Summary
Bereiding van mitochondriën-verrijkte monsters van eerder bevroren gearchiveerde vaste weefsels stelde de onderzoekers in staat om zowel functionele als analytische beoordelingen van mitochondriën uit te voeren in verschillende experimentele modaliteiten. Deze studie toont aan hoe mitochondria-verrijkte preparaten kunnen worden bereid uit bevroren hartweefsel en analytische beoordelingen van mitochondriën kunnen worden uitgevoerd.
Abstract
Het mitochondriale elektronenoverdrachtscomplex (ETC) -profiel wordt gewijzigd in het hartweefsel van de nakomelingen die zijn geboren uit een geoefende zeug. De hypothese die werd voorgesteld en getest was dat een regelmatige maternale oefening van een zeug tijdens de zwangerschap de mitochondriale efficiëntie van de hart-energetica van het nageslacht zou verhogen. Deze hypothese werd getest door mitochondriën te isoleren met behulp van een milde isolatieprocedure om mitochondriale ETC en supercomplexprofielen te beoordelen. De hier beschreven procedure maakte de verwerking van eerder bevroren gearchiveerde hartweefsels mogelijk en elimineerde de noodzaak van verse mitochondriale voorbereiding voor de beoordeling van mitochondriale ETC-complexcomplexen, supercomplexen en ETC-complexe activiteitsprofielen. Dit protocol beschrijft de optimale ETC-eiwitcomplexmeting in multiplexed antilichaamgebaseerde immunoblotting en supercomplexe beoordeling met behulp van blue-native gel-elektroforese.
Introduction
Het doel van dit protocol was om gedetailleerde stappen te bieden om mitochondria-verrijkte preparaten te verkrijgen uit eerder bevroren hartweefsel met een nieuwe technologie van lage energie mechanische verstoring van weefsel die weefsellysis en extractie van mitochondriën verbetert. Met deze methode wordt een verbeterde extractie-efficiëntie zonder hoge schuifspanning of hoge temperatuur en een korte homogenisatietijd (10-12 s) haalbaar1.
Het verkrijgen van mitochondriën uit gearchiveerd bevroren weefsel is een waardevolle aanwinst om zowel functionele2 - als biochemische studies uit te voeren3 anders niet gemakkelijk herhaalbaar onder de exacte experimentele omstandigheden. Een klassieke Potter-Elvehjem Teflon stamperglashomogenisator of Dounce-homogenisator is gebruikt en wordt nog steeds gebruikt in onderzoekslaboratoria om zachte weefsels zoals lever, nieren en hersenen te homogeniseren. Het homogeniseren van harde weefsels zoals spieren en hart vereist echter meer homogenisatietijd, enzymbehandeling, snelle homogenisatie en uitgebreide gebruikerservaring. Dit is nadelig voor het extraheren van intacte organellen zoals mitochondriën uit hard weefsel zoals spieren en hart. De methode die in dit protocol wordt beschreven, wordt gebruikt om mitochondriaal verrijkt preparaat met hoge opbrengst te verkrijgen om mitochondriale elektronentransportketen (ETC) eiwitcomplexen en hun supercomplexe vorming te analyseren in hartweefsels geoogst van nakomelingen geboren uit geoefende en sedentaire zeug, flash-bevroren in vloeibare stikstof en opgeslagen bij -80 ° C voor toekomstig gebruik. Met deze methode kan de gebruiker mitochondriaal verrijkt preparaat isoleren uit eerder bevroren gearchiveerde weefsels.
Blootstelling aan externe nanomaterialen aan zwangere knaagdieren kan de hartfunctie en mitochondriale ademhaling en bio-energetica op nakomelingen tijdens de zwangerschap negatief beïnvloeden4. Niettemin moeten aërobe door inspanning geïnduceerde positieve veranderingen in foetale myocytenbio-energetica tijdens de zwangerschap nog worden gedocumenteerd. Opkomende studies leveren echter bewijs dat maternale aerobe oefening tijdens de zwangerschap een positieve invloed heeft op de foetale hartfunctie5. Om verder bewijs te leveren, werd een analyse uitgevoerd van de longitudinale effecten van maternale oefening op de cardiale mitochondriale respiratoire ketencomplexen van nakomelingen (d.w.z. Complex I tot en met Complex V) tijdens de zwangerschap.
Deze studie heeft een aanzienlijke gezondheidsrelevantie omdat de resultaten kunnen suggereren dat maternale oefening de efficiëntie van de energieproductie in de hartochondriën van het nageslacht verbetert. In deze studie werden zeugen (vrouwelijk varken) om twee redenen als diermodel gebruikt: (i) hartfysiologie is vergelijkbaar met die van de mens6, en (ii) hartweefseloogst van nakomelingen uit verschillende tijdspunten is haalbaar onder een institutionele IACUC-goedkeuring. De voorgestelde studie is bedoeld om veel van de fundamentele vragen te beantwoorden die moederlijke oefening en de potentiële positieve effecten ervan op de cellulaire en biochemische samenstelling van het hartweefsel van de nakomelingen verbinden. Deze aanpak vereist zachte maar effectieve mitochondriale isolatietechnieken van eerder bevroren hartweefsel verkregen uit de langdurige en kostbare longitudinale studies die de problemen van de bio-energetische veranderingen in foetale hartmyocyten tijdens de zwangerschap aanpakten. De methode die in deze studie wordt beschreven, maakt het mogelijk om grote sommen eerder bevroren gearchiveerd weefsel te gebruiken voor mitochondria-verrijkte voorbereiding voor zowel analytische als functionele studies. De studie zal ook helpen de kenniskloof op dit gebied te dichten door voorlopige gegevens te verstrekken, wat zou kunnen leiden tot toekomstige studies die de effecten van maternale lichaamsbeweging op de gezondheid van het hart in de baarmoeder en daarbuiten bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bevroren hartweefsels van nakomelingen werden ontvangen van Dr. Sean Newcomer samen met de institutionele IACUC-goedkeuringsbrief. De hartweefsels werden verkregen uit een longitudinaal onderzoek, flash-bevroren in vloeibare stikstof, en opgeslagen bij -80 °C voor toekomstig gebruik. Alle protocollen met betrekking tot de verwerking van het hartweefsel van nakomelingen volgden de richtlijnen van de IBC- en IACUC-commissies van de Kansas City University.
1. Bereiding van buffers en reagentia
OPMERKING: Bereid alle monsters voor volgens de richtlijnen van de fabrikant. Gebruik ultragezuiverd water of gelijkwaardig in alle recepten en protocolstappen. Draag persoonlijke beschermingsmiddelen (laboratoriumkleding, mondkapje, handschoenen en bril/gezichtsscherm) tijdens deze procedure. Buffervolumes zijn geschikt voor het verwerken van zes weefselmonsters.
- Bereid 1,5 l weefselwasbuffer door 154,035 g sucrose (0,3 m definitief), 3,904 g HEPES (10 mM finale), 0,111 g EDTA (0,2 mM finale) te combineren. Voeg ingrediënten toe aan 1,0 l water op de roerplaat, stel de pH in op 7,2 met verdunde HCl en make-up tot het uiteindelijke volume tot 1,5 l.
OPMERKING: Er is ongeveer 200 ml wasbuffer nodig per monster (50-300 mg). Zes weefselmonsters kunnen op een dag worden verwerkt. Gebruik de resterende wasbuffer om een isolatiebuffer te maken. - Bereid de isolatiebuffer voor uit de wasbuffer die eerder in stap 1.1 is beschreven door 210 mg BSA toe te voegen aan 210 ml wasbuffer. Stel de pH in op 7,4 met verdunde NaOH-oplossing.
OPMERKING: Er is ongeveer 35 ml isolatiebuffer nodig per weefselmonster; daarom is 210 ml isolatiebuffer vereist voor zes monsters. Bereid deze buffer door op de dag van bereiding verse BSA-oplossing (1 mg / ml finale) toe te voegen. BSA wordt gebruikt om mitochondriën te isoleren omdat het de mitochondriale eigenschappen verbetert door natuurlijke ontkoppelaars zoals vrije vetzuren te verwijderen. BSA blijkt antioxiderende activiteit te hebben door de oxidatiesnelheid van substraten, vooral succinaat, in de mitochondriën van de hersenen7 te verhogen. Als alternatief kan runderserumalbumine worden vervangen door goedkopere zuurvrije analogen zoals ovalbumine. - Bereid 150 ml resuspensiebuffer voor door 0,011 g EDTA (eindconcentratie van 0,2 mM EDTA) te combineren of gebruik 150 μL 200 mM voorraad EDTA-oplossing voor 150 ml resuspensiebuffer), 12,836 g sucrose (0,25 M sucrose eindconcentratie) en 0,236 g Tris (10 mM Tris-HCl final). Stel de pH in op 7,8 met 0,1 N NaOH. Voeg vlak voor gebruik 60 μL van de proteaseremmercocktail toe.
- Bereid de trypsineoplossing door 7,5 mg trypsine op te lossen in 3,0 ml 1 mM HCl (2,5 mg trypsine/ml finale). Deze hoeveelheid is voldoende voor één monster.
OPMERKING: Bereid de trypsineoplossing op basis van het aantal weefselmonsters dat zal worden verwerkt. - Bereid de trypsineremmeroplossing uit sojabonen door 13,0 mg trypsineremmer te combineren in 20 ml isolatiebuffer met BSA (0,65 mg/ml trypsineremmer final).
OPMERKING: Bereid een verse trypsineremmeroplossing. - Bereid het ammoniumpersulfaatreagens door 0,1 g ammoniumpersulfaat toe te voegen in 1 ml water (10% ammoniumpersulfaatfinale).
OPMERKING: Het ammoniumpersulfaatreagens moet vers worden bereid of een groot volume kan worden gealiquoteerd en bewaard in een vriezer van -20 °C. - Bereid de aminocapronzuuroplossing (ACA) door 0,131 g 6-aminocapronzuur te combineren in 1,0 ml ultragezuiverd water en bewaar het in 4 °C (1 M 6-aminocapronzuur definitief).
- Bereid de Coomassie briljante blauwe kleurstofoplossing door 1 g Coomassie G-250 op te lossen in 0,5 ml water en 0,5 ml 1 m aminocapronzuur (eindconcentratie van 10% kleurstofoplossing).
- Bereid 5% Digitonin voor Blue native-PAGE (BN-PAGE). Bereken ongeveer hoeveel digitonine nodig is in de monstervoorbereiding plus wat extra volume om de pipetteerfouten te compenseren (overschatting met 10 mg). Voor 15 mg: Verdun eerst 15 mg digitonine in 30 μL 100% DMSO. Vortex om het digitonine te helpen in de oplossing te komen. Voeg vervolgens de resterende 90% ddH2O (270 μL) toe. Verwarm zachtjes om de oplossing te mengen (vortex) en koel deze vervolgens af op ijs.
- Bereid de native PAGE-anodebuffer voor. Voeg 50 ml 20x native PAGE-lopende buffer toe aan 950 ml water om een eindvolume van 1 l te maken. Bereid verse anodebuffer voor onmiddellijk gebruik. Gebruik dit als 1x lopende buffer.
- Bereid een donkerblauwe kathodebuffer voor. Los 0,0160 g Coomassie briljantblauwe G-250 op in 80 ml native PAGE-anodebuffer; meng goed.
OPMERKING: Bereid een verse kathodebuffer voor onmiddellijk gebruik. Er kan slechts 60 ml nodig zijn, maar maak een extra 20 ml in het geval van lekken. - Bereid de lichtblauwe kathodebuffer voor. Voeg 20 ml donkerblauwe kathodebuffer toe aan 180 ml native PAGE-anodebuffer en meng goed.
OPMERKING: Deze buffer kan slechts één keer worden gebruikt. - Bereid 5% Coomassie G-250 als een monsteradditief. Verdun 200 μL van 10% Coomassie-bouillon die al is gemaakt (stap 1.8) met 200 μL van 1 M ACA en bewaar bij de 4 °C.
- Bereid 4x native PAGE-monsterbuffer voor door 40% glycerol, 0,04% Ponceau S, 25 mM Tris-HCl (pH 6,8), 192 mM glycine te combineren in 10 ml eindvolume. Vul ze toe en bewaar ze bij -20 °C in de vriezer.
2. Mitochondriale isolatie van bevroren hartweefsel
OPMERKING: Voer de mitochondriale isolatieprocedure uit in een koude ruimte van 4 °C. In geval van onbeschikbaarheid van de koelcel, gebruik dan een groot ijsbad om de procedure uit te voeren.
- Neem eerder ingevroren hartweefselmonsters uit de -80 °C vriezer.
OPMERKING: Maximaal vier weefselmonsters kunnen comfortabel worden verwerkt voor mitochondriale isolatie op een bepaalde dag. - Weeg de buis met het hartweefselmonster en noteer het gewicht. Bereid drie bekers (elk 50 ml) met 40 ml wasbuffer. Koel elk bekerglas in het ijszoutbad met gelijke hoeveelheden ijs en zout gemengd gedurende 3-5 minuten voordat u doorgaat naar de volgende stap. Plaats magnetische roerstaafjes in elk bekerglas en stel de roerder in op gemiddelde snelheid.
OPMERKING: Vries de bekers niet te veel in en gebruik ze onmiddellijk net nadat wolken ijskristallen beginnen te verschijnen. - Doe het bevroren hartweefsel direct in de ijskoude oplossing in het eerste bekerglas. Wacht ongeveer 5 minuten terwijl u roert en lichte druk uitoefent op het weefsel met een pincet om zoveel mogelijk bloed eruit te krijgen.
- Weeg de lege buis en trek af van het oorspronkelijke gewicht (stap 2.2) om een nettogewicht van het hartweefsel te verkrijgen.
- Haal het zakdoekje eruit met een tang en knijp in het hart met een schone papieren handdoek van filtreerpapier om bloed te verwijderen. Plaats vervolgens het weefsel in het tweede bekerglas. Wacht ongeveer 5 minuten tijdens het roeren om overtollig bloed te verwijderen.
- Droog het zakdoekje voorzichtig af op een papieren handdoek. Verwijder al het vet, gestold bloed, oorschelpen en fasciae (wit weefsel). Pool vervolgens het ventriculaire weefsel.
- Versnipper de weefselmonsters met behulp van de shredder door de stappen 2.7.1-2.7.9 te volgen.
- Plaats het hartweefsel (~ 50-300 mg) vanaf de ramzijde in de weefselversnipperaarkamer.
Figuur 1: Weefselversnipperaarkamer (buis) voor gebruik met de shredder. Weefselhomogenisatie in de shredderbuis vereist ongeveer 10-12 s per weefselmonster. Weefselhomogenisatie is voltooid zodra het gehomogeniseerde weefsel door de geperforeerde schijf naar de bovenste kamer gaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Voeg ~ 0,2-0,8 ml wasbuffer toe aan de dopzijde van de buis.
OPMERKING: Zorg ervoor dat het totale volume van het monster en de wasbuffer gecombineerd tijdens het versnipperen niet groter is dan 0,7-0,8 ml. - Gebruik het buisgereedschap om de shredderkamer met de shredderdop goed af te sluiten.
OPMERKING: Draai de shredderdop niet te strak aan. - Plaats de shredderkamer in de shredderhouder met de ramzijde naar beneden. De ram zal een fitting in de shredderhouder inschakelen.
- Plaats het bit van de shredderdriver; laat het bit in contact komen met de shredderdop. Zorg ervoor dat het bit goed op zijn plaats zit.
OPMERKING: Gebruik altijd de volledig opgeladen shredderdriver. - Oefen handmatig druk uit op de shredderdriver en de shredderkamer totdat de drukindicator op de shredderhouder een instelling van ongeveer 2 op de shredderhouder bereikt.
OPMERKING: De instelling kan op een hoger niveau zijn als het versnipperen van weefsel vezeliger is. - Voer de shredderdriver ongeveer 10-12 s uit door op de trigger van de shredderdriver te drukken, terwijl de instelling op 2 blijft.
- Kijk naar de buis om te controleren of alle of het grootste deel van de vaste massa van het weefsel door de lysisschijf wordt versnipperd en naar de bovenste kamer van de shredderkamer wordt gebracht door naar de buis te kijken.
OPMERKING: Het kan nodig zijn om het weefselmonster voor een langere periode te versnipperen. Breng de buis gewoon terug naar de shredderhouder en ga verder met het proces. De meeste soorten weefselmonsters vereisen slechts 10-12 s versnippering. Hoewel alle versnippering wat warmte zal produceren als gevolg van wrijving, zal deze korte verwerkingstijd het monster niet significant verwarmen. - Na het versnipperen van het monster tilt u de shredderkamer uit de houdereenheid. Gebruik het buisgereedschap om de shredderdop te verwijderen en op een schoon oppervlak te plaatsen voor later gebruik.
OPMERKING: De shredderdop moet worden beschouwd als verontreinigd met monsterextract en kan, afhankelijk van het monstertype, verontreinigd zijn met infectieus materiaal. Gebruik niet dezelfde shredderdop voor andere weefselmonsters om kruisbesmetting te voorkomen.
- Breng het versnipperde hartweefsel over in het derde bekerglas met 40 ml wasbuffer en roerstaaf en roer het weefsel gedurende 5 minuten met een gemiddelde snelheid op de roerplaat.
- Filtreer de suspensie door een nylon mesh monofilament (poriegrootte van 74 μm) en gooi het filtraat weg. Was het versnipperde weefsel 3x op het filter met 10 ml wasbuffer.
OPMERKING: Zorg ervoor dat het nylon gaas monofilament vooraf is bevochtigd met water. - Breng het gewassen en versnipperde weefsel over in een bekerglas van 50 ml met 20 ml wasbuffer en plaats het bekerglas in het ijsbad op de magneetroerder. Voeg 0,5 ml trypsine-oplossing toe terwijl u gedurende 15 minuten constant roert. Breng ongeveer halverwege de incubatie (na ongeveer 7,5 min) de weefselsuspensie over in een loszittende handheld glas-op-glas homogenisator die 0-15 ml volume vasthoudt.
Figuur 1: Weefselversnipperaarkamer (buis) voor gebruik met de shredder. Weefselhomogenisatie in de shredderbuis vereist ongeveer 10-12 s per weefselmonster. Weefselhomogenisatie is voltooid zodra het gehomogeniseerde weefsel door de geperforeerde schijf naar de bovenste kamer gaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Homogeniseren voorzichtig met 4-5 slagen om de suspensie te verspreiden zonder schuim te produceren. Plaats het homogenaat in een bekerglas van 50 ml en meng voorzichtig op een roerplaat gedurende 15 minuten bij 4 °C.
- Voeg na 15 minuten incubatie 10 ml van de isolatiebuffer die de trypsineremmer bevat toe aan het bekerglas dat het homogenaat bevat en incubeer gedurende 1 min bij 4 °C terwijl u voorzichtig roert.
- Filtreer de suspensie opnieuw door een nylon filter en bewaar het filtraat in een conische buis van 50 ml.
- Verzamel de deeltjesfractie die achterblijft op het nylonfilter en plaats deze in de glas-op-glas homogenisator. Voeg 15-20 ml van de wasbuffer toe en homogeniseer voorzichtig met de hand gedurende 25-30 s.
OPMERKING: Het filtraat stroomt in deze stap heel langzaam. Om de filtraatstroom te vergroten, plaatst u de trechterpunt die de binnenkant van de conische buis raakt. - Combineer het homogenaat met het filtraat, balanceer de buizen en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 4 °C bij 600 x g .
- Filter het resulterende supernatant in een nieuwe conische buis met behulp van een nylon filter om verontreiniging door de pellet te voorkomen. Laat de centrifuge gedurende 15 minuten bij 4 °C opnieuw op 8.500 x g draaien.
OPMERKING: Gebruik een plastic transferpipet om het supernatant te verwijderen en offer 0,2 ml supernatant op van de bovenkant van de donzige pellet. - Gooi het supernatant weg en spoel de pellet 2-3 keer af met 1 ml van de isolatiebuffer. Zorg ervoor dat u de donzige witte buitenste randlaag elke keer weggooit.
OPMERKING: Was de pellet door de isolatiebuffer toe te voegen met een pipet met een punt van 1 ml of een nieuwe transferpipet. Voeg de buffer toe aan de zijkant van de buis, niet direct boven de pellet, om te voorkomen dat de pellet breekt en om verontreiniging van het supernatant te voorkomen. Zuig vervolgens de buffer op met een transferpipet en herhaal het proces nog twee keer. - Voeg 5 ml van de isolatiebuffer toe aan elke buis en breek de pellet met een pipet met een punt van 1 ml of een nieuwe transferpipet.
- Verdun de suspensie met 20 ml extra isolatiebuffer en laat de centrifuge gedurende 15 minuten bij 4 °C opnieuw draaien bij 8.500 x g .
- Gooi het supernatant weg en suspend de pellet in 5 ml van de resuspendatiebuffer. Voeg vervolgens 15 ml meer van de buffer toe voor een totaal van 20 ml en centrifugeer bij 8.500 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg. De resulterende bruine pellet bevat gewassen intacte mitochondriën.
- Resuspend de mitochondria-verrijkte pellet in 250 μL van de resuspenderende buffer, inclusief proteaseremmers. Aliquot in 25 μL, snel invriezen in vloeibare stikstof en bewaren in een -80 °C diepvriezer gedurende meerdere jaren.
OPMERKING: Bespaar 5 μL mitochondriënverrijkt preparaat voor de eiwitanalysetest. Voor een BN-PAGE (Blue native-PAGE) studie, aliquot de geresuspendeerde pellet in 50 μg mitochondriaal eiwit per buis. Centrifugeer bij 8.500 x g gedurende 15 min bij 4 °C. Zuig het supernatant voorzichtig op en bewaar de mitochondriale pellet (50 μg eiwit/aliquot) gedurende enkele jaren in een diepvriezer van -80 °C.
3. Mitochondriale elektronenoverdracht complex (ETC) beoordeling
OPMERKING: Individuele mitochondriale ETC-eiwitten (d.w.z. Complex-I, II, III, IV, V) kunnen worden beoordeeld met behulp van een standaard immunoblotting-assay. Vanwege de verscheidenheid aan monsters (vier tijdstippen: 48 h, 3 maanden, 6 maanden, 9 maanden), twee experimentele aandoeningen (geoefend en sedentair) en een aantal immunoprobing antilichamen (vijf antilichamen), wordt een multiplexed immunoblotting aanbevolen. Voer multiplexed immunoblotting als volgt uit.
- Los 50 μg mitochondriaal verrijkt eiwitmonster / put op in 4% -20% gradiënt polyacrylamide gel elektroforese (100 V, 90 min).
- Breng de eiwitten over op een PVDF-membraan (75 V; 60 min)
- Blokkeer het membraan in een blokkerende bufferoplossing gedurende ten minste 1 uur bij 4 °C.
OPMERKING: De blokkeringstijd kan worden verlengd tot 's nachts bij 4 °C. De blokkerende buffer (Table of Materials) bevat niet-zoogdieringrediënten (d.w.z. viseiwitten) die minder snel specifieke bindingsinteracties hebben met antilichamen en andere zoogdiereiwitten die aanwezig zijn in typische methoden. - Onderzoek het membraan met de antilichaamcocktail inclusief anti-Complex-I, II, III, IV, V-antilichamen en incubeer 's nachts op een orbitale shaker bij 4 °C.
- Was de volgende dag het membraan en de sonde met IR-gelabeld secundair antilichaam gedurende 2 uur op een orbitale shaker bij RT (kamertemperatuur).
- Vijf keer wassen met 1x TBS-T (TBS met Tween 20) en één keer met 1x TBS (Tris gebufferde zoutoplossing).
OPMERKING: Neem voor de laatste wasbeurt geen wasmiddel op in de TBS-buffer. - Stel de vlek in een afbeeldingsanalysator voor.
4. De mitochondriale supercomplex beoordeling door Blue Native Poly Acrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE)
LET OP: Een supercomplex profiel van ETC kan ook worden beoordeeld door gebruik te maken van de BN-PAGE techniek.
- Bereid de monsterbuffercocktail voor op 20 μL per 50 μg mitochondria-verrijkt pelleteiwit (7 μL water + 5 μL 4x native polyacrylamide gel elektroforese monster laadbuffer + 8 μL 5% Digitonin + 2 μL Coomassie G-250).
OPMERKING: Maak een buffercocktail met voorraadmonster, afhankelijk van het aantal beschikbare monsters (50 μg eiwit /monster). Kies de juiste digitoninehoeveelheden op basis van de eiwitconcentratie van de met mitochondriën verrijkte pellet (tabel 1)8. - Verwarm de digitonin bouillon gedurende 3 minuten op 95 °C, meng en koel af op ijs voordat je de mastermix maakt.
- Voeg het Coomassie G-250 monsteradditief toe net voordat u de monsters in de gel laadt.
- Voeg 20 μL van de monsterbuffercocktail toe in een buis die 50 μg mitochondriale eiwitkorrel bevat. Verzacht/resuspend de pellet door de pellet voorzichtig te mengen met een pipet zonder schuim te genereren.
- Incubeer het mengsel gedurende 20 minuten op ijs om maximale oplosbaarheid van de met mitochondriën verrijkte pellet te bereiken. Veeg van tijd tot tijd voorzichtig met de buizen om de oplosbaarheid te verbeteren.
- Bereid in afwachting van incubatie de native PAGE-anodebuffer/1x lopende buffer en de donkerblauw gekleurde kathodebuffer voor.
- Centrifugeer de opgeloste mitochondria-verrijkte pellet bij 20.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
- Verzamel na centrifugeren 15 μL van het supernatant in nieuwe buizen die op ijs worden geplaatst.
- Voeg de juiste hoeveelheid van 5% Coomassie G-250-reagens toe aan het supernatant dat is verkregen in stap 4.8 (zie tabel 1).
OPMERKING: Het 5% Coomassie G-250-volume moet zodanig zijn dat de uiteindelijke concentratie van de kleurstof 1/4 van de wasmiddelconcentratie is. Voer deze stap uit vlak voordat u de monsters in de gel laadt.
| Eiwit | Digitonine/eiwit | 4x voorbeeldbuffer | 5% Digitonine | Water | Laatste deel | 5% Coomassie G-250 |
| verhouding (g/g) | monster additief | |||||
| 50 μg | 8 | 5 | 8 | 7 | 20 | 2 |
| 50 μg | 4 | 5 | 4 | 11 | 20 | 1 |
Tabel 1: Sample Buffer Cocktail Preparation met twee verschillende verhoudingen tussen wasmiddel en eiwit. Om maximale oplosbaarheid van membraaneiwitten uit de mitochondriale suspensie te bereiken, moet de concentratie van digitonine/mitochondriaal suspensie-eiwit worden aangepast tot tussen 4-8 g digitonine/g eiwit. In het hartweefsel werd 400 μg digitonine voor 50 μg mitochondriale suspensie-eiwitten (d.w.z. 8 g digitonine / g mitochondriaal eiwit) gebruikt om de oplosbaarheid van de supercomplexen uit de mitochondriale suspensie te maximaliseren.
- Giet een 3%-8% gradiëntgel, verwijder de kam en was de putjes van de gel met 1x lopende buffer drie keer uit.
OPMERKING: De gel polymeriseert het beste als deze een dag van tevoren wordt gegoten. - Stel het elektroforesesysteem in en plaats de gel in het apparaat.
- Vul de monsterputten met de donkerblauw gekleurde kathodebuffer.
- Laad 10 μL van de ongekleurde eiwitstandaard als een native moleculaire gewichtsmarker op de eerste en laatste put van de gel.
- Laad de volledige hoeveelheid van het monster supernatant + Coomassie monsteradditief bereid in stap 4.9 hierboven in de putjes met behulp van een gel-ladende tip met platte kop.
- Vul de minicelbufferdam voorzichtig met ongeveer 60 ml donkerblauw gekleurde kathodebuffer zonder de monsters in de putten te verstoren en vul vervolgens het buffervat met de native PAGE 1x lopende buffer.
- Zet de voeding aan en elektroforeer de monsters op 150 V gedurende ongeveer 30 minuten.
- Verwijder de donkerblauwe kleur kathodebuffer uit de bufferdam (binnenkamer) met een transferpipet of zuig de monsterputten op. Vul de binnenkamer met 150-200 ml lichtblauw gekleurde kathodebuffer en laat de elektroforese gedurende 60 minuten op 250 V draaien.
OPMERKING: De elektroforesetijd kan worden bepaald door te controleren wanneer de voorkant van de kleurstof slechts 0,5 cm boven de bodem van de gelcassette migreert. - Verwijder de gel uit de cassette en plaats deze in een schoon plastic bakje. Was de gel met gedestilleerd water van goede kwaliteit gedurende 15 minuten op een rocker / orbitale shaker.
OPMERKING: Om de verloopgel uit de cassette te verwijderen, hanteert u de cassette vanaf de onderkant, die sterker is, om de kans op breuk te minimaliseren. - Giet water af, dompel de gel onder in een voldoende hoeveelheid Coomassie GelCode Blue vlekreagens en incubeer gedurende 1 uur op een orbitaal / rocker bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Meng de blue stain reagent (Table of Materials) oplossing voor gebruik door de fles meerdere keren voorzichtig te draaien. - Decanteer de verfoplossing, voeg gedestilleerd water toe, spoel meerdere keren met water en doe vervolgens de orbitaal / rocker op om vast te houden.
OPMERKING: Steek een stuk spons (~ 3 cm x 0,5 cm) in de gel-destaining container en laat de gel voor een nacht vasthouden. De spons adsorbeert de kleurstofdeeltjes zonder dat er meerdere waterverversingen nodig zijn. - Analyseer de gel in een beeldanalysator.
5. Mitochondria supercomplex beoordeling door immunoblot blot analyse
- Voer een nieuwe set BN-PAGE uit zonder de gel aan het einde van de elektroforese te kleuren.
- Volg dezelfde procedure als in rubriek 3 (mitochondriaal elektronenoverdrachtscomplex (ETC)-beoordeling) om de immunoblotting te voltooien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Volgens het protocol werd een goede opbrengst van mitochondriën-verrijkt eiwitmengsel uit hartweefsel bereid. Ongeveer 15 mg /ml mitochondriaal verrijkt eiwitmengsel werd verkregen uit gemiddeld 1,2 g bevroren hartweefsel geoogst van de nakomelingen van de zeug. Observaties gaven aan dat minder dan 0,5 g bevroren hartweefsel niet voldoende mitochondriaal verrijkt eiwitmengsel opleverde om een BN-PAGE-test uit te voeren. De hoeveelheid mitochondriaal preparaat was voldoende om (i) een standaard immunoblotanalyse uit te voeren voor het beoordelen van de individuele elektronenoverdrachtscomplexen (ETC) (d.w.z. Complex-I, II, III, IV en Complex-V), (ii) een mitochondriale supercomplexbeoordeling door BN-PAGE en immunoblotanalyse, en (iii) beperkte enzymatische assays voor het geselecteerde complex. De cocktail van antilichamen tegen individuele ETC-eiwitcomplexen biedt technische haalbaarheid dat elk antilichaam zijn eigen doeleiwit zal herkennen in één enkele immunoblot-assay.
Mitochondria-verrijkt eiwit werd bereid uit de linker ventrikel van het hart, verkregen uit de nakomelingen van de zeug. De nakomelingen werden geboren uit twee groepen zeugen: (1) één groep werd uitgeoefend tijdens de zwangerschap en (2) één groep was sedentair. De hartweefsels van beide groepen werden geoogst op verschillende tijdstippen na de geboorte (48 uur, 3 maanden, 6 maanden en 9 maanden). Of maternale lichaamsbeweging een positieve invloed heeft op mitochondriale ETC van de nakomelingen tijdens de zwangerschap was de hypothese die in deze studie werd getest. Vier hartweefsels werden comfortabel verwerkt op een bepaalde dag als gevolg van het langdurige mitochondria-verrijkte isolatieproces.
Figuur 2: Immunoblot profiel van mitochondriale ETC complexen uit nakomelingen hartweefsel. Het mitochondriaal verrijkte eiwitmengsel werd opgelost in een 4%-20% gradiëntgel onder reducerende omstandigheden. Eiwitten werden immunoprobed door een commerciële antilichaamcocktail en anti-VDAC-antilichaam werd gebruikt voor belastingscontrole (rode kleurband). De cocktail van antilichamen werd verhoogd tegen runderhart Complex-I (antigeen NDUFB8), runderhart Complex-II (antigeen C-II30 (FeS), runderhart Complex II, III (antigeen C-III-Core 2), humaan Complex IV, subeenheid II (antigeen C-IV-II) en runderhart Complex-V (antigeen C-V-α). Het secundaire antilichaam werd gelabeld met een infraroodtag en het beeld werd geanalyseerd met behulp van een beeldanalysesoftware. Individuele complexe profielen in de leeftijdsgroepen zijn opgenomen in aanvullende figuur 1 (A-E). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2 geeft een typisch ETC-eiwitprofiel weer. Antilichaamcocktails maakten immunoblotting in een multiplexformaat mogelijk. Elk antilichaam herkende zijn eigen doeleiwit en bood een aanvaardbare resolutie. De intensiteiten van de eiwitband werden digitaal geanalyseerd. Weefsels verkregen uit de nakomelingen van geoefende zeug vertoonden relatief verminderde niveaus in sommige van de ETC-complexen (aanvullende figuren 1A-E). Het met mitochondriën verrijkte preparaat moet worden opgelost in een gradiëntgel (4% -20%) omdat de immunoprobing werd uitgevoerd in een multiplexing-formaat. Deze aanpak elimineert de noodzaak van het uitvoeren van enkele vaste percentages SDS / PAGE-gels en run-to-run variabiliteit.
Mitochondriale eiwitten werden opgelost in een 3%-8% gradiënt BN-PAGE (figuur 3A) en immunoprobed met antilichaamcocktails. In zowel geoefende als sedentaire groepen werd meerdere supercomplexe formatie waargenomen (figuur 3B).
Figuur 3: Mitochondriaal supercomplex profiel door Blue-Native Polyacrylamide gel elektroforese (BN-PAGE). (A). Mitochondriaal verrijkte eiwitmengsels werden opgelost in 3%-8% BN-PAGE en gekleurd met een Coomassie blauw reagens (Gel Code, Blue Stain Reagent). (B). Mitochondriaal verrijkte eiwitmengsels werden opgelost in een 3%-8% BN-PAGE, overgebracht op een PVDF-membraan en immunoprobed met de antilichaamcocktails voor supercomplexen. In beide testen was de eiwitbelasting 150 μg/put. Een dataverzamelingspunt van 6 maanden werd niet opgenomen vanwege een onvoldoende eiwitopbrengst tijdens de bereiding. De meest prominente supercomplexe toename die werd waargenomen was na 9 maanden in de geoefende groep in vergelijking met de sedentaire groep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Een ander gradiëntgelformaat (3%-8%) werd bereid vanwege de grote omvang van de supercomplexen die in BN-PAGE kunnen worden opgelost. Mitochondria-verrijkt preparaat beschreven in dit protocol werd gebruikt voor het meten van mitochondriale ETC complexe activiteiten. Figuur 4 geeft de gegevens weer die zijn geregistreerd voor de beoordeling van complexe I-II-activiteiten. Deze test werd uitgevoerd volgens het vastgestelde protocol3.
Figuur 4: Complexe I-II activiteitsmetingen. Mitochondria-verrijkte eiwitmengsels verkregen uit verschillende leeftijdsgroepen (48 h, 3 maanden, 6 maanden en 9 maanden) werden geanalyseerd op de Complex I-II-activiteit met behulp van een kinetische test. De geoefende groep vertoonde een verhoogde Complex I-II-activiteit in vergelijking met die van de sedentaire groep. Het verschil tussen de twee groepen was niet statistisch significant volgens een gepaarde t-test (P > 0,05). De foutbalken in de figuur vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde (SEM) voor n = 4. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur 1: (A) Complex-I profiel in alle leeftijdsgroepen. Over het algemeen vertoonden nakomelingen van de geoefende zeug lagere niveaus van Complex-I in vergelijking met die van de sedentaire groep (n = 4). Dit was meer uitgesproken in de groep van 9 maanden. (B) Complex-II-profiel in alle leeftijdsgroepen. Alle leeftijdsgroepen vertoonden lage niveaus van Complex-II in de geoefende groep met uitzondering van drie maanden cohort (n = 4). (C) Complex-III-profiel in alle leeftijdsgroepen. Alleen de leeftijdsgroep van 9 maanden vertoonde lagere niveaus van Complex-III in de geoefende groep in vergelijking met die van de sedentaire groep (n = 4). (D) Complex-IV-profiel in alle leeftijdsgroepen. Een lichte toename van de Complex-IV eiwitniveaus van de geoefende groep werd waargenomen (n = 4). (E) Het Complex-V (ATP synthase) profiel over leeftijdsgroepen heen. Zowel geoefende als sedentaire groepen vertoonden lage niveaus van Complex-V, behalve op het 48-uurs datapunt (n = 4). Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De kritieke stappen voor dit protocol worden hier aangegeven. Ten eerste moet weefselhomogenisatie zorgvuldig worden behandeld, zodat overmatige pure effecten niet worden toegepast tijdens het weefselhomogenisatieproces. Er moet een weefselversnipperaar worden gebruikt, die deel uitmaakt van de drukcyclustechnologie (PCT) voor initiële weefselhomogenisatie9. Deze stap zal de overmatige slagcyclus van glas-op-glas homogenisator verminderen (figuur 1B) die de toch al fragiele mitochondriën verder kan vernietigen als gevolg van bevroren weefselomstandigheden. Ten tweede zal het gewicht van het ingevroren weefsel belangrijk zijn om voldoende hoeveelheden van het met mitochondriën verrijkte preparaat te verkrijgen. De aanbevolen hoeveelheid startweefsel zal groter zijn dan 0,8 g, afhankelijk van de bron van het weefsel. Het hartweefsel is zeer rijk aan mitochondriën10,11; daarom zal de aanbevolen hoeveelheid voldoende zijn om een met mitochondriën verrijkt preparaat te verkrijgen. Ten derde moeten alle procedures in een koelcel worden uitgevoerd. Als er geen koude kamer beschikbaar is, is een groot ijsbad voldoende.
De haalbaarheid van het verkrijgen van mitochondriën-verrijkte preparaten uit eerder bevroren hartweefsel is aangetoond in deze studie. Dit protocol zal essentieel zijn voor het bieden van toegang tot gearchiveerd bevroren weefsel waaruit mitochondriën kunnen worden geïsoleerd en waaruit mitochondriale ETC-enzymcomplexen kunnen worden beoordeeld. Een recente studie toonde aan dat mitochondriale ademhaling van eerder ingevroren weefsels en cellen ook meetbaar kon zijn2. Vanwege deze vooruitgang kunnen onderzoekers eerder verzamelde biosamples gebruiken voor verdere analyses.
Het beoordelen van het profiel van individuele ETC en supercomplexen wordt gemakkelijker gemaakt door klassieke immunoblotting uit te voeren in een multiplexing-indeling die meerdere antilichamen gebruikt tijdens de immunoblotting-procedure op hetzelfde PVDH-membraan. Het is van cruciaal belang voor de gebruiker om de hoeveelheid eiwit te bepalen die in gels voor SDS-PAGE en BN-PAGE moet worden geladen. Het resuspensievolume moet zo minimaal mogelijk zijn om hoge eiwitconcentraties te verkrijgen, zodat de gebruiker geen probleem heeft met het laadvolume van het monster. De eiwithoeveelheid die in BN-PAGE moet worden geladen, is afhankelijk van de opbrengst van het met mitochondriën verrijkte preparaat. Een 150 μg mitochondriën-verrijkt eiwitmengsel werd per put geladen in BN-PAGE vanwege de kleine hoeveelheid oorspronkelijk hartweefsel. Het 50-150 μg mitochondriënverrijkte pelletpreparaat zou voldoende zijn voor 1 mm dikke gel. De gebruiker kan de voorkeur geven aan een 1,5 mm dikke gel voor het laden van monsters; het is echter mogelijk dat de resolutie van eiwitbanden niet van aanvaardbare kwaliteit is. De minder mitochondriale eiwitreuspensie per put werd niet getest omdat antilichaamcocktails die in immunoblot-assays werden gebruikt, vooraf bepaald waren in hun concentratie; gebruikers kunnen echter hun eigen antilichaamcocktail maken om de signaal- / ruissnelheid te verhogen.
Een volledig gepolymeriseerde gradiëntgel (3%-8%) voor BN-PAGE gels wordt aanbevolen. Gradiëntgels van 3% -8% zijn niet in de handel verkrijgbaar geweest; daarom kunnen zelfgemaakte gradiënt (3% -8%) standaard mini-gels (9 x 6 cm) worden gebruikt. Door de gel 24 uur van tevoren te gieten en de gel een nacht in RT te laten polymeriseren, zorgt u voor een acceptabele gelvorming. Als een gebruiker een betere scheiding van supercomplexen nodig heeft, wordt het aanbevolen om grotere gelformaten te gebruiken (midi-gel 13,5 cm x 6,5 cm of lange gel 28 cm x 16 cm).
De toepassing van dit protocol zal onderzoekers in staat stellen om mitochondriën te isoleren en het profiel van ETC en supercomplexen in eerder bevroren gearchiveerde weefsels te analyseren. Alle nationale en regionale biospecimenbewaarplaatsen bewaren de biosamples in ultravriescondities (d.w.z. -80 °C). Een groot aantal weefsels wordt gearchiveerd door instellingen en farmaceutische bedrijven voor verdere studies en het delen van reagentia. Het National Institute of Health (NIH) schrijft voor dat alle door de NIH ondersteunde projecten verplicht zijn om de reagentia te delen die zijn geproduceerd uit de ondersteunde projecten. Deze biorepositories zijn zeer waardevolle bronnen voor het verkrijgen van bevroren gearchiveerde weefsels voor het verkrijgen van voorlopige gegevens voor subsidieaanvragen. Het analyseren van enzymactiviteiten van supercomplexen werd niet uitgevoerd in deze studie; er zijn echter protocollen beschikbaar om dergelijke testen uit te voeren8.
Met behulp van de methoden die in dit artikel worden beschreven, werden individuele ETC-complexen en supercomplexen van met mitochondriën verrijkte preparaten verkregen uit het hartweefsel van de nakomelingen van zeugen geanalyseerd. Nakomelingen geboren uit geoefende zeugen vertoonden lage niveaus van ETC tijdens de eerste 6 maanden van hun leven en uiteindelijk nivellerend met 9 maanden.
| ETC Complex | 48 u | 3 maanden | 6 maanden | 9 maanden |
| Complex-I | ↓ | ↓ | ↓ | Geen verandering |
| Complex-II | ↓ | ↓ | Geen verandering | Geen verandering |
| Complex-III | ↓ | Geen verandering | Geen verandering | ↓ |
| Complex-IV | ↑ | ↑ | ↑ | Geen verandering |
| Complex-V | ↓ | ↓ | ↓ | Geen verandering |
Tabel 2: Mitochondriaal elektronentransportketen eiwitcomplexen profiel. De tabel geeft een overzicht van het profiel van mitochondriale ETC-complexniveaus in de geoefende groep zeugen. Alle complexen, behalve Complex-IV, vertoonden een dalend patroon in de leeftijdsgroepen.
Deze observatie kan erop wijzen dat nakomelingen van de geoefende zeugen tijdens de zwangerschap minder maar efficiëntere ETC-complexen in hun hartweefsel mitochondriën aangaven (figuur 4). De supercomplexe formatie in een geoefende groep van 9 maanden is echter verhoogd gebleken. Oefening kan op de een of andere manier de herschikking van supercomplexen beïnvloeden in omstandigheden van verhoogde energievraag12. Bovendien heeft Complex-V (ATP-synthase) in de eerste 6 maanden na de geboorte een laag profiel vertoond. Deze respons kan te wijten zijn aan de waarschijnlijkheid van epigenetisch gemodificeerde ETC-eiwitcomplexen. De kleine steekproefomvang (n = 4) voor dit onderzoek was niet voldoende om tot een dergelijke conclusie te komen; patronen van lage ETC complexe eiwitniveaus, hoge Complex I-II-activiteit en verhoogde supercomplexe vorming kunnen echter suggereren dat bio-energetica in hartweefsel van het nageslacht van geoefende zeugen worden beïnvloed door lichaamsbeweging. Minder maar efficiënter werkende mitochondriale ETC-complexen en de vorming van verhoogde supercomplexen zijn interessante verschijnselen die onderzocht moeten worden. Dit project is nog in volle gang.
Samenvattend biedt dit protocol eenvoudige en ongecompliceerde mitochondria-verrijkte monstervoorbereiding van eerder bevroren gearchiveerd hartweefsel. Mitochondriale ETC-complexen kunnen worden geanalyseerd door standaard immunoblotting met multiplexed antilichaamcocktails. BN-PAGE gevolgd door immunoblotting kan de aanwezigheid van supercomplexen analyseren. Met dit preparaat kunnen gebruikers ook mitochondriale ETC-complexe activiteiten beoordelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd financieel ondersteund door de intramurale beurs van de Kansas City University voor Abdulbaki Agbas en de Summer Research Fellowship voor Daniel Barrera. De auteurs zijn dankbaar voor het redactionele werk van Dr. Jan Talley.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amino caproic acid | Sigma/Aldrich | A2504-100G | |
| Anti-Hu Total OxPhos complex kit | Invitrogen | 458199 | |
| anti-VDAC antibody | abcam | ab15895 | use 1 µg/mL |
| Coomassie G-250 | ThermoSientific | 20279 | |
| Coomassie GelCode Blue | ThermoScientific | 24592 | |
| Digitonin | Cabiochem | 300410 | |
| Glass-Glass pestle homogenizer | VWR | KT885451-0020 | |
| Image Studio | LICOR | ||
| IR-Dye conjugated anti-Rabbit Ab | LICOR | LC0725 | |
| Multiwell plate reader | BioTek | Synergy HT | |
| Native molecular weight marker | ThermoFisher | BN2001 | |
| Nylon mesh monofilament | Small Part Inc | CMN-74 | |
| Orbital shaker | ThermoScientfic | ||
| PCT Shredder | Pressure Bioscience Inc | ||
| SEA BLOCK Blocking buffer | ThermoScienctific | 37527 | |
| Shredder PULSE Tube | Pressure Bioscience Inc | FT500-PS | |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5418 | |
| Trypsin | Amresco | M150-1G | |
| Trypsin inhibitor | Amresco | M191-1G | Requires fresh preparation |
References
- Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Analytical Biochemistry. 418 (2), 213-223 (2011).
- Osto, C., et al. Measuring mitochondrial respiration in previously frozen biological samples. Current Protocols in Cell Biology. 89 (1), 116 (2020).
- Agbas, A., et al. Mitochondrial electron transfer cascade enzyme activity assessment in cultured neurons and select brain regions. Current Protocols in Toxicology. 80, 73 (2019).
- Hathaway, Q. A., et al. Maternal-engineered nanomaterial exposure disrupts progeny cardiac function and bioenergetics. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 312 (3), 446-458 (2017).
- May, L. E., et al. Influence of maternal aerobic exercise during pregnancy on fetal cardiac function and outflow. American Journal of Obstetrics & Gynecology MFM. 2 (2), 100095 (2020).
- Ehler, W. J., et al. Avoidance of malignant hyperthermia in a porcine model for experimental open heart surgery. Laboratory Animal Science. 35 (2), 172-175 (1985).
- Panov, A. V., et al. Effect of bovine serum albumin on mitochondrial respiration in the brain and liver of mice and rats. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 149 (2), 187-190 (2010).
- Jha, P., Wang, X., Auwerx, J. Analysis of mitochondrial respiratory chain supercomplexes using blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Current Protocols in Mouse Biology. 6 (1), 1-14 (2016).
- Pressure Biosciences Inc. Isolation of Functional Mitochondria from Whole Rat Heart Using a PBI Shredder and Pressure Cycling Technology (PCT). , South Easton, MA. (2010).
- McLaughlin, K. L., et al. Novel approach to quantify mitochondrial content and intrinsic bioenergetic efficiency across organs. Scientific Reports. 10 (1), 17599 (2020).
- Hom, J., Sheu, S. S. Morphological dynamics of mitochondria--a special emphasis on cardiac muscle cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46 (6), 811-820 (2009).
- Greggio, C., et al. Enhanced respiratory chain supercomplex formation in response to exercise in human skeletal muscle. Cell Metabolism. 25 (2), 301-311 (2017).
