複合体(すなわち、コンプレックスIからコンプレックスV)に及ぼす縦方向の影響の分析が行われた。
この研究は、母親の運動が子孫の心臓ミトコンドリアにおけるエネルギー産生の効率を向上させる可能性があるため、健康に有意な関連性を有する。本研究では、雌豚(雌豚)は、(i)心臓生理学はヒト6に類似しており、(ii)異なる時点から子孫からの心臓組織収穫が制度的なIACUC承認の下で実現可能である2つの理由で動物モデルとして使用された。提案された研究は、母親の運動とその潜在的な肯定的な効果が子孫の心臓組織の細胞および生化学的構成に及ぼす基本的な質問の多くを答えることを目的としています。このアプローチは、妊娠中の胎児心筋細胞内の生体エネルギー変化の問題に対処した長く高価な縦断研究から得られた以前に凍結した心臓組織からの穏やかで効果的なミトコンドリア分離技術を必要とする。本研究で説明された方法は、分析および機能研究の両方のためのミトコンドリア濃縮調製物のために、以前に凍結されたアーカイブされた組織の大量を利用することを可能にする。この研究はまた、予備的なデータを提供することによって、この分野の知識のギャップを埋めるのに役立ち、子宮内およびそれ以降の心臓の健康に対する母親の運動の影響を決定する将来の研究につながる可能性がある。
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Protocol
凍結した子孫の心臓組織は、機関IACUC承認書と共にショーン・ニューカマー博士から受け取られました。心臓組織は、長期の縦断的研究から得られ、液体窒素中でフラッシュ凍結し、将来の使用のために−80°Cで保存した。子孫の心臓組織の処理に関するすべてのプロトコルは、カンザスシティ大学IBCとIACUC委員会のガイドラインに従いました。
1. バッファーおよび試薬の調製
注: 製造元のガイドラインに従って、すべてのサンプルを準備します。すべてのレシピとプロトコルのステップで超精製水または同等のものを使用してください。この手順では、個人用保護具(ラボのうめき、フェイスマスク、手袋、ゴーグル/フェイスシールド)を着用してください。緩衝液容積は6つのティッシュサンプルを処理するのに適している。
- 154.035 gのショ糖(0.3M最終)、3.904 gのHEPES(10 mM最終)、0.11gのEDTA(0.2 mM最終)を組み合わせて1.5 L組織洗浄バッファーを調製します。攪拌プレート上で1.0Lの水に成分を加え、希釈HClでpHを7.2に調整し、最終的な体積に1.5 Lにメイクアップします。
注:サンプルあたり約200mLの洗浄バッファーが必要です(50〜300mg)。6つの組織サンプルは1日で処理することができる。残りの洗浄バッファーを使用して、分離バッファーを作成します。 - 210 mLの洗浄バッファーに210mgのBSAを加えて、ステップ1.1で前述した洗浄バッファーから分離バッファーを調製します。希釈NaOH溶液でpHを7.4に調整します。
注:組織サンプルごとに約35mLの分離バッファーが必要です。したがって、6つのサンプルに210 mLの分離バッファーが必要です。新鮮なBSA溶液(1mg/mL最終)を調製日に添加して、このバッファーを調製します。BSAは、遊離脂肪酸などの天然のアンカプラを除去することによってミトコンドリアの特性を改善するミトコンドリアを単離するために使用されます。BSAは、脳ミトコンドリア7において、特にコハク酸塩の酸化速度を増加させることによって抗酸化活性を有することが判明した。あるいは、ウシ血清アルブミンは、オボアルブミンのような安価な酸を含まない類似体によって置換することができる。 - 0.011 gのEDTA(最終濃度は0.2 mM EDTA)を組み合わせて150 mLの再懸濁液を調製し、100 mMのEDTA溶液を150 μL使用する リサスペンションバッファーの50 mL、スクロースの12.836 g(0.25 Mスクロース最終濃度)、および0.236 gのトリス(10 mM Tris-HCl最終)。0.1 N NaOH で pH を 7.8 に調整します。使用直前にプロテアーゼ阻害剤カクテルを60μL加えます。
- トリプシン溶液を1 mM HClの3.0 mL(2.5mgのトリプシン/mL最終)に溶解して、トリプシン溶液を調製します。この量は1つのサンプルに対して十分である。
注:処理予定の組織サンプルの数に基づいてトリプシン溶液を準備してください。 - BSAを含む分離緩衝液の20 mLに13.0mgのトリプシン阻害剤を組み合わせることにより、大豆からトリプシン阻害剤溶液を調製(0.65 mg/mLのトリプシン阻害剤最終)。
注:新鮮なトリプシン阻害剤溶液を準備してください。 - 1mLの水に0.1gの過硫酸アンモニウムを加えて、過硫酸アンモニウム試薬を調製します(10%過硫酸アンモニウム最終)。
注:過硫酸アンモニウム試薬は、新たに調製するか、または大量にアリクォートし、-20°Cの冷凍庫に保管することができます。 - 6アミノカプロ酸の0.131gを超精製水1.0mLに組み合わせてアミノカプロン酸溶液(ACA)を調製し、4°C(1M 6-アミノカプロ酸最終)に保存します。
- クマシーG-250の1 gを0.5mLの水に溶解し、0.5 mLの1 Mアミノカプロン酸(10%染料溶液最終濃度)を溶解して、クーマシーブリリアントブルー染料溶液を調製します。
- ブルーネイティブページ(BN-PAGE)のために5%ディジトニンを準備します。サンプル調製に必要なデジトニンの量と、ピペットの誤差を相殺するための余分な量(過大評価10mg)を計算します。15mgの場合:まず、15mgのジジソニンを30μLの100%DMSOで希釈します。ソリューションに入るためにデジトニンを助けるために渦。次に、ddH2O(270 μL)の残りの90%を加えます。溶液(渦)を混ぜて静かに加熱し、氷の上で冷却します。
- ネイティブ PAGE アノード バッファーを準備します。20xネイティブPAGEランニングバッファの50 mLを950 mLの水に加えて、1 Lの最終容積を作ります。これを 1x 実行バッファーとして使用します。
- 濃い青色のカソードバッファーを準備します。ネイティブPAGEアノードバッファの80 mLでクマシーブリリアントブルーG-250の0.0160 gを溶解します。よく混ぜる。
注:すぐに使用するために新鮮なカソードバッファを準備してください。60 mL のみが必要ですが、漏れが発生した場合は20 mLを追加します。 - 水色のカソードバッファーを準備します。ネイティブPAGEアノードバッファの180 mLにダークブルーのカソードバッファの20 mLを追加し、よく混ぜます。
メモ:このバッファは一度だけ使用できます。 - 5%クマシーG-250をサンプル添加剤として調製します。200 μL の 10% クマシーストックをすでに作られている(ステップ1.8)、200 μLの1 M ACAで希釈し、4 °Cで保管します。
- 40% グリセロール、0.04% ポンソー S、25 mM トリス HCl (pH 6.8) を組み合わせて 4x ネイティブ PAGE サンプル バッファーを準備し、最終体積の 10 mL で 192 mM グリシンを準備します。アリクォートと冷凍庫で-20°Cで保管してください。
2. 凍った心臓組織からのミトコンドリアの分離
注:4°Cの冷たい部屋でミトコンドリアの分離手順を実行します。しかし、冷蔵室が利用できない場合には、大きなサイズの氷浴を使用して手順を行う。
- -80°C冷凍庫から以前に凍結した心臓組織サンプルを取り出します。
注:最大4つの組織サンプルは、特定の日にミトコンドリア分離のために快適に処理することができます。 - 心臓組織サンプルを含むチューブの重量を量り、体重を記録します。洗浄バッファーの40 mLを含む3ビーカー(各50 mL)を準備します。氷塩浴の各ビーカーを、氷と塩を等量混合して3〜5分間混合してから、次のステップに進みます。各ビーカーに磁気攪拌棒を入れ、中速に攪拌機をセットします。
注:ビーカーを過剰に凍結し、氷の結晶の雲が現れ始めた直後にそれらを使用しないでください。 - 冷凍心臓組織を最初のビーカーの氷冷溶液に直接入れます。ピンセットを使用して組織にわずかな圧力をかけて、できるだけ多くの血液を出しながら約5分待ちます。
- 空の管を計量し、元の重量(ステップ2.2)から差し引き、心臓組織の正味重量を得る。
- 鉗子で組織を取り出し、血液を除去するために濾過紙のきれいなペーパータオルで心臓を絞ります。次に、組織を第2ビーカーに入れる。過剰な血液を除去するためにかき混ぜながら約5分待ちます。
- ペーパータオルでティッシュをやさしく乾かします。すべての脂肪、凝固した血液、耳利き、および筋膜(白い組織)を除去する。次いで、心室組織をプールする。
- 手順2.7.1-2.7.9に従ってシュレッダーを使用して組織サンプルをシュレッド。
- ラム側から組織シュレッダーチャンバーに心臓組織(約50〜300mg)を入れます。
図1:シュレッダーで使用するティッシュシュレッダーチャンバー(チューブ)。 シュレッダーチューブ内の組織均質化は、組織試料あたり約10〜12秒を必要とする。均質化された組織が穿光ディスクを通って上部の部屋に入ると、組織の均質化が完了する。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
- チューブのキャップ側に洗浄バッファーの〜0.2〜0.8 mLを加えます。
注: シュレッダー中にサンプルの総容積と洗浄バッファーを組み合わせた量が 0.7~0.8 mL を超えないようにしてください。 - チューブツールを使用して、シュレッダーキャップをぴったりとキャップします。
注:シュレッダーキャップを締めすぎないでください。 - シュレッダーチャンバーを、ラム側を下にしてシュレッダーホルダーユニットに入れます。ラムはシュレッダーホルダーにフィッティングを係合します。
- シュレッダー ドライバのビットを挿入します。ビットはシュレッダーキャップと係合してみましょう。ビットがぴったりとロックされていることを確認します。
メモ:常に完全に充電されたシュレッダードライバを使用してください。 - シュレッダーホルダーの圧力インジケーターがシュレッダーホルダーの約2の設定に達するまで、シュレッダードライバーとシュレッダーチャンバーに手動で下方に圧力を適用します。
注:細断組織がより繊維状である場合、設定は高いレベルにすることができます。 - 2で設定を維持しながら、シュレッダードライバのトリガーを押して、約10〜12 sのシュレッダードライバを実行します。
- チューブを見て、組織の固体質量の全部または大部分が溶質ディスクを通して細断され、チューブを見てシュレッダーチャンバーの上部チャンバーに渡されているかどうかを確認します。
注:組織サンプルを長期間細断する必要があるかもしれません。チューブをシュレッダーホルダーに戻し、プロセスを続行します。ほとんどの種類の組織サンプルは、10-12 sの細断しか必要としないです。すべてのシュレッダーは摩擦による熱を発生させますが、この短い処理時間はサンプルを大幅に加熱しません。 - サンプルを細断した後、ホルダーユニットからシュレッダーチャンバーを持ち上げます。チューブツールを使用してシュレッダーキャップを取り外し、後で使用するためにクリーンな表面に置きます。
注:シュレッダーキャップはサンプル抽出物で汚染されていると考え、サンプルの種類によっては感染性物質で汚染される可能性があります。クロスコンタミネーションを防ぐために、他の組織サンプルに同じシュレッダーキャップを使用しないでください。
- 40 mLの洗浄バッファーで3番目のビーカーに細断された心臓組織を移し、かき混ぜ合った状態で中速で5分間かき混ぜます。
- ナイロンメッシュモノフィラメント(74 μmの細孔サイズ)を通して懸濁液をフィルターし、濾液を捨てます。10 mLの洗浄バッファーでフィルター3xの細断されたティッシュを洗います。
注:ナイロンメッシュモノフィラメントが水であらかじめ濡れているか確認してください。 - 洗浄し、細断された組織を、20 mLの洗浄バッファーを備えた50 mLビーカーに移し、ビーカーを磁気スターラーの氷浴に入れます。15分間絶えず撹拌しながら0.5mLのトリプシン溶液を加えます。インキュベーションの途中(約7.5分)、組織懸濁液を緩く取り付けられたハンドヘルドガラスオンガラスホモジナイザーに移し、0〜15 mLの体積を保持します。
図1:シュレッダーで使用するティッシュシュレッダーチャンバー(チューブ)。 シュレッダーチューブ内の組織均質化は、組織試料あたり約10〜12秒を必要とする。均質化された組織が穿光ディスクを通って上部の部屋に入ると、組織の均質化が完了する。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
- 4-5ストロークで軽く均質化し、泡を生成することなく懸濁液を分散させます。ホモジュネートを50 mLのビーカーに入れ、攪拌プレートの上で4°Cで15分間軽く混ぜます。
- 15分間のインキュベーションの後、コモジン酸を含むビーカーにトリプシン阻害剤を含む分離バッファーの10 mLを加え、穏やかに攪拌しながら4°Cで1分間インキュベートします。
- ナイロンフィルターを通してサスペンションを再度フィルターし、50 mLの円錐形の管にろ過を保存します。
- ナイロンフィルターに残った微粒子分を収集し、ガラスオンガラスホモジナイザーに入れます。洗浄バッファーの15〜20 mLを加え、25〜30 sのために手で穏やかに均質化します。
注: このステップでは、濾過液は非常にゆっくりと流れます。濾液の流れを増やすには、円錐形の管の内側に触れる漏斗の先端を置く。 - ホモジュネートを濾液と組み合わせ、チューブのバランスをとり、遠心分離機を600 x g で4°Cで15分間調整します。
- ペレットによる汚染を避けるために、ナイロンフィルターを使用して、新しい円錐形のチューブに得られた上澄み物をフィルター処理します。4°Cで15分間、8,500 x g で遠心分離機を再び実行します。
注:プラスチックトランスファーピペットを使用して上清を除去し、ふわふわペレットの上部から上清の0.2 mLを犠牲にしてください。 - 上清を捨て、1mLの分離バッファーでペレットを2〜3回すすいで下します。ふわふわの白い外縁層を毎回捨てるようにしてください。
注:1 mLチップを使用して分離バッファーを追加するか、新しい転送ピペットを使用してペレットを洗浄します。ペレットの上ではなく、チューブの側面にバッファーを追加して、ペレットを破壊することを防止し、上清の汚染を防ぎます。次に、移管ピペットでバッファーを吸引し、さらに2回工程を繰り返す。 - 各チューブに5mLの分離バッファーを加え、1 mLチップまたは新しい転写ピペットを用いてペレットを分解します。
- サスペンションを20 mLの追加分離バッファーで希釈し、4°Cで15分間8,500 x g で再び遠心分離機を実行します。
- 上清を捨て、再懸濁液の5mLでペレットを再懸濁します。その後、合計20 mLのバッファを15mL、遠心分離機を4°Cで15分間8,500 x g で加えます。 上清を捨てます。得られた褐色ペレットは、ミトコンドリアをそのまま洗浄して含有する。
- ミトコンドリア濃縮ペレットを、プロテアーゼ阻害剤を含む再懸濁バッファーの250 μLで再懸濁します。アリコートは25μLで、液体窒素で素早く凍結し、数年の間、-80°Cの深い冷凍庫に保管します。
注:タンパク質分析アッセイ用のミトコンドリア濃縮製剤のスペア5 μL。BN-PAGE(ブルーネイティブページ)研究では、チューブ当たりミトコンドリアタンパク質の50 μgに再懸濁されたペレットをアリコートします。遠心分離機 8,500 x g で 4 °C で 15 分 上清を慎重に吸引し、ミトコンドリアペレット(50μgタンパク質/アリコート)を-80°Cの深い冷凍庫に数年間保管します。
3. ミトコンドリア電子移動複合体(ETC)評価
注:個々のミトコンドリアETCタンパク質(すなわち、複合I、II、III、IV、V)は、標準的な免疫ブロットアッセイによって評価することができる。サンプルの多様性(48時間、3ヶ月、6ヶ月、9ヶ月)、2つの実験条件(運動および座りっぱなし)、および多数の免疫プロービング抗体(5抗体)が、多重化免疫ブロッティングが推奨される。多重化免疫ブロット法を以下のように行う。
- 50 μgのミトコンドリア濃縮タンパク質サンプル/ウェルを4%-20%のグラディエントポリアクリルアミドゲル電気泳動(100 V、90分)で解決します。
- PVDF膜にタンパク質を移す(75 V;60分)
- 4°Cで最低1時間のブロッキング緩衝液中の膜をブロックする。
注:ブロッキング時間は、4°Cで一晩まで延長することができます。 ブロッキングバッファー(材料表)には、抗体との特異的結合相互作用を有する可能性が低い非哺乳類の成分(すなわち、魚のタンパク質)が含まれています。 - 抗コンプレックスI、II、III、IV、V抗体を含む抗体カクテルで膜をプローブし、4°Cの軌道シェーカーで一晩インキュベートする。
- 翌日、RT(室温)の軌道シェーカーで、膜とプローブをIRタグ付き二次抗体で2時間洗浄します。
- 1x TBS-T(Tween 20を含むTBS)で5回洗浄し、1x TBS(トリス緩衝生理生理液)で1回洗浄します。
注意:最後の洗浄のために、TBSバッファに洗剤を含めないでください。 - イメージ アナライザでブロットをイメージします。
4. ブルーネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動によるミトコンドリア超複合体評価(BN-PAGE)
注: ETC の超複合プロファイルは、BN-PAGE 技術を採用して評価することもできます。
- サンプルバッファーカクテルを50 μgのミトコンドリア濃縮ペレットタンパク質あたり20 μL(水7 μL + 5 μLの4x天然ポリアクリルアミドゲル電気泳動サンプル負荷バッファー + 8 μL 5% デジトニン + 2 μL のクーマッシー G-250) に調製します。
注:サンプルのサンプル数(50 μgタンパク質/サンプル)に応じて、サンプルバッファーカクテルをストックしてください。ミトコンドリア濃縮ペレットのタンパク質濃度に基づいて適当なデジコニン量を選択する(表1)8。 - 95°Cのデジコニンストックを3分間加熱し、氷の上で混ぜ、冷やしてからマスターミックスを作ります。
- サンプルをゲルにセットする直前に、クーマッシーG-250サンプル添加剤を加えます。
- 50 μgのミトコンドリアタンパク質ペレットを含むチューブに、サンプルバッファーカクテルを 20 μL 追加します。ペレットを泡を発生させることなくピペットと穏やかに混合してペレットを可溶化/再懸濁します。
- ミトコンドリア濃縮ペレットの最大可溶化を達成するために20分間氷上で混合物をインキュベートします。時々、チューブを軽くフリックして可溶性を高めます。
- インキュベーションを待つ間に、ネイティブ PAGE アノード バッファ/1x ランニング バッファと濃い青色のカソード バッファを準備します。
- 4°Cで10分間20,000 x g で可溶化したミトコンドリア濃縮ペレットを遠心分離します。
- 遠心分離後、15μLの上清を氷の上に置いた新しいチューブに集めます。
- ステップ4.8で得られた上清に適量の5%クマシーG-250試薬を加える( 表1参照)。
注:5%クマシーG-250容積は、染料の最終濃度が洗剤濃度の1/4になるようにする必要があります。サンプルをゲルにロードする直前に、この手順を実行します。
| 蛋白質 | ジジトニン/タンパク質 | 4x サンプルバッファ | 5% デジトン | 水 | 最終巻 | 5% クマシー G-250 |
| 比率 (g/g) | サンプル添加物 | |||||
| 50 μg | 8 | 5 | 8 | 7 | 20 | 2 |
| 50 μg | 4 | 5 | 4 | 11 | 20 | 1 |
表1:2種類の洗剤/タンパク質比を有するサンプルバッファーカクテル調製。 ミトコンドリア懸濁液から膜タンパク質の最大可溶化を達成するために、ジジトニン/ミトコンドリア懸濁液タンパク質濃度は、タンパク質の4〜8 gのデジトニン/gの間に調整する必要があります。心臓組織では、ミトコンドリア懸濁液タンパク質の50μg(すなわち、ミトコンドリアタンパク質の8gデジコニン/g)に対して400μgのジギトニンを使用して、ミトコンドリア懸濁液からの超複合体の溶解性を最大化した。
- 3%~8%の勾配ゲルを注ぎ、くしを取り出し、1xランニングバッファでゲルのウェルを3回洗い流します。
注:ゲルは前日に注いだ場合に最も重合します。 - 電気泳動システムを設置し、ゲルを装置に入れます。
- 濃い青色のカソードバッファーでサンプルウェルを充填します。
- ゲルの最初と最後のウェルに、非染色タンパク質標準の10 μLをネイティブの分子量マーカーとしてロードします。
- 上記のステップ4.9で調製したサンプル上清+クマシーサンプル添加剤の全量を、フラットヘッドゲルローディングチップを使用してウェルにロードします。
- ウェル内のサンプルを邪魔することなく、ミニセルバッファダムに約60 mLの濃い青色のカソードバッファを慎重に充填し、ネイティブPAGE 1xランニングバッファでバッファタンクを充填します。
- 電源を入れ、サンプルを150 Vで約30分間電源を入れます。
- サンプルウェルを移管ピペットまたは吸気して、バッファーダム(内室)から濃い青色のカソードバッファーを取り外します。150~200 mLの水色のカソードバッファーで内チャンバを充填し、250 Vで60分間電気泳動を行います。
注:電気泳動時間は、色素フロントがゲルカセットの底部からわずか0.5cm上に移動するタイミングを確認することによって決定することができます。 - カセットからゲルを取り出し、きれいなプラスチック容器に入れます。ロッカー/オービタルシェーカーで15分間、良質の蒸留水でゲルを洗います。
注意:カセットから勾配ゲルを取り除くために、カセットを底部から取り出して、破損の可能性を最小限に抑えます。 - 水を流し、十分な量のクーマシーゲルコードブルー染色試薬にゲルを浸し、室温で軌道/ロッカーに1時間インキュベートします。
注:青色の染色試薬(材料表)溶液を使用する前に、ボトルを数回軽く旋回して混合してください。 - 染料溶液をデカントし、蒸留水を加え、水で数回すすいでから、軌道/ロッカーに置いて取り込みます。
注:スポンジ(約3cm x 0.5cm)をゲル脱染色容器に入れ、ゲルを一晩脱汚するために残します。スポンジは、複数の水の変化を必要とせずに染料粒子を吸い付けます。 - 画像分析装置でゲルを分析します。
5. 免疫ブロット分析によるミトコンドリア超複合体評価
- 電気泳動の終わりにゲルを染色せずに、BN-PAGEの新しいセットを実行します。
- セクション3(ミトコンドリア電子移動複合体(ETC)評価)と同様の手順に従って、免疫ブロットを完了します。
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Representative Results
プロトコルに従って、心臓組織からのミトコンドリア濃縮タンパク質混合物の良好な収量を調製した。約15mg/mLのミトコンドリア濃縮タンパク質混合物は、種まきの子孫から採取された平均1.2gの凍結心臓組織から得られた。観察は、0.5g未満の凍結した心臓組織がBN-PAGEアッセイを行うのに十分な量のミトコンドリア濃縮タンパク質混合物を生じさせなかったことを示した。ミトコンドリア製剤の量は、(i)個々の電子伝達複合体(ETC)(すなわち、複素I、II、III、IV、および複合-V)、(ii)BN-PAGEおよびイムノブロット分析によるミトコンドリア超錯体評価、および(iii)選択複合体に対する限定的な酵素的な分析を行うのに十分であった。個々のETCタンパク質複合体に対して上げられた抗体のカクテルは、各抗体が1つの単一の免疫ブロットアッセイで独自の標的タンパク質を認識する技術的な実現可能性を提供する。
ミトコンドリア濃縮タンパク質は、雌豚の子孫から得られた心臓の左心室から調製され、子孫は2群の雌種に生まれ、(1)妊娠中に1群が運動され、(2)1群が座っていた。両群の心臓組織は、出生後異なる時点(48時間、3ヶ月、6ヶ月、9ヶ月)で採取された。母体運動が妊娠中の子孫のミトコンドリアETCにプラスの影響を与えるかどうかは、この研究でテストされた仮説であった。4つの心臓組織は、長いミトコンドリア濃縮分離プロセスのために、任意の日に快適に処理された。
図2:子孫心臓組織由来のミトコンドリアETC複合体の免疫ブロットプロファイル ミトコンドリア濃縮タンパク質混合物を還元条件下で4%〜20%の勾配ゲルで分解した。タンパク質を市販の抗体カクテルで免疫プローブし、抗VDAC抗体をローディングコントロール(赤色色帯)に使用した。抗体のカクテルは、ウシ心臓Complex-I(抗原NDUFB8)、ウシ心Complex-II(抗原C-II30(FeS)、ウシ心複合体II、III(抗原C-III-コア2)、ヒトコンプレックスIV、サブユニットII(抗原C-IV-II)、およびウシ心臓complex-V(抗原C-V-V α-)に対して上げられた。二次抗体を赤外線タグで標識し、画像分析ソフトウェアを用いて画像を解析した。年齢グループ全体の個々の複合プロファイルは 、補足図1(A-E)に示されています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2は、典型的なETCタンパク質プロファイルを表す。マルチプレックス形式で免疫ブロットを行うための抗体カクテル。各抗体は、独自の標的タンパク質を認識し、許容可能な解像度を提供しました。タンパク質バンド強度をデジタル解析した。運動した種まきの子孫から得られた組織は、いくつかのETC複合体において比較的減少したレベルを提示した(補足的な図1A−E)。ミトコンドリア濃縮製剤は、免疫プロービングが多重化形式で行われたため、勾配ゲル(4%-20%)で分解されなければならない。このアプローチにより、SDS/PAGE ゲルの数パーセントを固定して実行する必要がなくなります。
ミトコンドリアタンパク質を3%-8%のグラジェントBN-PAGE(図3A)で分解し、抗体カクテルで免疫プローブした。運動群と座りっぱなし群の両方で、複数の超複合体形成が観察された(図3B)。
図3:青色天然ポリアクリルアミドゲル電気泳動(BN-PAGE)によるミトコンドリア超錯体プロファイル(A)ミトコンドリア濃縮タンパク質混合物を3%-8%BN-PAGEで分解し、クマシーブルー試薬(ゲルコード、ブルーステイン試薬)で染色した。ミトコンドリア濃縮タンパク質混合物を3%-8%BN-PAGEで分解し、PVDF膜に移し、超複合体の抗体カクテルで免疫プローブした。どちらのアッセイでも、タンパク質負荷は150μg/wellであった。調製時のタンパク質収率が不十分なため、6ヶ月間のデータ収集ポイントは含まれなかった。観察された最も顕著な超複合体の増加は、座りっぱなし群と比較して、行使群で9ヶ月であった。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
BN-PAGEで解決できる超複合体の大きさのために、異なる勾配ゲル形式(3%-8%)が調製されました。本プロトコルに記載されたミトコンドリア濃縮製剤は、ミトコンドリアETCの複雑な活動を測定するために用いた。 図4 は、複雑なI-II活動評価のために記録されたデータを表しています。このアッセイは、確立されたプロトコル3に従って行われた。
図4:複雑なI-II活性測定 異なる年齢層(48時間、3ヶ月、6ヶ月、9ヶ月)から得られたミトコンドリア濃縮タンパク質混合物を、運動アッセイを用いて複合I-II活性について分析した。運動したグループは、座りっぱなし群と比較して複素I-II活性の増加を示した。2つの群の差は、 ペアt検定(P>0.05)に従って統計的に有意ではなかった。図に示す誤差範囲は、n = 4 の平均値 (SEM) の標準誤差を表しています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図1: (A)年齢層間の複合Iプロファイル。一般に、運動した種まきに生まれた子孫は、座りっぱなし群のそれと比較して、Complex-Iの低いレベルを提示した(n= 4)。これは9ヶ月のグループでより顕著でした。(B) 年齢層を超えた複合IIプロファイル。すべての年齢層は、3ヶ月のコホート(n=4)を除いて、運動群における複合体-IIの低レベルを示した。(C)年齢層を超えた複合IIIプロファイル。9ヶ月の年齢層だけが、座りっぱなし群のレベルと比較して、運動群におけるComplex-IIIの低いレベルを示した(n=4)。(D) 年齢層を超えた複雑なIVプロファイル。運動した群の複雑-IVタンパク質レベルのわずかな増加が観察された(n=4)。(E) 年齢層を超える複合V(ATP合成)プロファイル。運動群と座りっぱなし群はいずれも、48時間のデータポイント(n=4)を除いて、低レベルのComplex-Vを示した。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルの重要な手順をここに示します。まず、組織均質化プロセス中に過剰な効果が適用されないように、組織均質化を慎重に行う必要があります。初期組織均質化のための圧力サイクリング技術(PCT)の一部であるティッシュシュレッダーを使用する必要があります9。このステップは、凍結組織状態のために既に脆弱なミトコンドリアをさらに破壊する可能性のあるガラスオンガラスホモジナイザー(図1B)の過剰なストロークサイクルを低減します。第二に、凍結組織重量は、ミトコンドリア濃縮製剤の十分な量を得ることが重要となる。推奨開始組織量は、組織の供給源に応じて0.8gより大きくなる。心臓組織はミトコンドリアが非常に豊富です10,11;したがって、ミトコンドリア濃縮製剤を得るために推奨量で十分である。第三に、すべての手順は、冷たい部屋で行われるべきです。冷たい部屋が利用できない場合は、大型の氷浴で十分です。
以前に凍結した心臓組織からミトコンドリア濃縮製剤を得る可能性が、この研究で実証されている。このプロトコルは、ミトコンドリアを単離し、ミトコンドリアETC酵素複合体を評価できるアーカイブされた凍結組織へのアクセスを提供するために不可欠です。最近の研究では、以前に凍結した組織や細胞からのミトコンドリア呼吸も測定可能であることが実証されました2。この進歩により、研究者は以前に収集したバイオサンプルをさらなる分析に利用することができます。
個々のETCおよび超複合体のプロファイルを評価するために、同じPVDH膜上での免疫ブロット法の間に複数の抗体を利用する多重化形式で古典的な免疫ブロット法を行うことによって容易になる。SDS-PAGEおよびBN-PAGE用のゲルにロードされるタンパク質の量を決定することが重要です。再懸濁量は、サンプルの負荷量に問題が発生しないように、高いタンパク質濃度を得るためにできるだけ最小限にする必要があります。BN-PAGEにロードされるタンパク質量は、ミトコンドリア濃縮製剤の収量に依存する。ミトコンドリア濃縮タンパク質混合物の150 μgは、元の心臓組織の少量のためにBN-PAGEでウェルあたりロードされました。50-150 μgのミトコンドリア濃縮ペレット製剤は、1 mm厚いゲルに十分です。ユーザーはサンプルの負荷に1.5 mmの厚さのゲルを好むかもしれません;しかし、タンパク質バンドの分解能は許容できる品質ではない可能性があります。免疫ブロットアッセイで使用される抗体カクテルは、その濃度で事前に決定されたため、ウェルあたりのミトコンドリアタンパク質の再懸濁はテストされませんでした。しかし、ユーザーは、信号/ノイズレートを増加させるために独自の抗体カクテルを作ることができます。
BN-PAGEゲルの完全重合勾配ゲル(3%-8%)が推奨されます。3%-8%の勾配ゲルは市販されていない。そのため、自家製のグラデーション(3%-8%)の標準的なミニゲル(9 x 6 cm)を使用することができます。ゲル24時間前に注ぎ、RTで一晩重合するようにゲルを可能にし、許容可能なゲル形成を提供する。ユーザーが超複合体のより良い分離を必要とする場合は、より大きなゲル形式(ミディゲル13.5 cm x 6.5 cmまたは長いゲル28cm x 16 cm)を使用することをお勧めします。
このプロトコルの適用は、研究者がミトコンドリアを分離し、以前に凍結されたアーカイブ組織におけるETCおよび超複合体のプロファイルを分析することを可能にする。すべての国および地域の生物標本の寄託物は、超凍結状態(すなわち、-80°C)でバイオサンプルを保つ。さらに研究や試薬の共有目的のために、多数の組織が機関や製薬会社によってアーカイブされています。国立衛生研究所(NIH)は、NIHが支援するプロジェクトから製造された試薬を共有する必要があることを義務付けています。これらのバイオレポジトリは、補助金申請のための予備データを取得するための凍結アーカイブ組織を得るための非常に貴重な情報源です。超複合体の酵素活性を分析するために、この研究では行われませんでした;しかしながら、プロトコルはアッセイ8などを実行するために利用可能である。
本論文に記載した方法を用いて、雌豚の子孫の心臓組織から得られたミトコンドリア濃縮製剤の個々のETC複合体および超錯体を分析した。運動雌豚に生まれた子孫は、人生の最初の6ヶ月間に低レベルのETCを提示し、最終的には9ヶ月でレベルアップしました。
| ETC コンプレックス | 48時間 | 3ヶ月 | 6ヶ月 | 9ヶ月 |
| コンプレックス-I | ↓ | ↓ | ↓ | 変更なし |
| コンプレックスII | ↓ | ↓ | 変更なし | 変更なし |
| コンプレックスIII | ↓ | 変更なし | 変更なし | ↓ |
| コンプレックスIV | ↑ | ↑ | ↑ | 変更なし |
| コンプレックスV | ↓ | ↓ | ↓ | 変更なし |
表2:ミトコンドリア電子輸送鎖蛋白質複合体プロファイル この表は、雌豚の行使群におけるミトコンドリアETC複合体レベルのプロファイルをまとめたものです。Complex-IVを除くすべての複合体は、年齢層全体で減少パターンを示した。
この観察は、妊娠中に運動した雌豚に生まれた子孫が、心臓組織ミトコンドリアにおけるより少ないが効率的なETC複合体を示したことを示唆している可能性がある(図4)。しかし、9ヶ月で超複合体形成が運動された群は上昇することが分かった。運動は、エネルギー需要の増加の条件における超複合体の再配置に何らかの影響を及ぼす可能性がある12。また、Complex-V(ATP合成酵素)は、出生後6ヶ月で低プロファイルを示した。この応答は、エピジェネティックに修飾されたETCタンパク質複合体の確率に起因する可能性がある。この研究のための小さなサンプルサイズ(n = 4)は、そのような結論に達するのに十分ではなかった。しかし、低ETC複雑なタンパク質レベル、高い複雑なI-II活性、および高い超錯体形成のパターンは、運動雌豚の子孫の心臓組織における生体エネルギーが運動の影響を受けることを示唆している可能性がある。ミトコンドリアETC複合体の数は少ないが効率的に作業し、超複合体の形成は興味深い現象です。このプロジェクトはまだ進行中です。
要約すると、このプロトコルは、以前に凍結されたアーカイブされた心臓組織からの単純で簡単なミトコンドリア濃縮サンプル調製を提供する。ミトコンドリアETC複合体は、多重化抗体カクテルを用いた標準免疫ブロット法により分析することができる。BN-PAGEに続いて免疫ブロット法は、超複合体の存在を分析することができる。この準備はまたユーザーがミトコンドリアETCの複雑な活動を評価することを可能にする。
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Disclosures
著者らは利益相反を宣言しない。
Acknowledgments
この研究は、カンザスシティ大学のアブドゥルバキ・アグバスに対する壁内助成金とダニエル・バレラの夏の研究フェローシップによって財政的に支援されました。著者たちはヤン・タリー博士の編集作業に感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amino caproic acid | Sigma/Aldrich | A2504-100G | |
| Anti-Hu Total OxPhos complex kit | Invitrogen | 458199 | |
| anti-VDAC antibody | abcam | ab15895 | use 1 µg/mL |
| Coomassie G-250 | ThermoSientific | 20279 | |
| Coomassie GelCode Blue | ThermoScientific | 24592 | |
| Digitonin | Cabiochem | 300410 | |
| Glass-Glass pestle homogenizer | VWR | KT885451-0020 | |
| Image Studio | LICOR | ||
| IR-Dye conjugated anti-Rabbit Ab | LICOR | LC0725 | |
| Multiwell plate reader | BioTek | Synergy HT | |
| Native molecular weight marker | ThermoFisher | BN2001 | |
| Nylon mesh monofilament | Small Part Inc | CMN-74 | |
| Orbital shaker | ThermoScientfic | ||
| PCT Shredder | Pressure Bioscience Inc | ||
| SEA BLOCK Blocking buffer | ThermoScienctific | 37527 | |
| Shredder PULSE Tube | Pressure Bioscience Inc | FT500-PS | |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5418 | |
| Trypsin | Amresco | M150-1G | |
| Trypsin inhibitor | Amresco | M191-1G | Requires fresh preparation |
References
- Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Analytical Biochemistry. 418 (2), 213-223 (2011).
- Osto, C., et al. Measuring mitochondrial respiration in previously frozen biological samples. Current Protocols in Cell Biology. 89 (1), 116 (2020).
- Agbas, A., et al. Mitochondrial electron transfer cascade enzyme activity assessment in cultured neurons and select brain regions. Current Protocols in Toxicology. 80, 73 (2019).
- Hathaway, Q. A., et al. Maternal-engineered nanomaterial exposure disrupts progeny cardiac function and bioenergetics. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 312 (3), 446-458 (2017).
- May, L. E., et al. Influence of maternal aerobic exercise during pregnancy on fetal cardiac function and outflow. American Journal of Obstetrics & Gynecology MFM. 2 (2), 100095 (2020).
- Ehler, W. J., et al. Avoidance of malignant hyperthermia in a porcine model for experimental open heart surgery. Laboratory Animal Science. 35 (2), 172-175 (1985).
- Panov, A. V., et al. Effect of bovine serum albumin on mitochondrial respiration in the brain and liver of mice and rats. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 149 (2), 187-190 (2010).
- Jha, P., Wang, X., Auwerx, J. Analysis of mitochondrial respiratory chain supercomplexes using blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Current Protocols in Mouse Biology. 6 (1), 1-14 (2016).
- Pressure Biosciences Inc. Isolation of Functional Mitochondria from Whole Rat Heart Using a PBI Shredder and Pressure Cycling Technology (PCT). , South Easton, MA. (2010).
- McLaughlin, K. L., et al. Novel approach to quantify mitochondrial content and intrinsic bioenergetic efficiency across organs. Scientific Reports. 10 (1), 17599 (2020).
- Hom, J., Sheu, S. S. Morphological dynamics of mitochondria--a special emphasis on cardiac muscle cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46 (6), 811-820 (2009).
- Greggio, C., et al. Enhanced respiratory chain supercomplex formation in response to exercise in human skeletal muscle. Cell Metabolism. 25 (2), 301-311 (2017).
