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Biochemistry

Medición de complejos de transferencia de electrones mitocondriales en tejido cardíaco previamente congelado de la descendencia de cerda: un modelo para evaluar los cambios bioenergéticos mitocondriales inducidos por el ejercicio

Published: August 16, 2021 doi: 10.3791/62809
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 7, 7,13
1AdventHelath, 2University of Illinois Chicago School of Public Health, 3Lincoln Memorial University, 4Children’s Mercy Hospital, 5Scripps Clinic, 6Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, 7Kansas City University, 8Roblex Rex Veterans Affairs Medical Center, 9California State University San Marcos, 10East Carolina University, 11Massachusetts Institute of Technology, 12Boehringer Ingelheim Norway KS, 13Heartland Center for Mitochondrial Medicine

Summary

La preparación de muestras enriquecidas con mitocondrias a partir de tejidos sólidos archivados previamente congelados permitió a los investigadores realizar evaluaciones funcionales y analíticas de las mitocondrias en diversas modalidades experimentales. Este estudio demuestra cómo preparar preparaciones enriquecidas con mitocondrias a partir de tejido cardíaco congelado y realizar evaluaciones analíticas de las mitocondrias.

Abstract

El perfil del complejo de transferencia de electrones mitocondrial (ETC) se modifica en el tejido cardíaco de la descendencia nacida de una cerda ejercitada. La hipótesis propuesta y probada fue que un ejercicio materno regular de una cerda durante el embarazo aumentaría la eficiencia mitocondrial de la bioenergética cardíaca de la descendencia. Esta hipótesis se probó mediante el aislamiento de mitocondrias mediante un procedimiento de aislamiento leve para evaluar la ETC mitocondrial y los perfiles supercomplejos. El procedimiento descrito aquí permitió el procesamiento de tejidos cardíacos archivados previamente congelados y eliminó la necesidad de una preparación de mitocondrias frescas para la evaluación de complejos ETC mitocondriales, supercomplejos y perfiles de actividad compleja ETC. Este protocolo describe la medición óptima del complejo de proteínas ETC en la inmunoblotting basada en anticuerpos multiplexados y la evaluación súper compleja utilizando electroforesis en gel nativo azul.

Introduction

El objetivo de este protocolo era proporcionar pasos detallados para obtener una preparación enriquecida con mitocondrias a partir de tejido cardíaco previamente congelado con una nueva tecnología de interrupción mecánica de baja energía del tejido que mejora la lisis tisular y la extracción de mitocondrias. Con este método, se puede lograr una mayor eficiencia de extracción sin generar altas tensiones de cizallamiento o alta temperatura y un corto tiempo de homogeneización (10-12 s)10.0001.

Obtener mitocondrias a partir de tejido congelado archivado es un activo valioso para realizar estudios funcionales2 y bioquímicos3, de lo contrario no sería fácilmente repetible en las condiciones experimentales exactas. Se ha utilizado un homogeneizador de vidrio de mortero de teflón clásico Potter-Elvehjem o homogeneizador Dounce y todavía se usa en laboratorios de investigación para homogeneizar tejidos blandos como el hígado, el riñón y el cerebro. Sin embargo, la homogeneización de tejidos duros como el músculo y el corazón requiere más tiempo de homogeneización, tratamiento enzimático, homogeneización de alta velocidad y una amplia experiencia de usuario. Esto es desventajoso para extraer orgánulos intactos, como las mitocondrias, del tejido duro, como el músculo y el corazón. El método descrito en este protocolo se utiliza para obtener una preparación enriquecida con mitocondrias de alto rendimiento para analizar complejos de proteínas de cadena de transporte de electrones mitocondriales (ETC) y su formación supercompleja en tejidos cardíacos cosechados de crías nacidas de cerdas ejercitadas y sedentarias, congeladas en nitrógeno líquido y almacenadas a -80 ° C para su uso futuro. Este método permite al usuario aislar la preparación enriquecida con mitocondrias de tejidos archivados previamente congelados.

La exposición externa a nanomateriales a roedores preñados puede afectar negativamente la función cardíaca y la respiración mitocondrial y la bioenergética de la progenie durante la gestación4. Sin embargo, los cambios positivos inducidos por el ejercicio aeróbico en la bioenergética de los miocitos fetales durante el embarazo aún no se han documentado. Sin embargo, estudios emergentes aportan evidencia de que el ejercicio aeróbico materno durante el embarazo tiene una influencia positiva en la función cardíaca fetal5. Con el fin de proporcionar más evidencia, se realizó un análisis de los efectos longitudinales del ejercicio materno sobre los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial cardíaca de la descendencia (es decir, del Complejo I al Complejo V) durante el embarazo.

Este estudio tiene una relevancia significativa para la salud, ya que los resultados pueden sugerir que el ejercicio materno mejora la eficiencia de la producción de energía en las mitocondrias cardíacas de la descendencia. En este estudio, las cerdas (cerdo hembra) se utilizaron como modelo animal por dos razones: (i) la fisiología cardíaca es similar a la humana6, y (ii) la recolección de tejido cardíaco de la descendencia de diferentes puntos de tiempo es factible bajo una aprobación institucional de la IACUC. El estudio propuesto tiene como objetivo responder a muchas de las preguntas fundamentales que vinculan el ejercicio materno y sus posibles efectos positivos en la composición celular y bioquímica del tejido cardíaco de la descendencia. Este enfoque requiere técnicas de aislamiento de mitocondrias suaves pero efectivas a partir de tejido cardíaco previamente congelado obtenido de los largos y costosos estudios longitudinales que abordaron los problemas de los cambios bioenergéticos dentro de los miocitos cardíacos fetales durante el embarazo. El método descrito en este estudio permite utilizar grandes sumas de tejido archivado previamente congelado para la preparación enriquecida con mitocondrias para estudios analíticos y funcionales. El estudio también ayudará a llenar el vacío de conocimiento en este campo al proporcionar datos preliminares, lo que podría conducir a futuros estudios que determinen los efectos del ejercicio materno en la salud cardíaca en el útero y más allá.

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Protocol

Los tejidos cardíacos de la descendencia congelada fueron recibidos del Dr. Sean Newcomer junto con la carta de aprobación institucional de la IACUC. Los tejidos cardíacos se obtuvieron de un estudio longitudinal a largo plazo, se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 ° C para su uso futuro. Todos los protocolos relacionados con el procesamiento del tejido cardíaco de la descendencia siguieron las pautas de los comités IBC e IACUC de la Universidad de Kansas City.

1. Preparación de tampones y reactivos

NOTA: Prepare todas las muestras según las directrices del fabricante. Use agua ultrapurificada o equivalente en todas las recetas y pasos del protocolo. Use equipo de protección personal (batas de laboratorio, mascarilla, guantes y gafas/protector facial) durante este procedimiento. Los volúmenes de tampón son adecuados para procesar seis muestras de tejido.

  1. Preparar tampón de lavado de tejidos de 1,5 L combinando 154,035 g de sacarosa (0,3 M final), 3,904 g de HEPES (10 mM final), 0,111 g de EDTA (0,2 mM final). Agregue los ingredientes a 1.0 L de agua mientras está en la placa de agitación, ajuste el pH a 7.2 con HCl diluido y el maquillaje al volumen final a 1.5 L.
    NOTA: Se necesitan aproximadamente 200 ml de tampón de lavado por muestra (50-300 mg). Se pueden procesar seis muestras de tejido en un día. Utilice el búfer de lavado restante para crear un búfer de aislamiento.
  2. Prepare el tampón de aislamiento del tampón de lavado descrito anteriormente en el paso 1.1 agregando 210 mg de BSA en 210 ml de tampón de lavado. Ajuste el pH a 7.4 con solución diluida de NaOH.
    NOTA: Se necesitan aproximadamente 35 ml de tampón de aislamiento por muestra de tejido; por lo tanto, se requieren 210 ml de tampón de aislamiento para seis muestras. Prepare este tampón agregando una solución fresca de BSA (1 mg / ml final) el día de la preparación. BSA se utiliza para aislar las mitocondrias, ya que mejora las propiedades mitocondriales mediante la eliminación de desacopladores naturales como los ácidos grasos libres. Se ha encontrado que la BSA tiene actividad antioxidante al aumentar la tasa de oxidación de los sustratos, especialmente el succinato, en las mitocondrias cerebrales7. Alternativamente, la albúmina sérica bovina puede ser sustituida por análogos libres de ácido menos costosos, como la ovoalbúmina.
  3. Preparar 150 mL de tampón de resuspensión combinando 0,011 g de EDTA (concentración final de 0,2 mM de EDTA o utilizar 150 μL de solución de EDTA de 200 mM para 150 mL de tampón de resuspensión), 12,836 g de sacarosa (concentración final de sacarosa de 0,25 M) y 0,236 g de Tris (10 mM Tris-HCl final). Ajuste el pH a 7.8 con 0.1 N NaOH. Añadir 60 μL del cóctel inhibidor de la proteasa justo antes de usar.
  4. Preparar la solución de tripsina disolviendo 7,5 mg de tripsina en 3,0 ml de 1 mM HCl (2,5 mg de tripsina/ml final). Esta cantidad es suficiente para una muestra.
    NOTA: Prepare la solución de tripsina en función del número de muestras de tejido planificadas para ser procesadas.
  5. Preparar la solución inhibidora de tripsina de soja combinando 13,0 mg de inhibidor de tripsina en 20 ml de tampón de aislamiento que contenga BSA (0,65 mg/ml de inhibidor de tripsina final).
    NOTA: Prepare una solución fresca de inhibidor de tripsina.
  6. Preparar el reactivo de persulfato de amonio añadiendo 0,1 g de persulfato de amonio en 1 ml de agua (10% de persulfato de amonio final).
    NOTA: El reactivo de persulfato de amonio debe estar recién preparado o se puede alicitar un gran volumen y mantenerlo en un congelador de -20 °C.
  7. Preparar la solución de ácido aminocaproico (ACA) combinando 0,131 g de ácido 6-amino caproico en 1,0 ml de agua ultrapurificada y almacenarla en 4 °C (1 M de ácido 6-aminocaproico final).
  8. Prepare la solución de colorante azul brillante coomassie disolviendo 1 g de Coomassie G-250 en 0,5 ml de agua y 0,5 ml de ácido aminocaproico 1 M (concentración final de solución de colorante al 10%).
  9. Prepare el 5% de digitonina para Blue native-PAGE (BN-PAGE). Calcule aproximadamente la cantidad de digitonina que se necesita en la preparación de la muestra más un poco de volumen adicional para compensar los errores de pipeteo (sobreestimar en 10 mg). Para 15 mg: Primero, diluya 15 mg de digitonina en 30 μL de 100% DMSO. Vórtice para ayudar a la digitonina a entrar en la solución. A continuación, agregue el 90% restante de ddH2O (270 μL). Calentar suavemente para mezclar la solución (vórtice) y luego enfriarla sobre hielo.
  10. Prepare el búfer de ánodo PAGE nativo. Agregue 50 ml de búfer de ejecución PAGE nativo 20x a 950 ml de agua para hacer un volumen final de 1 L. Prepare un búfer de ánodo fresco para uso inmediato. Utilice esto como un búfer de ejecución 1x.
  11. Prepare un tampón de cátodo azul oscuro. Disolver 0.0160 g de Coomassie azul brillante G-250 en 80 ml de tampón de ánodo PAGE nativo; mezclar bien.
    NOTA: Prepare un tampón de cátodo fresco para su uso inmediato. Solo se pueden necesitar 60 ml, pero haga 20 ml adicionales en caso de fugas.
  12. Prepare el tampón de cátodo azul claro. Agregue 20 ml de búfer de cátodo azul oscuro en 180 ml de búfer de ánodo PAGE nativo y mezcle bien.
    NOTA: Este búfer solo se puede utilizar una vez.
  13. Prepare Coomassie G-250 al 5% como aditivo de muestra. Diluir 200 μL de stock de Coomassie al 10% ya realizado (paso 1.8) con 200 μL de 1 M de ACA y almacenar a 4 °C.
  14. Prepare 4x tampón de muestra PAGE nativo combinando 40% de glicerol, 0.04% Ponceau S, 25 mM Tris-HCl (pH 6.8), 192 mM de glicina en 10 mL de volumen final. Alícuotas y guárdalos a -20 °C en el congelador.

2. Aislamiento de mitocondrias del tejido cardíaco congelado

NOTA: Realice el procedimiento de aislamiento de mitocondrias en una cámara frigorífica de 4 °C. Sin embargo, en caso de falta de disponibilidad de la cámara frigorífica, use un baño de hielo de gran tamaño para realizar el procedimiento.

  1. Saque muestras de tejido cardíaco previamente congeladas del congelador de -80 °C.
    NOTA: Un máximo de cuatro muestras de tejido pueden procesarse cómodamente para el aislamiento de mitocondrias en un día determinado.
  2. Pese el tubo que contiene la muestra de tejido cardíaco y registre el peso. Prepare tres vasos de precipitados (cada uno de 50 ml) que contengan 40 ml de tampón de lavado. Enfríe cada vaso de precipitados en el baño de hielo y sal con cantidades iguales de hielo y sal mezcladas durante 3-5 minutos antes de continuar con el siguiente paso. Coloque barras de agitación magnéticas en cada vaso de precipitados y ajuste el agitador a velocidad media.
    NOTA: No congele en exceso los vasos de precipitados y úselos inmediatamente después de que comiencen a aparecer nubes de cristales de hielo.
  3. Coloque el tejido cardíaco congelado directamente en la solución helada en el primer vaso de precipitados. Espere aproximadamente 5 minutos mientras agita y aplica una ligera presión al tejido con pinzas para extraer la mayor cantidad de sangre posible.
  4. Pesar el tubo vacío y restar del peso original (paso 2.2) para obtener un peso neto del tejido cardíaco.
  5. Saque el pañuelo con fórceps y apriete el corazón con una toalla de papel limpia de papel de filtro para eliminar la sangre. Luego, coloque el tejido en el segundo vaso de precipitados. Espere aproximadamente 5 minutos mientras revuelve para eliminar el exceso de sangre.
  6. Seque suavemente el pañuelo de papel en una toalla de papel. Retire toda la grasa, la sangre coagulada, las aurículas y las fascias (tejido blanco). Luego, agrupe el tejido ventricular.
  7. Triture las muestras de tejido con la trituradora siguiendo los pasos 2.7.1-2.7.9.
    1. Coloque el tejido cardíaco (~ 50-300 mg) en la cámara trituradora de tejido desde el lado del carnero.

Figure 1
Figura 1: Cámara trituradora de tejidos (tubo) para usar con la trituradora. La homogeneización de tejidos en el tubo triturador requiere alrededor de 10-12 s por muestra de tejido. La homogeneización del tejido se completa una vez que el tejido homogeneizado pasa a través del disco perforado a la cámara superior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Agregue ~ 0.2-0.8 ml de tampón de lavado al lado de la tapa del tubo.
    NOTA: Asegúrese de que el volumen total de la muestra y el tampón de lavado combinados durante la trituración no exceda de 0.7-0.8 mL.
  2. Use la herramienta de tubo para tapar la cámara de la trituradora con la tapa de la trituradora cómodamente.
    NOTA: No apriete demasiado la tapa de la trituradora.
  3. Coloque la cámara trituradora en la unidad de soporte de la trituradora con el lado del ariete hacia abajo. El carnero enganchará un accesorio en el soporte de la trituradora.
  4. Inserte el bit del controlador de la trituradora; deje que la broca se enganche con la tapa de la trituradora. Asegúrese de que el bit esté bien bloqueado en su lugar.
    NOTA: Utilice siempre el controlador de trituradora completamente cargado.
  5. Aplique presión manualmente hacia abajo al controlador de la trituradora y a la cámara de la trituradora hasta que el indicador de presión en el soporte de la trituradora alcance un ajuste de aproximadamente 2 en el soporte de la trituradora.
    NOTA: El ajuste puede estar en un nivel más alto si el tejido de trituración es más fibroso.
  6. Ejecute el controlador de la trituradora durante aproximadamente 10-12 s presionando el gatillo del controlador de la trituradora, mientras mantiene la configuración en 2.
  7. Mire el tubo para verificar si toda o la mayor parte de la masa sólida del tejido se tritura a través del disco de lisis y se pasa a la cámara superior de la cámara trituradora mirando el tubo.
    NOTA: Puede ser necesario triturar la muestra de tejido durante un período más largo. Simplemente devuelva el tubo al soporte de la trituradora y continúe el proceso. La mayoría de los tipos de muestras de tejido requieren solo 10-12 s de trituración. Si bien toda la trituración producirá algo de calor debido a la fricción, este corto tiempo de procesamiento no calentará significativamente la muestra.
  8. Después de triturar la muestra, levante la cámara trituradora de la unidad de soporte. Use la herramienta de tubo para quitar la tapa de la trituradora y colóquela sobre una superficie limpia para su uso posterior.
    NOTA: La tapa de la trituradora debe considerarse contaminada con extracto de muestra y, dependiendo del tipo de muestra, puede estar contaminada con materiales infecciosos. No use la misma tapa de la trituradora para ninguna otra muestra de tejido para evitar la contaminación cruzada.
  1. Transfiera el tejido cardíaco triturado al tercer vaso de precipitados con 40 ml de tampón de lavado y barra de agitación y revuelva el tejido durante 5 minutos a una velocidad media mientras está en la placa de agitación.
  2. Filtre la suspensión a través de un monofilamento de malla de nylon (tamaño de poro de 74 μm) y deseche el filtrado. Lave el pañuelo triturado en el filtro 3x con 10 ml de tampón de lavado.
    NOTA: Asegúrese de que el monofilamento de malla de nylon esté previamente humedecido con agua.
  3. Transfiera el tejido lavado y triturado a un vaso de precipitados de 50 ml con 20 ml de tampón de lavado y coloque el vaso de precipitados en el baño de hielo en el agitador magnético. Agregue 0.5 ml de solución de tripsina mientras agita constantemente durante 15 min. Aproximadamente a la mitad de la incubación (aproximadamente a los 7,5 min), transfiera la suspensión de tejido a un homogeneizador de vidrio sobre vidrio de mano poco ajustado que contendrá de 0 a 15 ml de volumen.

Figure 1
Figura 1: Cámara trituradora de tejidos (tubo) para usar con la trituradora. La homogeneización de tejidos en el tubo triturador requiere alrededor de 10-12 s por muestra de tejido. La homogeneización del tejido se completa una vez que el tejido homogeneizado pasa a través del disco perforado a la cámara superior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Homogeneizar suavemente con 4-5 golpes para dispersar la suspensión sin producir espuma. Coloque el homogeneizado en un vaso de precipitados de 50 ml y mezcle suavemente en una placa de agitación durante 15 min a 4 °C.
  2. Después de 15 min de incubación, agregue 10 ml del tampón de aislamiento que contiene el inhibidor de tripsina en el vaso de precipitados que contiene el homogeneizado e incube durante 1 min a 4 ° C mientras se agita suavemente.
  3. Filtra la suspensión de nuevo a través de un filtro de nylon y guarda el filtrado en un tubo cónico de 50 ml.
  4. Recoja la fracción de partículas que queda en el filtro de nylon y colóquela en el homogeneizador de vidrio sobre vidrio. Agregue 15-20 ml del tampón de lavado y homogeneice suavemente a mano durante 25-30 s.
    NOTA: El filtrado fluye muy lentamente en este paso. Para aumentar el flujo de filtrado, coloque la punta del embudo tocando el interior del tubo cónico.
  5. Combine el homogeneizado con el filtrado, equilibre los tubos y centrífique a 600 x g durante 15 min a 4 °C.
  6. Filtre el sobrenadante resultante en un nuevo tubo cónico utilizando un filtro de nylon para evitar la contaminación por el pellet. Vuelva a ejecutar la centrífuga a 8.500 x g durante 15 min a 4 °C.
    NOTA: Use una pipeta de transferencia de plástico para quitar el sobrenadante y sacrifique 0.2 ml de sobrenadante de la parte superior del pellet esponjoso.
  7. Deseche el sobrenadante y enjuague el pellet 2-3 veces con 1 ml del tampón de aislamiento. Asegúrese de desechar la capa de borde exterior blanco esponjoso cada vez.
    NOTA: Lave el pellet agregando el tampón de aislamiento con una pipeta con punta de 1 ml o una nueva pipeta de transferencia. Agregue el tampón al costado del tubo, no directamente sobre el pellet, para evitar que se rompa el pellet y evitar la contaminación del sobrenadante. A continuación, aspire el tampón con una pipeta de transferencia y repita el proceso dos veces más.
  8. Agregue 5 ml del tampón de aislamiento a cada tubo y rompa el pellet usando una pipeta con una punta de 1 ml o una nueva pipeta de transferencia.
  9. Diluya la suspensión con 20 ml de tampón de aislamiento adicional y vuelva a ejecutar la centrífuga a 8.500 x g durante 15 min a 4 °C.
  10. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 5 ml del tampón de resuspensión. Luego, agregue 15 ml más del tampón para un total de 20 ml y centrífique a 8,500 x g durante 15 min. a 4 ° C. Deseche el sobrenadante. El pellet marrón resultante contiene mitocondrias intactas lavadas.
  11. Resuspend el pellet enriquecido con mitocondrias en 250 μL del tampón de resuspensión, incluidos los inhibidores de la proteasa. Alícuota en 25 μL, congelación rápida en nitrógeno líquido y almacenamiento en un congelador de -80 °C durante varios años.
    NOTA: Repuesto de 5 μL de preparación enriquecida con mitocondrias para el ensayo de análisis de proteínas. Para un estudio BN-PAGE (Blue native-PAGE), alícuota el pellet resuspendido en 50 μg de proteína mitocondrial por tubo. Centrifugadora a 8.500 x g durante 15 min a 4 °C. Aspire cuidadosamente el sobrenadante y almacene el pellet mitocondrial (50 μg de proteína/alícuota) en un congelador profundo de -80 °C durante varios años.

3. Evaluación del complejo de transferencia de electrones mitocondriales (ETC)

NOTA: Las proteínas ETC mitocondriales individuales (es decir, Complex-I, II, III, IV, V) se pueden evaluar mediante un ensayo de inmunoblotting estándar. Debido a la variedad de muestras (cuatro puntos temporales: 48 h, 3 meses, 6 meses, 9 meses), dos condiciones experimentales (ejercitadas y sedentarias) y una serie de anticuerpos inmunoprobantes (cinco anticuerpos), se recomienda una inmunoblotting multiplexada. Realice el inmunoblotting multiplexado de la siguiente manera.

  1. Resolver 50 μg de muestra/pozo de proteína enriquecida con mitocondrias en electroforesis en gel de poliacrilamida de gradiente 4%-20% (100 V, 90 min).
  2. Transferir las proteínas a una membrana de PVDF (75 V; 60 min)
  3. Bloquee la membrana en una solución tampón de bloqueo durante un mínimo de 1 h a 4 °C.
    NOTA: El tiempo de bloqueo se puede extender hasta durante la noche a 4 ° C. El tampón de bloqueo (Tabla de materiales) contiene ingredientes no mamíferos (es decir, proteínas de pescado) que tienen menos probabilidades de tener interacciones de unión específicas con anticuerpos, así como otras proteínas de mamíferos presentes en métodos típicos.
  4. Sondee la membrana con el cóctel de anticuerpos que incluye anticuerpos anti-Complejo-I, II, III, IV, V e incube durante la noche en un agitador orbital a 4 °C.
  5. Al día siguiente, lave la membrana y la sonda con anticuerpos secundarios marcados con IR durante 2 h en un agitador orbitario a RT (temperatura ambiente).
  6. Lavar cinco veces con 1x TBS-T (TBS que contiene Tween 20), y una vez con 1x TBS (Solución salina tamponada Tris).
    NOTA: Para el último lavado, no incluya detergente en el tampón TBS.
  7. Imagen de la mancha en un analizador de imágenes.

4. La evaluación del supercomplejo de las mitocondrias mediante electroforesis en gel de poliacrilamida nativa azul (BN-PAGE)

NOTA: Un perfil supercomplejo de ETC también se puede evaluar mediante el empleo de la técnica BN-PAGE.

  1. Prepare el cóctel tampón de muestra para 20 μL por 50 μg de proteína de pellet enriquecida con mitocondrias (7 μL de agua + 5 μL de 4x tampón de carga de muestra de electroforesis de gel de poliacrilamida nativa + 8 μL de digitonina al 5% + 2 μL de Coomassie G-250).
    NOTA: Haga un cóctel tampón de muestra de stock dependiendo del número de muestras disponibles (50 μg de proteína / muestra). Elija las cantidades apropiadas de digitoninas en función de la concentración de proteínas del pellet enriquecido con mitocondrias (Tabla 1)8.
  2. Calentar el caldo de digitoninas a 95 °C durante 3 min, mezclar y enfriar sobre hielo antes de hacer la mezcla maestra.
  3. Agregue el aditivo de muestra Coomassie G-250 justo antes de cargar las muestras en el gel.
  4. Añadir 20 μL del cóctel tampón de muestra en un tubo que contenga 50 μg de pellet de proteína mitocondrial. Solubilizar/resuspendir el pellet mezclando suavemente el pellet con una pipeta sin generar espuma.
  5. Incubar la mezcla en hielo durante 20 min para lograr la máxima solubilización del pellet enriquecido con mitocondrias. De vez en cuando, mueva suavemente los tubos para mejorar la solubilización.
  6. Mientras espera la incubación, prepare el búfer de ánodo PAGE nativo/búfer de ejecución 1x y el búfer de cátodo de color azul oscuro.
  7. Centrifugar el pellet solubilizado enriquecido con mitocondrias a 20.000 x g durante 10 min a 4 °C.
  8. Después de la centrifugación, recoja 15 μL del sobrenadante en nuevos tubos colocados en hielo.
  9. Añadir la cantidad apropiada de reactivo de Coomassie G-250 al 5% al sobrenadante obtenido en el paso 4.8 (consulte la Tabla 1).
    NOTA: El volumen de Coomassie G-250 al 5% debe ser tal que la concentración final del colorante sea 1/4 de la concentración de detergente. Realice este paso justo antes de cargar las muestras en el gel.
Proteína Digitonina/proteína 4x búfer de muestra 5% Digitonina Agua Volumen final 5% Coomassie G-250
relación (g/g) aditivo de muestra
50 μg 8 5 8 7 20 2
50 μg 4 5 4 11 20 1

Tabla 1: Preparación de cóctel tampón de muestra con dos proporciones diferentes de detergente / proteína. Para lograr la máxima solubilización de las proteínas de membrana de la suspensión mitocondrial, la concentración de proteína de digitonina/suspensión mitocondrial debe ajustarse a entre 4-8 g de digitonina/g de proteína. En el tejido cardíaco, se utilizaron 400 μg de digitonina para 50 μg de proteínas de suspensión mitocondrial (es decir, 8 g de digitonina/g de proteína mitocondrial) para maximizar la solubilidad de los supercomplejos de la suspensión mitocondrial.

  1. Vierta un gel de gradiente del 3% al 8%, retire el peine y lave los pocillos del gel con 1x tampón de ejecución tres veces.
    NOTA: El gel polimeriza mejor si se vierte un día antes.
  2. Configure el sistema de electroforesis y coloque el gel en el aparato.
  3. Llene los pocillos de muestra con el tampón de cátodo de color azul oscuro.
  4. Carga 10 μL del estándar de proteína no teñida como marcador de peso molecular nativo en el primer y último pozo del gel.
  5. Cargue toda la cantidad del sobrenadante de muestra + aditivo de muestra Coomassie preparado en el paso 4.9 anterior en los pozos utilizando una punta de carga de gel de cabeza plana.
  6. Llene cuidadosamente la presa de amortiguación de mini celdas con aproximadamente 60 ml de búfer de cátodo de color azul oscuro sin perturbar las muestras en los pozos, y luego llene el tanque de amortiguación con el búfer nativo PAGE 1x en ejecución.
  7. Encienda la fuente de alimentación y electroforese las muestras a 150 V durante aproximadamente 30 min.
  8. Retire el tampón de cátodo de color azul oscuro de la presa de amortiguación (cámara interior) con una pipeta de transferencia o aspire los pozos de muestra. Llene la cámara interior con 150-200 ml de tampón catódico de color azul claro y ejecute la electroforesis a 250 V durante 60 minutos.
    NOTA: El tiempo de electroforesis se puede determinar comprobando cuándo el frente del tinte migra solo 0,5 cm por encima de la parte inferior del cassette de gel.
  9. Retire el gel del cassette y colóquelo en un recipiente de plástico limpio. Lave el gel con agua destilada de buena calidad durante 15 minutos en un batidor/agitador orbital.
    NOTA: Para quitar el gel degradado del cassette, maneje el cassette desde la parte inferior, que es más fuerte, para minimizar las posibilidades de rotura.
  10. Vierta el agua, sumerja el gel en una cantidad suficiente de reactivo de tinción Coomassie GelCode Blue e incube durante 1 h en un orbital/balancín a temperatura ambiente.
    NOTA: Mezcle la solución de reactivo de mancha azul (Tabla de materiales) antes de usar girando suavemente la botella varias veces.
  11. Decantar la solución de tinte, agregar agua destilada, enjuagar varias veces con agua y luego poner el orbital / balancín para la detención.
    NOTA: Inserte un trozo de esponja (~3 cm x 0,5 cm) en el recipiente de detención de gel y deje el gel para descontener durante la noche. La esponja adsorbe las partículas de colorante sin requerir múltiples cambios de agua.
  12. Analice el gel en un analizador de imágenes.

5. Evaluación del supercomplejo mitocondrial mediante análisis de blot de inmunoblot

  1. Realice un nuevo juego de BN-PAGE sin manchar el gel al final de la electroforesis.
  2. Siga el mismo procedimiento que en la sección 3 (evaluación del complejo de transferencia de electrones mitocondrial (ETC)) para completar el inmunoblotting.

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Representative Results

Siguiendo el protocolo, se preparó un buen rendimiento de la mezcla de proteínas enriquecidas con mitocondrias del tejido cardíaco. Se obtuvieron aproximadamente 15 mg/ml de mezcla de proteínas enriquecidas con mitocondrias a partir de un promedio de 1,2 g de tejido cardíaco congelado extraído de la descendencia de la cerda. Las observaciones indicaron que menos de 0,5 g de tejido cardíaco congelado no produjeron una cantidad suficiente de mezcla de proteínas enriquecidas con mitocondrias para llevar a cabo un ensayo BN-PAGE. La cantidad de preparación mitocondrial fue suficiente para realizar (i) un análisis de inmunoblot estándar para evaluar los complejos de transferencia de electrones (ETC) individuales (es decir, Complejo-I, II, III, IV y Complejo-V), (ii) una evaluación del supercomplejo mitocondrial por BN-PAGE y análisis de inmunoblot, y (iii) ensayos enzimáticos limitados para el complejo seleccionado. El cóctel de anticuerpos levantados contra complejos de proteínas ETC individuales proporciona viabilidad técnica de que cada anticuerpo reconocerá su propia proteína diana en un solo ensayo de inmunoblot.

La proteína enriquecida con mitocondrias se preparó a partir del ventrículo izquierdo del corazón, obtenida de la descendencia de la cerda. La descendencia nació de dos grupos de cerdas: (1) un grupo se ejercitó durante el embarazo y (2) un grupo fue sedentario. Los tejidos cardíacos de ambos grupos se cosecharon en diferentes puntos de tiempo después del nacimiento (48 h, 3 meses, 6 meses y 9 meses). Si el ejercicio materno tiene un impacto positivo en la ETC mitocondrial de la descendencia durante la gestación fue la hipótesis que se probó en este estudio. Cuatro tejidos cardíacos se procesaron cómodamente en un día determinado debido al largo proceso de aislamiento enriquecido con mitocondrias.

Figure 2
Figura 2: Perfil de Immunoblot de complejos ETC mitocondriales del tejido cardíaco de la descendencia. La mezcla de proteínas enriquecidas con mitocondrias se resolvió en un gel de gradiente del 4% al 20% en condiciones reductoras. Las proteínas fueron inmunoprobsadas por un cóctel de anticuerpos comerciales, y el anticuerpo anti-VDAC se utilizó para el control de la carga (banda de color rojo). El cóctel de anticuerpos se planteó contra el corazón bovino Complex-I (antígeno NDUFB8), el corazón bovino Complex-II (antígeno C-II30 (FeS), el corazón bovino Complex II, III (antígeno C-III-Core 2), el humano Complex IV, subunidad II (antígeno C-IV-II) y el corazón bovino Complex-V (antígeno C-V-α). El anticuerpo secundario se etiquetó con una etiqueta infrarroja y la imagen se analizó utilizando un software de análisis de imágenes. Los perfiles complejos individuales en todos los grupos de edad se proporcionan en la Figura Suplementaria 1 (A-E). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La Figura 2 representa un perfil típico de proteína ETC. Los cócteles de anticuerpos permitieron la inmunoblotting en un formato multiplex. Cada anticuerpo reconoció su propia proteína diana, proporcionando una resolución aceptable. Las intensidades de la banda de proteínas se analizaron digitalmente. Los tejidos obtenidos de la descendencia de cerda ejercitada presentaron niveles relativamente reducidos en algunos de los complejos ETC (Figuras Suplementarias 1A-E). La preparación enriquecida con mitocondrias debe resolverse en un gel de gradiente (4%-20%) ya que la inmunoprobización se realizó en un formato de multiplexación. Este enfoque eliminará la necesidad de ejecutar varios porcentajes fijos de geles SDS/PAGE y la variabilidad de ejecución a ejecución.

Las proteínas mitocondriales se resolvieron en un gradiente BN-PAGE del 3%-8% (Figura 3A) y se inmunoprobieron con cócteles de anticuerpos. Tanto en grupos ejercitados como sedentarios, se observó formación de múltiples supercomplejos (Figura 3B).

Figure 3
Figura 3: Perfil supercomplejo mitocondrial por electroforesis en gel de poliacrilamida nativa azul (BN-PAGE). (A). Las mezclas de proteínas enriquecidas con mitocondrias se resolvieron en 3%-8% BN-PAGE, y se tiñeron con un reactivo azul de Coomassie (Código de gel, Reactivo de tinción azul). (B). Las mezclas de proteínas enriquecidas con mitocondrias se resolvieron en un BN-PAGE del 3%-8%, se transfirieron a una membrana de PVDF y se inmunoprobaron con los cócteles de anticuerpos para supercomplejos. En ambos ensayos, la carga proteica fue de 150 μg/pozo. No se incluyó un punto de recolección de datos de 6 meses debido a un rendimiento insuficiente de proteínas durante la preparación. El aumento supercomplejo más prominente observado fue a los 9 meses en el grupo ejercitado en comparación con el grupo sedentario. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Se preparó un formato de gel de gradiente diferente (3%-8%) debido al gran tamaño de los supercomplejos que se pueden resolver en BN-PAGE. La preparación enriquecida con mitocondrias descrita en este protocolo se utilizó para medir las actividades del complejo ETC mitocondrial. La Figura 4 representa los datos registrados para la evaluación de la actividad del Complejo I-II. Este ensayo se realizó de acuerdo con el protocolo establecido3.

Figure 4
Figura 4: Mediciones complejas de la actividad I-II. Las mezclas de proteínas enriquecidas con mitocondrias obtenidas de diferentes grupos de edad (48 h, 3 meses, 6 meses y 9 meses) se analizaron para la actividad del Complejo I-II mediante un ensayo cinético. El grupo ejercitado mostró un aumento de la actividad del Complejo I-II en comparación con la del grupo sedentario. La diferencia entre los dos grupos no fue estadísticamente significativa según una prueba t pareada (P > 0,05). Las barras de error representadas en la figura representan el error estándar de la media (SEM) para n = 4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura suplementaria 1: (A) Perfil del Complejo I en todos los grupos de edad. En general, la descendencia nacida de la cerda ejercitada presentó niveles más bajos de Complex-I en comparación con la del grupo sedentario (n = 4). Esto fue más pronunciado en el grupo de 9 meses. B) Perfil del Complejo II en todos los grupos de edad. Todos los grupos de edad mostraron niveles bajos de Complejo-II en el grupo ejercitado con la excepción de la cohorte de tres meses (n = 4). C) Perfil del Complejo III en todos los grupos de edad. Solo el grupo de edad de 9 meses mostró niveles más bajos de Complejo III en el grupo ejercitado en comparación con el del grupo sedentario (n = 4). D) Perfil del complejo IV en todos los grupos de edad. Se observó un ligero aumento en los niveles de proteína Complex-IV del grupo ejercitado (n = 4). (E) El perfil del Complejo V (ATP sintasa) en todos los grupos de edad. Tanto los grupos ejercitados como los sedentarios exhibieron niveles bajos de Complejo-V, excepto en el punto de datos de 48 h (n = 4). Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

Los pasos críticos para este protocolo se indican aquí. En primer lugar, la homogeneización de tejidos debe manejarse cuidadosamente para que no se apliquen efectos excesivos durante el proceso de homogeneización de tejidos. Se debe utilizar una trituradora de tejidos, que forma parte de la tecnología de ciclo de presión (PCT) para la homogeneización inicial de tejidos9. Este paso reducirá el ciclo de carrera excesivo del homogeneizador de vidrio sobre vidrio (Figura 1B) que puede destruir aún más las mitocondrias ya frágiles debido a las condiciones del tejido congelado. En segundo lugar, el peso del tejido congelado será importante para obtener cantidades suficientes de la preparación enriquecida con mitocondrias. La cantidad de tejido inicial recomendada será superior a 0,8 g, dependiendo de la fuente del tejido. El tejido cardíaco es muy rico en mitocondrias10,11; por lo tanto, la cantidad recomendada será suficiente para obtener una preparación enriquecida con mitocondrias. En tercer lugar, todos los procedimientos deben realizarse en una cámara frigorífica. Si una cámara frigorífica no está disponible, un baño de hielo de gran tamaño será suficiente.

La viabilidad de obtener preparaciones enriquecidas con mitocondrias a partir de tejido cardíaco previamente congelado se ha demostrado en este estudio. Este protocolo será esencial para proporcionar acceso a tejido congelado archivado del que se pueden aislar las mitocondrias y a partir del cual se pueden evaluar los complejos enzimáticos ETC mitocondriales. Un estudio reciente demostró que la respiración mitocondrial de tejidos y células previamente congelados también podría ser medible2. Debido a este avance, los investigadores podrán utilizar biomuestras previamente recolectadas para análisis adicionales.

Evaluar el perfil de ETC individuales y supercomplejos se hace más fácil mediante la realización de inmunoblotting clásico en un formato de multiplexación que utiliza múltiples anticuerpos durante el procedimiento de immunoblotting en la misma membrana PVDH. Es fundamental que el usuario determine la cantidad de proteína que se cargará en geles para SDS-PAGE y BN-PAGE. El volumen de resuspensión debe ser lo más mínimo posible para obtener altas concentraciones de proteínas para que el usuario no tenga problemas con el volumen de carga de la muestra. La cantidad de proteína a cargar en BN-PAGE depende del rendimiento de la preparación enriquecida con mitocondrias. Se cargó una mezcla de proteínas enriquecidas con mitocondrias de 150 μg por pozo en BN-PAGE debido a la pequeña cantidad de tejido cardíaco original. La preparación de pellets enriquecidos con mitocondrias de 50-150 μg sería suficiente para un gel de 1 mm de espesor. El usuario puede preferir un gel de 1,5 mm de espesor para la carga de muestras; sin embargo, la resolución de las bandas de proteínas puede no ser de calidad aceptable. La menor resuspensión de proteína mitocondrial por pozo no se probó porque los cócteles de anticuerpos utilizados en los ensayos de inmunoblot estaban predeterminados en su concentración; sin embargo, los usuarios pueden hacer su propio cóctel de anticuerpos para aumentar la velocidad de señal / ruido.

Se recomienda un gel de gradiente totalmente polimerizado (3%-8%) para los geles BN-PAGE. Los geles degradados del 3% al 8% no han estado disponibles comercialmente; por lo tanto, se pueden usar mini geles estándar de gradiente casero (3% -8%) (9 x 6 cm). Verter el gel 24 horas antes y permitir que el gel polimerice durante la noche en RT proporcionará una formación de gel aceptable. Si un usuario necesita una mejor separación de los supercomplejos, se recomienda utilizar formatos de gel más grandes (ya sea gel midi de 13,5 cm x 6,5 cm o gel largo de 28 cm x 16 cm).

La aplicación de este protocolo permitirá a los investigadores aislar mitocondrias y analizar el perfil de ETC y supercomplejos en tejidos archivados previamente congelados. Todos los depósitos de bioespecímenes nacionales y regionales mantienen las muestras biológicas en condiciones de ultracongelación (es decir, -80 °C). Un gran número de tejidos están siendo archivados por instituciones y compañías farmacéuticas para estudios adicionales y con fines de intercambio de reactivos. El Instituto Nacional de Salud (NIH) exige que cualquier proyecto apoyado por los NIH debe compartir los reactivos producidos a partir de los proyectos apoyados. Estos biorepositorios son fuentes muy valiosas para la obtención de tejidos archivados congelados para la obtención de datos preliminares para las solicitudes de subvención. Para analizar las actividades enzimáticas de los supercomplejos no se realizó en este estudio; sin embargo, existen protocolos disponibles para realizar dichos ensayos8.

Utilizando los métodos descritos en este artículo, se analizaron complejos ETC individuales y supercomplejos de preparaciones enriquecidas con mitocondrias obtenidas del tejido cardíaco de la descendencia de cerdas. Las crías nacidas de cerdas ejercitadas presentaron bajos niveles de ETC durante los primeros 6 meses de su vida y eventualmente subieron de nivel a los 9 meses.

Complejo ETC 48 horas 3 meses 6 meses 9 meses
Complejo-I ↓ ↓ ↓ Sin cambios
Complejo II ↓ ↓ Sin cambios Sin cambios
Complejo III ↓ Sin cambios Sin cambios ↓
Complejo IV ↑ ↑ ↑ Sin cambios
Complejo-V ↓ ↓ ↓ Sin cambios

Tabla 2: Perfil de complejos de proteínas de cadena de transporte de electrones mitocondriales. La tabla resume el perfil de los niveles del complejo ETC mitocondrial en el grupo de cerdas ejercitadas. Todos los complejos, excepto el Complejo IV, mostraron un patrón decreciente en todos los grupos de edad.

Esta observación puede sugerir que las crías nacidas de las cerdas ejercitadas durante el embarazo indicaron menos complejos etc pero más eficientes en sus mitocondrias del tejido cardíaco (Figura 4). Sin embargo, se ha encontrado que la formación de supercomplejos en el grupo ejercitado de 9 meses es elevada. El ejercicio puede afectar de alguna manera el reordenamiento de los supercomplejos en condiciones de mayor demanda de energía12. Además, Complex-V (ATP sintasa) ha exhibido un perfil bajo en los primeros 6 meses después del nacimiento. Esta respuesta puede deberse a la probabilidad de complejos de proteínas ETC modificados epigenéticamente. El pequeño tamaño de la muestra (n = 4) para este estudio no fue suficiente para llegar a tal conclusión; sin embargo, los patrones de bajos niveles de proteínas complejas DE ETC, alta actividad del Complejo I-II y formación elevada de supercomplejos pueden sugerir que la bioenergética en el tejido cardíaco de la progenie de las cerdas ejercitadas está influenciada por el ejercicio. Menos complejos DE ETC mitocondriales, pero que funcionan de manera más eficiente, y la formación de supercomplejos aumentados son fenómenos interesantes que deben investigarse. Este proyecto aún está en curso.

En resumen, este protocolo proporciona una preparación de muestras enriquecidas con mitocondrias simples y directas a partir de tejido cardíaco archivado previamente congelado. Los complejos ETC mitocondriales se pueden analizar mediante inmunoblotting estándar con cócteles de anticuerpos multiplexados. BN-PAGE seguido de inmunoblotting puede analizar la presencia de supercomplejos. Esta preparación también puede permitir a los usuarios evaluar las actividades del complejo ETC mitocondrial.

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Disclosures

Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado financieramente por la subvención intramuros de la Universidad de Kansas City para Abdulbaki Agbas y la Beca de Investigación de Verano para Daniel Barrera. Los autores están agradecidos por el trabajo editorial del Dr. Jan Talley.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amino caproic acid Sigma/Aldrich A2504-100G
Anti-Hu Total OxPhos complex kit Invitrogen 458199
anti-VDAC antibody abcam ab15895 use 1 µg/mL
Coomassie G-250 ThermoSientific 20279
Coomassie GelCode Blue ThermoScientific 24592
Digitonin Cabiochem 300410
Glass-Glass pestle homogenizer VWR KT885451-0020
Image Studio LICOR
IR-Dye conjugated anti-Rabbit Ab LICOR LC0725
Multiwell plate reader BioTek Synergy HT
Native molecular weight marker ThermoFisher BN2001
Nylon mesh monofilament Small Part Inc CMN-74
Orbital shaker ThermoScientfic
PCT Shredder Pressure Bioscience Inc
SEA BLOCK Blocking buffer ThermoScienctific 37527
Shredder PULSE Tube Pressure Bioscience Inc FT500-PS
Table top centrifuge Eppendorf 5418
Trypsin Amresco M150-1G
Trypsin inhibitor Amresco M191-1G Requires fresh preparation

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References

  1. Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Analytical Biochemistry. 418 (2), 213-223 (2011).
  2. Osto, C., et al. Measuring mitochondrial respiration in previously frozen biological samples. Current Protocols in Cell Biology. 89 (1), 116 (2020).
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  4. Hathaway, Q. A., et al. Maternal-engineered nanomaterial exposure disrupts progeny cardiac function and bioenergetics. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 312 (3), 446-458 (2017).
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  8. Jha, P., Wang, X., Auwerx, J. Analysis of mitochondrial respiratory chain supercomplexes using blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Current Protocols in Mouse Biology. 6 (1), 1-14 (2016).
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  11. Hom, J., Sheu, S. S. Morphological dynamics of mitochondria--a special emphasis on cardiac muscle cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46 (6), 811-820 (2009).
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Bioquímica Número 174
Medición de complejos de transferencia de electrones mitocondriales en tejido cardíaco previamente congelado de la descendencia de cerda: un modelo para evaluar los cambios bioenergéticos mitocondriales inducidos por el ejercicio
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Barrera, D., Upton, S., Rauch, M.,… More

Barrera, D., Upton, S., Rauch, M., Notarianni, T., Eum, K. S., Liberty, M., Sah, S. V., Liu, R., Newcomer, S., May, L. E., Agbas, E., Sage, J., Kosa, E., Agbas, A. Measuring Mitochondrial Electron Transfer Complexes in Previously Frozen Cardiac Tissue from the Offspring of Sow: A Model to Assess Exercise-Induced Mitochondrial Bioenergetics Changes. J. Vis. Exp. (174), e62809, doi:10.3791/62809 (2021).

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