Summary
Daha önce dondurulmuş arşivlenmiş katı dokulardan mitokondri ile zenginleştirilmiş örneklerin hazırlanması, araştırmacıların çeşitli deneysel yöntemlerde mitokondrilerin hem fonksiyonel hem de analitik değerlendirmelerini yapmalarına izin verdi. Bu çalışma, donmuş kalp dokusundan mitokondri ile zenginleştirilmiş preparatların nasıl hazırlanacağını ve mitokondrilerin analitik değerlendirmelerinin nasıl yapıldığını göstermektedir.
Abstract
Mitokondriyal elektron transfer kompleksi (ETC) profili, egzersiz yapılan bir ekimden doğan yavruların kalp dokusunda modifiye edilir. Önerilen ve test edilen hipotez, hamilelik sırasında bir ekimin düzenli bir anne egzersizinin yavru kalp biyoenergetiklerinin mitokondriyal verimliliğini artıracağıydı. Bu hipotez, mitokondriyal ETC ve süperkompleks profillerini değerlendirmek için hafif izolasyon prosedürü kullanılarak mitokondri izole edilmesiyle test edildi. Burada açıklanan prosedür, daha önce dondurulmuş arşivlenmiş kalp dokularının işlenmesine izin verdi ve mitokondriyal ETC komplekslerinin, süperkomplekslerin ve ETC karmaşık aktivite profillerinin değerlendirilmesi için taze mitokondri hazırlığının gerekliliğini ortadan kaldırdı. Bu protokol, çok katlı antikor bazlı immünoblojlamada optimal ETC protein kompleksi ölçümünü ve mavi-yerli jel elektroforezi kullanılarak süper karmaşık değerlendirmeyi açıklar.
Introduction
Bu protokolün amacı, doku lizizini ve mitokondri ekstraksiyonunu iyileştiren düşük enerjili dokuların düşük enerjili mekanik bozulması teknolojisi ile daha önce dondurulmuş kalp dokusundan mitokondri ile zenginleştirilmiş preparat elde etmek için ayrıntılı adımlar sağlamaktı. Bu yöntemle, yüksek kesme stresi veya yüksek sıcaklık ve kısa homojenizasyon süresi (10-12 s) üretmeden ekstraksiyon verimliliğinin artırılması ulaşılabilir hale gelir1.
Arşivlenmiş donmuş dokudan mitokondri elde etmek, hem fonksiyonel2 hem de biyokimyasal çalışmaları gerçekleştirmek için değerli bir varlıktır3 aksi takdirde tam deneysel koşullar altında kolayca tekrarlanamaz. Klasik bir Potter-Elvehjem Teflon pestle cam homojenizatörü veya Dounce homojenizatörü kullanılmıştır ve hala karaciğer, böbrek ve beyin gibi yumuşak dokuları homojenize etmek için araştırma laboratuvarlarında kullanılmaktadır. Bununla birlikte, kas ve kalp gibi homojenizasyon sert dokuları daha fazla homojenizasyon süresi, enzim tedavisi, yüksek hızlı homojenizasyon ve kapsamlı kullanıcı deneyimi gerektirir. Bu, mitokondri gibi bozulmamış organelleri kas ve kalp gibi sert dokulardan çıkarmak için dezavantajlıdır. Bu protokolde açıklanan yöntem, mitokondriyal elektron taşıma zinciri (ETC) protein komplekslerini ve bunların egzersiz ve sedanter ekime doğan yavrulardan hasat edilen, sıvı nitrojende flash dondurulan ve gelecekteki kullanım için -80 °C'de depolanan kalp dokularındaki süperkompleks oluşumunu analiz etmek için yüksek verimli mitokondri bakımından zenginleştirilmiş preparat elde etmek için kullanılır. Bu yöntem, kullanıcının daha önce dondurulmuş arşivlenmiş dokulardan mitokondri zenginleştirilmiş preparatını izole etmesini sağlar.
Hamile kemirgenlere dış nanomalzeme maruziyeti, gebelik sırasında kalp fonksiyonunu ve mitokondriyal solunumu ve biyoenergetikleri olumsuz yönde etkileyebilir4. Bununla birlikte, gebelikte fetal miyosit biyoenergetiklerinde aerobik egzersize bağlı olumlu değişiklikler henüz belgelenmiştir. Bununla birlikte, ortaya çıkan çalışmalar, hamilelik sırasında anne aerobik egzersizin fetal kardiyak fonksiyon üzerinde olumlu bir etkisi olduğuna dair kanıtlar samaktadır5. Daha fazla kanıt sağlamak için, gebelik sırasında anne egzersizinin yavru kardiyak mitokondriyal solunum zinciri kompleksleri (yani Kompleks I'den Kompleks V'ye) üzerindeki uzunlamasına etkilerinin analizi yapıldı.
Sonuçlar, anne egzersizinin yavruların kardiyak mitokondrilerinde enerji üretiminin verimliliğini artırdığını düşündürebileceğinden, bu çalışmanın sağlıkla önemli bir ilgisi vardır. Bu çalışmada, ekmekler (dişi domuz) iki nedenden dolayı hayvan modeli olarak kullanılmıştır: (i) kardiyak fizyoloji insan6'ya benzer ve (ii) farklı zaman noktalarından yavrulardan kalp dokusu hasadı kurumsal bir IACUC onayı altında mümkündür. Önerilen çalışma, anne egzersizini ve yavruların kalp dokusunun hücresel ve biyokimyasal makyajı üzerindeki potansiyel olumlu etkilerini bağlayan temel soruların çoğunu yanıtlamayı amaçlamaktadır. Bu yaklaşım, gebelik sırasında fetal kardiyak miyositler içindeki biyoenergetik değişikliklerin sorunlarını ele alan uzun ve maliyetli boyuna çalışmalardan elde edilen daha önce dondurulmuş kardiyak dokudan nazik ama etkili mitokondri izolasyon teknikleri gerektirir. Bu çalışmada açıklanan yöntem, hem analitik hem de fonksiyonel çalışmalar için mitokondri ile zenginleştirilmiş hazırlık için daha önce dondurulmuş arşivlenmiş dokunun büyük miktarda kullanılmasını sağlar. Çalışma ayrıca, anne egzersizinin rahim ve ötesinde kalp sağlığı üzerindeki etkilerini belirleyen gelecekteki çalışmalara yol açabilecek ön veriler sağlayarak bu alandaki bilgi boşluğunun doldurulmasına yardımcı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dondurulmuş yavru kalp dokuları, kurumsal IACUC onay mektubu ile birlikte Dr. Sean Newcomer'dan alındı. Kalp dokuları uzun süreli uzunlamasına bir çalışmadan elde edildi, sıvı nitrojende flaş donduruldu ve ileride kullanılmak üzere -80 °C'de depolandı. Yavru kalp dokusunun işlenmesiyle ilgili tüm protokoller Kansas City Üniversitesi IBC ve IACUC komitelerinin yönergelerine uydu.
1. Tamponların ve reaktiflerin hazırlanması
NOT: Tüm numuneleri üreticinin yönergelerine göre hazırlayın. Tüm tariflerde ve protokol adımlarında ultra saflaştırılmış su veya eşdeğeri kullanın. Bu işlem sırasında kişisel koruma ekipmanı (laboratuvar böbürlenmeleri, yüz maskesi, eldiven ve gözlük/yüz kalkanı) giyin. Tampon hacimleri altı doku örneğinin işlenmesi için uygundur.
- 154.035 g sakkaroz (0,3 M finali), 3,904 g HEPES (10 mM final), 0,111 g EDTA (0,2 mM final) birleştirerek 1,5 L doku yıkama tamponu hazırlayın. Karıştırma plakasındayken 1,0 L suya malzemeler ekleyin, pH'ı seyreltilmiş HCl ile 7,2'ye ve son hacme kadar makyajı 1,5 L'ye ayarlayın.
NOT: Numune başına yaklaşık 200 mL yıkama tamponu gereklidir (50-300 mg). Bir günde altı doku örneği işlenebilir. İzolasyon arabelleği yapmak için kalan yıkama arabelleği kullanın. - 210 mL yıkama arabelleğine 210 mg BSA ekleyerek, daha önce 1.1 adımında açıklanan yıkama tamponundan yalıtım tamponu hazırlayın. Seyreltilmiş NaOH çözeltisi ile pH'ı 7,4'e ayarlayın.
NOT: Doku örneği başına yaklaşık 35 mL izolasyon tamponu gereklidir; bu nedenle, altı numune için 210 mL yalıtım tamponu gereklidir. Hazırlık gününde taze BSA çözeltisi (1mg/mL finali) ekleyerek bu tamponu hazırlayın. BSA, serbest yağ asitleri gibi doğal uncoupler'ları çıkararak mitokondriyal özellikleri iyileştirdiği için mitokondrileri izole etmek için kullanılır. BSA'nın beyin mitokondrisinde başta süksinit olmak üzere substratların oksidasyon oranını artırarak antioksidan aktiviteye sahip olduğu bulunmuştur7. Alternatif olarak, sığır serum albümini ovalbumin gibi daha az pahalı asitsiz analoglarla ikame edilebilir. - 0,011 g EDTA 'yı birleştirerek 150 mL resüspensiyon tamponu hazırlayın (0,2 mM EDTA'nın son konsantrasyonu veya 200 mM stok EDTA çözeltisinin 150 μL'si kullanın 150 mL resüspenzyon tamponu), 12.836 g sakkaroz (0.25 M sakkaroz son konsantrasyonu) ve 0.236 g Tris (10 mM Tris-HCl finali). 0,1 N NaOH ile pH'ı 7,8'e ayarlayın. Kullanmadan hemen önce proteaz inhibitörü kokteylinin 60 μL'sini ekleyin.
- 7,5 mg tripsin 3,0 mL 1 mM HCl (2,5 mg tripsin/mL finali) çözünerek tripsin çözeltisini hazırlayın. Bu miktar bir örnek için yeterlidir.
NOT: Tripsin çözeltisini işlenmesi planlanan doku örneklerinin sayısına göre hazırlayın. - BSA (0.65 mg/mL tripsin inhibitörü finali) içeren 20 mL izolasyon tamponunda 13.0 mg tripsin inhibitörünü birleştirerek soya fasulyesinden tripsin inhibitörü çözeltisini hazırlayın.
NOT: Yeni bir tripsin inhibitörü çözeltisi hazırlayın. - 1 mL suya 0,1 g amonyum persülfat ekleyerek amonyum persülfat reaktifini hazırlayın (%10 amonyum persülfat finali).
NOT: Amonyum persülfat reaktifi taze olarak hazırlanmalı veya büyük bir hacim aliquoted ve -20 °C dondurucuda tutulabilir. - 0,131 g 6-amino kaproik asidi 1,0 mL ultra saflaştırılmış suda birleştirerek aminokproik asit çözeltisini (ACA) hazırlayın ve 4 °C'de (1 M 6-aminocaproik asit finali) saklayın.
- 0,5 mL suda 1 g Coomassie G-250 ve 1 M aminokeproik asit (%10 boya çözeltisi son konsantrasyonu) 0,5 mL çözünerek Coomassie parlak mavi boya çözeltisini hazırlayın.
- Mavi yerel PAGE (BN-PAGE) için %5 Digitonin hazırlayın. Örnek hazırlamada ne kadar digitonin gerektiğini ve pipetleme hatalarını dengelemek için biraz ekstra hacim (10 mg ile abartın) yaklaşık olarak hesaplayın. 15 mg için: İlk olarak, 15 mg digitonin 30 μL%100 DMSO'da seyreltin. Vortex, digitonin çözüme girmesine yardımcı olmak için. Ardından, ddH2O'nun (270 μL) kalan% 90'ını ekleyin. Çözeltiyi (girdap) karıştırmak için hafifçe ısıtın ve ardından buz üzerinde soğutun.
- Yerel PAGE anot arabelleği hazırlayın. 1 L'lik son bir hacim yapmak için 950 mL suya 50 mL 20x yerel PAGE çalışan tampon ekleyin. Bunu 1x çalışan arabellek olarak kullanın.
- Koyu mavi bir katot tamponu hazırlayın. 0.0160 g Coomassie parlak mavi G-250'yi 80 mL yerel PAGE anot tamponunda çözün; iyice karıştırın.
NOT: Hemen kullanım için taze katot tamponu hazırlayın. Sadece 60 mL gerekebilir, ancak herhangi bir sızıntı durumunda ekstra 20 mL yapın. - Açık mavi katot tamponu hazırlayın. 180 mL yerel PAGE anot tamponuna 20 mL koyu mavi katot tamponu ekleyin ve iyice karıştırın.
NOT: Bu arabellek yalnızca bir kez kullanılabilir. - Örnek katkı maddesi olarak %5 Coomassie G-250 hazırlayın. 200 μL%10 Coomassie stoğunun 200 μL'si 1 M ACA ile yapılmış (adım 1,8) seyreltin ve 4 °C'de saklayın.
- 10 mL son hacimde %40 gliserol, %0,04 Ponceau S, 25 mM Tris-HCl (pH 6,8), 192 mM glisin birleştirerek 4x doğal PAGE örnek tamponu hazırlayın. Aliquot onları ve dondurucuda -20 °C'de saklayın.
2. Donmuş kalp dokusundan Mitokondri izolasyonu
NOT: Mitokondri izolasyon prosedürünü 4 °C soğuk bir odada gerçekleştirin. Bununla birlikte, soğuk odanın kullanılamaması durumunda, prosedürü gerçekleştirmek için büyük boyutlu bir buz banyosu kullanın.
- -80 °C dondurucudan önceden dondurulmuş kalp dokusu örneklerini alın.
NOT: Belirli bir günde mitokondri izolasyonu için en fazla dört doku örneği rahatça işlenebilir. - Kalp dokusu örneğini içeren tüpü tartın ve ağırlığı kaydedin. 40 mL yıkama tamponu içeren üç beher (her biri 50 mL) hazırlayın. Bir sonraki adıma geçmeden önce her bir kabı buz tuzu banyosunda 3-5 dakika boyunca karıştırılarak eşit miktarda buz ve tuzla soğutun. Her bir kabın içine manyetik karıştırma çubukları koyun ve karıştırıcıyı orta hız için ayarlayın.
NOT: Beherleri aşırı dondurmayın ve buz kristalleri bulutları ortaya çıkmaya başladıktan hemen sonra kullanın. - Donmuş kalp dokusunu doğrudan ilk beherdeki buz gibi çözeltiye koyun. Mümkün olduğunca fazla kan almak için cımbız kullanarak dokuya hafif basınç uygularken yaklaşık 5 dakika bekleyin.
- Boş tüpü tartın ve kalp dokusunun net ağırlığını elde etmek için orijinal ağırlıktan çıkarın (adım 2.2).
- Dokuyu tokalarla çıkarın ve kanı çıkarmak için kalbi temiz bir kağıt havlu ile sıkın. Daha sonra, dokuyu ikinci kabın içine yerleştirin. Fazla kanı çıkarmak için karıştırırken yaklaşık 5 dakika bekleyin.
- Kağıdı kağıt havlu üzerinde hafifçe kurulayın. Tüm yağ, pıhtılaşmış kan, kulak kepçesi ve fasyayı (beyaz doku) çıkarın. Sonra, ventrikül dokusunu bire birler.
- 2.7.1-2.7.9 adımlarını izleyerek parçalayıcıyı kullanarak doku örneklerini parçala.
- Kalp dokusunu (~50-300 mg) koç tarafından doku öğütücü odasına yerleştirin.
Şekil 1: Öğütücü ile kullanılmak üzere doku öğütücü odası (tüp). Parçalayıcı tüpteki doku homojenizasyonu, doku örneği başına yaklaşık 10-12 s gerektirir. Homojenize doku delikli diskten üst odaya geçtikten sonra doku homojenizasyonu tamamlanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
- Tüpün kapak tarafına ~0,2-0,8 mL yıkama tamponu ekleyin.
NOT: Parçalama sırasında birleştirilen numunenin toplam hacminin ve yıkama tamponunun 0,7-0,8 mL'yi aşmamasını sağlayın. - Parçalayıcı odasını parçalayıcı kapağıyla sıkıca kaplamak için tüp aracını kullanın.
NOT: Öğütücü kapağını fazla sıkmayın. - Öğütücü haznesini, koç tarafı aşağı olacak şekilde öğütücü tutucu ünitesine yerleştirin. Koç, öğütücü tutucuya bir bağlantı elemanı takacaktır.
- Öğütücü sürücüsünün bitini takın; parçalayıcı kapağı ile bit meşgul izin verin. Parçanın sıkıca yerine kilitlendiğinden emin olun.
NOT: Her zaman tam şarjlı öğütücü sürücüsünü kullanın. - Öğütücü tutucu üzerindeki basınç göstergesi öğütücü tutucuda yaklaşık 2 ayara ulaşana kadar öğütücü sürücüsüne ve öğütücü odasına aşağı doğru basınç uygulayın.
NOT: Parçalanan doku daha lifliyse ayar daha yüksek bir seviyede olabilir. - Ayarı 2'de tutarken, öğütücü sürücüsünün tetiğine basarak öğütücü sürücüsünü yaklaşık 10-12 sn çalıştırın.
- Dokunun katı kütlesinin tamamının mı yoksa çoğunun lizis diskinden mi parçalandığını ve tüpe bakarak parçalayıcı odasının üst odasına geçirilip geçirilmediğini kontrol etmek için tüpe bakın.
NOT: Doku örneğinin daha uzun süre parçalanarak parçalanması gerekebilir. Tüpü öğütücü tutucuya geri verin ve işleme devam edin. Doku örneklerinin çoğu sadece 10-12 s parçalama gerektirir. Tüm parçalama sürtünme nedeniyle bir miktar ısı üretecek olsa da, bu kısa işlem süresi numuneyi önemli ölçüde ısıtmayacaktır. - Numuneyi parçaladıktan sonra, öğütücü haznesini tutucu ünitesinden kaldırın. Parçalayıcı kapağını çıkarmak ve daha sonra kullanmak üzere temiz bir yüzeye yerleştirmek için tüp aracını kullanın.
NOT: Öğütücü kapağı numune özü ile kontamine olarak kabul edilmelidir ve numune tipine bağlı olarak enfeksiyöz malzemelerle kontamine olabilir. Çapraz kontaminasyonu önlemek için diğer doku örnekleri için aynı öğütücü kapağı kullanmayın.
- Parçalanmış kalp dokusunu 40 mL yıkama tamponu ile üçüncü kabın içine aktarın ve çubuğu karıştırın ve karıştırma plakasındayken orta hızda 5 dakika boyunca dokuyu karıştırın.
- Süspansiyonu naylon ağ monofilamenti (74 μm gözenek boyutu) ile filtreleyin ve filtratı atın. 10 mL yıkama tamponu ile 3x filtre üzerindeki parçalanmış dokuyu yıkayın.
NOT: Naylon ağ monofilamentinin su ile önceden ıslatıldığından emin olun. - Yıkanmış ve parçalanmış dokuyu 20 mL yıkama tamponu ile 50 mL'lik bir behere aktarın ve kabı manyetik karıştırıcı üzerindeki buz banyosuna yerleştirin. 15 dakika boyunca sürekli karıştırırken 0,5 mL tripsin çözeltisi ekleyin. Kuluçkanın yaklaşık yarısında (yaklaşık 7,5 dk), doku süspansiyonunu 0-15 mL hacim tutacak gevşek bir şekilde monte edilmiş el camı cam homojenizatöre aktarın.
Şekil 1: Öğütücü ile kullanılmak üzere doku öğütücü odası (tüp). Parçalayıcı tüpteki doku homojenizasyonu, doku örneği başına yaklaşık 10-12 s gerektirir. Homojenize doku delikli diskten üst odaya geçtikten sonra doku homojenizasyonu tamamlanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
- Köpüğü üretmeden süspansiyonu dağıtmak için 4-5 vuruşla hafifçe homojenize edin. Homojenatı 50 mL'lik bir kabın içine yerleştirin ve 4 °C'de 15 dakika boyunca karıştırma plakasında hafifçe karıştırın.
- 15 dakikalık inkübasyondan sonra, tripin inhibitörini içeren izolasyon tamponunun 10 mL'lik kısmını homojenatı içeren kabın içine ekleyin ve hafifçe karıştırırken 4 °C'de 1 dakika kuluçkaya yatırın.
- Süspansiyonu bir naylon filtreden tekrar filtreleyin ve filtratları 50 mL konik bir tüpe kaydedin.
- Naylon filtrede kalan partikül fraksiyonunu toplayın ve cam üzerindeki homojenizatöre yerleştirin. Yıkama tamponunun 15-20 mL'sini ekleyin ve 25-30 sn boyunca elle hafifçe homojenize edin.
NOT: Filtrat bu adımda çok yavaş akar. Filtrat akışını artırmak için, konik tüpün içine dokunan huni ucunu yerleştirin. - Homojenatı filtratla birleştirin, tüpleri dengeleyin ve 4 °C'de 15 dakika boyunca 600 x g'da santrifüj.
- Pelet tarafından kirlenmeyi önlemek için naylon filtre kullanarak elde edilen süpernatant'ı yeni bir konik tüpe filtreleyin. Santrifüjü 4 °C'de 15 dakika boyunca 8.500 x g'da tekrar çalıştırın.
NOT: Süpernatant kaldırmak ve kabarık pelet üstten 0.2 mL supernatant feda etmek için plastik bir transfer pipet kullanın. - Süpernatant atın ve 1 mL izolasyon tamponu ile peleti 2-3 kez durulayın. Kabarık beyaz dış kenar tabakasını her seferinde attığından emin olun.
NOT: İzolasyon tamponunu 1 mL uçlu bir pipet veya yeni bir transfer pipeti kullanarak ekleyerek peleti yıkayın. Peletin kırılmasını önlemek ve süpernatant kirlenmesini önlemek için tamponu doğrudan peletin üzerine değil, tüpün yanına ekleyin. Ardından, arabelleği bir aktarım pipetiyle aspire edin ve işlemi iki kez daha tekrarlayın. - Her tüpe 5 mL izolasyon tamponu ekleyin ve peleti 1 mL uçlu bir pipet veya yeni bir transfer pipeti kullanarak parçalayın.
- Süspansiyonu 20 mL ek izolasyon tamponu ile seyreltin ve santrifüjü 4 °C'de 15 dakika boyunca 8.500 x g'da tekrar çalıştırın.
- Üstnatant atın ve pellet resüse edici tamponun 5 mL'sinde yeniden süzülür. Ardından, toplam 20 mL için tampondan 15 mL daha ekleyin ve 4 °C'de 15 dakika boyunca 8.500 x g'da santrifüj ekleyin. Üstnatant atın. Elde edilen kahverengi pelet yıkanmış bozulmamış mitokondri içerir.
- Mitokondri ile zenginleştirilmiş peleti, proteaz inhibitörleri de dahil olmak üzere, canlandırma tamponunun 250 μL'sinde yeniden sunun. 25 μL'de aliquot, sıvı nitrojende hızlı donma ve birkaç yıl boyunca -80 °C derin dondurucuda saklayın.
NOT: Protein analizi tahlil için 5 μL mitokondri ile zenginleştirilmiş preparat yedek. Bir BN-PAGE (Mavi yerel PAGE) çalışması için, tüp başına 50 μg mitokondriyal proteinde yeniden canlanan pelet aliquot. 4 °C'de 15 dakika boyunca 8.500 x g'da santrifüj. Süpernatantı dikkatlice emiş ve mitokondriyal peleti (50 μg protein / aliquot) birkaç yıl boyunca -80 ° C derin dondurucuda saklayın.
3. Mitokondriyal elektron transfer kompleksi (ETC) değerlendirmesi
NOT: Bireysel mitokondriyal ETC proteinleri (yani, Complex-I, II, III, IV, V) standart immünblotting tahlil ile değerlendirilebilir. Örneklerin çeşitliliği (dört zaman noktası: 48 saat, 3 ay,6 ay, 9 ay), iki deneysel durum (egzersiz ve sedanter) ve bir dizi immünprobing antikoru (beş antikor) nedeniyle çok yönlü bir immünblotting önerilir. Multipleksli immünblotting aşağıdaki gibi gerçekleştirin.
- 50 μg mitokondri zenginleştirilmiş protein örneğini/kuyusunu %4-%20 gradyan poliakrilamid jel elektroforezinde (100 V, 90 dk) çözün.
- Proteinleri bir PVDF membranına aktarın (75 V; 60 dk)
- Membranı 4 °C'de en az 1 saat boyunca bir engelleme tampon çözeltisinde engelleyin.
NOT: Engelleme süresi 4 °C'de bir geceye kadar uzatılabilir. Blokaj tamponu (Malzeme Tablosu), tipik yöntemlerde bulunan diğer memeli proteinlerinin yanı sıra antikorlarla spesifik bağlayıcı etkileşimlere sahip olma olasılığı daha düşük olan memeli olmayan bileşenler (yani balık proteinleri) içerir. - Anti-Complex-I, II, III, IV, V antikorlarını içeren antikor kokteyli ile membranı araştırın ve 4 °C'de bir yörünge çalkalayıcıda bir gecede kuluçkaya yatırın.
- Ertesi gün, rt (oda sıcaklığı) bir orbital çalkalayıcı üzerinde 2 saat boyunca IR etiketli ikincil antikor ile membran ve prob yıkayın.
- 1x TBS-T (Ara 20 içeren TBS) ve 1x TBS (Tris tamponlu salin) ile bir kez beş kez yıkayın.
NOT: Son yıkama için TBS tamponuna deterjan eklemeyin. - Görüntü çözümleyicisinde lekeyi görüntüleyin.
4. Mavi Yerli Poli Akrilamid Jel Elektroforez (BN-PAGE) tarafından mitokondri süpercomplex değerlendirmesi
NOT: ETC'nin süpercomplex profili BN-PAGE tekniği kullanılarak da değerlendirilebilir.
- Örnek tampon kokteylini 50 μg mitokondri ile zenginleştirilmiş pelet proteini başına 20 μL için hazırlayın (7 μL su + 5 μL 4x yerli poliakrilamid jel elektroforez numune yükleme tamponu + 8 μL% 5 Digitonin + 2 μL Coomassie G-250).
NOT: Mevcut numune sayısına (50 μg protein/numune) bağlı olarak bir stok numune tampon kokteyli yapın. Mitokondri ile zenginleştirilmiş peletin protein konsantrasyonuna göre uygun digitonin miktarlarını seçin (Tablo 1)8. - Digitonin stoğunu 95 °C'de 3 dakika ısıtın, karıştırın ve ana karışımı yapmadan önce buz üzerinde soğutun.
- Numuneleri jel içine yüklemeden hemen önce Coomassie G-250 numune katkı maddesini ekleyin.
- 50 μg mitokondriyal protein pelet içeren bir tüpe 20 μL numune tampon kokteyli ekleyin. Köpüğü üretmeden peleti hafifçe pipetle karıştırarak çözün/yeniden diriltin.
- Mitokondri ile zenginleştirilmiş peletin maksimum çözünmesi için karışımı 20 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın. Zaman zaman, çözünürlüğü arttırmak için tüpleri hafifçe hafifçe kaydırın.
- İnkübasyon beklerken, yerel PAGE anot arabelleği/1x çalışan arabelleği ve koyu mavi renkli katot arabelleği hazırlayın.
- Çözünürize mitokondri ile zenginleştirilmiş peleti 4 °C'de 10 dakika boyunca 20.000 x g'da santrifüj edin.
- Santrifüjlemeden sonra, 15 μL süpernatantı buza yerleştirilen yeni tüplere toplayın.
- Adım 4.8'de elde edilen süpernatanta uygun miktarda %5 Coomassie G-250 reaktif ekleyin ( Tablo 1'e bakın).
NOT: % 5 Coomassie G-250 hacmi, boyanın son konsantrasyonu deterjan konsantrasyonunun 1/4'ü olacak şekilde olmalıdır. Numuneleri jel içine yüklemeden hemen önce bu adımı gerçekleştirin.
| Protein | Digitonin/protein | 4x Örnek Arabellek | %5 Digitonin | Su | Son ses düzeyi | %5 Coomassie G-250 |
| oran (g/g) | numune katkı maddesi | |||||
| 50 μg | 8 | 5 | 8 | 7 | 20 | 2 |
| 50 μg | 4 | 5 | 4 | 11 | 20 | 1 |
Tablo 1: İki farklı deterjan/protein oranına sahip Örnek Tampon Kokteyl Hazırlama. Membran proteinlerinin mitokondriyal süspansiyondan maksimum çözünmesi için, digitonin/mitokondriyal süspansiyon protein konsantrasyonu 4-8 g digitonin/g protein arasında ayarlanmalıdır. Kalp dokusunda, mitokondri süspansiyonundan süperkomkomlerin çözünürlüğünü en üst düzeye çıkarmak için 50 μg mitokondriyal süspansiyon proteinleri (yani, 8 g digitonin/g mitokondri proteini) için 400 μg digitonin kullanılmıştır.
- % 3-8 gradyan jel dökün, tarağı çıkarın ve jelin kuyularını 1x çalışan tamponla üç kez yıkayın.
NOT: Jel bir gün önce dökülürse en iyi polimerize olur. - Elektroforezi sistemini kurun ve jeli aparatın içine yerleştirin.
- Numune kuyularını koyu mavi renkli katot tamponu ile doldurun.
- Jelin ilk ve son kuyusuna yerel moleküler ağırlık belirteci olarak 10 μL'lik bir protein standardı yükleyin.
- Yukarıdaki 4.9.
- Kuyulardaki numuneleri bozmadan mini hücre tampon barajını yaklaşık 60 mL koyu mavi renkli katot tamponu ile dikkatlice doldurun ve ardından tampon tankını yerel PAGE 1x çalışan tamponla doldurun.
- Güç kaynağını açın ve numuneleri yaklaşık 30 dakika boyunca 150 V'ta elektrofor olarak açın.
- Koyu mavi renkli katot tamponu bir transfer pipeti ile tampon barajından (iç oda) çıkarın veya numune kuyularını aspire edin. İç odayı 150-200 mL açık mavi renkli katot tamponu ile doldurun ve elektroforez 250 V'ta 60 dakika çalıştırın.
NOT: Elektroforezi süresi, boya cephesinin jel kasetin dibinden sadece 0,5 cm yukarı ne zaman göç ettiği kontrol edilerek belirlenebilir. - Jeli kasetten çıkarın ve temiz bir plastik kaba yerleştirin. Jeli kaliteli damıtılmış su ile bir rocker / orbital çalkalayıcı üzerinde 15 dakika yıkayın.
NOT: Degrade jeli kasetten çıkarmak için, kırılma olasılığını en aza indirmek için kaseti daha güçlü olan alttan alın. - Suyu dökün, jeli yeterli miktarda Coomassie GelCode Mavi leke reaktifine daldırin ve oda sıcaklığında bir orbital / rocker üzerinde 1 saat kuluçkaya yatırın.
NOT: Şişeyi birkaç kez hafifçe döndürerek kullanmadan önce Mavi leke reaktifi (Malzeme Masası) çözeltisini karıştırın. - Boya çözeltisini dekante edin, damıtılmış su ekleyin, suyla birkaç kez durulayın ve ardından destaining için orbital / rocker'ı koyun.
NOT: Jel destaining kabına bir parça sünger (~3 cm x 0,5 cm) yerleştirin ve jeli gece boyunca destaining için bırakın. Sünger, birden fazla su değişikliği gerektirmeden boya parçacıklarını adsorbe eder. - Görüntü çözümleyicisinde jeli analiz edin.
5. İmmünoblot blot analizi ile Mitokondri süpercomplex değerlendirmesi
- Elektroforezin sonundaki jeli lekelemeden yeni bir BN-PAGE seti gerçekleştirin.
- İmmünblottlamayı tamamlamak için bölüm 3'teki (mitokondriyal elektron transfer kompleksi (ETC) değerlendirmesi ile aynı prosedürü izleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokolün ardından kalp dokusundan mitokondri ile zenginleştirilmiş iyi bir protein karışımı verimi hazırlandı. Ekimin yavrularından hasat edilen ortalama 1,2 g dondurulmuş kalp dokusundan yaklaşık 15 mg/mL mitokondri ile zenginleştirilmiş protein karışımı elde edildi. Gözlemler, 0,5 g'dan az dondurulmuş kalp dokusunun BN-PAGE testini gerçekleştirmek için yeterli miktarda mitokondriyal zenginleştirilmiş protein karışımı vermediğini gösterdi. Mitokondriyal hazırlık miktarı,(i) bireysel elektron transfer komplekslerini (ETC) (örneğin, Complex-I, II, III, IV ve Complex-V) değerlendirmek için standart bir immünoblot analizi, (ii) BN-PAGE ve immünoblot analizi ile mitokondriyal süperkomplex değerlendirmesi ve (iii) seçilen kompleks için sınırlı enzmatik tahliller yapmak için yeterliydi. Bireysel ETC protein komplekslerine karşı yetiştirilen antikorların kokteyli, her antikorun tek bir immünoblot testinde kendi hedef proteinini tanıyacağı teknik fizibilite sağlar.
Mitokondri ile zenginleştirilmiş protein, ekimin yavrularından elde edilen kalbin sol karıncığı tarafından hazırlandı. Yavrular iki grup ekmekten doğdu: (1) hamilelik sırasında bir grup egzersiz yapıldı ve (2) bir grup hareketsizdi. Her iki grubun kalp dokuları doğumdan sonra farklı zaman noktalarında (48 saat, 3 ay, 6 ay ve 9 ay) hasat edildi. Anne egzersizinin gebelik sırasında yavruların mitokondriyal ETC'si üzerinde olumlu bir etkisi olup olmadığı bu çalışmada test edilen hipotezdi. Uzun mitokondri ile zenginleştirilmiş izolasyon süreci nedeniyle herhangi bir günde dört kalp dokusu rahatça işlendi.
Şekil 2: Yavru kalp dokusundan mitokondriyal ETC komplekslerinin immünoblot profili. Mitokondriyal zenginleştirilmiş protein karışımı azaltıcı koşullar altında %4-%20 gradyan jelde çözümlendi. Proteinler ticari bir antikor kokteyli ile immünprobed edildi ve yükleme kontrolü için anti-VDAC antikor kullanıldı (kırmızı renk bandı). Antikor kokteyli sığır kalbi Kompleks-I (antijen NDUFB8), sığır kalbi Kompleksi-II (antijen C-II30 (FeS), sığır kalbi Kompleksi II, III (antijen C-III-Core 2), insan Kompleksi IV, alt ünit II (antijen C-IV-II) ve sığır kalp Kompleksi-V'ye (antijen C-V-α) karşı yükseltildi. İkincil antikor kızılötesi etiketle etiketlendi ve görüntü bir görüntü analiz yazılımı kullanılarak analiz edildi. Yaş gruplarındaki Bireysel Kompleks profilleri Ek Şekil 1'de (A-E) sağlanmaktadır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2 tipik bir ETC protein profilini temsil eder. Antikor kokteylleri multiplks formatında immünblotting için izin verilir. Her antikor kendi hedef proteinini tanıyarak kabul edilebilir bir çözünürlük sağladı. Protein bandı yoğunlukları dijital olarak analiz edildi. Egzersiz yapılan ekimin yavrularından elde edilen dokular, etc komplekslerinin bazılarında nispeten düşük seviyeler sunmuştır (Ek Şekiller 1A-E). Mitokondri ile zenginleştirilmiş preparat, immünproblama çoklama formatında yapıldığı için gradyan jelde (%4-%20) çözülmelidir. Bu yaklaşım, SDS/PAGE jellerinin birkaç sabit yüzdesini çalıştırma ve çalıştırmadan çalıştırma değişkenliğini ortadan kaldıracaktır.
Mitokondriyal proteinler %3-%8 gradyan BN-PAGE (Şekil 3A) ile çözümlendi ve antikor kokteylleri ile immünproblandı. Hem egzersizli hem de sedanter gruplarda birden fazla süperkompleks oluşumu gözlenmiştir (Şekil 3B).
Şekil 3: Mavi-Yerli Poliakrilamid jel elektroforez (BN-PAGE) tarafından mitokondriyal süpercomplex profili. Mitokondriyal zenginleştirilmiş protein karışımları %3-%8 BN-PAGE'de çözümlendi ve Coomassie mavi reaktifi (Jel Kodu, Mavi Leke Reaktifi) ile boyandı. (B). Mitokondriyal zenginleştirilmiş protein karışımları %3-%8 BN-PAGE'de çözümlendi, PVDF membranına aktarıldı ve süperkaplesler için antikor kokteylleri ile immünproblandı. Her iki tahlilde de protein yükü 150 μg/well idi. Hazırlık sırasında yetersiz protein verimi nedeniyle 6 aylık veri toplama noktası dahil değildi. Gözlenen en belirgin süperkapleks artışı, hareketsiz gruba göre egzersiz yapılan grupta 9 ayda gerçekleşti. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
BN-PAGE'de çözülebilen süperkompekslerin büyüklüğü nedeniyle farklı bir degrade jel formatı (%3-%8) hazırlanmıştır. Bu protokolde açıklanan mitokondri zenginleştirilmiş preparat, mitokondriyal ETC kompleks faaliyetlerini ölçmek için kullanılmıştır. Şekil 4 , Karmaşık I-II etkinlik değerlendirmesi için kaydedilen verileri temsil eder. Bu tahlil belirlenen protokole göre gerçekleşmiştir3.
Şekil 4: Karmaşık I-II aktivite ölçümleri. Farklı yaş gruplarından (48 saat, 3 ay, 6 ay ve 9 ay) elde edilen mitokondri ile zenginleştirilmiş protein karışımları kinetik test kullanılarak Kompleks I-II aktivitesi için analiz edildi. Egzersiz yapılan grup, sedanter grubunkine kıyasla artan bir Kompleks I-II aktivitesi gösterdi. eşleştirilmiş bir t-testine göre iki grup arasındaki fark istatistiksel olarak anlamlı değildi (P > 0.05). Şekilde gösterilen hata çubukları, n = 4 için ortalamanın (SEM) standart hatasını temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: (A) Yaş grupları arasında Kompleks-I profili. Genel olarak, egzersiz yapılan ekimden doğan yavrular, sedanter grubunkine kıyasla daha düşük Complex-I seviyeleri ile sunuldu (n = 4). Bu 9 aylık grupta daha belirgindi. (B) Yaş grupları arasında Kompleks-II profili. Tüm yaş grupları, üç aylık kohort hariç, egzersiz yapılan grupta düşük Complex-II seviyeleri gösterdi (n = 4). (C) Yaş grupları arasında Kompleks-III profili. Sadece 9 aylık yaş grubunda, hareketsiz gruba göre daha düşük Kompleks-III düzeyleri görüldü (n = 4). (D) Yaş grupları arasında Complex-IV profili. Egzersiz yapılan grubun Complex-IV protein seviyelerinde hafif bir artış gözlendi (n = 4). (E) Yaş grupları arasında Complex-V (ATP synthase) profili. Hem egzersizli hem de sedanter gruplar 48 h veri noktası dışında düşük Complex-V seviyeleri sergiledi (n = 4). Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol için kritik adımlar burada belirtilmiştir. İlk olarak, doku homojenizasyonu işlemi sırasında aşırı saf etkilerin uygulanmaması için doku homojenizasyonu dikkatlice ele alınmalıdır. İlk doku homojenizasyonu için basınç döngüsü teknolojisinin (PCT) bir parçası olan bir doku parçalayıcı kullanılmalıdır9. Bu adım, donmuş doku koşulları nedeniyle zaten kırılgan olan mitokondrileri daha da tahrip edebilecek cam üzerine cam homojenizatörün (Şekil 1B) aşırı inme döngüsünü azaltacaktır. İkincisi, donmuş doku ağırlığı, mitokondri ile zenginleştirilmiş preparatın yeterli miktarda elde edilmesi için önemli olacaktır. Önerilen başlangıç dokusu miktarı, dokunun kaynağına bağlı olarak 0,8 g'dan büyük olacaktır. Kalp dokusu mitokondri bakımından çok zengindir10,11; bu nedenle, önerilen miktar mitokondri ile zenginleştirilmiş bir preparat elde etmek için yeterli olacaktır. Üçüncüsü, tüm prosedürler soğuk bir odada yapılmalıdır. Soğuk bir oda yoksa, büyük boy bir buz banyosu yeterli olacaktır.
Daha önce dondurulan kalp dokusundan mitokondri ile zenginleştirilmiş preparatların elde etmenin fizibilitesi bu çalışmada gösterilmiştir. Bu protokol, mitokondrilerin izole edilebileceği ve mitokondriyal ETC enzim komplekslerinin değerlendirilebileceği arşivlenmiş donmuş dokuya erişim sağlamak için gerekli olacaktır. Yeni bir çalışma, daha önce donmuş dokulardan ve hücrelerden mitokondriyal solunumun da ölçülebilir olabileceğini göstermiştir2. Bu ilerleme nedeniyle, araştırmacılar daha önce toplanan biyosamlemleri daha fazla analiz için kullanabileceklerdir.
Bireysel ETC profilini değerlendirmek için ve süpercomplexes aynı PVDH membran üzerinde immünblotting prosedürü sırasında birden fazla antikor kullanan bir çoklama formatında klasik immünobotting yapılarak daha kolay hale getirilir. Kullanıcının SDS-PAGE ve BN-PAGE için jellere yüklenecek protein miktarını belirlemesi kritik öneme sahiptir. Kullanıcının örnek yükleme hacminde bir sorun olmaması için yüksek protein konsantrasyonları elde etmek için resüspensyon hacmi mümkün olduğunca az olmalıdır. BN-PAGE'e yüklenecek protein miktarı mitokondri ile zenginleştirilmiş preparatın verimine bağlıdır. BN-PAGE'de az miktarda orijinal kalp dokusu nedeniyle kuyu başına 150 μg mitokondri ile zenginleştirilmiş protein karışımı yüklendi. 50-150 μg mitokondri ile zenginleştirilmiş pelet preparatı 1 mm kalınlığında jel için yeterli olacaktır. Kullanıcı numune yüklemesi için 1,5 mm kalınlığında bir jel tercih edebilir; ancak protein bantlarının çözünürlüğü kabul edilebilir kalitede olmayabilir. Kuyu başına daha az mitokondriyal protein resüspenzyonu test edilmemiştir, çünkü immünoblot testlerinde kullanılan antikor kokteylleri konsantrasyonlarında önceden belirlenmiştir; ancak, kullanıcılar sinyal / gürültü oranını artırmak için kendi antikor kokteyllerini yapabilirler.
BN-PAGE jelleri için tamamen polimerize degrade jel (%3-%8) önerilir. % 3-8'lik gradyan jelleri ticari olarak mevcut değildir; bu nedenle, ev yapımı gradyan (%3-%8) standart mini jeller (9 x 6 cm) kullanılabilir. Jelin 24 saat önce dökülmesi ve jelin RT'de bir gecede polimerize olmasını sağlamak kabul edilebilir bir jel oluşumu sağlayacaktır. Bir kullanıcının süperkomparşların daha iyi ayrılması gerekiyorsa, daha büyük jel formatları (midi jel 13,5 cm x 6,5 cm veya uzun jel 28 cm x 16 cm) kullanılması önerilir.
Bu protokolün uygulanması, araştırmacıların mitokondrileri izole etmelerine ve daha önce dondurulmuş arşivlenmiş dokulardaki ETC ve süperkomplekslerin profilini analiz etmelerine izin verecektir. Tüm ulusal ve bölgesel biyosplenimen depoları biyo örneklemleri ultra donma koşullarında (yani -80 °C) tutar. Çok sayıda doku, daha fazla çalışma ve reaktif paylaşım amacıyla kurumlar ve ilaç şirketleri tarafından arşivlenmektedir. Ulusal Sağlık Enstitüsü (NIH), desteklenen projelerden üretilen reaktifleri paylaşmak için NIH destekli herhangi bir projenin gerekli olmasını zorunlu kilmektedir. Bu biyorepoziterler, hibe başvuruları için ön veri elde etmek için dondurulmuş arşivlenmiş dokuların elde etmek için çok değerli kaynaklardır. Bu çalışmada süperkomplekslerin enzim aktivitelerini analiz etmek için yapılmamıştır; ancak, tahliller8 gibi protokoller kullanılabilir.
Bu makalede açıklanan yöntemler kullanılarak, ekmek yavrularının kalp dokusundan elde edilen mitokondri ile zenginleştirilmiş preparatların bireysel ETC kompleksleri ve süperkompleksleri analiz edildi. Egzersiz yapılan ekmeklerden doğan yavrular, yaşamlarının ilk 6 ayında düşük etc seviyeleri sundular ve sonunda 9 ay kadar seviye atladılar.
| ETC Kompleksi | 48 saat | 3 ay | 6 ay | 9 ay |
| Karmaşık-I | ↓ | ↓ | ↓ | Değişiklik yok |
| Karmaşık-II | ↓ | ↓ | Değişiklik yok | Değişiklik yok |
| Karmaşık-III | ↓ | Değişiklik yok | Değişiklik yok | ↓ |
| Karmaşık-IV | ↑ | ↑ | ↑ | Değişiklik yok |
| Karmaşık-V | ↓ | ↓ | ↓ | Değişiklik yok |
Tablo 2: Mitokondriyal elektron taşıma zinciri protein kompleksleri profili. Tablo, egzersiz yapılan ekmek grubundaki mitokondriyal ETC kompleks seviyelerinin profilini özetlemektedir. Complex-IV dışındaki tüm kompleksler yaş gruplarında azalan bir model gösterdi.
Bu gözlem, hamilelik sırasında egzersiz yapılan ekimlerden doğan yavruların kalp dokusu mitokondrilerinde daha az ama daha verimli ETC kompleksleri gösterdiğini gösterebilir (Şekil 4). Bununla birlikte, 9 ayda süpercomplex oluşumunun yüksek olduğu bulunmuştur. Egzersiz, artan enerji talebi koşullarında süperkomplekslerin yeniden düzenlenmesini bir şekilde etkileyebilir12. Ek olarak, Complex-V (ATP synthase) doğumdan sonraki ilk 6 ayda düşük bir profil sergilemektedir. Bu yanıt epigenetik olarak değiştirilmiş ETC protein komplekslerinin olasılığından kaynaklanabilir. Bu çalışma için küçük örneklem boyutu (n = 4) böyle bir sonuca varmak için yeterli değildi; bununla birlikte, düşük ETC kompleks protein seviyeleri, yüksek Kompleks I-II aktivitesi ve yüksek süpercomplex oluşumu, egzersiz yapılan ekmeklerin soyunun kalp dokusundaki biyoenergetiklerin egzersizden etkilendiğini gösterebilir. Daha az ama daha verimli çalışan mitokondriyal ETC kompleksleri ve artan süperkompleslerin oluşumu araştırılması gereken ilginç olaylardır. Bu proje hala devam ediyor.
Özetle, bu protokol daha önce dondurulmuş arşivlenmiş kalp dokusundan basit ve basit mitokondri ile zenginleştirilmiş numune hazırlama sağlar. Mitokondriyal ETC kompleksleri multiplxed antikor kokteylleri ile standart immünblotting ile analiz edilebilir. BN-PAGE ve ardından immünblotting süperkomplekslerin varlığını analiz edebilir. Bu hazırlık, kullanıcıların mitokondriyal ETC karmaşık faaliyetlerini değerlendirmelerine de izin verebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.
Acknowledgments
Bu çalışma, Kansas City Üniversitesi'nin Abdulbaki Agbas için intramural hibesi ve Daniel Barrera için Yaz Araştırma Bursu ile finansal olarak desteklendi. Yazarlar Dr. Jan Talley'nin editörlük çalışmaları için minnettarlar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amino caproic acid | Sigma/Aldrich | A2504-100G | |
| Anti-Hu Total OxPhos complex kit | Invitrogen | 458199 | |
| anti-VDAC antibody | abcam | ab15895 | use 1 µg/mL |
| Coomassie G-250 | ThermoSientific | 20279 | |
| Coomassie GelCode Blue | ThermoScientific | 24592 | |
| Digitonin | Cabiochem | 300410 | |
| Glass-Glass pestle homogenizer | VWR | KT885451-0020 | |
| Image Studio | LICOR | ||
| IR-Dye conjugated anti-Rabbit Ab | LICOR | LC0725 | |
| Multiwell plate reader | BioTek | Synergy HT | |
| Native molecular weight marker | ThermoFisher | BN2001 | |
| Nylon mesh monofilament | Small Part Inc | CMN-74 | |
| Orbital shaker | ThermoScientfic | ||
| PCT Shredder | Pressure Bioscience Inc | ||
| SEA BLOCK Blocking buffer | ThermoScienctific | 37527 | |
| Shredder PULSE Tube | Pressure Bioscience Inc | FT500-PS | |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5418 | |
| Trypsin | Amresco | M150-1G | |
| Trypsin inhibitor | Amresco | M191-1G | Requires fresh preparation |
References
- Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Analytical Biochemistry. 418 (2), 213-223 (2011).
- Osto, C., et al. Measuring mitochondrial respiration in previously frozen biological samples. Current Protocols in Cell Biology. 89 (1), 116 (2020).
- Agbas, A., et al. Mitochondrial electron transfer cascade enzyme activity assessment in cultured neurons and select brain regions. Current Protocols in Toxicology. 80, 73 (2019).
- Hathaway, Q. A., et al. Maternal-engineered nanomaterial exposure disrupts progeny cardiac function and bioenergetics. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 312 (3), 446-458 (2017).
- May, L. E., et al. Influence of maternal aerobic exercise during pregnancy on fetal cardiac function and outflow. American Journal of Obstetrics & Gynecology MFM. 2 (2), 100095 (2020).
- Ehler, W. J., et al. Avoidance of malignant hyperthermia in a porcine model for experimental open heart surgery. Laboratory Animal Science. 35 (2), 172-175 (1985).
- Panov, A. V., et al. Effect of bovine serum albumin on mitochondrial respiration in the brain and liver of mice and rats. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 149 (2), 187-190 (2010).
- Jha, P., Wang, X., Auwerx, J. Analysis of mitochondrial respiratory chain supercomplexes using blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Current Protocols in Mouse Biology. 6 (1), 1-14 (2016).
- Pressure Biosciences Inc. Isolation of Functional Mitochondria from Whole Rat Heart Using a PBI Shredder and Pressure Cycling Technology (PCT). , South Easton, MA. (2010).
- McLaughlin, K. L., et al. Novel approach to quantify mitochondrial content and intrinsic bioenergetic efficiency across organs. Scientific Reports. 10 (1), 17599 (2020).
- Hom, J., Sheu, S. S. Morphological dynamics of mitochondria--a special emphasis on cardiac muscle cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46 (6), 811-820 (2009).
- Greggio, C., et al. Enhanced respiratory chain supercomplex formation in response to exercise in human skeletal muscle. Cell Metabolism. 25 (2), 301-311 (2017).
