Summary
Utarbeidelse av mitokondri-berikede prøver fra tidligere frosne arkiverte faste vev tillot etterforskerne å utføre både funksjonelle og analytiske vurderinger av mitokondrier i ulike eksperimentelle modaliteter. Denne studien viser hvordan man forbereder mitokondri-berikede preparater fra frossent hjertevev og utfører analytiske vurderinger av mitokondrier.
Abstract
Mitokondrie-elektronoverføringskomplekset (ETC) profilen er modifisert i hjertevevet til avkom født til en utøvd så. Hypotesen som ble foreslått og testet var at en vanlig morsøvelse av en så under graviditet ville øke mitokondrieeffektiviteten til avkom hjertebioenergetikk. Denne hypotesen ble testet ved å isolere mitokondrier ved hjelp av en mild isolasjonsprosedyre for å vurdere mitokondrie ETC og supercomplex profiler. Prosedyren beskrevet her tillot behandling av tidligere frosne arkiverte hjertevev og eliminerte nødvendigheten av fersk mitokondrier forberedelse for vurdering av mitokondrie ETC-komplekser, superkompatibiliteter og ETC komplekse aktivitetsprofiler. Denne protokollen beskriver den optimale ETC-proteinkompleksmålingen i multiplekset antistoffbasert immunoblotting og superkompleks vurdering ved hjelp av blå-innfødt geleelektroforese.
Introduction
Målet med denne protokollen var å gi detaljerte trinn for å oppnå mitokondrier-beriket forberedelse fra tidligere frossent hjertevev med en ny teknologi for mekanisk forstyrrelse av vev med lav energi som forbedrer vevslys og utvinning av mitokondrier. Med denne metoden blir forbedret utvinningseffektivitet uten å generere høy skjærspenning eller høy temperatur og kort homogeniseringstid (10-12 s) oppnåelig1.
For å få mitokondrier fra arkivert frossent vev er en verdifull ressurs for å utføre både funksjonelle2 og biokjemiske studier3 ellers ikke lett repeterbar under de eksakte eksperimentelle forholdene. En klassisk Potter-Elvehjem Teflon pestle glass homogenisator eller Dounce homogenisator har blitt brukt og brukes fortsatt i forskningslaboratorier for å homogenisere bløtvev som lever, nyre og hjerne. Imidlertid krever homogenisering av harde vev som muskel og hjerte mer homogeniseringstid, enzymbehandling, høyhastighets homogenisering og omfattende brukeropplevelse. Dette er ufordelaktig for å trekke ut intakte organeller som mitokondrier fra hardt vev som muskel og hjerte. Metoden beskrevet i denne protokollen brukes til å oppnå høy avkastning mitokondri-beriket forberedelse for å analysere mitokondrie elektron transportkjede (ETC) proteinkomplekser og deres supercomplex dannelse i hjertevev høstet fra avkom født til utøvd og stillesittende så, flash-frossen i flytende nitrogen, og lagret ved -80 °C for fremtidig bruk. Denne metoden gjør det mulig for brukeren å isolere mitokondrier beriket preparat fra tidligere frosne arkiverte vev.
Ekstern nanomaterialeeksponering for gravide gnagere kan påvirke hjertefunksjonen og mitokondrie respirasjon og bioenergi negativt på avkom under svangerskapet4. Likevel er aerob treningsinduserte positive endringer i fosterets myocyttbioenergetikk under graviditet ennå ikke dokumentert. Imidlertid gir nye studier bevis på at mors aerob trening under graviditet har en positiv innflytelse på fosterets hjertefunksjon5. For å gi ytterligere bevis, ble det utført en analyse av langsgående effekter av mors trening på avkom hjerte mitokondrie respiratoriske kjedekomplekser (dvs. kompleks I gjennom kompleks V) under graviditet.
Denne studien har betydelig helserelevans siden resultatene kan tyde på at mors trening forbedrer effektiviteten av energiproduksjon i hjerte mitokondriene til avkom. I denne studien ble søer (kvinnelig gris) brukt som dyremodell av to grunner: (i) hjertefysiologi ligner på human6, og (ii) hjertevevshøst fra avkom fra forskjellige tidspunkter er mulig under en institusjonell IACUC-godkjenning. Den foreslåtte studien tar sikte på å svare på mange av de grunnleggende spørsmålene som knytter mors trening og dens potensielle positive effekter på cellulær og biokjemisk sminke av avkommets hjertevev. Denne tilnærmingen krever milde, men effektive mitokondrier isolasjon teknikker fra tidligere frossent hjertevev hentet fra lange og kostbare langsgående studier som adresserte problemene med bioenergetiske endringer innen foster hjerte myocytter under graviditeten. Metoden beskrevet i denne studien tillater bruk av store summer av tidligere frossent arkivert vev for mitokondrier-beriket forberedelse for både analytiske og funksjonelle studier. Studien vil også bidra til å fylle kunnskapsgapet på dette feltet ved å gi foreløpige data, noe som kan føre til fremtidige studier som bestemmer effekten av mors trening på hjertehelse i utero og utover.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Frosne avkom hjertevev ble mottatt fra Dr. Sean Newcomer sammen med det institusjonelle IACUC-godkjenningsbrevet. Hjertevevet ble hentet fra en langvarig langsgående studie, flashfryst i flytende nitrogen og lagret ved -80 °C for fremtidig bruk. Alle protokoller om behandling av avkom hjertevev fulgte retningslinjene til Kansas City University IBC og IACUC-komiteer.
1. Utarbeidelse av buffere og reagenser
MERK: Forbered alle prøver i henhold til produsentens retningslinjer. Bruk ultrarenset vann eller tilsvarende i alle oppskrifter og protokolltrinn. Bruk personlig verneutstyr (labgloats, ansiktsmaske, hansker og vernebriller/ansiktsskjerm) under denne prosedyren. Buffervolumer er egnet for behandling av seks vevsprøver.
- Forbered 1,5 L vevsvaskebuffer ved å kombinere 154,035 g sukrose (0,3 M endelig), 3,904 g HEPES (10 mM endelig), 0,111 g EDTA (0,2 mM endelig). Tilsett ingrediensene i 1,0 l vann mens du er på røreplaten, juster pH til 7,2 med fortynnet HCl, og sminke til sluttvolum til 1,5 L.
MERK: Omtrent 200 ml vaskebuffer er nødvendig per prøve (50-300 mg). Seks vevsprøver kan behandles på en dag. Bruk den gjenværende vaskebufferen til å lage en isolasjonsbuffer. - Klargjør isolasjonsbufferen fra vaskebufferen som tidligere er beskrevet i trinn 1.1 ved å tilsette 210 mg BSA i 210 ml vaskebuffer. Juster pH til 7,4 med fortynnet NaOH-oppløsning.
MERK: Omtrent 35 ml isolasjonsbuffer er nødvendig per vevsprøve; Derfor kreves 210 ml isolasjonsbuffer for seks prøver. Forbered denne bufferen ved å tilsette fersk BSA-løsning (1mg/ml endelig) på forberedelsesdagen. BSA brukes til å isolere mitokondrier da det forbedrer mitokondrieegenskapene ved å fjerne naturlige uncouplers som frie fettsyrer. BSA har vist seg å ha antioksidantaktivitet ved å øke oksidasjonsraten for substrater, spesielt succinate, i hjernen mitokondrier7. Alternativt kan bovint serumalbumin erstattes av billigere syrefrie analoger som ovalbumin. - Forbered 150 ml resuspensionbuffer ved å kombinere 0,011 g EDTA (sluttkonsentrasjon på 0,2 mM EDTA eller bruk 150 μL 200 mM lager EDTA-oppløsning for 150 μL 200 mM lager EDTA-oppløsning for 150 μL 200 mM lager EDTA-oppløsning 150 ml resuspensionbuffer), 12,836 g sukrose (0,25 M sukrose endelig konsentrasjon) og 0,236 g Tris (10 mM Tris-HCl finale). Juster pH til 7,8 med 0,1 N NaOH. Tilsett 60 μL av proteasehemmercocktailen rett før bruk.
- Forbered trypsinoppløsningen ved å oppløse 7,5 mg trypsin i 3,0 ml 1 mM HCl (2,5 mg trypsin/ml finale). Dette beløpet er tilstrekkelig for én prøve.
MERK: Forbered trypsinløsningen basert på antall vevsprøver som er planlagt behandlet. - Forbered trypsinhemmerløsningen fra soyabønner ved å kombinere 13,0 mg trypsinhemmer i 20 ml isolasjonsbuffer som inneholder BSA (0,65 mg/ml trypsinhemmer endelig).
MERK: Forbered en fersk trypsinhemmerløsning. - Forbered ammoniumpersulfatreagenset ved å tilsette 0,1 g ammoniumpersulfat i 1 ml vann (10% ammoniumpersulfatfinale).
MERK: Ammoniumpersulfatreagenset bør enten tilberedes ferskt, eller et stort volum kan alisiteres og oppbevares i en -20 °C fryser. - Forbered den aminokaproinsyreoppløsningen (ACA) ved å kombinere 0,131 g 6-amino caproinsyre i 1,0 ml ultrarenset vann og oppbevar den i 4 °C (1 M 6-aminokaproinsyrefinale).
- Forbered Coomassie strålende blå fargestoffløsning ved å oppløse 1 g Coomassie G-250 i 0,5 ml vann og 0,5 ml 1 M aminokaproinsyre (10% fargestoffløsning endelig konsentrasjon).
- Forbered 5% Digitonin for blå innfødt side (BN-SIDE). Omtrent beregne hvor mye digitonin som trengs i prøvepreparatet pluss noe ekstra volum for å kompensere for pipetteringsfeilene (overvurder med 10 mg). For 15 mg: For det første, fortynn 15 mg digitonin i 30 μL 100% DMSO. Vortex for å hjelpe digitonin å komme inn i løsningen. Deretter legger du til de resterende 90% av ddH2O (270 μL). Varm forsiktig for å blande løsningen (virvel), og avkjøl den deretter på is.
- Klargjør den opprinnelige PAGE-anodebufferen. Tilsett 50 ml 20 ganger ukomprimert sidekjøringsbuffer til 950 ml vann for å lage et endelig volum på 1 L. Klargjør fersk anodebuffer for umiddelbar bruk. Bruk dette som en 1x løpende buffer.
- Forbered en mørk blå katodebuffer. Løs opp 0,0160 g Coomassie strålende blå G-250 i 80 ml innfødt PAGE anode buffer; bland godt.
MERK: Klargjør fersk katodebuffer for umiddelbar bruk. Bare 60 ml kan være nødvendig, men lag en ekstra 20 ml i tilfelle lekkasjer. - Klargjør den lyseblå katodebufferen. Tilsett 20 ml mørk blå katodebuffer i 180 ml opprinnelig PAGE-anodbuffer og bland godt.
MERK: Denne bufferen kan bare brukes én gang. - Forbered 5% Coomassie G-250 som et prøvetilsetning. Fortynn 200 μL av 10% Coomassie lager allerede laget (trinn 1.8) med 200 μL av 1 M ACA og lagre ved 4 °C.
- Forbered 4x opprinnelig sideprøvebuffer ved å kombinere 40% glyserol, 0,04% Ponceau S, 25 mM Tris-HCl (pH 6,8), 192 mM glycin i 10 ml endelig volum. Aliquot dem og lagre ved -20 °C i fryseren.
2. Mitokondrier isolasjon fra frossent hjertevev
MERK: Utfør mitokondrienes isolasjonsprosedyre i et kaldt rom på 4 °C. Men i tilfelle utilgjengelighet av det kalde rommet, bruk et stort isbad for å utføre prosedyren.
- Ta ut tidligere frosne hjertevevsprøver fra -80 °C fryseren.
MERK: Maksimalt fire vevsprøver kan behandles komfortabelt for mitokondrier isolasjon på en gitt dag. - Vei røret som inneholder hjertevevsprøven og registrer vekten. Forbered tre beger (hver 50 ml) som inneholder 40 ml vaskebuffer. Avkjøl hvert beger i issaltbadet med like store mengder is og salt blandet i 3-5 minutter før du går videre til neste trinn. Sett magnetiske rørestenger i hvert beger og still inn røreren for middels hastighet.
MERK: Ikke frys begeret for mye og bruk dem umiddelbart rett etter at skyene av iskrystaller begynner å dukke opp. - Sett det frosne hjertevevet direkte inn i den iskalde løsningen i det første begeret. Vent ca 5 min mens du rører og påfør litt trykk på vevet ved hjelp av pinsett for å komme ut så mye blod som mulig.
- Vei det tomme røret og trekk fra den opprinnelige vekten (trinn 2.2) for å få en nettovekt av hjertevevet.
- Ta ut vevet med tang og klem hjertet med et rent papirhåndkle med filterpapir for å fjerne blod. Plasser deretter vevet i det andre begeret. Vent ca. 5 minutter mens du rører for å fjerne overflødig blod.
- Tørk forsiktig vevet på et papirhåndkle. Fjern alt fett, koagulert blod, aurikler og fasciae (hvitt vev). Deretter kan du samle ventrikkelvevet.
- Makuler vevsprøvene ved hjelp av makuleringsmaskinen ved å følge trinn 2.7.1-2.7.9.
- Plasser hjertevevet (~50-300 mg) i vevsmakuleringskammeret fra ramsiden.
Figur 1: Vevsmakuleringskammer (rør) for bruk med makuleringsmaskinen. Vev homogenisering i makuleringsrøret krever ca 10-12 s per vevsprøve. Vev homogenisering er fullført når det homogeniserte vevet passerer gjennom perforert disk inn i det øvre kammeret. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Tilsett ~0,2-0,8 ml vaskebuffer på hettesiden av røret.
MERK: Påse at det totale volumet på prøven og vaskebufferen som kombineres under makuleringen, ikke overstiger 0,7-0,8 ml. - Bruk rørverktøyet til å kappe makuleringskammeret med makuleringshetten tett.
MERK: Ikke stram makuleringshetten for mye. - Plasser makuleringskammeret i makuleringsholderenheten med ramsiden ned. Rammen vil gripe inn i makuleringsholderen.
- Sett inn bitset til makuleringsmaskinen. la bitset gripe inn i makuleringshetten. Pass på at bitset er godt låst på plass.
MERK: Bruk alltid den fulladede makuleringsmaskinen. - Trykk manuelt nedover på makuleringsmaskinen og makuleringskammeret til trykkindikatoren på makuleringsmaskinen når en innstilling på ca. 2 på makuleringsmaskinen.
MERK: Innstillingen kan være på et høyere nivå hvis makuleringsvevet er mer fibrøst. - Kjør makuleringsmaskinen i ca. 10-12 s ved å trykke på avtrekkeren til makuleringsmaskinen, samtidig som du opprettholder innstillingen ved 2.
- Se på røret for å sjekke om hele eller det meste av vevets faste masse makuleres gjennom lysisskiven og passerer inn i det øvre kammeret i makuleringskammeret ved å se på røret.
MERK: Det kan være nødvendig å makulere vevsprøven i en lengre periode. Bare returner røret til makuleringsmaskinen og fortsett prosessen. De fleste typer vevsprøver krever bare 10-12 s makulering. Mens all makulering vil produsere litt varme på grunn av friksjon, vil denne korte behandlingstiden ikke varme opp prøven betydelig. - Etter at du har makulert prøven, løfter du makuleringskammeret ut av holderenheten. Bruk rørverktøyet til å fjerne makuleringshetten og plassere den på et rent underlag for senere bruk.
MERK: Makuleringshetten bør betraktes som forurenset med prøveekstrakt, og avhengig av prøvetypen kan den være forurenset med smittsomme materialer. Ikke bruk samme makuleringshette til andre vevsprøver for å forhindre krysskontaminering.
- Overfør det ristede hjertevevet til det tredje begeret med 40 ml vaskebuffer og rørestang og rør vevet i 5 minutter med middels hastighet mens du er på røreplaten.
- Filtrer suspensjonen gjennom et monofilament i nylonnett (74 μm porestørrelse) og kast filtratet. Vask det ristede vevet på filteret 3x med 10 ml vaskebuffer.
MERK: Pass på at monofilamentet i nylonnettet er for fuktet med vann. - Overfør det vaskede og ristede vevet til et 50 ml beger med 20 ml vaskebuffer og legg begeret i isbadet på den magnetiske omrøreren. Tilsett 0,5 ml trypsinoppløsning mens du stadig rører i 15 min. Omtrent halvveis gjennom inkubasjonen (ca. 7,5 min), overfør vevsfjæringen til en løst montert håndholdt glass-på-glass homogenisator som holder 0-15 ml volum.
Figur 1: Vevsmakuleringskammer (rør) for bruk med makuleringsmaskinen. Vev homogenisering i makuleringsrøret krever ca 10-12 s per vevsprøve. Vev homogenisering er fullført når det homogeniserte vevet passerer gjennom perforert disk inn i det øvre kammeret. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Homogeniser forsiktig med 4-5 slag for å spre suspensjonen uten å produsere skum. Plasser homogenatet i et 50 ml beger og bland forsiktig på en røreplate i 15 min ved 4 °C.
- Etter 15 min inkubasjon, tilsett 10 ml av isolasjonsbufferen som inneholder trypsinhemmeren i begeret som inneholder homogenatet og inkuberer i 1 min ved 4 °C under forsiktig omrøring.
- Filtrer suspensjonen igjen gjennom et nylonfilter og lagre filtratet i et 50 ml konisk rør.
- Samle partikkelfraksjonen som er igjen på nylonfilteret og legg den i glass-på-glass homogenisatoren. Tilsett 15-20 ml av vaskebufferen og homogeniser forsiktig for hånd i 25-30 s.
MERK: Filtratet flyter veldig sakte på dette trinnet. For å øke filtratstrømmen, plasser traktspissen som berører innsiden av det koniske røret. - Kombiner homogenatet med filtratet, balanser rørene og sentrifugen ved 600 x g i 15 min ved 4 °C.
- Filtrer den resulterende supernatanten inn i et nytt konisk rør ved hjelp av et nylonfilter for å unngå forurensning av pelletsen. Kjør sentrifugen igjen ved 8500 x g i 15 min ved 4 °C.
MERK: Bruk en pipette for plastoverføring til å fjerne supernatanten og ofre 0,2 ml supernatant fra toppen av den myke pelletsen. - Kast supernatanten og skyll pelletsen 2-3 ganger med 1 ml isolasjonsbuffer. Sørg for å kaste det myke hvite ytre felglaget hver gang.
MERK: Vask pelletsen ved å tilsette isolasjonsbufferen med en pipette med 1 ml spiss, eller en ny overføringspipette. Tilsett bufferen på siden av røret, ikke direkte over pelletsen, for å forhindre å bryte pelletsen og forhindre forurensning av supernatanten. Deretter aspirerer du bufferen med en overføringspipette og gjentar prosessen to ganger til. - Tilsett 5 ml av isolasjonsbufferen i hvert rør og bryt opp pelletsen ved hjelp av en pipette med en 1 ml spiss, eller en ny overføringspipette.
- Fortynn suspensjonen med 20 ml ekstra isolasjonsbuffer og kjør sentrifugen igjen ved 8500 x g i 15 minutter ved 4 °C.
- Kast supernatanten og resuspender pelletsen i 5 ml av resuspendingbufferen. Tilsett deretter 15 ml mer av bufferen i totalt 20 ml, og sentrifuger ved 8500 x g i 15 min. ved 4 °C. Kast supernatanten. Den resulterende brune pellets inneholder vasket intakt mitokondrier.
- Resuspend den mitokondri-beriket pellet i 250 μL av resuspending buffer, inkludert proteasehemmere. Aliquot i 25 μL, rask frysing i flytende nitrogen, og oppbevar i en -80 °C dypfryser i flere år.
MERK: Spar 5 μL mitokondri-beriket preparat for proteinanalyseanalysen. For en BN-PAGE (Blue native-PAGE) studie, aliquot resuspended pellet i 50 μg mitokondrieprotein per rør. Sentrifuge ved 8500 x g i 15 min ved 4 °C. Aspirer forsiktig supernatanten og oppbevar mitokondriepellet (50 μg protein/aliquot) i en -80 °C dypfryser i flere år.
3. Vurdering av mitokondriell elektronoverføringskompleks (ETC)
MERK: Individuelle mitokondrie ETC-proteiner (dvs. Complex-I, II, III, IV, V) kan vurderes ved standard immunoblottinganalyse. På grunn av mangfoldet av prøver (fire tidspunkter: 48 timer, 3 måneder, 6 måneder, 9 måneder), anbefales to eksperimentelle forhold (utøvd og stillesittende), og en rekke immunoprobing antistoffer (fem antistoffer), en multiplekset immunoblotting. Utfør multiplekset immunoblotting som følger.
- Løs 50 μg mitokondrier beriket proteinprøve/brønn i 4%-20% gradient polyakrylamidgelelektroforese (100 V, 90 min).
- Overfør proteinene til en PVDF-membran (75 V; 60 min)
- Blokker membranen i en blokkeringsbufferløsning i minst 1 time ved 4 °C.
MERK: Blokkeringstiden kan forlenges i opptil natten ved 4 °C. Blokkeringsbufferen (Materialfortegnelse) inneholder ikke-pattedyringredienser (dvs. fiskeproteiner) som er mindre sannsynlig å ha spesifikke bindende interaksjoner med antistoffer samt andre pattedyrproteiner tilstede i typiske metoder. - Sonde membranen med antistoffcocktailen, inkludert anti-Complex-I, II, III, IV, V antistoffer og inkuber over natten på en orbital shaker ved 4 °C.
- Neste dag vasker du membranen og sonden med IR-merket sekundært antistoff i 2 timer på en orbital shaker ved RT (romtemperatur).
- Vask fem ganger med 1x TBS-T (TBS som inneholder Tween 20), og en gang med 1x TBS (Tris bufret saltvann).
MERK: For den siste vasken må du ikke ta med rengjøringsmiddel i TBS-bufferen. - Bilde av flekken i en bildeanalysator.
4. Mitokondrienes supercomplex-vurdering av Blue Native Poly Acrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE)
MERK: En supercomplex-profil av ETC kan også vurderes ved å bruke BN-PAGE-teknikken.
- Forbered prøvebuffercocktailen for 20 μL per 50 μg mitokondrier-beriket pelletsprotein (7 μL vann + 5 μL 4x innfødt polyakrylamidgelelektroforeseprøvelastingsbuffer + 8 μL 5% Digitonin + 2 μL Coomassie G-250).
MERK: Lag en lagerprøvebuffercocktail avhengig av antall tilgjengelige prøver (50 μg protein/prøve). Velg passende digitoninmengder basert på proteinkonsentrasjonen av mitokondrieberiket pellets (tabell 1)8. - Varm opp digitoninbestanden ved 95 °C i 3 minutter, bland og avkjøl på is før du får mesteren til å blande.
- Tilsett Coomassie G-250 prøvetilsetning rett før du legger prøvene i gelen.
- Tilsett 20 μL av prøvebuffercocktailen i et rør som inneholder 50 μg mitokondrieproteinpellet. Solubiliser/resuspender pellet ved å forsiktig blande pelletsen med en pipette uten å generere skum.
- Inkuber blandingen på is i 20 min for å oppnå maksimal solubilisering av mitokondrieberiket pellets. Fra tid til annen flikker du forsiktig rørene for å forbedre løseligheten.
- Mens du venter på inkubasjon, klargjør du den opprinnelige PAGE-anodbufferen/1x-bufferen og den mørkeblå fargede katodebufferen.
- Sentrifuger den solubiliserte mitokondri-beriket pellet ved 20.000 x g i 10 min ved 4 °C.
- Etter sentrifugering samler du 15 μL av supernatanten i nye rør plassert på is.
- Tilsett riktig mengde 5% Coomassie G-250 reagens til supernatanten oppnådd i trinn 4.8 (se tabell 1).
MERK: 5% Coomassie G-250-volumet skal være slik at den endelige konsentrasjonen av fargestoffet er 1/4 vaskemiddelkonsentrasjonen. Utfør dette trinnet rett før du laster prøvene inn i gelen.
| Protein | Digitonin/protein | 4x prøvebuffer | 5% Digitonin | Vann | Endelig volum | 5% Coomassie G-250 |
| forholdstall (g/g) | prøvetilsetning | |||||
| 50 μg | 8 | 5 | 8 | 7 | 20 | 2 |
| 50 μg | 4 | 5 | 4 | 11 | 20 | 1 |
Tabell 1: Prøvebuffercocktailforberedelse med to forskjellige vaskemiddel/ proteinforhold. For å oppnå maksimal solubilisering av membranproteiner fra mitokondrie suspensjon, bør digitonin / mitokondrie suspensjon proteinkonsentrasjon justeres til mellom 4-8 g digitonin / g protein. I hjertevevet ble 400 μg digitonin for 50 μg mitokondrie-suspensjonsproteiner (dvs. 8 g digitonin/g mitokondriprotein) brukt til å maksimere løseligheten til superkompatibilitetene fra mitokondrienes suspensjon.
- Hell en 3%-8% gradient gel, fjern kammen, og vask ut gelens brønner med 1x løpebuffer tre ganger.
MERK: Gelen polymeriserer best hvis den helles en dag før. - Sett opp elektroforesesystemet og legg gelen i apparatet.
- Fyll prøvebrønnene med den mørkeblå fargede katodebufferen.
- Last 10 μL av den unstained proteinstandarden som en innfødt molekylvektmarkør på den første og siste brønnen av gelen.
- Last hele mengden av prøven supernatant + Coomassie prøvetilsetning tilberedt i trinn 4.9 ovenfor i brønnene ved hjelp av en flat-head gel-lasting tips.
- Fyll forsiktig minicellebufferdammen med omtrent 60 ml mørk blåfarget katodebuffer uten å forstyrre prøvene i brønnene, og fyll deretter buffertanken med den opprinnelige SIDE 1x-bufferen.
- Slå på strømforsyningen og elektroforen prøvene ved 150 V i ca. 30 min.
- Fjern den mørkeblå fargekatodbufferen fra bufferdammen (indre kammer) med en overføringspipette eller aspirer prøvebrønnene. Fyll det indre kammeret med 150-200 ml lyseblå farget katodebuffer og kjør elektroforesen ved 250 V i 60 minutter.
MERK: Elektroforesetiden kan bestemmes ved å kontrollere når fargefronten migrerer bare 0,5 cm over bunnen av gelkassetten. - Fjern gelen fra kassetten og legg den i en ren plastbeholder. Vask gelen med destillert vann av god kvalitet i 15 min på en rocker /orbital shaker.
MERK: For å fjerne gradientgelen fra kassetten, håndter kassetten fra bunnen, som er sterkere, for å minimere sjansene for brudd. - Hell av vann, senk gelen i tilstrekkelig mengde Coomassie GelCode Blue flekkreagens, og inkuber i 1 time på en orbital / rocker ved romtemperatur.
MERK: Bland den blå flekkreagensen (materialbord) før bruk ved å virvle flasken forsiktig flere ganger. - Dekanter fargestoffløsningen, tilsett destillert vann, skyll flere ganger med vann, og sett deretter på orbital / rocker for destaining.
MERK: Sett et stykke svamp (~3 cm x 0,5 cm) inn i gelens avsendelsesbeholder og la gelen stå over natten. Svampen adsorberer fargepartiklene uten å kreve flere vannforandringer. - Analyser gelen i en bildeanalysator.
5. Mitokondrier supercomplex vurdering ved immunoblot blot analyse
- Utfør et nytt sett med BN-PAGE uten å fargelegge gelen på slutten av elektroforesen.
- Følg samme prosedyre som i avsnitt 3 (mitokondrie-elektronoverføringskompleks (ETC)-vurdering) for å fullføre immunoblottingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter protokollen ble det utarbeidet et godt utbytte av mitokondrier-beriket proteinblanding fra hjertevev. Omtrent 15 mg/ml mitokondri-beriket proteinblanding ble hentet fra et gjennomsnitt på 1,2 g frossent hjertevev høstet fra avkom av såret. Observasjoner indikerte at mindre enn 0,5 g frossent hjertevev ikke ga tilstrekkelig mengde mitokondrieberiket proteinblanding til å utføre en BN-PAGE-analyse. Mengden mitokondriepreparat var tilstrekkelig til å utføre (i) en standard immunoblotanalyse for å vurdere de enkelte elektronoverføringskompleksene (ETC) (dvs. Complex-I, II, III, IV og Complex-V), (ii) en mitokondrie supercomplex vurdering av BN-PAGE og immunoblotanalyse, og (iii) begrensede enzymatiske analyser for det valgte komplekset. Cocktailen av antistoffer oppdratt mot individuelle ETC-proteinkomplekser gir teknisk gjennomførbarhet at hvert antistoff vil gjenkjenne sitt eget målprotein i en enkelt immunoblotanalyse.
Mitokondrier-beriket protein ble tilberedt fra hjertets venstre ventrikel, hentet fra avkom av såret. Avkomene ble født til to grupper søer: (1) en gruppe ble utøvd under graviditeten og (2) en gruppe var stillesittende. Hjertevevet til begge gruppene ble høstet på forskjellige tidspunkter etter fødselen (48 timer, 3 måneder, 6 måneder og 9 måneder). Hvorvidt mors trening har en positiv innvirkning på mitokondrie ETC av avkom under svangerskapet var hypotesen som ble testet i denne studien. Fire hjertevev ble komfortabelt behandlet på en gitt dag på grunn av den lange mitokondri-beriket isolasjonsprosessen.
Figur 2: Immunoblot profil av mitokondrie ETC komplekser fra avkom hjertevev. Mitokondrieberiket proteinblanding ble løst i en 4% -20% gradientgel under reduserende forhold. Proteiner ble immunoprobert av en kommersiell antistoffcocktail, og anti-VDAC antistoff ble brukt til lastingskontroll (rød fargebånd). Cocktailen av antistoffer ble reist mot bovint hjerte Complex-I (antigen NDUFB8), bovint hjerte Complex-II (antigen C-II30 (FeS), bovint hjerte Complex II, III (antigen C-III-Core 2), human Complex IV, subenhet II (antigen C-IV-II) og bovint hjerte Complex-V (antigen C-V-α). Det sekundære antistoffet ble merket med en infrarød tag, og bildet ble analysert ved hjelp av en bildeanalyseprogramvare. Individuelle komplekse profiler på tvers av aldersgruppene finnes i supplerende figur 1 (A-E). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 representerer en typisk ETC-proteinprofil. Antistoffcocktails tillatt for immunoblotting i multipleksformat. Hvert antistoff anerkjente sitt eget målprotein, og ga en akseptabel oppløsning. Proteinbåndintensitetene ble analysert digitalt. Vev hentet fra avkom av utøvd så presentert relativt reduserte nivåer i noen av ETC-kompleksene (Supplerende tall 1A-E). Mitokondrieberiket preparat må løses i en gradientgel (4%-20%) da immunoprobing ble utført i et multipleksingsformat. Denne tilnærmingen vil eliminere nødvendigheten av å kjøre flere faste prosent av SDS / PAGE gels og run-to-run variability.
Mitokondrieproteiner ble løst i en 3%-8% gradient BN-PAGE (figur 3A) og immunoprobed med antistoffcocktails. I både utøvde og stillesittende grupper ble det observert flere supercomplexformasjoner (figur 3B).
Figur 3: Mitokondrie supercomplex profil av Blue-Native Polyacrylamide gel elektroforese (BN-PAGE). Mitokondrieberikede proteinblandinger ble løst i 3%-8% BN-PAGE, og farget med et Coomassie blått reagens (Gel Code, Blue Stain Reagent). (B). Mitokondrieberikede proteinblandinger ble løst i en 3%-8% BN-SIDE, overført til en PVDF-membran og immunoprobed med antistoffcocktails for superkomplekser. I begge analysene var proteinbelastningen 150 μg/brønn. Et 6-måneders datainnsamlingspunkt ble ikke inkludert på grunn av utilstrekkelig proteinutbytte under preparatet. Den mest fremtredende supercomplex økningen observert var på 9 måneder i den utøvde gruppen sammenlignet med stillesittende gruppe. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Et annet gradientgelformat (3%-8%) ble utarbeidet på grunn av den store størrelsen på superkompatibilitetene som kan løses på BN-SIDE. Mitokondri-beriket forberedelse beskrevet i denne protokollen ble brukt til måling av mitokondrie ETC komplekse aktiviteter. Figur 4 representerer data som er registrert for kompleks I-II-aktivitetsvurdering. Denne analysen ble utført i henhold til den etablerte protokollen3.
Figur 4: Komplekse I-II-aktivitetsmålinger. Mitokondrier-berikede proteinblandinger hentet fra forskjellige aldersgrupper (48 timer, 3 måneder, 6 måneder og 9 måneder) ble analysert for kompleks I-II-aktivitet ved hjelp av en kinetisk analyse. Den utøvde gruppen viste en økt kompleks I-II-aktivitet sammenlignet med stillesittende gruppe. Forskjellen mellom de to gruppene var ikke statistisk signifikant i henhold til en parvis t-test (P > 0,05). Feilfeltene som er avbildet i figuren, representerer standardfeilen for gjennomsnittet (SEM) for n = 4. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende figur 1: (A) Kompleks-I-profil på tvers av aldersgrupper. Generelt presenterte avkom født til den utøvde såen lavere nivåer av Complex-I sammenlignet med den stillesittende gruppen (n = 4). Dette var tydeligere i 9-månedersgruppen. (B) Kompleks-II-profil på tvers av aldersgrupper. Alle aldersgrupper viste lave nivåer av Kompleks-II i den utøvde gruppen med unntak av tre måneders kohort (n = 4). (C) Kompleks-III-profil på tvers av aldersgrupper. Bare 9-måneders aldersgruppen viste lavere nivåer av Kompleks-III i den utøvde gruppen sammenlignet med den stillesittende gruppen (n = 4). (D) Kompleks-IV-profil på tvers av aldersgrupper. En liten økning i complex-IV proteinnivåene til den utøvde gruppen ble observert (n = 4). (E) Complex-V (ATP synthase)-profilen på tvers av aldersgrupper. Både utøvde og stillesittende grupper viste lave nivåer av Complex-V bortsett fra ved datapunktet 48 h (n = 4). Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De kritiske trinnene for denne protokollen er angitt her. For det første bør vev homogenisering håndteres nøye slik at overdreven rene effekter ikke vil bli brukt under vev homogeniseringsprosessen. En vevsmakuleringsmaskin bør brukes, som er en del av trykksyklingsteknologi (PCT) for innledende vev homogenisering9. Dette trinnet vil redusere den overdrevne slagsyklusen til glass-på-glass homogenisator (figur 1B) som ytterligere kan ødelegge allerede skjøre mitokondrier på grunn av frosne vevsforhold. For det andre vil den frosne vevsvekten være viktig for å oppnå tilstrekkelige mengder mitokondrieberiket preparat. Den anbefalte startvevsmengden vil være større enn 0,8 g, avhengig av vevets kilde. Hjertevevet er veldig rikt på mitokondrier10,11; Derfor vil den anbefalte mengden være tilstrekkelig til å oppnå et mitokondri-beriket preparat. For det tredje bør alle prosedyrer utføres i et kaldt rom. Hvis et kaldt rom ikke er tilgjengelig, vil et stort isbad være tilstrekkelig.
Muligheten for å skaffe mitokondrier-berikede preparater fra tidligere frossent hjertevev har blitt demonstrert i denne studien. Denne protokollen vil være avgjørende for å gi tilgang til arkivert frossent vev hvorfra mitokondrier kan isoleres og hvorfra mitokondrie ETC-enzymkomplekser kan vurderes. En nylig studie viste at mitokondrie respirasjon fra tidligere frosne vev og celler kan være målbare også2. På grunn av dette fremskrittet vil etterforskere kunne bruke tidligere innsamlede biosamples for videre analyser.
For å vurdere profilen til individuelle ETC og supercomplexes er gjort enklere ved å utføre klassisk immunoblotting i et multipleksingsformat som bruker flere antistoffer under immunoblotting prosedyren på samme PVDH membran. Det er viktig for brukeren å bestemme mengden protein som skal lastes inn i geler for SDS-PAGE og BN-PAGE. Resuspension-volumet bør være så minimalt som mulig for å oppnå høye proteinkonsentrasjoner slik at brukeren ikke vil ha et problem med prøvelastingsvolumet. Proteinmengden som skal lastes i BN-PAGE avhenger av utbyttet av mitokondrieberiket preparat. En 150 μg mitokondri-beriket proteinblanding ble lastet per brønn i BN-PAGE på grunn av den lille mengden originalt hjertevev. Det 50-150 μg mitokondri-beriket pelletspreparatet ville være tilstrekkelig for 1 mm tykk gel. Brukeren kan foretrekke en 1,5 mm tykk gel for prøvelasting; Imidlertid kan oppløsningen av proteinbånd ikke være av akseptabel kvalitet. Den mindre mitokondrieprotein resuspension per brønn ble ikke testet fordi antistoff cocktailer som brukes i immunoblot analyser ble forhåndsbestemt i konsentrasjonen; Brukere kan imidlertid lage sin egen antistoffcocktail for å øke signalet / støyhastigheten.
En fullt polymerisert gradientgel (3%-8%) for BN-SIDE geler anbefales. Gradient geler på 3%-8% har ikke vært kommersielt tilgjengelig; Derfor kan hjemmelaget gradient (3%-8%) standard minigeler (9 x 6 cm) brukes. Helling av gelen 24 timer før og la gelen polymerisere over natten i RT vil gi en akseptabel geldannelse. Hvis en bruker trenger bedre separasjon av superkompatibiliteter, anbefales det å bruke større gelformater (enten midi gel 13,5 cm x 6,5 cm eller lang gel 28 cm x 16 cm).
Anvendelsen av denne protokollen vil tillate etterforskere å isolere mitokondrier og analysere profilen til ETC og superkompatibiliteter i tidligere frosne arkiverte vev. Alle nasjonale og regionale biospecimen-depoter holder biosamplene i ultrafrysingsforhold (dvs. -80 °C). Et stort antall vev arkiverers av institusjoner og legemiddelselskaper for videre studier og reagensdelingsformål. Folkehelseinstituttet (NIH) pålegger alle NIH-støttede prosjekter å dele reagensene som produseres fra de støttede prosjektene. Disse biorepositorene er svært verdifulle kilder for å skaffe frosne arkiverte vev for å skaffe foreløpige data for søknader. For å analysere enzymaktiviteter av superkompatibiliteter ble det ikke utført i denne studien; Protokoller er imidlertid tilgjengelige for å utføre slike analyser8.
Ved hjelp av metodene beskrevet i dette papiret ble individuelle ETC-komplekser og superkompatibiliteter av mitokondri-berikede preparater hentet fra hjertevevet til avkom av søer analysert. Avkom født til utøvde søer presenterte lave nivåer av ETC i løpet av de første 6 månedene av livet og til slutt flatet opp med 9 måneder.
| ETC-kompleks | 48 timer | 3 måneder | 6 måneder | 9 måneder |
| Kompleks-I | ↓ | ↓ | ↓ | Ingen endring |
| Kompleks-II | ↓ | ↓ | Ingen endring | Ingen endring |
| Kompleks-III | ↓ | Ingen endring | Ingen endring | ↓ |
| Kompleks-IV | ↑ | ↑ | ↑ | Ingen endring |
| Kompleks-V | ↓ | ↓ | ↓ | Ingen endring |
Tabell 2: Mitokondriell elektrontransportkjede proteinkomplekser profil. Tabellen oppsummerer profilen til mitokondrie ETC komplekse nivåer i den utøvde gruppen av søer. Alle komplekser, unntatt Complex-IV, viste et synkende mønster på tvers av aldersgruppene.
Denne observasjonen kan tyde på at avkom født til de utøvde søene under graviditeten indikerte færre, men mer effektive ETC-komplekser i hjertevevet mitokondrier (figur 4). Imidlertid har supercomplex formasjon i 9 måneder utøvd gruppe vist seg å være forhøyet. Trening kan på en eller annen måte påvirke omorganiseringen av superkompatibiliteter under forhold med økt energibehov12. I tillegg har Complex-V (ATP synthase) vist en lav profil de første 6 månedene etter fødselen. Dette svaret kan skyldes sannsynligheten for epigenetisk modifiserte ETC proteinkomplekser. Den lille utvalgsstørrelsen (n = 4) for denne studien var ikke tilstrekkelig til å komme frem til en slik konklusjon; Imidlertid kan mønstre med lave ETC-komplekse proteinnivåer, høy kompleks I-II-aktivitet og forhøyet supercomplexformasjon antyde at bioenergetikk i hjertevev av avkom av utøvde søer påvirkes av trening. Færre, men mer effektivt arbeidende mitokondrie ETC-komplekser og dannelsen av økte superkompatibiliteter er interessante fenomener som skal undersøkes. Dette prosjektet pågår fortsatt.
Oppsummert gir denne protokollen enkel og grei mitokondri-beriket prøvepreparering fra tidligere frossent arkivert hjertevev. Mitokondrie ETC-komplekser kan analyseres ved standard immunoblotting med multipleksede antistoffcocktailer. BN-PAGE etterfulgt av immunoblotting kan analysere tilstedeværelsen av superkompatibiliteter. Dette preparatet kan også tillate brukere å vurdere mitokondrie ETC komplekse aktiviteter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble økonomisk støttet av Kansas City Universitys intramurale stipend for Abdulbaki Agbas og Summer Research Fellowship for Daniel Barrera. Forfatterne er takknemlige for Dr. Jan Talleys redaksjonelle arbeid.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amino caproic acid | Sigma/Aldrich | A2504-100G | |
| Anti-Hu Total OxPhos complex kit | Invitrogen | 458199 | |
| anti-VDAC antibody | abcam | ab15895 | use 1 µg/mL |
| Coomassie G-250 | ThermoSientific | 20279 | |
| Coomassie GelCode Blue | ThermoScientific | 24592 | |
| Digitonin | Cabiochem | 300410 | |
| Glass-Glass pestle homogenizer | VWR | KT885451-0020 | |
| Image Studio | LICOR | ||
| IR-Dye conjugated anti-Rabbit Ab | LICOR | LC0725 | |
| Multiwell plate reader | BioTek | Synergy HT | |
| Native molecular weight marker | ThermoFisher | BN2001 | |
| Nylon mesh monofilament | Small Part Inc | CMN-74 | |
| Orbital shaker | ThermoScientfic | ||
| PCT Shredder | Pressure Bioscience Inc | ||
| SEA BLOCK Blocking buffer | ThermoScienctific | 37527 | |
| Shredder PULSE Tube | Pressure Bioscience Inc | FT500-PS | |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5418 | |
| Trypsin | Amresco | M150-1G | |
| Trypsin inhibitor | Amresco | M191-1G | Requires fresh preparation |
References
- Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Analytical Biochemistry. 418 (2), 213-223 (2011).
- Osto, C., et al. Measuring mitochondrial respiration in previously frozen biological samples. Current Protocols in Cell Biology. 89 (1), 116 (2020).
- Agbas, A., et al. Mitochondrial electron transfer cascade enzyme activity assessment in cultured neurons and select brain regions. Current Protocols in Toxicology. 80, 73 (2019).
- Hathaway, Q. A., et al. Maternal-engineered nanomaterial exposure disrupts progeny cardiac function and bioenergetics. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 312 (3), 446-458 (2017).
- May, L. E., et al. Influence of maternal aerobic exercise during pregnancy on fetal cardiac function and outflow. American Journal of Obstetrics & Gynecology MFM. 2 (2), 100095 (2020).
- Ehler, W. J., et al. Avoidance of malignant hyperthermia in a porcine model for experimental open heart surgery. Laboratory Animal Science. 35 (2), 172-175 (1985).
- Panov, A. V., et al. Effect of bovine serum albumin on mitochondrial respiration in the brain and liver of mice and rats. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 149 (2), 187-190 (2010).
- Jha, P., Wang, X., Auwerx, J. Analysis of mitochondrial respiratory chain supercomplexes using blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Current Protocols in Mouse Biology. 6 (1), 1-14 (2016).
- Pressure Biosciences Inc. Isolation of Functional Mitochondria from Whole Rat Heart Using a PBI Shredder and Pressure Cycling Technology (PCT). , South Easton, MA. (2010).
- McLaughlin, K. L., et al. Novel approach to quantify mitochondrial content and intrinsic bioenergetic efficiency across organs. Scientific Reports. 10 (1), 17599 (2020).
- Hom, J., Sheu, S. S. Morphological dynamics of mitochondria--a special emphasis on cardiac muscle cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46 (6), 811-820 (2009).
- Greggio, C., et al. Enhanced respiratory chain supercomplex formation in response to exercise in human skeletal muscle. Cell Metabolism. 25 (2), 301-311 (2017).
