Summary
이전에 냉동 보관 된 고체 조직에서 미토콘드리아 농축 샘플의 준비는 다양한 실험 양식에서 미토콘드리아의 기능적 및 분석 평가를 모두 수행 할 수 있었습니다. 이 연구는 냉동 심장 조직에서 미토콘드리아농축 제제를 준비하고 미토콘드리아의 분석 평가를 수행하는 방법을 보여줍니다.
Abstract
미토콘드리아 전자 전달 복합체(ETC) 프로파일은 운동된 뿌리기로 태어난 자손의 심장 조직에서 변형됩니다. 이 가설은 미토콘드리아 ETC 및 초복합 프로파일을 평가하기 위해 가벼운 격리 절차를 사용하여 미토콘드리아를 격리하여 테스트되었습니다. 여기에 설명된 절차는 이전에 동결된 보관된 심장 조직의 처리를 허용하고 미토콘드리아 ETC 복합체, 초복합체 및 ETC 복합 활동 프로파일의 평가를 위한 신선한 미토콘드리아 제제의 필요성을 제거하였다. 이 프로토콜은 다중 항체 기반 면역 블로팅 및 블루 네이티브 젤 전기 포근을 사용하여 슈퍼 복합 평가에서 최적의 ETC 단백질 복합 측정을 설명합니다.
Introduction
이 프로토콜의 목표는 조직 용해및 미토콘드리아의 추출을 향상시키는 조직의 저에너지 기계적 중단의 새로운 기술로 이전에 냉동 된 심장 조직에서 미토콘드리아 농축 된 준비를 얻기위한 상세한 단계를 제공하는 것이었습니다. 이 방법으로, 높은 전단 응력 또는 고온 및 짧은 균질화 시간 (10-12 s)을 생성하지 않고 추출 효율을 향상 달성할 수 있게된다1.
보관된 냉동 조직으로부터 미토콘드리아를 얻으려면 기능2 및 생화학 연구를 모두 수행하는 귀중한 자산입니다3 그렇지 않으면 정확한 실험 조건하에서 쉽게 반복할 수 없다. 고전적인 포터-엘베젬 테플론 유봉 유리 균질화제 또는 두스균제제는 사용되었으며 여전히 간, 신장 및 뇌와 같은 연조직을 균질화하기 위해 연구 실험실에서 사용되고 있습니다. 그러나 근육과 심장과 같은 단단한 조직을 균질화하려면 더 많은 균질화 시간, 효소 치료, 고속 균질화 및 광범위한 사용자 경험이 필요합니다. 이것은 근육과 심장과 같은 단단한 조직에서 미토콘드리아와 같은 온전한 세포기관을 추출하는 데 불리합니다. 본 프로토콜에 기재된 방법은 미토콘드리아-농축 제제를 얻어 미토콘드리아-농축 제제를 얻어 미토콘드리아-단백질 복합체 및 이들의 초복합형성을 운동및 앉아있는 뿌리에서 태어난 자손으로부터 수확하고, 액체 질소에서 플래시 냉동, 향후 사용을 위해 -80°C에 저장된다. 이 방법을 사용하면 사용자가 이전에 냉동 보관된 조직에서 미토콘드리아 농축 제제를 분리할 수 있습니다.
임신 한 설치류에 대한 외부 나노 물질 노출은 임신 4 동안 자손에 심장 기능 과 미토콘드리아 호흡 및 생체 에너지에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 임신 중 태아 근세포 생물 에너지에 에어로빅 운동 유도 긍정적인 변화 아직 문서화 되지 않은. 그러나, 신흥 연구는 임신 중 모계 유산소 운동이 태아 심장 기능에 긍정적 인 영향을 미친다는 증거를 제공합니다5. 추가 증거를 제공하기 위해, 임신 중 자손 심장 미토콘드리아 호흡기 사슬 복합체 (즉, 복합 V를 통한 복합 I)에 대한 모계 운동의 세로 적 효과에 대한 분석이 수행되었습니다.
이 연구는 결과 모성 운동이 자손의 심장 미토콘드리아에 있는 에너지 생산의 효율성을 향상시킨다는 것을 건의할 수 있기 때문에 중요한 건강 관련성이 있습니다. 이 연구에서, 뿌리 (암컷 돼지)는 두 가지 이유로 동물 모델로 사용되었다 : (i) 심장 생리학은 인간6과 유사하고, (ii) 다른 시점에서 자손에서 심장 조직 수확은 기관 IACUC 승인하에 가능하다. 제안된 연구 결과는 모계 운동 및 자손의 심장 조직의 세포 및 생화학적인 메이크업에 그것의 잠재적인 긍정적인 효력을 연결하는 근본적인 질문의 많은 대답을 목표로 합니다. 이 접근법은 임신 도중 태아 심장 근구 내의 생체 에너지 변화의 문제점을 해결한 길고 비용이 많이 드는 종방향 연구 결과에서 얻은 이전에 동결된 심장 조직에서 온화하면서도 효과적인 미토콘드리아 격리 기술을 요구합니다. 이 연구에서 설명된 방법은 분석 및 기능 적 연구를 위한 미토콘드리아 농축 제제를 위해 이전에 냉동 보관된 조직의 큰 금액을 활용할 수 있게 합니다. 연구 결과는 또한 자궁과 그 너머에 있는 심장 건강에 임산부 운동의 효력을 결정하는 미래 연구 결과로 이끌어 낼 수 있던 예비 데이터를 제공함으로써 이 필드에 있는 지식 격차를 채우는 것을 도울 것입니다.
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Protocol
냉동 자손 심장 조직은 기관 IACUC 승인 서신과 함께 숀 뉴커머 박사로부터 받았다. 심장 조직은 장기 종방향 연구에서 얻어지고, 액체 질소에서 플래시 동결, 향후 사용을 위해 -80°C에 저장하였다. 자손 심장 조직의 처리에 관한 모든 프로토콜은 캔자스 시티 대학 IBC와 IACUC 위원회의 지침을 따랐다.
1. 버퍼 및 시약 준비
참고: 제조업체의 지침에 따라 모든 샘플을 준비합니다. 모든 레시피 및 프로토콜 단계에서 매우 정제된 물 또는 이와 동등한 물을 사용합니다. 이 절차 중에 개인 보호 장비(실험실 글로트, 페이스 마스크, 장갑 및 고글/얼굴 보호장치)를 착용하십시오. 완충제 부피가 6개의 조직 샘플을 처리하는 데 적합합니다.
- 1.5L 조직 세척 버퍼를 자당 154.035 g(0.3M 결승), HEPES 3.904 g(10mM 결승), EDTA 0.111 g(0.2mM 결승)를 결합하여 준비하십시오. 교반판에 있는 동안 1.0 L의 물에 재료를 넣고, pH를 희석HCl으로 7.2로 조정하고, 메이크업은 최종 부피량인 1.5L로 조정합니다.
참고: 시료 당 약 200mL의 세척 버퍼가 필요합니다(50-300 mg). 6개의 조직 견본은 하루에 처리될 수 있습니다. 나머지 세척 버퍼를 사용하여 격리 버퍼를 만듭니다. - 이전에 설명된 세척 버퍼로부터 210 mg의 BSA를 210mL의 세척 버퍼에 추가하여 절연 버퍼를 준비한다. 희석 NaOH 용액으로 pH를 7.4로 조정합니다.
참고: 조직 샘플당 약 35mL의 절연 완충제가 필요합니다. 따라서 6개의 샘플에 대해 210mL의 격리 버퍼가 필요합니다. 준비 당일 에 신선한 BSA 솔루션(1mg/mL 최종)을 추가하여 이 버퍼를 준비하십시오. BSA는 자유 지방산과 같은 천연 분리제를 제거하여 미토콘드리아 특성을 향상시켜 미토콘드리아를 분리하는 데 사용됩니다. BSA는 뇌 미토콘드리아7에서 기판, 특히 간결한 기판의 산화 속도를 증가시킴으로써 항산화 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 또는, 소 혈청 알부민은 ovalbumin와 같은 더 저렴한 산이 없는 아날로그로 대체될 수 있다. - EDTA 0.011 g(최종 농도 0.2mEDTA) 또는 200mM 스톡 EDTA 용액 150μL을 15에 사용하여 150mL의 재서스펜션 버퍼를 준비하십시오. 재서스펜션 버퍼0mL, 자당 12.836 g(0.25M 자당 최종 농도), 트리스 0.236 g(10mM Tris-HCl 결승). pH를 0.1 N NaOH로 7.8로 조정합니다. 사용하기 직전에 프로테아제 억제제 칵테일60 μL을 추가합니다.
- 트립신 용액을 1 mM HCl (트립신/mL 최종 2.5 mg)의 3.0 mL에서 7.5 mg의 트립신용액을 준비하십시오. 이 양은 하나의 샘플에 충분합니다.
참고: 처리될 조직 샘플의 수에 따라 트립신 용액을 준비합니다. - BSA를 함유한 절연 완충제의 20mL에 13.0 mg의 트립신 억제제용을 결합하여 대두로부터의 트립신 억제제 용액을 준비한다(트립신 억제제 최종0.65 mg/mL).
참고: 신선한 트립신 억제제 용액을 준비합니다. - 1mL의 물(10% 암모늄 감산궁 결승)에 감산 암모늄 감산 시약을 준비한다.
참고: 암모늄 감황산염 시약은 신선하게 준비되어야 하며 대용량은 -20°C 냉동고에 알리인용되어 보관될 수 있다. - 아미노카프로산 용액(ACA)을 1.0mL의 6아미노산 카프로아산에 결합하여 4°C(1M 6-aminocaproic acid final)에 보관한다.
- 쿠마시 브릴리언트 블루 염료 용액을 0.5mL의 물에 1g, 1M 아미노카프로아산(10% 염료용액 최종 농도)의 0.5mL를 용해하여 쿠마시 의 화려한 블루 염료 용액을 준비한다.
- 블루 네이티브 페이지(BN-PAGE)에 대해 5% 디지토닌을 준비합니다. 대략 샘플 준비에 필요한 디지토닌의 양을 계산하고 파이펫 팅 오류를 상쇄하기 위해 약간의 추가 볼륨 (10 mg에 의해 과대 평가). 15 mg: 먼저 15 mg의 디지오닌을 100% DMSO의 30 μL에 희석하십시오. 소용돌이는 디지토닌이 솔루션에 들어갈 수 있도록 돕습니다. 다음으로 ddH2O(270 μL)의 나머지 90%를 추가합니다. 부드럽게 가열하여 용액(소용돌이)을 혼합한 다음 얼음 위에서 식힙니다.
- 네이티브 PAGE 양극 버퍼를 준비합니다. 20x 네이티브 PAGE 실행 버퍼 50mL를 950mL 물에 추가하여 최종 부피 1L을 즉시 사용할 수 있도록 신선한 양극 버퍼를 준비합니다. 이 것을 1배 실행 버퍼로 사용합니다.
- 진한 파란색 음극 버퍼를 준비합니다. 네이티브 PAGE 양극 버퍼의 80 mL에 쿠마시 화려한 블루 G-250의 0.0160 g를 용해; 잘 섞으세요.
참고: 즉시 사용할 수 있는 신선한 음극 버퍼를 준비하십시오. 60mL만 필요할 수 있지만 누출 시 20mL를 추가로 만들 수 있습니다. - 밝은 파란색 음극 버퍼를 준비합니다. 네이티브 PAGE 양극 버퍼의 180mL에 다크 블루 음극 버퍼 20mL을 추가하고 잘 섞습니다.
참고: 이 버퍼는 한 번만 사용할 수 있습니다. - 5% 쿠마시 G-250을 샘플 첨가제로 준비합니다. 1M ACA의 200 μL로 이미 만든 10 % 쿠마시 주식 (단계 1.8)의 200 μL을 희석하고 4 ° C에 저장합니다.
- 40% 글리세롤, 0.04% 폰소 S, 25m Tris-HCl(pH 6.8), 192mM 글리신을 최종 부피 의 10mL에 결합하여 4배 네이티브 PAGE 샘플 버퍼를 준비한다. 알리쿼트및 냉동실에 -20°C에 보관하십시오.
2. 얼어붙은 심장 조직에서 미토콘드리아 격리
참고 : 4 ° C 차가운 방에서 미토콘드리아 격리 절차를 수행합니다. 그러나, 차가운 방의 가용성의 경우, 절차를 수행하기 위해 큰 크기의 얼음 목욕을 사용합니다.
- -80°C 냉동고에서 이전에 냉동 된 심장 조직 샘플을 꺼내십시오.
참고: 지정된 날에 미토콘드리아 격리를 위해 최대 4개의 조직 샘플을 편안하게 처리할 수 있습니다. - 심장 조직 샘플을 포함하는 튜브의 무게를 측정하고 무게를 기록합니다. 40mL의 세척 완충제가 들어 있는 3개의 비커(각 50mL)를 준비합니다. 얼음 소금 목욕의 각 비커를 3-5분 동안 섞은 얼음과 소금을 식힌 후 다음 단계로 진행하십시오. 각 비커에 마그네틱 교반 바를 넣고 교반기는 중간 속도를 설정합니다.
참고: 비커를 과도하게 얼러가지 말고 얼음 결정 구름이 나타나기 시작한 직후에 사용하십시오. - 냉동 심장 조직을 첫 번째 비커에서 얼음 차가운 용액에 직접 넣습니다. 가능한 한 많은 혈액을 얻기 위해 핀셋을 사용하여 조직에 약간의 압력을 가하고 교반하고 적용하는 동안 약 5 분 기다립니다.
- 빈 튜브의 무게를 측정하고 원래 체중(2.2단계)에서 빼서 심장 조직의 순 중량을 얻습니다.
- 집게로 조직을 꺼내서 깨끗한 종이 타월로 심장을 짜서 혈액을 제거하십시오. 그런 다음 조직을 두 번째 비커에 넣습니다. 여분의 혈액을 제거하기 위해 저어주면서 약 5 분 기다립니다.
- 종이 타월에 티슈를 부드럽게 말리십시오. 모든 지방, 응고 혈액, 오리클 및 근막 (흰색 조직)을 제거하십시오. 그런 다음 심실 조직을 풀.
- 2.7.1-2.7.9 단계를 수행하여 분쇄기를 사용하여 조직 샘플을 분쇄하였다.
- 심장 조직 (~50-300 mg)을 램 측의 조직 분쇄챔버에 넣습니다.
도 1: 분쇄기와 함께 사용하기 위한 조직 분쇄기 챔버(tube). 분쇄관에서의 조직 균질화는 조직 샘플 당 약 10-12 s가 필요합니다. 균질화된 조직이 천공 된 디스크를 통과하여 상부 챔버로 전달되면 조직 균질화가 완료됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 튜브의 캡 측에 세척 버퍼의 ~0.2-0.8 mL을 추가합니다.
참고: 파쇄 중에 결합된 샘플의 총 부피와 세척 버퍼가 0.7-0.8mL를 초과하지 않는지 확인합니다. - 튜브 도구를 사용하여 분쇄기 캡으로 분쇄기 챔버를 아늑하게 캡합니다.
참고: 분쇄기 캡을 과도하게 조이지 마십시오. - 분쇄기 챔버를 램 사이드를 아래로 놓는 분쇄기 홀더 유닛에 넣습니다. 램은 분쇄자 홀더에 피팅을 참여합니다.
- 분쇄기 드라이버의 비트를 삽입; 비트가 분쇄기 캡에 참여하게하십시오. 비트가 제자리에 고정되어 있는지 확인합니다.
참고: 항상 완전 충전된 분쇄기 드라이버를 사용합니다. - 분쇄기 홀더의 압력 표시등이 분쇄기 홀더의 약 2의 설정에 도달할 때까지 분쇄기 드라이버 및 분쇄기 챔버에 압력을 수동으로 적용합니다.
참고: 조직을 파쇄하는 것이 더 섬유질인 경우 설정은 더 높은 수준에 있을 수 있습니다. - 2에서 설정을 유지하면서 분쇄기 드라이버의 트리거를 눌러 분쇄기 드라이버를 약 10-12s로 실행합니다.
- 조직의 고체 질량의 전부 또는 대부분이 리시스 디스크를 통해 파쇄되고 튜브를 보고 분쇄기 챔버의 상부 챔버로 전달되는지 여부를 확인하기 위해 튜브를 본다.
참고: 더 긴 기간 동안 조직 샘플을 파쇄해야 할 수도 있습니다. 튜브를 분쇄자 홀더로 되돌리기만 하면 프로세스를 계속 진행하십시오. 대부분의 종류의 조직 샘플은 10-12 s의 파쇄만 필요합니다. 모든 파쇄는 마찰로 인해 약간의 열을 생성하지만,이 짧은 처리 시간은 크게 샘플을 가열하지 않습니다. - 시료를 분쇄한 후 분쇄기 챔버를 홀더 유닛 밖으로 들어올립니다. 튜브 도구를 사용하여 분쇄기 캡을 제거하고 나중에 사용할 수 있도록 깨끗한 표면에 놓습니다.
참고: 분쇄기 캡은 샘플 추출물로 오염된 것으로 간주되어야 하며, 샘플 유형에 따라 전염성 물질로 오염될 수 있습니다. 교차 오염을 방지하기 위해 다른 조직 샘플에 동일한 분쇄기 캡을 사용하지 마십시오.
- 파쇄된 심장 조직을 40mL의 세척 완충제로 세컨드 비커로 옮기고, 저어주면서 중간 속도로 5분 동안 티슈를 저어줍니다.
- 나일론 메쉬 모노필라멘트(74 μm 모공 크기)를 통해 서스펜션을 걸러내고 여과물을 버립니다. 파쇄된 조직을 10mL의 세척 버퍼로 필터 3x에 세척합니다.
참고: 나일론 메쉬 모노필라멘트가 물에 미리 젖어 있는지 확인하십시오. - 세척 및 파쇄 된 조직을 20 mL의 세척 완충액으로 50 mL 비커로 옮기고 비커를 자기 교반기위에 얼음 욕조에 놓습니다. 트립신 용액0.5mL를 추가하면서 15분 동안 계속 저어줍니다. 인큐베이션을 통해 약 7.5분 동안, 조직 현탁액을 0-15mL의 부피를 보유할 느슨하게 장착된 핸드헬드 유리 온 글래스 균질화제로 이송한다.
도 1: 분쇄기와 함께 사용하기 위한 조직 분쇄기 챔버(tube). 분쇄관에서의 조직 균질화는 조직 샘플 당 약 10-12 s가 필요합니다. 균질화된 조직이 천공 된 디스크를 통과하여 상부 챔버로 전달되면 조직 균질화가 완료됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 부드럽게 거품을 생산하지 않고 서스펜션을 분산하기 위해 4-5 스트로크로 균질화. 50mL 비커에 호모하게 를 넣고 4 °C에서 15 분 동안 교반 접시에 부드럽게 섞습니다.
- 15분 동안 인큐베이션을 한 후, 10mL의 분리 완충제는 편모를 함유한 비커에 10mL를 넣고 부드럽게 교반하면서 4°C에서 1분간 배양한다.
- 나일론 필터를 통해 서스펜션을 다시 걸러내고 50mL 원상 관에 여과물을 저장합니다.
- 나일론 필터에 남은 미립자 분획을 수집하고 유리온 유리 균질화제에 놓습니다. 세척 버퍼의 15-20 mL을 추가하고 25-30 s를 위해 손으로 부드럽게 균질화합니다.
참고: 이 단계에서 여과가 매우 느리게 흐릅니다. 여과 흐름을 증가시키기 위해, 원물 튜브의 내부를 만지는 깔때기 팁을 놓습니다. - 균모를 여과물과 결합하고 튜브와 원심분리기를 600 x g 에서 4°C에서 15분 동안 균형을 이릅니다.
- 펠릿에 의한 오염을 피하기 위해 나일론 필터를 사용하여 결과 상체를 새로운 원식 튜브로 필터링합니다. 원심분리기를 8,500 x g 에서 4°C에서 15분 동안 다시 실행합니다.
참고 : 플라스틱 전송 파이펫을 사용하여 상체를 제거하고 푹신한 펠릿의 상단에서 0.2 mL의 상퍼를 희생하십시오. - 상체를 버리고 절연 버퍼의 1mL로 펠릿을 2-3번 헹구십시오. 매번 푹신한 흰색 외부 림 레이어를 폐기하십시오.
참고: 1mL 팁이 있는 파이펫 또는 새 이송 파이펫을 사용하여 격리 버퍼를 추가하여 펠릿을 세척합니다. 펠릿을 깨는 것을 방지하고 상류체의 오염을 방지하기 위해 펠릿 위에 직접가 아닌 튜브 측면에 버퍼를 추가합니다. 다음으로, 전사 파이펫으로 버퍼를 흡인하고 프로세스를 두 번 더 반복합니다. - 각 튜브에 절연 버퍼 5mL을 추가하고 1mL 팁 또는 새 전송 파이펫이 있는 파이펫을 사용하여 펠릿을 분해합니다.
- 서스펜션을 20mL의 추가 절연 버퍼로 희석하고 원심분리기를 8,500 x g 에서 다시 4°C에서 15분 동안 실행합니다.
- 상체를 버리고 재일시 중단 버퍼의 5mL에서 펠릿을 다시 놓습니다. 이어서, 총 20mL, 원심분리기는 8,500x g 에서 4°C에서 15분 동안 버퍼를 더 15mL 더 추가한다. 상부체를 폐기합니다. 그 결과 갈색 펠릿에는 세척되지 않은 미토콘드리아가 들어 있습니다.
- 프로테아제 억제제를 포함한 재중단 버퍼의 250 μL에서 미토콘드리아농축 펠릿을 다시 중단한다. 25 μL의 알리쿼트, 액체 질소의 빠른 동결, -80°C 깊이 냉동고에 몇 년 동안 보관하십시오.
참고: 단백질 분석 분석을 위한 미토콘드리아 농축 제제의 5 μL을 예비합니다. BN-PAGE(블루 네이티브 페이지) 연구의 경우, 튜브당 미토콘드리아 단백질 50μg에서 재부유펠릿을 알리쿼트한다. 원심분리기 는 8,500 x g 에서 4 °C에서 15 분 동안. 수퍼네티를 조심스럽게 흡인시키고 미토콘드리아 펠릿(50 μg 단백질/알리쿼트)을 -80°C 깊이 냉동고에 몇 년 동안 저장한다.
3. 미토콘드리아 전자 전달 복합체(ETC) 평가
참고: 개별 미토콘드리아 ETC 단백질(즉, 복합-I, II, III, IV, V)은 표준 면역 블로팅 분석으로 평가될 수 있다. 다양한 시료(4시간 포인트: 48h, 3개월, 6개월, 9개월), 2가지 실험 조건(운동 및 앉아있는), 다수의 면역프로빙 항체(5개의 항체)로 인해 멀티플렉스 면역블로팅이 권장됩니다. 다음과 같이 멀티플렉스 면역 블로팅을 수행합니다.
- 미토콘드리아 농축 단백질 샘플/4%-20% 그라데이션 폴리아크릴아미드 젤 전기포레시스(100V, 90분)에서 50μg를 해결합니다.
- 단백질을 PVDF 멤브레인으로 이송 (75 V; 60분)
- 블로킹 버퍼 용액에서 멤브레인을 4°C에서 최소 1시간 동안 차단합니다.
참고: 차단 시간은 최대 4°C에서 최대 1박까지 연장할 수 있습니다. 차단 완충제(재료의 표)는 일반적인 방법에 존재하는 그밖 포유류 단백질뿐만 아니라 항체와 특정 결합 상호 작용이 있기 위하여 확률이 낮은 비 포유류 성분 (즉, 물고기 단백질)를 포함합니다. - 항 복합체-I, II, III, IV, V 항체를 포함한 항체 칵테일로 멤브레인을 탐사하고 4°C에서 궤도 셰이커에서 하룻밤 동안 배양한다.
- 다음 날, RT (실온)에서 궤도 셰이커에 2 시간 IR 태그 이차 항체로 멤브레인과 프로브를 세척합니다.
- 1x TBS-T(Tween 20을 포함하는 TBS)로 5회 세척하고 1배 TBS(Tris 버퍼드 식염수)로 한 번 세척합니다.
참고: 마지막 세척의 경우 TBS 버퍼에 세제를 포함하지 마십시오. - 이미지 분석기의 블롯을 이미지합니다.
4. 블루 네이티브 폴리 아크릴아미드 젤 전기 포레시스에 의한 미토콘드리아 슈퍼컴플렉스 평가 (BN-PAGE)
참고: BN-PAGE 기술을 사용하여 ETC의 초복합 프로파일도 평가할 수 있습니다.
- 50 μg 미토콘드리아 농축 펠릿 단백질(7μL + 4x 네이티브 폴리아크릴아미드 젤 전기포레시스 샘플 로딩 버퍼 + 8 μL + 쿠마시 G-250의 2 μL)에 대한 샘플 버퍼 칵테일을 준비합니다.
참고: 사용 가능한 샘플 수(50 μg 단백질/샘플)에 따라 스톡 샘플 버퍼 칵테일을 만듭니다. 미토콘드리아 농축 펠릿의 단백질 농도에 따라 적절한 디지토닌 양을 선택하십시오(표 1)8. - 디지오닌 스톡을 95°C에서 3분간 가열하고, 얼음 위에서 섞고 식힌 후 마스터 믹스를 만듭니다.
- 샘플을 젤에 넣기 직전에 Coomassie G-250 샘플 첨가제를 추가합니다.
- 미토콘드리아 단백질 펠릿 50 μg가 포함된 튜브에 샘플 버퍼 칵테일 20 μL을 추가합니다. 펠릿을 피펫과 부드럽게 혼합하여 거품을 일으키지 않고 용해시키게/재중단합니다.
- 미토콘드리아농축 펠릿의 최대 용용화를 달성하기 위해 20분 동안 얼음에 혼합물을 배양합니다. 때때로, 부드럽게 용해성을 향상시키기 위해 튜브를 쓸어.
- 인큐베이션을 기다리는 동안 네이티브 PAGE 양극 버퍼/1x 실행 버퍼와 진한 파란색 음극 버퍼를 준비합니다.
- 원심분리기는 4°C에서 10분 동안 20,000 x g 에서 용해성 미토콘드리아 농축 펠릿을 원심분리합니다.
- 원심 분리 후, 얼음위에 놓인 새로운 튜브에 상류체의 15 μL을 수집합니다.
- 4.8 단계에서 얻은 상체에 5% 쿠마시 G-250 시약을 추가합니다( 표 1참조).
참고: 5% 쿠마시 G-250 부피는 염료의 최종 농도가 세제 농도가 1/4이기 때문에야 한다. 샘플을 젤에 적재하기 직전에 이 단계를 수행합니다.
| 단백질 | 디지노닌/단백질 | 4x 샘플 버퍼 | 5% 디지노닌 | 물 | 최종 볼륨 | 5% 쿠마시 G-250 |
| 비율(g/g) | 샘플 첨가제 | |||||
| 50 μg | 8 | 5 | 8 | 7 | 20 | 2 |
| 50 μg | 4 | 5 | 4 | 11 | 20 | 1 |
표 1: 두 가지 세제/단백질 비율을 가진 샘플 버퍼 칵테일 준비. 미토콘드리아 현탁액에서 멤브레인 단백질의 최대 용해화를 달성하기 위해, 디지토닌/미토콘드리아 현탁액 단백질 농도는 단백질의 4-8 g digitonin/g 사이에서 조정되어야 합니다. 심장 조직에서는 미토콘드리아 현탁액 단백질(즉, 8g 디지토닌/미토콘드리아 단백질 의 g)에 대해 400 μg 디지토닌을 사용하여 미토콘드리아 현탁액으로부터 초대형 복합체의 용해도를 극대화하였다.
- 3%-8% 그라데이션 젤을 붓고 빗을 제거하고 1배의 완충액으로 젤의 우물을 세 번 씻어내시다.
참고 : 젤은 하루 전에 부어 경우 가장 중합합니다. - 전기 전광 계를 설정하고 장치에 젤을 배치합니다.
- 진한 파란색 음극 버퍼로 샘플 웰을 채웁니다.
- 젤의 첫 번째 및 마지막 우물에 네이티브 분자량 마커로서 얼룩이 없는 단백질 표준의 10 μL을 적재합니다.
- 평평한 머리 젤 로딩 팁을 사용하여 4.9 단계에서 제조된 샘플 상피 + Coomassie 샘플 첨가제의 전체 양을 우물에 적재합니다.
- 조심스럽게 우물의 샘플을 방해하지 않고 어두운 파란색 음극 버퍼의 약 60 mL미니 셀 버퍼 댐을 채우고, 네이티브 PAGE 1x 실행 버퍼로 버퍼 탱크를 채웁니다.
- 약 30 분 동안 150 V에서 전원 공급 장치 및 전기 전극을 켭니다.
- 컨체피와 버퍼 댐(내부 챔버)에서 진한 파란색 음극 버퍼를 제거하거나 샘플 우물을 흡인합니다. 내부 챔버를 150-200mL의 밝은 파란색 음극 버퍼로 채우고 전기 전구를 60 분 동안 250 V에서 실행합니다.
참고: 전기전도 시간은 염료 전면이 젤 카세트의 바닥 위 0.5cm 이상으로 이동하는 시기를 확인하여 결정될 수 있다. - 카세트에서 젤을 제거하고 깨끗한 플라스틱 용기에 놓습니다. 로커/궤도 셰이커에서 15분 동안 양질의 증류수로 젤을 씻으셔도 좋습니다.
참고: 카세트에서 그라데이션 젤을 제거하려면 카세트를 바닥에서 처리하여 파손 가능성을 최소화합니다. - 물을 붓고, 충분한 양의 쿠마시 젤코드 블루 스테인 시약에 젤을 담그고, 실온에서 궤도/로커에 1시간 동안 배양합니다.
참고: 병을 여러 번 부드럽게 돌리면 사용하기 전에 블루 스테인 시약(재료 테이블) 용액을 섞습니다. - 염료 용액을 데산하고 증류수를 추가하고 물로 여러 번 헹구고, 궤도/로커를 타서 탈색합니다.
참고: 스폰지 조각(~3cm x 0.5cm)을 젤 디스테인 용기에 넣고 젤을 남기고 밤새 스테인링을 합니다. 스폰지는 여러 개의 물 변화가 필요없이 염료 입자를 사용합니다. - 이미지 분석기에서 젤을 분석합니다.
5. 면역 blot blot 분석에 의한 미토콘드리아 슈퍼복합성 평가
- 전기 전도의 끝에 젤을 염색하지 않고 BN-PAGE의 새로운 세트를 수행합니다.
- 면역 블로팅을 완료하기 위해 섹션 3 (미토콘드리아 전자 전달 복합체 (ETC) 평가)와 동일한 절차를 따르십시오.
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Representative Results
프로토콜에 따라 심장 조직에서 미토콘드리아농축 단백질 혼합물의 좋은 수율을 준비하였다. 미토콘드리아농축 단백질 혼합물의 약 15 mg/mL은 뿌리의 자손으로부터 수확된 평균 1.2g의 냉동 심장 조직으로부터 수득하였다. 미토콘드리아 제제의 양은 (i) 개별 전자 전달 복합체(ETC)를 평가하기 위한 표준 면역블롯 분석을 수행하기에 충분했다(즉, 복합체-I, II, III, IV 및 복합-V), (ii) BN 페이지 및 면역블롯 분석에 의한 미토콘드리아 슈퍼콤플렉스 평가, (iii) 컴플렉스선택에 대한 한정으로 제한된 효소분석. 개별 ETC 단백질 복합체에 대해 제기된 항체의 칵테일은 각 항체가 하나의 단일 면역블롯 분석에서 자체 표적 단백질을 인식할 기술적 타당성을 제공한다.
미토콘드리아농축 단백질은 심혼의 좌심실으로부터 제조되었고, 뿌리의 자손으로부터 수득하였다. 두 그룹의 심장 조직은 출생 후 다른 시점에서 수확되었다 (48 h, 3 개월, 6 개월, 9 개월). 임산부 운동이 임신 중 자손의 미토콘드리아 ETC에 긍정적인 영향을 미치는지 여부는 이 연구에서 테스트된 가설이었습니다. 4개의 심장 조직은 긴 미토콘드리아 농축 격리 과정 때문에 주어진 날에 편안하게 처리되었습니다.
그림 2: 자손 심장 조직에서 미토콘드리아 ETC 복합체의 면역 블로트 프로파일. 미토콘드리아 농축 단백질 혼합물은 감소 조건 하에서 4%-20% 그라데이션 젤로 해결되었다. 단백질은 상업적인 항체 칵테일에 의해 면역 프로브되었고, 안티-VDAC 항체는 로딩 제어(red color band)에 사용되었다. 항체의 칵테일은 소 심장 복합체-I(항원 NDUFB8), 소 심장 복합II(항원 C-II30(FeS), 소 심장 복합 II, III(항원 C-III-Core 2), 인간 복합 IV, 서브유닛 II(항원 C-IV-II), 소 심장 복합체-V(항원 C-V-V-α)에 대하여 제기되었다. 이차 항체는 적외선 태그로 표지되었고, 이미지는 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 분석되었다. 연령 집단에 걸친 개별 복합 프로필은 보충 도 1(A-E)에서 제공됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2는 전형적인 ETC 단백질 프로파일을 나타낸다. 항체 칵테일은 멀티플렉스 형식으로 면역 블로팅을 허용했습니다. 각 항체는 수용 가능한 해상도를 제공하는 자체 표적 단백질을 인식했습니다. 단백질 밴드 강도는 디지털로 분석되었다. 운동 된 뿌리의 자손에서 얻은 조직은 ETC 단지의 일부에서 상대적으로 감소 된 수준을 제시했다 (보충 수치 1A-E). 면역프로빙이 멀티플렉스 형식으로 수행되었기 때문에 미토콘드리아 농축 제제는 그라데이션 젤(4%-20%)으로 해결되어야 한다. 이 방법은 SDS/PAGE 젤의 몇 가지 고정 퍼센트와 실행-투-런 가변성을 실행할 필요성을 제거할 것입니다.
미토콘드리아 단백질은 3%-8% 그라데이션 BN-PAGE(그림 3A)에서 해결되었으며 항체 칵테일로 면역 프로브를 하였다. 운동과 앉아있는 그룹 모두에서, 다중 초복합 형성이 관찰되었다(도 3B).
그림 3: 미토콘드리아 슈퍼콤플렉스 프로파일바이 블루 네이티브 폴리아크릴아미드 젤 전기포레시스(BN-PAGE). (A). 미토콘드리아 농축 단백질 혼합물은 3%-8% BN-PAGE로 해결되었고, 쿠마시 블루 시약(젤 코드, 블루 스테인 시약)으로 염색하였다. (B). 미토콘드리아 농축 단백질 혼합물은 3%-8% BN-PAGE로 해결되었고, PVDF 멤브레인으로 이송되고, 슈퍼콤플렉스용 항체 칵테일로 면역프로브하였다. 두 가지 모두, 단백질 하중은 150 μg/웰이었다. 6개월 데이터 수집 지점은 준비 중 단백질 수율이 부족하여 포함되지 않았다. 관찰 된 가장 눈에 띄는 슈퍼 컴플렉스 증가는 앉아있는 그룹에 비해 운동 그룹에서 9 개월이었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
BN-PAGE에서 해결할 수 있는 초복합체의 크기가 크기 때문에 다른 그라데이션 겔 포맷(3%-8%)이 제조되었다. 이 프로토콜에 기재된 미토콘드리아 농축 제제는 미토콘드리아 ETC 복합 활동을 측정하는 데 사용되었다. 그림 4 는 복잡한 I-II 활동 평가에 기록된 데이터를 나타냅니다. 이 분석은 확립된 프로토콜3에 따라 수행되었다.
그림 4: 복잡한 I-II 활동 측정. 미토콘드리아 농축 단백질 혼합물은 다른 연령군(48h, 3개월, 6개월 및 9개월)으로부터 얻은 운동 분석기를 사용하여 복잡한 I-II 활성을 분석하였다. 운동 그룹은 앉아있는 그룹의 활동과 비교하여 복잡한 I-II 활동이 증가했습니다. 쌍t 테스트 (P > 0.05)에 따라 두 그룹 사이의 차이는 통계적으로 유의하지 않았다. 그림에 묘사된 오류 막대는 n = 4에 대한 평균(SEM)의 표준 오차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 1: (A) 연령 집단에 걸쳐 복합-I 프로필. 일반적으로, 운동 된 뿌리에 태어난 자손은 앉아있는 그룹 (n = 4)에 비해 복합 -I의 낮은 수준으로 제시된다. 이것은 9 개월 그룹에서 더 두드러졌다. (B) 연령 집단에 걸친 복합 II 프로필. 모든 연령대는 3개월 코호트(n=4)를 제외한 운동군에서 컴플렉스-II수준이 낮은 것으로 나타났다. (C) 연령 집단에 걸친 복합 III 프로필. 9개월 연령대만 앉아있는 그룹(n=4)과 비교하여 운동된 그룹에서 컴플렉스-III 수준이 낮은 것으로 나타났다. (D) 연령 집단에 걸친 복합 IV 프로필. 운동군의 복합-IV 단백질 수치가 약간 증가하였다(n=4). (E) 연령 층의 복합 V(ATP synthase) 프로필. 운동 및 앉아있는 그룹 모두 48h 데이터 포인트(n = 4)를 제외한 복합-V의 낮은 수준을 나타냈다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜의 중요한 단계는 여기에 표시됩니다. 첫째, 조직 균질화 는 조직 균질화 과정에서 과도한 깎아 지른듯한 효과가 적용되지 않도록 신중하게 처리해야합니다. 초기 조직 균질화에 대한 압력 사이클링 기술 (PCT)의 일부인 조직 분쇄기가 사용되어야합니다. 이 단계는 냉동 조직 조건으로 인해 이미 깨지기 쉬운 미토콘드리아를 더 파괴 할 수있는 유리 온 유리 균질화 (도 1B)의 과도한 뇌졸중 주기를 줄일 수 있습니다. 둘째, 냉동 조직 중량은 미토콘드리아 농축 제제의 충분한 양을 얻는 것이 중요할 것이다. 권장되는 시작 조직 량은 조직의 근원에 따라 0.8g 보다 큽것입니다. 심장 조직은 미토콘드리아10,11에서 매우 풍부합니다. 따라서 권장량은 미토콘드리아 농축 제제를 얻기에 충분합니다. 셋째, 모든 절차는 차가운 방에서 수행되어야합니다. 차가운 방을 이용할 수 없는 경우 대형 얼음 욕조로 충분합니다.
이전에 얼린 심장 조직에서 미토콘드리아 농축 된 준비를 얻기의 타당성은이 연구에서 입증되었습니다. 이 프로토콜은 미토콘드리아가 분리될 수 있고 미토콘드리아 ETC 효소 복합체를 평가할 수 있는 보관된 냉동 조직에 대한 접근을 제공하는 데 필수적입니다. 최근 연구는 이전에 동결 된 조직과 세포에서 미토콘드리아 호흡뿐만 아니라 측정 할 수 있음을 보여 주었다2. 이러한 발전으로 인해 조사관은 이전에 수집된 바이오샘플을 활용하여 추가 분석을 할 수 있습니다.
개별 ETC 및 초복합체의 프로파일을 평가하기 위해 동일한 PVDH 멤브레인에서 면역 블로팅 절차 중에 여러 항체를 활용하는 멀티플렉스 형식으로 고전적인 면역 블로팅을 수행함으로써 더 쉬워집니다. 사용자가 SDS-PAGE 및 BN-PAGE용 젤에 적재할 단백질의 양을 결정하는 것이 중요합니다. 사용자가 시료 적재부피에 문제가 없도록 고단의 농도를 얻기 위해서는 가능한 한 최소한의 양의 재서스펜션 부피가 있어야 한다. BN-PAGE에 적재되는 단백질 양은 미토콘드리아 농축 제제의 수율에 따라 달라집니다. 미토콘드리아농축 단백질 혼합물 150μg는 소량의 원래 심장 조직으로 인해 BN-PAGE에 잘 적재되었다. 50-150 μg 미토콘드리아 농축 펠릿 제제는 1mm 두께의 젤에 충분합니다. 사용자는 시료 로딩을 위해 1.5mm 두께의 젤을 선호할 수 있습니다. 그러나, 단백질 밴드의 해상도 허용 품질 되지 않을 수 있습니다. 면역블롯 분석서에 사용되는 항체 칵테일이 농도에서 소정의 되었기 때문에 잘 당 적은 미토콘드리아 단백질 재서스펜션은 테스트되지 않았다; 그러나 사용자는 신호/소음 속도를 높이기 위해 자체 항체 칵테일을 만들 수 있습니다.
BN-PAGE 젤의 완전 중합체 그라데이션 젤(3%-8%)을 권장합니다. 3%-8%의 그라데이션 젤은 시판되지 않았습니다. 따라서 수제 그라데이션(3%-8%) 표준 미니 젤(9 x 6cm)을 사용할 수 있습니다. 젤을 24시간 전에 붓고 젤이 RT에서 하룻밤 동안 중합하도록 허용하면 허용 가능한 젤 형성을 제공할 수 있습니다. 사용자가 슈퍼콤플렉스의 더 나은 분리가 필요한 경우, 더 큰 젤 형식(미디 젤 13.5cm x 6.5cm 또는 롱 젤 28cm x 16cm)을 사용하는 것이 좋습니다.
이 프로토콜의 적용은 조사관이 미토콘드리아를 분리하고 이전에 냉동 보관 된 조직에서 ETC 및 슈퍼 컴플렉스의 프로파일을 분석 할 수 있습니다. 모든 국내 및 지역 바이오시메시 예치이론은 바이오시료를 초동결 조건(즉, -80°C)으로 유지한다. 많은 수의 조직이 추가 연구 및 시약 공유 목적을 위해 기관 및 제약 회사에 의해 보관되고 있습니다. 국립보건원(NIH)은 NIH지원 프로젝트가 지원되는 프로젝트에서 생산된 시약을 공유해야 한다고 규정하고 있습니다. 이러한 생물 학적 저장소는 보조금 응용 프로그램에 대한 예비 데이터를 얻기위한 냉동 보관 조직을 얻기위한 매우 가치있는 소스입니다. 초복합체의 효소 활동을 분석하기 위해 이 연구에서는 수행되지 않았다. 그러나 프로토콜은 assays8과 같은 작업을 수행할 수 있습니다.
본 논문에 기재된 방법을 이용하여, 개별 ETC 복합체 및 미토콘드리아의 초복합체가 뿌리의 자손의 심장 조직으로부터 얻어진 농축제제를 분석하였다. 운동을 하기 위해 태어난 자손은 생애 첫 6개월 동안 ETC수치가 낮아졌고 결국 9개월까지 평준화되었습니다.
| ETC 컴플렉스 | 48 h | 3개월 | 6개월 | 9개월 |
| 컴플렉스-I | ↓ | ↓ | ↓ | 변경 없음 |
| 컴플렉스-II | ↓ | ↓ | 변경 없음 | 변경 없음 |
| 컴플렉스 III | ↓ | 변경 없음 | 변경 없음 | ↓ |
| 복합 IV | ↑ | ↑ | ↑ | 변경 없음 |
| 컴플렉스-V | ↓ | ↓ | ↓ | 변경 없음 |
표 2: 미토콘드리아 전자 수송 사슬 단백질 복합 프로파일. 표는 뿌리의 운동 단에 있는 미토콘드리아 ETC 복잡한 수준의 단면도를 요약합니다. 복합-IV를 제외한 모든 단지는 연령대 전반에 걸쳐 감소하는 패턴을 보였다.
이 관측은 임신 도중 운동한 뿌리에 태어난 자손이 그들의 심장 조직 미토콘드리아에 있는 더 적지만 더 능률적인 ETC 복합체를 표시했다는 것을 건의할 수 있습니다 (그림 4). 그러나, 9 개월 에 슈퍼 복합 형성 운동 그룹 상승 될 것으로 밝혀졌다. 운동은 어떻게 든 증가 에너지 수요의 조건에서 초복합체의 재배열에 영향을 미칠 수 있습니다12. 또한, 컴플렉스-V(ATP synthase)는 출생 후 첫 6개월 동안 낮은 프로필을 보이고 있다. 이러한 반응은 후성 유전학적으로 변형된 ETC 단백질 복합체의 확률 때문일 수 있다. 이 연구를 위한 작은 샘플 크기(n = 4)는 그러한 결론에 도달하기에 충분하지 않았습니다. 그러나, 낮은 ETC 복합 단백질 수준의 패턴, 높은 복합 I-II 활동, 및 높은 초복합체 형성은 운동 뿌리의 자손의 심장 조직에 있는 생체 에너지가 운동에 의해 영향을 받는다는 것을 건의할 수 있습니다. 미토콘드리아 ETC 복합체를 더 적게 효율적으로 작동하고 증가하는 초복합체의 형성은 조사해야 할 흥미로운 현상입니다. 이 프로젝트는 아직 진행 중입니다.
요약하자면, 이 프로토콜은 이전에 냉동 보관된 심장 조직에서 간단하고 간단한 미토콘드리아 농축 시료 제제를 제공합니다. 미토콘드리아 ETC 복합체는 멀티플렉스 항체 칵테일을 사용하여 표준 면역 블로팅에 의해 분석될 수 있다. BN-PAGE 다음에 면역 블로팅은 슈퍼컴플렉스의 존재를 분석할 수 있다. 이 준비는 또한 사용자가 미토콘드리아 ETC 복잡한 활동을 평가할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 캔자스 시티 대학의 교내 보조금으로 압둘바키 아그바스와 다니엘 바레라의 여름 연구 펠로우십에 의해 재정적으로 지원되었습니다. 저자들은 얀 탈리 박사의 편집 작품에 감사한다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amino caproic acid | Sigma/Aldrich | A2504-100G | |
| Anti-Hu Total OxPhos complex kit | Invitrogen | 458199 | |
| anti-VDAC antibody | abcam | ab15895 | use 1 µg/mL |
| Coomassie G-250 | ThermoSientific | 20279 | |
| Coomassie GelCode Blue | ThermoScientific | 24592 | |
| Digitonin | Cabiochem | 300410 | |
| Glass-Glass pestle homogenizer | VWR | KT885451-0020 | |
| Image Studio | LICOR | ||
| IR-Dye conjugated anti-Rabbit Ab | LICOR | LC0725 | |
| Multiwell plate reader | BioTek | Synergy HT | |
| Native molecular weight marker | ThermoFisher | BN2001 | |
| Nylon mesh monofilament | Small Part Inc | CMN-74 | |
| Orbital shaker | ThermoScientfic | ||
| PCT Shredder | Pressure Bioscience Inc | ||
| SEA BLOCK Blocking buffer | ThermoScienctific | 37527 | |
| Shredder PULSE Tube | Pressure Bioscience Inc | FT500-PS | |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5418 | |
| Trypsin | Amresco | M150-1G | |
| Trypsin inhibitor | Amresco | M191-1G | Requires fresh preparation |
References
- Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Analytical Biochemistry. 418 (2), 213-223 (2011).
- Osto, C., et al. Measuring mitochondrial respiration in previously frozen biological samples. Current Protocols in Cell Biology. 89 (1), 116 (2020).
- Agbas, A., et al. Mitochondrial electron transfer cascade enzyme activity assessment in cultured neurons and select brain regions. Current Protocols in Toxicology. 80, 73 (2019).
- Hathaway, Q. A., et al. Maternal-engineered nanomaterial exposure disrupts progeny cardiac function and bioenergetics. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 312 (3), 446-458 (2017).
- May, L. E., et al. Influence of maternal aerobic exercise during pregnancy on fetal cardiac function and outflow. American Journal of Obstetrics & Gynecology MFM. 2 (2), 100095 (2020).
- Ehler, W. J., et al. Avoidance of malignant hyperthermia in a porcine model for experimental open heart surgery. Laboratory Animal Science. 35 (2), 172-175 (1985).
- Panov, A. V., et al. Effect of bovine serum albumin on mitochondrial respiration in the brain and liver of mice and rats. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 149 (2), 187-190 (2010).
- Jha, P., Wang, X., Auwerx, J. Analysis of mitochondrial respiratory chain supercomplexes using blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Current Protocols in Mouse Biology. 6 (1), 1-14 (2016).
- Pressure Biosciences Inc. Isolation of Functional Mitochondria from Whole Rat Heart Using a PBI Shredder and Pressure Cycling Technology (PCT). , South Easton, MA. (2010).
- McLaughlin, K. L., et al. Novel approach to quantify mitochondrial content and intrinsic bioenergetic efficiency across organs. Scientific Reports. 10 (1), 17599 (2020).
- Hom, J., Sheu, S. S. Morphological dynamics of mitochondria--a special emphasis on cardiac muscle cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46 (6), 811-820 (2009).
- Greggio, C., et al. Enhanced respiratory chain supercomplex formation in response to exercise in human skeletal muscle. Cell Metabolism. 25 (2), 301-311 (2017).
