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Biochemistry

Medindo complexos de transferência de elétrons mitocondrial em tecido cardíaco previamente congelado da prole da porca: um modelo para avaliar alterações bioenergetics mitocondrial induzidas pelo exercício

Published: August 16, 2021 doi: 10.3791/62809
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 7, 7,13
1AdventHelath, 2University of Illinois Chicago School of Public Health, 3Lincoln Memorial University, 4Children’s Mercy Hospital, 5Scripps Clinic, 6Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, 7Kansas City University, 8Roblex Rex Veterans Affairs Medical Center, 9California State University San Marcos, 10East Carolina University, 11Massachusetts Institute of Technology, 12Boehringer Ingelheim Norway KS, 13Heartland Center for Mitochondrial Medicine

Summary

A preparação de amostras enriquecidas com mitocôndrias de tecidos sólidos arquivados previamente congelados permitiu que os pesquisadores realizassem avaliações funcionais e analíticas de mitocôndrias em várias modalidades experimentais. Este estudo demonstra como preparar preparações enriquecidas com mitocôndrias a partir de tecido cardíaco congelado e realizar avaliações analíticas de mitocôndrias.

Abstract

O perfil do complexo de transferência de elétrons mitocondrial (ETC) é modificado no tecido cardíaco da prole nascido em uma porca exercida. A hipótese proposta e testada foi que um exercício materno regular de uma porca durante a gravidez aumentaria a eficiência mitocondrial da bioenergetic do coração da prole. Essa hipótese foi testada por mitocôndrias isolando utilizando um procedimento de isolamento leve para avaliar perfis mitocondriais etc e supercomplexo. O procedimento aqui descrito permitiu o processamento de tecidos cardíacos arquivados previamente congelados e eliminou a necessidade de preparação de mitocôndrias frescas para a avaliação de complexos etc mitocondrial, supercomplexos e perfis de atividades complexas etc. Este protocolo descreve a medição ideal do complexo proteico ETC em imunoblotting baseado em anticorpos multiplexados e avaliação super complexa usando eletroforese de gel azul-nativa.

Introduction

O objetivo deste protocolo foi fornecer passos detalhados para obter a preparação enriquecida com mitocôndrias a partir de tecido cardíaco previamente congelado com uma nova tecnologia de interrupção mecânica de baixa energia do tecido que melhora a lise tecidual e a extração de mitocôndrias. Com este método, a melhoria da eficiência extração sem gerar alto estresse de tesoura ou alta temperatura e curto tempo de homogeneização (10-12 s) tornam-se alcançáveis1.

Obter mitocôndrias a partir de tecido congelado arquivado é um ativo valioso para realizar estudos funcionais2 e bioquímicos3, caso contrário, não facilmente repetível sob as condições experimentais exatas. Um clássico homogeneizador de vidro de pilão Potter-Elvehjem Teflon ou homogeneizador de dounce tem sido usado e ainda está sendo usado em laboratórios de pesquisa para homogeneizar tecidos moles como fígado, rim e cérebro. No entanto, homogeneizar tecidos duros como músculo e coração requer mais tempo de homogeneização, tratamento enzimático, homogeneização de alta velocidade e ampla experiência do usuário. Isso é desvantajoso para extrair organelas intactas, como mitocôndrias de tecido duro, como músculo e coração. O método descrito neste protocolo é usado para obter uma preparação enriquecida com mitocôndrias de alto rendimento para analisar complexos proteicos da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial (ETC) e sua formação supercomplexa em tecidos cardíacos colhidos de descendentes nascidos a porcas exercitadas e sedentárias, congelados em nitrogênio líquido e armazenados a -80 °C para uso futuro. Este método permite que o usuário isole a preparação enriquecida de mitocôndrias de tecidos arquivados previamente congelados.

A exposição nanomaterial externa a roedores gestantes pode afetar negativamente a função cardíaca e a respiração mitocondrial e bioenergésicos na prole durante a gestação4. No entanto, as alterações positivas induzidas pelo exercício aeróbico nos bioenergésicos do miócito fetal durante a gravidez ainda não foram documentadas. No entanto, estudos emergentes fornecem evidências de que o exercício aeróbico materno durante a gravidez tem uma influência positiva na função cardíaca fetal5. Para fornecer mais evidências, foi realizada uma análise dos efeitos longitudinais do exercício materno nos complexos da cadeia respiratória mitocondrial cardíaca (ou seja, Complexo I através do Complexo V) durante a gravidez.

Este estudo tem relevância significativa para a saúde, uma vez que os resultados podem sugerir que o exercício materno melhora a eficiência da produção de energia nas mitocôndrias cardíacas da prole. Neste estudo, as porcas (porcas fêmeas) foram utilizadas como modelo animal por duas razões: (i) a fisiologia cardíaca é semelhante à humana6, e (ii) a colheita de tecido cardíaco de descendentes de diferentes pontos de tempo é viável sob aprovação institucional da IACUC. O estudo proposto tem como objetivo responder a muitas das questões fundamentais que ligam o exercício materno e seus potenciais efeitos positivos na composição celular e bioquímica do tecido cardíaco da prole. Esta abordagem requer técnicas suaves, mas eficazes de isolamento de mitocôndrias de tecido cardíaco previamente congelado obtido a partir dos longos e caros estudos longitudinais que abordaram as questões das alterações bioenergésticas dentro dos miócitos cardíacos fetais durante a gravidez. O método descrito neste estudo permite utilizar grandes somas de tecido arquivado previamente congelado para preparação enriquecida com mitocôndrias para estudos analíticos e funcionais. O estudo também ajudará a preencher a lacuna de conhecimento nesse campo, fornecendo dados preliminares, o que poderia levar a estudos futuros determinando os efeitos do exercício materno sobre a saúde do coração no útero e além.

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Protocol

Os tecidos cardíacos da prole congelada foram recebidos do Dr. Sean Newcomer juntamente com a carta de aprovação institucional da IACUC. Os tecidos cardíacos foram obtidos a partir de um estudo longitudinal de longo prazo, congelados em nitrogênio líquido, e armazenados a -80 °C para uso futuro. Todos os protocolos relativos ao processamento de tecido cardíaco da prole seguiram as diretrizes dos comitês da Universidade de Kansas City IBC e da IACUC.

1. Preparação de tampões e reagentes

NOTA: Prepare todas as amostras de acordo com as diretrizes do fabricante. Use água ultra-purificada ou equivalente em todas as receitas e etapas de protocolo. Use equipamentos de proteção pessoal (gloats de laboratório, máscara facial, luvas e óculos/escudo facial) durante este procedimento. Os volumes de buffer são adequados para o processamento de seis amostras de tecido.

  1. Prepare 1,5 L tampão de lavagem de tecido combinando 154,035 g de sacarose (final de 0,3 M), 3,904 g de HEPES (final de 10 mM), 0,111 g de EDTA (final de 0,2 mM). Adicione os ingredientes a 1,0 L de água enquanto estiver na placa de mexida, ajuste o pH para 7,2 com HCl diluído e maquiagem para o volume final a 1,5 L.
    NOTA: São necessários aproximadamente 200 mL de tampão de lavagem por amostra (50-300 mgs). Seis amostras de tecido podem ser processadas em um dia. Use o tampão de lavagem restante para fazer um tampão de isolamento.
  2. Prepare o tampão de isolamento do tampão de lavagem descrito anteriormente na etapa 1.1 adicionando 210 mg de BSA em 210 mL de tampão de lavagem. Ajuste o pH para 7.4 com solução NaOH diluída.
    NOTA: Aproximadamente 35 mL de tampão de isolamento são necessários por amostra de tecido; portanto, 210 mL de tampão de isolamento são necessários para seis amostras. Prepare este buffer adicionando nova solução BSA (final de 1mg/mL) no dia da preparação. A BSA é usada para isolar mitocôndrias à medida que melhora as propriedades mitocondriais removendo desacopladores naturais, como ácidos graxos livres. Verificou-se que a BSA tem atividade antioxidante aumentando a taxa de oxidação de substratos, especialmente o succinato, nas mitocôndrias cerebrais7. Alternativamente, a albumina de soro bovino pode ser substituída por análogos sem ácido mais baratos, como ovalbumin.
  3. Prepare 150 mL de tampão de resuspensão combinando 0,011 g de EDTA (concentração final de 0,2 mM EDTA ou use 150 μL de 200 mM de estoque EDTA solução para 150 mL de tampão de resuspensão), 12,836 g de sacarose (concentração final de sacarose de 0,25 M) e 0,236 g de Tris (final tris-HCl de 10 mM). Ajuste o pH para 7,8 com NaOH de 0,1 N. Adicione 60 μL do coquetel inibidor de protease pouco antes de usar.
  4. Prepare a solução de trypsin dissolvendo 7,5 mg de trippsina em 3,0 mL de 1 mM HCl (2,5 mg de trippsin/mL final). Esta quantidade é suficiente para uma amostra.
    NOTA: Prepare a solução de trippsina com base no número de amostras de tecido previstas para serem processadas.
  5. Prepare a solução inibidora de trippsina da soja combinando 13,0 mg de inibidor de trippsina em 20 mL de tampão de isolamento contendo BSA (0,65 mg/mL de inibidor de trippsina final).
    NOTA: Prepare uma nova solução inibidora de trippsina.
  6. Prepare o reagente persulfeto de amônio adicionando 0,1 g de persulfito de amônio em 1 mL de água (final de persulfeto de amônio de 10%).
    NOTA: O reagente persulfeto de amônio deve ser recém-preparado ou um grande volume pode ser aliquotado e mantido em um congelador de -20 °C.
  7. Prepare a solução de ácido aminocagóico (ACA) combinando 0,131 g de ácido capróico 6-amino em 1,0 mL de água ultra-purificada e armazene-a em 4 °C (1 M 6-aminocaproic acid final).
  8. Prepare a solução de corante azul brilhante Coomassie dissolvendo 1 g de Coomassie G-250 em 0,5 mL de água, e 0,5 mL de ácido aminocaproico de 1 M (concentração final de solução de corante de 10%).
  9. Prepare 5% Digitonin para Blue native-PAGE (BN-PAGE). Calcule aproximadamente quanto digitonin é necessário na preparação da amostra mais algum volume extra para compensar os erros de pipetação (superestimar em 10 mgs). Para 15 mgs: Primeiro, diluir 15 mg de digitonina em 30 μL de 100% DMSO. Vórtice para ajudar o digitonin a entrar na solução. Em seguida, adicione os 90% restantes do ddH2O (270 μL). Aqueça suavemente para misturar a solução (vórtice) e depois esfrie-a no gelo.
  10. Prepare o buffer de ânodo page nativo. Adicione 50 mL de buffer de execução de 20x nativo PAGE a 950 mL de água para fazer um volume final de 1 L. Prepare o tampão de ânodo fresco para uso imediato. Use isso como um buffer de corrida de 1x.
  11. Prepare um tampão de cátodo azul escuro. Dissolver 0,0160 g de Coomassie brilhante azul G-250 em 80 mL de tampão de ânodo page nativo; misturar bem.
    NOTA: Prepare um novo tampão de cátodo para uso imediato. Apenas 60 mL podem ser necessários, mas fazer um extra de 20 mL no caso de qualquer vazamento.
  12. Prepare o tampão de cátodo azul claro. Adicione 20 mL de tampão de cátodo azul escuro em 180 mL de tampão de ânodo page nativo e misture bem.
    NOTA: Este buffer só pode ser usado uma vez.
  13. Prepare 5% Coomassie G-250 como aditivo amostral. Diluir 200 μL de 10% de estoque coomassie já feito (passo 1.8) com 200 μL de 1 M ACA e armazenar a 4 °C.
  14. Prepare o tampão de amostra de 4x nativo PAGE combinando 40% glicerol, Ponceau S 0,04%, 25 mM Tris-HCl (pH 6.8), 192 mM de glicecina em 10 mL de volume final. Aliquot-los e armazenar a -20 °C no congelador.

2. Isolamento mitocôndria do tecido cardíaco congelado

NOTA: Realize o procedimento de isolamento das mitocôndrias em uma sala fria de 4 °C. No entanto, em caso de indisponibilidade da sala fria, use um banho de gelo de grande porte para realizar o procedimento.

  1. Retire amostras previamente congeladas de tecido cardíaco do congelador de -80 °C.
    NOTA: Um máximo de quatro amostras de tecido pode ser confortavelmente processado para isolamento de mitocôndrias em um determinado dia.
  2. Pese o tubo contendo a amostra do tecido cardíaco e regissue o peso. Prepare três béquers (cada 50 mL) contendo 40 mL de tampão de lavagem. Esfrie cada béquer no banho de sal gelado com quantidades iguais de gelo e sal misturados por 3-5 minutos antes de prosseguir para o próximo passo. Coloque as barras de agitação magnética em cada béquer e coloque o agitador em velocidade média.
    NOTA: Não congele demais os béquers e use-os imediatamente logo após nuvens de cristais de gelo começarem a aparecer.
  3. Coloque o tecido cardíaco congelado diretamente na solução gelada no primeiro béquer. Aguarde aproximadamente 5 minutos enquanto mexe e aplique uma leve pressão no tecido usando pinças para sair o máximo de sangue possível.
  4. Pesar o tubo vazio e subtrair do peso original (passo 2.2) para obter um peso líquido do tecido cardíaco.
  5. Retire o tecido com fórceps e esprema o coração com uma toalha de papel limpa de papel filtro para remover o sangue. Em seguida, coloque o tecido no segundo béquer. Aguarde aproximadamente 5 minutos enquanto mexe para remover o excesso de sangue.
  6. Seque suavemente o tecido em uma toalha de papel. Remova toda a gordura, sangue coagulado, aurículos e fáscia (tecido branco). Em seguida, laça o tecido ventricular.
  7. Desfie as amostras de tecido usando o triturador seguindo as etapas 2.7.1-2.7.9.
    1. Coloque o tecido cardíaco (~50-300 mgs) na câmara de triturador de tecido do lado do carneiro.

Figure 1
Figura 1: Câmara de triturador de tecido (tubo) para uso com o triturador. A homogeneização tecidual no tubo de triturador requer cerca de 10-12 s por amostra de tecido. A homogeneização do tecido é concluída uma vez que o tecido homogeneizado passa pelo disco perfurado para a câmara superior. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Adicione ~0,2-0,8 mL de tampão de lavagem ao lado da tampa do tubo.
    NOTA: Certifique-se de que o volume total da amostra e do tampão de lavagem combinados durante a trituração não exceda 0,7-0,8 mL.
  2. Use a ferramenta do tubo para tampar a câmara de triturador com a tampa do triturador.
    NOTA: Não aperte demais a tampa do triturador.
  3. Coloque a câmara de triturador na unidade do suporte do triturador com o lado do carneiro para baixo. O carneiro vai engatar um encaixe no suporte do triturador.
  4. Inserir o pedaço do condutor do triturador; deixe a broca se envolver com a tampa do triturador. Certifique-se de que a broca está presa no lugar.
    NOTA: Use sempre o condutor do triturador totalmente carregado.
  5. Aplique manualmente pressão para baixo no condutor do triturador e na câmara de trituração até que o indicador de pressão no suporte do triturador atinja uma configuração de aproximadamente 2 no suporte do triturador.
    NOTA: A configuração pode ser em um nível mais alto se o tecido desfiante for mais fibroso.
  6. Execute o condutor do triturador por aproximadamente 10-12 s pressionando o gatilho do condutor do triturador, mantendo a configuração em 2.
  7. Olhe para o tubo para verificar se toda ou a maior parte da massa sólida do tecido é triturada através do disco de lise e passada para a câmara superior da câmara de triturador olhando para o tubo.
    NOTA: Pode ser necessário triturar a amostra de tecido por um período mais longo. Basta devolver o tubo ao suporte do triturador e continuar o processo. A maioria dos tipos de amostras de tecido requerem apenas 10-12 s de trituração. Embora toda a trituração produza algum calor devido ao atrito, este curto tempo de processamento não aquecerá significativamente a amostra.
  8. Depois de triturar a amostra, retire a câmara de triturador da unidade de suporte. Use a ferramenta do tubo para remover a tampa do triturador e coloque-a em uma superfície limpa para uso posterior.
    NOTA: A tampa do triturador deve ser considerada contaminada com extrato amostral, e dependendo do tipo de amostra, pode estar contaminada com materiais infecciosos. Não use a mesma tampa de triturador para quaisquer outras amostras de tecido para evitar contaminação cruzada.
  1. Transfira o tecido cardíaco desfiado para o terceiro béquer com 40 mL de tampão de lavagem e mexa a barra e mexa o tecido por 5 minutos a uma velocidade média enquanto estiver na placa de mexida.
  2. Filtre a suspensão através de um monofilamento de malha de nylon (tamanho de poros de 74 μm) e descarte o filtrado. Lave o tecido desfiado no filtro 3x com 10 mL de tampão de lavagem.
    NOTA: Certifique-se de que o monofilamento da malha de nylon está pré-molhado com água.
  3. Transfira o tecido lavado e desfiado em um béquer de 50 mL com 20 mL de tampão de lavagem e coloque o béquer no banho de gelo no agitador magnético. Adicione 0,5 mL de solução de trippsina enquanto mexe constantemente por 15 min. Aproximadamente na metade da incubação (cerca de 7,5 min), transfira a suspensão do tecido para um homogeneizador portátil de vidro em vidro que conterá de 0 a 15 mL de volume.

Figure 1
Figura 1: Câmara de triturador de tecido (tubo) para uso com o triturador. A homogeneização tecidual no tubo de triturador requer cerca de 10-12 s por amostra de tecido. A homogeneização do tecido é concluída uma vez que o tecido homogeneizado passa pelo disco perfurado para a câmara superior. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Homogeneize suavemente com 4-5 tacadas para dispersar a suspensão sem produzir espuma. Coloque o homogeneizar em um béquer de 50 mL e misture delicadamente em uma placa de agitação por 15 min a 4 °C.
  2. Após 15 minutos de incubação, adicione 10 mL do tampão de isolamento que contém o inibidor de trippsina no béquer contendo o homogeneizar e incubar por 1 min a 4 °C enquanto mexe suavemente.
  3. Filtre a suspensão novamente através de um filtro de nylon e salve o filtrado em um tubo cônico de 50 mL.
  4. Colete a fração de partículas deixada no filtro de nylon e coloque-a no homogeneizador de vidro em vidro. Adicione 15-20 mL do tampão de lavagem e homogeneize suavemente manualmente por 25-30 s.
    NOTA: O filtrado flui muito lentamente nesta etapa. Para aumentar o fluxo de filtragem, coloque a ponta do funil tocando o interior do tubo cônico.
  5. Misture o homogeneizar com o filtrado, equilibre os tubos e centrífuga a 600 x g por 15 min a 4 °C.
  6. Filtre o supernatante resultante em um novo tubo cônico usando um filtro de nylon para evitar contaminação pela pelota. Execute a centrífuga novamente a 8.500 x g por 15 min a 4 °C.
    NOTA: Use uma pipeta de transferência de plástico para remover o supernante e sacrifique 0,2 mL de supernadante do topo da pelota macia.
  7. Descarte o supernatante e enxágue a pelota 2-3 vezes com 1 mL do tampão de isolamento. Certifique-se de descartar a camada de aro exterior branca fofa cada vez.
    NOTA: Lave a pelota adicionando o tampão de isolamento usando uma pipeta com ponta de 1 mL ou uma nova pipeta de transferência. Adicione o tampão ao lado do tubo, não diretamente sobre a pelota, para evitar quebrar a pelota e evitar a contaminação do supernasciente. Em seguida, aspire o buffer com uma pipeta de transferência e repita o processo mais duas vezes.
  8. Adicione 5 mL do tampão de isolamento a cada tubo e quebre a pelota usando uma pipeta com uma ponta de 1 mL ou uma nova pipeta de transferência.
  9. Diluir a suspensão com 20 mL de tampão de isolamento adicional e executar a centrífuga novamente a 8.500 x g por 15 min a 4 °C.
  10. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota em 5 mL do buffer de resusus pendente. Em seguida, adicione 15 mL a mais do buffer para um total de 20 mL, e centrífuga a 8.500 x g por 15 min. a 4 °C. Descarte o supernatante. A pelota marrom resultante contém mitocôndrias intactas lavadas.
  11. Resuspend a pelota enriquecida com mitocôndrias em 250 μL do buffer de resususpending, incluindo inibidores de protease. Alíquota em 25 μL, congelamento rápido em nitrogênio líquido e armazenamento em um congelador profundo de -80 °C por vários anos.
    NOTA: Poupe 5 μL de preparação enriquecida com mitocôndrias para o ensaio de análise de proteínas. Para um estudo BN-PAGE (Blue native-PAGE), aliquot a pelota resuspended em 50 μg de proteína mitocondrial por tubo. Centrifugar a 8.500 x g por 15 min a 4 °C. Aspire cuidadosamente o supernasce e armazene a pelota mitocondrial (50 μg de proteína/aliquot) em um congelador profundo de -80 °C por vários anos.

3. Avaliação do complexo de transferência de elétrons mitocondrial (ETC)

NOTA: As proteínas etc mitocondrial individuais (ou seja, Complex-I, II, III, IV, V) podem ser avaliadas pelo ensaio padrão de imunoblotação. Devido à variedade de amostras (quatro pontos de tempo: 48h, 3 meses,6 meses, 9 meses), duas condições experimentais (exercidas e sedentárias) e uma série de anticorpos imunoprobadores (cinco anticorpos), recomenda-se uma imunoblotting multiplexada. Realize imunoblotting multiplexed da seguinte forma.

  1. Resolva 50 μg de mitocôndria enriquecida amostra de proteína/bem em eletroforese de gel de poliacrilamida de 4%-20% gradiente (100 V, 90 min).
  2. Transfira as proteínas para uma membrana PVDF (75 V; 60 min)
  3. Bloqueie a membrana em uma solução tampão de bloqueio por um mínimo de 1h a 4 °C.
    NOTA: O tempo de bloqueio pode ser estendido por até durante a noite a 4 °C. O tampão de bloqueio (Tabela de Materiais) contém ingredientes não-mamíferos (ou seja, proteínas de peixe) que são menos propensos a ter interações específicas de ligação com anticorpos, bem como outras proteínas mamíferas presentes em métodos típicos.
  4. Teste a membrana com o coquetel de anticorpos incluindo anticorpos complexos I, II, III, IV, V anticorpos e incubar durante a noite em um agitador orbital a 4 °C.
  5. No dia seguinte, lave a membrana e a sonda com anticorpo secundário com marca IR por 2 h em um agitador orbital em RT (temperatura ambiente).
  6. Lave cinco vezes com 1x TBS-T (TBS contendo Interpol 20) e uma vez com 1x TBS (soro fisiológico tamponado tris).
    NOTA: Para a última lavagem, não inclua detergente no buffer TBS.
  7. Imagem da mancha em um analisador de imagem.

4. A avaliação do supercomplex mitocôndria por Blue Native Poly Acrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE)

NOTA: Um perfil supercomplexo de ETC também pode ser avaliado utilizando a técnica BN-PAGE.

  1. Prepare o coquetel tampão de amostra para 20 μL por 50 μg de proteína de pelota enriquecida com mitocôndrias (7 μL de água + 5 μL de 4x nativa poliacrilamida gel eletroforese tampão de carga da amostra + 8 μL de 5% digitonina + 2 μL de Coomassie G-250).
    NOTA: Faça um coquetel tampão de amostra de estoque dependendo do número de amostras disponíveis (50 μg de proteína/amostra). Escolha quantidades de digitonin apropriadas com base na concentração proteica da pelota enriquecida com mitocôndrias (Tabela 1)8.
  2. Aqueça o estoque de digitonin a 95 °C por 3 min, misture e esfrie no gelo antes de fazer a mistura mestre.
  3. Adicione o aditivo da amostra Coomassie G-250 pouco antes de carregar as amostras no gel.
  4. Adicione 20 μL do coquetel tampão de amostra em um tubo que contém 50 μg de pellet de proteína mitocondrial. Solubilize/resuspenque a pelota misturando suavemente a pelota com uma pipeta sem gerar espuma.
  5. Incubar a mistura no gelo por 20 minutos para alcançar a solubilização máxima da pelota enriquecida com mitocôndrias. De tempos em tempos, aperte suavemente os tubos para melhorar a solubilização.
  6. Enquanto aguarda a incubação, prepare o buffer de ânodo page nativo/1x e o tampão de cátodo azul escuro.
  7. Centrifugar a pelota solubilizada enriquecida com mitocôndrias a 20.000 x g por 10 min a 4 °C.
  8. Após a centrifugação, colete 15 μL do supernatante em novos tubos colocados no gelo.
  9. Adicione a quantidade apropriada de 5% reagente Coomassie G-250 ao supernante obtido na etapa 4.8 (consulte a Tabela 1).
    NOTA: O volume coomassie G-250 de 5% deve ser de tal forma que a concentração final do corante seja 1/4 da concentração de detergente. Realize esta etapa pouco antes de carregar as amostras no gel.
Proteína Digitonin/proteína Tampão de amostra 4x 5% Digitonin Água Volume final 5% Coomassie G-250
razão (g/g) aditivo de amostra
50 μg 8 5 8 7 20 2
50 μg 4 5 4 11 20 1

Tabela 1: Preparação do coquetel tampão de amostra com duas diferentes relações detergente/proteína. Para alcançar a solubilização máxima das proteínas de membrana a partir da suspensão mitocondrial, a concentração de proteína de suspensão digitonin/mitocondrial deve ser ajustada entre 4-8 g de digitonina/g de proteína. No tecido cardíaco, 400 μg de digitonina para 50 μg de proteínas de suspensão mitocondrial (ou seja, 8 g de digitonin/g de proteína mitocôndria) foram usados para maximizar a solubilidade dos supercomplexos da suspensão das mitocôndrias.

  1. Despeje um gel de 3%-8%, remova o pente e lave os poços do gel com 1x tampão de corrida três vezes.
    NOTA: O gel melhor polimeriza se derramado um dia antes.
  2. Configure o sistema de eletroforese e coloque o gel no aparelho.
  3. Encha os poços de amostra com o tampão de cátodo azul escuro.
  4. Carregue 10 μL do padrão de proteína não manchada como marcador de peso molecular nativo no primeiro e último poço do gel.
  5. Carregue toda a quantidade do aditivo amostrante + Coomassie preparado na etapa 4.9 acima nos poços usando uma ponta de carregamento de gel de cabeça plana.
  6. Encha cuidadosamente a barragem de tampão de mini células com aproximadamente 60 mL de tampão de cátodo azul escuro sem perturbar as amostras nos poços e, em seguida, encha o tanque tampão com o buffer nativo PAGE 1x running buffer.
  7. Ligue a fonte de alimentação e eletroforese as amostras a 150 V por aproximadamente 30 minutos.
  8. Remova o tampão de cátodo de cor azul escuro da barragem tampão (câmara interna) com uma pipeta de transferência ou aspire os poços de amostra. Encha a câmara interna com 150-200 mL de tampão de cátodo azul claro e execute a eletroforese a 250 V por 60 min.
    NOTA: O tempo de eletroforese pode ser determinado verificando quando a frente de corante migra apenas 0,5 cm acima da parte inferior do de gel.
  9. Retire o gel do e coloque-o em um recipiente plástico limpo. Lave o gel com água destilada de boa qualidade por 15 minutos em um agitador/roqueiro orbital.
    NOTA: Para remover o gel gradiente do, manuseie o de baixo, que é mais forte, para minimizar as chances de quebra.
  10. Despeje a água, mergulhe o gel em uma quantidade suficiente de reagente de manchas Coomassie GelCode Blue e incubar por 1 h em um orbital/roqueiro à temperatura ambiente.
    NOTA: Misture a solução de reagente de manchas azul (Tabela de Materiais) antes de ser usada girando suavemente a garrafa várias vezes.
  11. Decante a solução de corante, adicione água destilada, enxágue várias vezes com água e, em seguida, coloque o orbital/roqueiro para desinining.
    NOTA: Insira um pedaço de esponja (~3 cm x 0,5 cm) no recipiente de desinining de gel e deixe o gel para a desestabilização durante a noite. A esponja adsorbe as partículas de corante sem exigir múltiplas mudanças de água.
  12. Analise o gel em um analisador de imagens.

5. Avaliação do supercomplex mitocôndria por análise de manchas de imunoblot

  1. Execute um novo conjunto de BN-PAGE sem colorir o gel no final da eletroforese.
  2. Siga o mesmo procedimento da seção 3 (avaliação do complexo de transferência de elétrons mitocondrial (ETC) para completar a imunoblotação.

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Representative Results

Seguindo o protocolo, foi preparado um bom rendimento da mistura de proteína enriquecida com mitocôndrias a partir do tecido cardíaco. Aproximadamente 15 mg/mL de mistura de proteína enriquecida com mitocôndrias foram obtidos a partir de uma média de 1,2 g de tecido cardíaco congelado colhido da prole da porca. Observações indicaram que menos de 0,5 g de tecido cardíaco congelado não produziu uma quantidade suficiente de mistura de proteína enriquecida mitocondrial para realizar um ensaio BN-PAGE. A quantidade de preparação mitocondrial foi suficiente para realizar (i) uma análise padrão de imunoblot para avaliação dos complexos individuais de transferência de elétrons (ETC) (ou seja, Complexo-I, II, III, IV e Complexo-V), (ii) uma avaliação mitocondrial de supercomplex por análise BN-PAGE e imunoblot, e (iii) ensaios enzimáticos limitados para o complexo seleto. O coquetel de anticorpos criados contra complexos proteicos etc individuais fornece viabilidade técnica de que cada anticorpo reconhecerá sua própria proteína alvo em um único ensaio de imunoblot.

A proteína enriquecida com mitocôndrias foi preparada a partir do ventrículo esquerdo do coração, obtido a partir da prole da porca. A prole nasceu de dois grupos de porcas: (1) um grupo foi exercitado durante a gravidez e (2) um grupo era sedentário. Os tecidos cardíacos de ambos os grupos foram colhidos em diferentes momentos após o nascimento (48h, 3 meses, 6 meses e 9 meses). Se o exercício materno tem um impacto positivo na ETC mitocondrial da prole durante a gestação foi a hipótese que foi testada neste estudo. Quatro tecidos cardíacos foram confortavelmente processados em qualquer dia devido ao longo processo de isolamento enriquecido com mitocôndrias.

Figure 2
Figura 2: Perfil de imunobloto de complexos etc mitocondrial a partir do tecido cardíaco da prole. A mistura de proteína enriquecida mitocondrial foi resolvida em um gel de gradiente de 4%-20% em condições de redução. As proteínas foram imunoprobed por um coquetel de anticorpos comerciais, e o anticorpo anti-VDAC foi usado para o controle de carregamento (faixa de cor vermelha). O coquetel de anticorpos foi levantado contra o coração bovino Complex-I (antígeno NDUFB8), coração bovino Complex-II (antígeno C-II30 (FeS), complexo de coração bovino II, III (antígeno C-III-Core 2), Complexo Humano IV, subunit II (antígeno C-IV-II) e coração bovino Complexo-V (antígeno C-V-α). O anticorpo secundário foi rotulado com uma etiqueta infravermelha, e a imagem foi analisada por meio de um software de análise de imagem. Perfis complexos individuais em todas as faixas etárias são fornecidos na Figura Suplementar 1 (A-E). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A Figura 2 representa um perfil típico de proteína ETC. Coquetéis de anticorpos permitidos para imunoblotting em formato multiplex. Cada anticorpo reconheceu sua própria proteína alvo, fornecendo uma resolução aceitável. As intensidades da banda proteica foram analisadas digitalmente. Os tecidos obtidos a partir da prole da porca exercida apresentaram níveis relativamente reduzidos em alguns dos complexos etc (Figuras Suplementares 1A-E). A preparação enriquecida com mitocôndrias deve ser resolvida em gel gradiente (4%-20%), uma vez que a imunoprobing foi realizada em formato multiplexatório. Essa abordagem eliminará a necessidade de executar vários por cento fixos de géis SDS/PAGE e variabilidade run-to-run.

As proteínas mitocondriais foram resolvidas em 3%-8% gradiente BN-PAGE (Figura 3A) e imunoprovadas com coquetéis de anticorpos. Tanto em grupos exercidos quanto sedentárias, observou-se formação de múltiplos supercomplex (Figura 3B).

Figure 3
Figura 3: Perfil do supercomplex mitocondrial por eletroforese de gel poliacrilamida nativa azul (BN-PAGE). As misturas de proteínas enriquecidas com mitocondrial foram resolvidas em 3%-8% BN-PAGE, e manchadas com um reagente azul Coomassie (Gel Code, Blue Stain Reagent). (B) As misturas de proteínas enriquecidas com mitocondrial foram resolvidas em uma BN-PAGE de 3%-8%, transferidas para uma membrana PVDF e imunoprovadas com os coquetéis de anticorpos para supercomplexos. Em ambos os ensaios, a carga proteica foi de 150 μg/bem. Um ponto de coleta de dados de 6 meses não foi incluído devido a um rendimento proteico insuficiente durante a preparação. O aumento do supercomplexo mais proeminente observado foi aos 9 meses no grupo exercido em comparação com o grupo sedentário. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Um formato diferente de gel de gradiente (3%-8%) foi preparado devido ao grande tamanho dos supercomplexos que podem ser resolvidos em BN-PAGE. A preparação enriquecida com mitocôndrias descrita neste protocolo foi utilizada para medir atividades complexas etc mitocondrial. A Figura 4 representa os dados registrados para avaliação da atividade complexa I-II. Este ensaio foi realizado de acordo com o protocolo estabelecido3.

Figure 4
Figura 4: Medidas complexas de atividade I-II. Misturas proteicas enriquecidas com mitocôndrias obtidas de diferentes faixas etárias (48h, 3 meses, 6 meses e 9 meses) foram analisadas para a atividade complexa I-II utilizando um ensaio cinético. O grupo exercido apresentou aumento da atividade complexa I-II em comparação com a do grupo sedentário. A diferença entre os dois grupos não foi estatisticamente significante segundo um teste t emparelhado (P > 0,05). As barras de erro retratadas na figura representam o erro padrão da média (SEM) para n = 4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar 1: (A) Perfil complexo-I entre as faixas etárias. Em geral, os descendentes nascidos da porca exercida apresentaram níveis mais baixos de Complexo-I em comparação com o do grupo sedentário (n = 4). Isso foi mais pronunciado no grupo de 9 meses. (B) Perfil complexo-II entre as faixas etárias. Todas as faixas etárias apresentaram baixos níveis de Complexo-II no grupo exercido, com exceção de três meses de coorte (n = 4). (C) Perfil complexo-III entre as faixas etárias. Apenas a faixa etária de 9 meses apresentou níveis mais baixos de Complexo-III no grupo exercido em comparação com o do grupo sedentário (n = 4). (D) Perfil complexo-IV entre as faixas etárias. Observou-se um ligeiro aumento nos níveis de proteína Complex-IV do grupo exercido (n = 4). (E) O perfil Complex-V (ATP synthase) entre as faixas etárias. Ambos os grupos exercidos e sedentários apresentaram baixos níveis de Complexo-V, exceto no ponto de dados de 48 h (n = 4). Clique aqui para baixar este Arquivo.

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Discussion

Os passos críticos para este protocolo estão indicados aqui. Em primeiro lugar, a homogeneização do tecido deve ser cuidadosamente tratada para que efeitos excessivos não sejam aplicados durante o processo de homogeneização do tecido. Deve-se utilizar um triturador de tecidos, que faz parte da tecnologia de ciclismo de pressão (PCT) para homogeneização inicial do tecido9. Esta etapa reduzirá o ciclo excessivo de avc do homogeneizador de vidro em vidro (Figura 1B) que pode destruir ainda mais mitocôndrias já frágeis devido às condições do tecido congelado. Em segundo lugar, o peso do tecido congelado será importante para obter quantidades suficientes da preparação enriquecida com mitocôndrias. A quantidade de tecido inicial recomendada será superior a 0,8 g, dependendo da fonte do tecido. O tecido cardíaco é muito rico em mitocôndrias10,11; portanto, a quantidade recomendada será suficiente para obter uma preparação enriquecida com mitocôndrias. Terceiro, todos os procedimentos devem ser realizados em uma sala fria. Se uma sala fria não estiver disponível, um banho de gelo de grande porte será suficiente.

A viabilidade da obtenção de preparações enriquecidas com mitocôndrias a partir de tecido cardíaco previamente congelado foi demonstrada neste estudo. Este protocolo será essencial para fornecer acesso ao tecido congelado arquivado do qual mitocôndrias podem ser isoladas e a partir das quais complexos enzimáticos ETC mitocondrial podem ser avaliados. Um estudo recente demonstrou que a respiração mitocondrial de tecidos e células previamente congelados poderia ser mensurável também2. Por causa desse avanço, os pesquisadores poderão utilizar biosamples previamente coletadas para novas análises.

Avaliar o perfil de ETC individual e supercomplexos é facilitado pela realização de imunoblotação clássica em um formato multiplexal que utiliza múltiplos anticorpos durante o procedimento de imunoblotação na mesma membrana PVDH. É fundamental que o usuário determine a quantidade de proteína a ser carregada em géis para SDS-PAGE e BN-PAGE. O volume de resuspensão deve ser o mínimo possível para obter altas concentrações proteicas para que o usuário não tenha problemas com o volume de carga amostral. O valor proteico a ser carregado em BN-PAGE depende do rendimento da preparação enriquecida com mitocôndrias. Uma mistura de proteína enriquecida com mitocôndrias foi carregada por poço em BN-PAGE devido à pequena quantidade de tecido cardíaco original. A preparação de pelotas enriquecida com mitocôndrias de 50-150 μg seria suficiente para gel de 1 mm de espessura. O usuário pode preferir um gel de 1,5 mm de espessura para carregamento amostral; no entanto, a resolução de bandas proteicas pode não ser de qualidade aceitável. A ressuspensão de proteína mitocondrial por poço não foi testada porque coquetéis de anticorpos usados em ensaios de imunoblot foram predeterminados em sua concentração; no entanto, os usuários podem fazer seu próprio coquetel de anticorpos para aumentar a taxa de sinal/ruído.

Recomenda-se um gel de gradiente totalmente polimerizado (3%-8%) para géis BN-PAGE. Géis de gradiente de 3%-8% não estão disponíveis comercialmente; portanto, podem ser utilizados mini géis padrão (9 x 6 cm) de gradiente caseiro (3%-8%) (9 x 6 cm). Derramar o gel 24 h antes e permitir que o gel polimerize durante a noite em RT fornecerá uma formação de gel aceitável. Se um usuário precisa de uma melhor separação dos supercomplexos, recomenda-se usar formatos de gel maiores (seja midi gel 13,5 cm x 6,5 cm ou gel longo 28 cm x 16 cm).

A aplicação deste protocolo permitirá aos investigadores isolar mitocôndrias e analisar o perfil de ETC e supercomplexos em tecidos arquivados previamente congelados. Todos os depósitos de bioespéditos nacionais e regionais mantêm as biosamples em condições de ultraconsugnóstico (ou seja, -80 °C). Um grande número de tecidos está sendo arquivado por instituições e empresas farmacêuticas para novos estudos e propósitos de compartilhamento de reagentes. O Instituto Nacional de Saúde (NIH) determina que quaisquer projetos apoiados pelo NIH sejam necessários para compartilhar os reagentes produzidos a partir dos projetos apoiados. Esses biorepositórios são fontes muito valiosas para a obtenção de tecidos arquivados congelados para a obtenção de dados preliminares para pedidos de subvenção. A análise das atividades enzimonas dos supercomplexos não foi realizada neste estudo; no entanto, protocolos estão disponíveis para realizar tais ensaios8.

Utilizando-se os métodos descritos neste artigo, foram analisados complexos etc individuais e supercomplexos de preparações enriquecidas com mitocôndrias obtidas a partir do tecido cardíaco da prole das porcas. Descendentes de porcas exercidas apresentaram baixos níveis de ETC durante os primeiros 6 meses de vida e, eventualmente, nivelados em 9 meses.

COMPLEXO ETC 48 h 3 meses 6 meses 9 meses
Complexo-I ↓ ↓ ↓ Nenhuma mudança
Complexo-II ↓ ↓ Nenhuma mudança Nenhuma mudança
Complexo-III ↓ Nenhuma mudança Nenhuma mudança ↓
Complexo-IV ↑ ↑ ↑ Nenhuma mudança
Complexo-V ↓ ↓ ↓ Nenhuma mudança

Tabela 2: Perfil mitocondrial de complexos proteicos da cadeia de transporte de elétrons. A tabela resume o perfil dos níveis complexos etc mitocondrial no grupo exercido de porcas. Todos os complexos, exceto Complexo-IV, apresentaram padrão decrescente entre as faixas etárias.

Esta observação pode sugerir que os descendentes nascidos das porcas exercitadas durante a gravidez indicaram menos, mas mais eficientes complexos etc em suas mitocôndrias de tecido cardíaco (Figura 4). No entanto, a formação de supercomplexos em 9 meses de grupo exercido foi considerada elevada. O exercício pode de alguma forma afetar o rearranjo dos supercomplexos em condições de aumento da demanda de energia12. Além disso, o Complex-V (ATP synthase) exibiu um perfil discreto nos primeiros seis meses após o nascimento. Esta resposta pode ser devido à probabilidade de complexos proteicos ETC epigeneticamente modificados. O pequeno tamanho amostral (n = 4) para este estudo não foi suficiente para chegar a tal conclusão; no entanto, padrões de baixos níveis de proteína complexa etc, alta atividade complexa I-II e formação elevada de supercomplex podem sugerir que bioenergésicos no tecido cardíaco da prole das porcas exercidas são influenciados pelo exercício. Menos, mas mais eficientemente trabalhando complexos etc mitocondrial e a formação de supercomplexos aumentados são fenômenos interessantes a serem investigados. Este projeto ainda está em andamento.

Em resumo, este protocolo fornece uma preparação de amostra enriquecida com mitocôndrias simples e simples de tecido cardíaco arquivado anteriormente congelado. Os complexos ETC mitocondrial podem ser analisados por imunoblotting padrão com coquetéis de anticorpos multiplexados. BN-PAGE seguido de imunoblotting pode analisar a presença de supercomplexos. Essa preparação também pode permitir que os usuários avaliem atividades complexas etc mitocondrial.

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Disclosures

Os autores não declaram conflitos de interesse.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado financeiramente pela bolsa intramuros da Universidade de Kansas City para Abdulbaki Agbas e Summer Research Fellowship para Daniel Barrera. Os autores agradecem pelo trabalho editorial do Dr. Jan Talley.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amino caproic acid Sigma/Aldrich A2504-100G
Anti-Hu Total OxPhos complex kit Invitrogen 458199
anti-VDAC antibody abcam ab15895 use 1 µg/mL
Coomassie G-250 ThermoSientific 20279
Coomassie GelCode Blue ThermoScientific 24592
Digitonin Cabiochem 300410
Glass-Glass pestle homogenizer VWR KT885451-0020
Image Studio LICOR
IR-Dye conjugated anti-Rabbit Ab LICOR LC0725
Multiwell plate reader BioTek Synergy HT
Native molecular weight marker ThermoFisher BN2001
Nylon mesh monofilament Small Part Inc CMN-74
Orbital shaker ThermoScientfic
PCT Shredder Pressure Bioscience Inc
SEA BLOCK Blocking buffer ThermoScienctific 37527
Shredder PULSE Tube Pressure Bioscience Inc FT500-PS
Table top centrifuge Eppendorf 5418
Trypsin Amresco M150-1G
Trypsin inhibitor Amresco M191-1G Requires fresh preparation

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References

  1. Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Analytical Biochemistry. 418 (2), 213-223 (2011).
  2. Osto, C., et al. Measuring mitochondrial respiration in previously frozen biological samples. Current Protocols in Cell Biology. 89 (1), 116 (2020).
  3. Agbas, A., et al. Mitochondrial electron transfer cascade enzyme activity assessment in cultured neurons and select brain regions. Current Protocols in Toxicology. 80, 73 (2019).
  4. Hathaway, Q. A., et al. Maternal-engineered nanomaterial exposure disrupts progeny cardiac function and bioenergetics. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 312 (3), 446-458 (2017).
  5. May, L. E., et al. Influence of maternal aerobic exercise during pregnancy on fetal cardiac function and outflow. American Journal of Obstetrics & Gynecology MFM. 2 (2), 100095 (2020).
  6. Ehler, W. J., et al. Avoidance of malignant hyperthermia in a porcine model for experimental open heart surgery. Laboratory Animal Science. 35 (2), 172-175 (1985).
  7. Panov, A. V., et al. Effect of bovine serum albumin on mitochondrial respiration in the brain and liver of mice and rats. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 149 (2), 187-190 (2010).
  8. Jha, P., Wang, X., Auwerx, J. Analysis of mitochondrial respiratory chain supercomplexes using blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Current Protocols in Mouse Biology. 6 (1), 1-14 (2016).
  9. Pressure Biosciences Inc. Isolation of Functional Mitochondria from Whole Rat Heart Using a PBI Shredder and Pressure Cycling Technology (PCT). , South Easton, MA. (2010).
  10. McLaughlin, K. L., et al. Novel approach to quantify mitochondrial content and intrinsic bioenergetic efficiency across organs. Scientific Reports. 10 (1), 17599 (2020).
  11. Hom, J., Sheu, S. S. Morphological dynamics of mitochondria--a special emphasis on cardiac muscle cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46 (6), 811-820 (2009).
  12. Greggio, C., et al. Enhanced respiratory chain supercomplex formation in response to exercise in human skeletal muscle. Cell Metabolism. 25 (2), 301-311 (2017).

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Bioquímica Edição 174
Medindo complexos de transferência de elétrons mitocondrial em tecido cardíaco previamente congelado da prole da porca: um modelo para avaliar alterações bioenergetics mitocondrial induzidas pelo exercício
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