Summary
Beredning av mitokondriberikade prover från tidigare frysta arkiverade fasta vävnader tillät utredarna att utföra både funktionella och analytiska bedömningar av mitokondrier i olika experimentella modaliteter. Denna studie visar hur man förbereder mitokondriberikade preparat från frusen hjärtvävnad och utför analytiska bedömningar av mitokondrier.
Abstract
Den mitokondriella elektronöverföringskomplexet (ETC)-profilen modifieras i hjärtvävnaden hos avkomman som fötts till en tränad sugga. Denna hypotes testades genom att isolera mitokondrier med hjälp av en mild-isolering förfarande för att bedöma mitokondriell ETC och superkomplex profiler. Förfarandet som beskrivs här tillåtet för bearbetning av tidigare frysta arkiverade hjärtvävnader och eliminerade behovet av färska mitokondrier förberedelse för bedömning av mitokondriella ETC komplex, superkomplex och ETC komplexa verksamhet profiler. Detta protokoll beskriver den optimala ETC protein komplexa mätning i multiplexed antikropp-baserade immunblåsning och super komplexa bedömning med blå-native gel elektrofores.
Introduction
Målet med detta protokoll var att tillhandahålla detaljerade steg för att erhålla mitokondrier-berikade preparat från tidigare fryst hjärtvävnad med en ny teknik för låg energi mekanisk störning av vävnad som förbättrar vävnad lys och extraktion av mitokondrier. Med denna metod blir förbättrad extraktionseffektivitet utan att generera hög skjuvningsstress eller hög temperatur och kort homogeniseringstid (10-12 s) uppnåelig1.
Att få mitokondrier från arkiverad frusen vävnad är en värdefull tillgång för att utföra både funktionella2 och biokemiska studier3 annars inte lätt repeterbara under de exakta experimentella förhållandena. En klassisk Potter-Elvehjem Teflon pestle glass homogenisator eller Dounce homogenisator har använts och används fortfarande i forskningslaboratorier för att homogenisera mjuka vävnader som lever, njure och hjärna. Homogenisering av hårda vävnader som muskler och hjärta kräver dock mer homogeniseringstid, enzymbehandling, höghastighets homogenisering och omfattande användarupplevelse. Detta är ofördelaktigt för att extrahera intakta organeller som mitokondrier från hårdvävnad som muskler och hjärta. Metoden som beskrivs i detta protokoll används för att erhålla hög avkastning mitokondrier-berikad beredning för att analysera mitokondriell elektron transport kedja (ETC) proteinkomplex och deras superkomplex bildas i hjärtvävnader skördas från avkommor födda till utövad och stillasittande sugga, flash-fryst i flytande kväve, och lagras vid -80 °C för framtida användning. Denna metod gör det möjligt för användaren att isolera mitokondrier berikad beredning från tidigare frysta arkiverade vävnader.
Extern nanomaterialexponering för gravida gnagare kan påverka hjärtfunktionen och mitokondriell andning och bioenergetik på avkomma under dräktigheten4 negativt. Aerob motion-inducerad positiva förändringar i fetala myocyt bioenergetics under graviditeten är dock ännu inte dokumenteras. Nya studier ger dock bevis för att moderns aeroba träning under graviditeten har en positiv inverkan på fetala hjärtfunktionen5. För att ge ytterligare bevis utfördes en analys av de longitudinella effekterna av moderns träning på avkommans mitokondriella andningskedjekomplex (dvs. komplex I genom komplex V) under graviditeten.
Denna studie har betydande hälsorelevans eftersom resultaten kan tyda på att moderns träning förbättrar effektiviteten i energiproduktionen i hjärt mitokondrier av avkomman. I denna studie användes suggor (hongris) som en djurmodell av två skäl: (i) hjärtfysiologi liknar human6, och (ii) hjärtvävnadsskörd från avkommor från olika tidpunkter är möjlig enligt ett institutionellt IACUC-godkännande. Den föreslagna studien syftar till att svara på många av de grundläggande frågorna som kopplar samman moderns träning och dess potentiella positiva effekter på den cellulära och biokemiska makeupen av avkommans hjärtvävnad. Detta tillvägagångssätt kräver skonsam men effektiv mitokondrier isolering tekniker från tidigare fryst hjärt vävnad erhålls från de långa och kostsamma longitudinella studier som tog upp frågorna om bioenergetic förändringar inom fetala hjärt myocyter under graviditeten. Metoden som beskrivs i denna studie gör det möjligt att använda stora mängder tidigare frusen arkiverad vävnad för mitokondrier-berikad förberedelse för både analytiska och funktionella studier. Studien kommer också att bidra till att fylla kunskapsgapet inom detta område genom att tillhandahålla preliminära data, vilket kan leda till framtida studier som fastställer effekterna av moderns träning på hjärthälsan in utero och därefter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Frysta avkommor hjärtvävnader mottogs från Dr. Sean Newcomer tillsammans med det institutionella IACUC godkännandebrevet. Hjärtvävnaderna erhölls från en långsiktig longitudinell studie, blixtfryst i flytande kväve och lagrades vid -80 °C för framtida användning. Alla protokoll om bearbetning av avkomma hjärtvävnad följde riktlinjerna från Kansas City University IBC och IACUC kommittéer.
1. Beredning av buffertar och reagenser
OBS: Förbered alla prover enligt tillverkarens riktlinjer. Använd ultrarenat vatten eller motsvarande i alla recept och protokollsteg. Använd personlig skyddsutrustning (labbgloats, ansiktsmask, handskar och skyddsglasögon/ansiktsskydd) under denna procedur. Buffertvolymer är lämpliga för bearbetning av sex vävnadsprover.
- Förbered 1,5 L vävnadstvättbuffert genom att kombinera 154,035 g sackaros (0,3 M slutlig), 3,904 g HEPES (10 mM slutlig), 0,111 g EDTA (0,2 mM slutlig). Tillsätt ingredienser till 1,0 L vatten medan du är på omrörningsplattan, justera pH till 7,2 med utspädd HCl och smink till slutlig volym till 1,5 L.
OBS: Cirka 200 ml tvättbuffert behövs per prov (50-300 mg). Sex vävnadsprover kan bearbetas på en dag. Använd den återstående tvättbufferten för att skapa en isoleringsbuffert. - Förbered isoleringsbufferten från tvättbufferten som tidigare beskrivits i steg 1.1 genom att tillsätta 210 mg BSA i 210 ml tvättbuffert. Justera pH-värdet till 7,4 med utspädd NaOH-lösning.
OBS: Cirka 35 ml isoleringsbuffert behövs per vävnadsprov. Därför krävs 210 ml isoleringsbuffert för sex prover. Förbered denna buffert genom att tillsätta färsk BSA-lösning (1 mg/ml-final) på beredningsdagen. BSA används för att isolera mitokondrier eftersom det förbättrar mitokondriella egenskaper genom att ta bort naturliga uncouplers såsom fria fettsyror. BSA har visat sig ha antioxidant aktivitet genom att öka oxidationshastigheten av substrat, särskilt succinate, i hjärnan mitokondrier7. Alternativt kan bovint serumalbumin ersättas med billigare syrafria analoger som ovalbumin. - Förbered 150 ml resuspensionbuffert genom att kombinera 0,011 g EDTA (slutlig koncentration på 0,2 mM EDTA eller använd 150 μL 200 mM EDTA-lösning för 150 ml resuspensionbuffert), 12,836 g sackaros (0,25 M sackaros slutlig koncentration) och 0,2 g trisa-slutlig koncentration) och 0,2 g tris). Justera pH-värdet till 7,8 med 0,1 N NaOH. Tillsätt 60 μL proteashämmande cocktail strax före användning.
- Förbered trypsinlösningen genom att lösa upp 7, 5 mg trypsin i 3,0 ml 1 mM HCl (2,5 mg trypsin/ml-final). Denna mängd är tillräcklig för ett prov.
OBS: Förbered trypsinlösningen baserat på antalet vävnadsprover som planeras att bearbetas. - Förbered trypsinhämmarlösningen från sojabönor genom att kombinera 13, 0 mg trypsinhämmare i 20 ml isoleringsbuffert innehållande BSA (0, 65 mg/ml trypsinhämmare slutlig).
OBS: Förbered en ny trypsinhämmare lösning. - Förbered ammoniumpersulfatreagens genom att tillsätta 0,1 g ammoniumpersulfat i 1 ml vatten (10% ammoniumpersulfatfinal).
OBS: Ammoniumpersulfatreagenset ska antingen vara nyberett eller en stor volym kan alikvoteras och förvaras i en frys på -20 °C. - Förbered aminosyralösningen (ACA) genom att kombinera 0,131 g 6-amino caproinsyra i 1,0 ml ultrarenat vatten och förvara den i 4 °C (1 M 6-aminosyra slutlig).
- Förbered Coomassie briljant blå färglösning genom att lösa upp 1 g Coomassie G-250 i 0,5 ml vatten och 0,5 ml 1 M aminocaproinsyra (10% färglösning slutlig koncentration).
- Förbered 5% Digitonin för Blå native-PAGE (BN-PAGE). Beräkna ungefär hur mycket digitonin som behövs i provberedningen plus lite extra volym för att kompensera pipetteringsfelen (överskatta med 10 mg). För 15 mg: Späd först 15 mg digitonin i 30 μL 100% DMSO. Vortex för att hjälpa digitonin att komma in i lösningen. Lägg sedan till resterande 90% av ddH2O (270 μL). Värm försiktigt för att blanda lösningen (virvel) och kyl den sedan på is.
- Förbered den ursprungliga PAGE-anodbufferten. Tillsätt 50 ml 20x inbyggd PAGE-buffert till 950 ml vatten för att göra en slutlig volym på 1 L. Förbered färsk anodbuffert för omedelbar användning. Använd detta som en 1x-buffert som körs.
- Förbered en mörkblå katodbuffert. Lös upp 0,0160 g Coomassie lysande blå G-250 i 80 ml inbyggd PAGE-anodbuffert; blanda väl.
OBS: Förbered färsk katodbuffert för omedelbar användning. Endast 60 ml kan behövas men gör en extra 20 ml i händelse av läckor. - Förbered den ljusblå katodbufferten. Tillsätt 20 ml mörkblå katodbuffert i 180 ml inbyggd PAGE-anodbuffert och blanda väl.
OBS: Den här bufferten kan bara användas en gång. - Förbered 5% Coomassie G-250 som provtillsats. Späd ut 200 μL av 10% Coomassie lager redan gjort (steg 1.8) med 200 μL av 1 M ACA och lagra vid 4 °C.
- Förbered 4x inbyggd PAGE-provbuffert genom att kombinera 40% glycerol, 0,04% Ponceau S, 25 mM Tris-HCl (pH 6,8), 192 mM glycin i 10 ml slutlig volym. Aliquot dem och förvara vid -20 °C i frysen.
2. Mitokondrier isolering från frusen hjärtvävnad
OBS: Utför mitokondriernas isoleringsprocedur i ett 4 °C kallt rum. Men om det inte är tillgängligt för kylrummet, använd ett stort isbad för att utföra proceduren.
- Ta tidigare frysta hjärtvävnadsprover från frysen -80 °C.
OBS: Högst fyra vävnadsprover kan bekvämt bearbetas för mitokondrier isolering under en viss dag. - Väg röret som innehåller hjärtvävnadsprovet och registrera vikten. Förbered tre bägare (vardera 50 ml) som innehåller 40 ml tvättbuffert. Kyl varje bägare i issaltbadet med lika stora mängder is och salt blandat i 3-5 minuter innan du går vidare till nästa steg. Sätt magnetiska omrörningsstänger i varje bägare och ställ in omröraren för medelhastighet.
OBS: Överfrys inte bägarna och använd dem omedelbart strax efter att moln av iskristaller börjar dyka upp. - Lägg den frusna hjärtvävnaden direkt i den iskalla lösningen i den första bägaren. Vänta ca 5 min under omrörning och applicera lätt tryck på vävnaden med pincett för att få ut så mycket blod som möjligt.
- Väg det tomma röret och subtrahera från den ursprungliga vikten (steg 2.2) för att få en nettovikt av hjärtvävnaden.
- Ta ut vävnaden med tång och pressa hjärtat med en ren pappershandduk av filterpapper för att ta bort blod. Placera sedan vävnaden i den andra bägaren. Vänta ca 5 min under omrörning för att ta bort överflödigt blod.
- Torka försiktigt vävnaden på en pappershandduk. Ta bort allt fett, clotted blod, öronen och fascia (vit vävnad). Poola sedan ventrikulär vävnaden.
- Strimla vävnadsproverna med hjälp av dokumentförstöraren genom att följa steg 2.7.1-2.7.9.
- Placera hjärtvävnaden (~50-300 mg) i vävnadsförstörarkammaren från ramsidan.
Bild 1: Vävnadsförstörarkammare (rör) för användning med dokumentförstöraren. Vävnad homogenisering i shredder röret kräver ca 10-12 s per vävnadsprov. Vävnad homogenisering avslutas när den homogeniserade vävnaden passerar genom den perforerade skivan in i den övre kammaren. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
- Tillsätt ~0,2-0,8 ml tvättbuffert på rörets locksida.
OBS: Se till att den totala volymen av provet och tvättbufferten som kombineras under strimlingen inte överstiger 0,7-0,8 ml. - Använd rörverktyget för att täcka strimlarkammaren med strimlarlocket tätt.
OBS: Dra inte åt för hårt för strimlarlocket. - Placera strimlarkammaren i strimlarhållaren med ramsidan nedåt. Rammen kommer att koppla in en montering i strimlarhållaren.
- Sätt i biten på dokumentförstöraren. låt biten kopplas med strimlarlocket. Se till att borrkronan är ordentligt låst på plats.
OBS: Använd alltid den fulladdade strimlardrivrutinen. - Tryck manuellt nedåt på strimlardrivrutinen och dokumentförstörarkammaren tills tryckindikatorn på dokumentförstöraren når en inställning på cirka 2 på dokumentförstöraren.
OBS: Inställningen kan vara på en högre nivå om strimlingsvävnaden är mer fibrös. - Kör dokumentförstöraren i cirka 10-12 s genom att trycka på avtryckaren på dokumentförstöraren, samtidigt som inställningen bibehålls vid 2.
- Titta på röret för att kontrollera om hela eller större delen av vävnadens fasta massa strimlas genom lysskivan och skickas in i den övre kammaren i dokumentförstörarkammaren genom att titta på röret.
OBS: Det kan vara nödvändigt att strimla vävnadsprovet under en längre period. Sätt bara tillbaka röret till dokumentförstöraren och fortsätt processen. De flesta typer av vävnadsprover kräver bara 10-12 s strimling. Medan all strimling kommer att producera lite värme på grund av friktion, kommer denna korta bearbetningstid inte att värma provet avsevärt. - När provet har strimlats lyfter du ut dokumentförstörarkammaren ur hållarenheten. Använd rörverktyget för att ta bort strimlarlocket och placera det på en ren yta för senare användning.
OBS: Strimlarlocket bör anses vara förorenat med provextrakt, och kan beroende på provtyp vara förorenat med smittsamma material. Använd inte samma strimlingslock för andra vävnadsprover för att förhindra korskontaminering.
- Överför den strimlade hjärtvävnaden till den tredje bägaren med 40 ml tvättbuffert och rör om och rör om vävnaden i 5 min med medelhastighet medan du är på omrörningsplattan.
- Filtrera suspensionen genom en monofilament i nylonnät (74 μm porstorlek) och kassera filtratet. Tvätta den strimlade vävnaden på filtret 3x med 10 ml tvättbuffert.
OBS: Se till att monofilamentet i nylonnät är förtrött med vatten. - Överför den tvättade och strimlade vävnaden till en 50 ml bägare med 20 ml tvättbuffert och placera bägaren i isbadet på magnetomröraren. Tillsätt 0,5 ml trypsinlösning under ständig omrörning i 15 minuter. Ungefär halvvägs genom inkubationen (vid ca 7,5 min), överför vävnadsfjädringen till en löst monterad handhållen glas-på-glas homogenisator som rymmer 0-15 ml volym.
Bild 1: Vävnadsförstörarkammare (rör) för användning med dokumentförstöraren. Vävnad homogenisering i shredder röret kräver ca 10-12 s per vävnadsprov. Vävnad homogenisering avslutas när den homogeniserade vävnaden passerar genom den perforerade skivan in i den övre kammaren. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
- Homogenisera försiktigt med 4-5 slag för att skingra suspensionen utan att producera skum. Placera homogenatet i en 50 ml bägare och blanda försiktigt på en omrörningsplatta i 15 min vid 4 °C.
- Efter 15 minuters inkubation tillsätt 10 ml isoleringsbuffert som innehåller trypsinhämmaren i bägaren som innehåller homogenatet och inkuberar i 1 min vid 4 °C under omrörning.
- Filtrera fjädringen igen genom ett nylonfilter och spara filtratet i ett koniskt rör på 50 ml.
- Samla upp partikelfraktionen kvar på nylonfiltret och placera den i homogenisatorn glas mot glas. Tillsätt 15-20 ml tvättbufferten och homogenisera försiktigt för hand i 25-30 s.
OBS: Filtratet flyter mycket långsamt i detta steg. För att öka filtratflödet, placera trattspetsen vidrör insidan av det koniska röret. - Kombinera homogenatet med filtratet, balansera rören och centrifugera vid 600 x g i 15 min vid 4 °C.
- Filtrera den resulterande supernatanten i ett nytt koniskt rör med hjälp av ett nylonfilter för att undvika förorening av pelleten. Kör centrifugen igen vid 8 500 x g i 15 min vid 4 °C.
OBS: Använd en plastöverföringspipett för att ta bort supernatanten och offra 0,2 ml supernatant från toppen av den fluffiga pelleten. - Kassera supernatanten och skölj pelleten 2-3 gånger med 1 ml isoleringsbufferten. Se till att kassera det fluffiga vita yttre fälgskiktet varje gång.
OBS: Tvätta pelleten genom att tillsätta isoleringsbufferten med en pipett med 1 ml spets eller en ny överföringspipeett. Tillsätt bufferten på sidan av röret, inte direkt över pelleten, för att förhindra att pelleten bryts och förhindra förorening av supernatanten. Därefter aspirera bufferten med en överföringspipett och upprepa processen ytterligare två gånger. - Tillsätt 5 ml isoleringsbuffert till varje rör och bryt upp pelleten med en pipett med en 1 ml-spets eller en ny överföringspipett.
- Späd suspensionen med 20 ml extra isoleringsbuffert och kör centrifugen igen vid 8 500 x g i 15 minuter vid 4 °C.
- Kassera supernatanten och återanvänd pelleten i 5 ml av den återanvändande bufferten. Tillsätt sedan 15 ml mer av bufferten för totalt 20 ml och centrifugera vid 8 500 x g i 15 minuter vid 4 °C. Kasta supernatanten. Den resulterande bruna pelleten innehåller tvättade intakta mitokondrier.
- Återsuspend den mitokondriberikade pelleten i 250 μL av den återupplivande bufferten, inklusive proteashämmare. Aliquot i 25 μL, snabbfrysning i flytande kväve och förvara i en -80 °C djupfrys i flera år.
OBS: Extra 5 μL mitokondriberikad beredning för proteinanalysanalysanalysen. För en BN-PAGE -studie (Blue native-PAGE) alikvoterar den återsuspenderade pelleten i 50 μg mitokondriellt protein per rör. Centrifugera vid 8 500 x g i 15 min vid 4 °C. Aspirera försiktigt på supernatanten och förvara mitokondriell pellet (50 μg protein/alikvot) i en djupfrys på -80 °C i flera år.
3. Mitokondriell elektronöverföringskomplex (ETC) bedömning
OBS: Enskilda mitokondriella ETC-proteiner (dvs. Complex-I, II, III, IV, V) kan bedömas med standard immunoblotting assay. På grund av de olika proverna (fyra tidpunkter: 48 h, 3 månader,6 månader, 9 månader), två experimentella tillstånd (tränade och stillasittande) och ett antal immunprobing antikroppar (fem antikroppar), rekommenderas en multiplexerad immunblåsning. Utför multiplexerad immunoblotting enligt följande.
- Lös 50 μg mitokondri berikat proteinprov/brunn i 4%-20% gradient polyakrylamidgelelektrofores (100 V, 90 min).
- Överför proteinerna till ett PVDF-membran (75 V; 60 min)
- Blockera membranet i en blockerande buffertlösning i minst 1 h vid 4 °C.
OBS: Blockeringstiden kan förlängas upp till över natten vid 4 °C. Blockeringsbufferten (Table of Materials) innehåller ingredienser som inte är däggdjur (dvs. fiskproteiner) som är mindre benägna att ha specifika bindande interaktioner med antikroppar samt andra däggdjursproteiner som förekommer i typiska metoder. - Undersök membranet med antikroppscocktailen inklusive anti-Complex-I, II, III, IV, V-antikroppar och inkubera över natten på en orbital shaker vid 4 °C.
- Tvätta nästa dag membranet och sonden med IR-märkta sekundära antikroppar i 2 h på en orbital shaker vid RT (rumstemperatur).
- Tvätta fem gånger med 1x TBS-T (TBS innehållande Interpolering 20) och en gång med 1x TBS (Tris buffrad saltlösning).
OBS: För den sista tvätten, inkludera inte tvättmedel i TBS-bufferten. - Avbilda fläcken i en bildanalysator.
4. Mitokondriernas superkomplexbedömning av Blue Native Poly Akrylamid Gel Electrophoresis (BN-PAGE)
OBS: En superkomplex profil av ETC kan också bedömas genom att använda BN-PAGE-tekniken.
- Förbered provbuffertcocktailen för 20 μL per 50 μg mitokondriberikat pelletprotein (7 μL vatten + 5 μL 4x infödd polyakrylamidgelelektroforesprovbelastningsbuffert + 8 μL 5% Digitonin + 2 μL Coomassie G-250).
OBS: Gör en buljongprovsbuffertcocktail beroende på antalet tillgängliga prover (50 μg protein/prov). Välj lämpliga digitoninmängder baserat på proteinkoncentrationen i den mitokondriberikade pelleten (tabell 1)8. - Värm digitoninbuljongen vid 95 °C i 3 minuter, blanda och svalna på is innan du gör huvudblandningen.
- Tillsätt coomassie G-250-provtillsatsen strax innan du laddar proverna i gelén.
- Tillsätt 20 μL av provbuffertcocktailen i ett rör som innehåller 50 μg mitokondriell proteinpellet. Solubilisera/återanvänd pelleten genom att försiktigt blanda pelleten med en pipett utan att generera skum.
- Inkubera blandningen på is i 20 minuter för att uppnå maximal solubilisering av den mitokondriberikade pelleten. Från tid till annan, snärta försiktigt rören för att förbättra solubiliseringen.
- Förbered den ursprungliga PAGE-anodbufferten/1x-bufferten och den mörkblå färgade katodbufferten i väntan på inkubation.
- Centrifugera den solubiliserade mitokondriberikade pelleten vid 20 000 x g i 10 min vid 4 °C.
- Efter centrifugering samlar du upp 15 μL av supernatanten i nya rör placerade på is.
- Tillsätt lämplig mängd Coomassie G-250 reagens på lämpligt belopp på 5 % till det supernatant som erhålls i steg 4.8 (se tabell 1).
OBS: 5% Coomassie G-250-volymen ska vara sådan att färgämnets slutliga koncentration är 1/4 tvättmedelskoncentrationen. Utför detta steg precis innan du laddar proverna i gelén.
| Protein | Digitonin/protein | 4x provbuffert | 5% Digitonin | Vatten | Slutlig volym | 5% Coomassie G-250 |
| förhållandet (g/g) | provtillsats | |||||
| 50 μg | 8 | 5 | 8 | 7 | 20 | 2 |
| 50 μg | 4 | 5 | 4 | 11 | 20 | 1 |
Tabell 1: Prov BuffertcocktailBeredning med två olika tvättmedel/proteinförhållanden. För att uppnå maximal solubilisering av membranproteiner från mitokondriell suspension bör koncentrationen av digitaliseringen av digitaliseringen/mitokondriell suspensionsprotein justeras till mellan 4-8 g digitonin/g protein. I hjärtvävnaden användes 400 μg digitonin för 50 μg mitokondriell suspension proteiner (dvs. 8 g digitonin/g mitokondriprotein) för att maximera lösligheten av superkomplexiteterna från mitokondrierna suspension.
- Häll en 3%-8% gradientgel, ta bort kammen och tvätta ut geléns brunnar med 1x löpande buffert tre gånger.
OBS: Gelén polymeriserar bäst om den hälls en dag innan. - Ställ in elektroforessystemet och placera gelén i apparaten.
- Fyll provbrunnarna med den mörkblå färgade katodbufferten.
- Ladda 10 μL av den oförstådda proteinstandarden som en inbyggd molekylviktsmarkör på gelens första och sista brunn.
- Ladda hela mängden prov supernatant + Coomassie provtillsats beredd i steg 4.9 ovan i brunnarna med hjälp av en platt huvud gel-loading spets.
- Fyll försiktigt minicellsbuffertdammen med cirka 60 ml mörkblå katodenbuffert utan att störa proverna i brunnarna och fyll sedan bufferttanken med den ursprungliga PAGE 1x-bufferten.
- Slå på strömförsörjningen och elektrofores proverna vid 150 V i cirka 30 min.
- Ta bort den mörkblå färgkatodbufferten från buffertdammen (innerkammaren) med en överföringspipett eller aspirera provbrunnarna. Fyll den inre kammaren med 150-200 ml ljusblå färgad katodbuffert och kör elektroforesen vid 250 V i 60 min.
OBS: Elektroforestiden kan bestämmas genom att kontrollera när färgfronten migrerar bara 0,5 cm över gelkassettens botten. - Ta bort gelén från kassetten och placera den i en ren plastbehållare. Tvätta gelén med destillerat vatten av god kvalitet i 15 minuter på en rocker/orbital shaker.
OBS: För att ta bort gradientgelen från kassetten, hantera kassetten från botten, som är starkare, för att minimera risken för brott. - Häll av vatten, doppa gelén i en tillräcklig mängd Coomassie GelCode Blue fläckreagens och inkubera i 1 h på en orbital / rocker vid rumstemperatur.
OBS: Blanda lösningen blue stain reagens (Table of Materials) innan du använder den genom att försiktigt virvla flaskan flera gånger. - Dekantera färglösningen, tillsätt destillerat vatten, skölj flera gånger med vatten och sätt sedan på orbital / rocker för avtaining.
OBS: För in en bit svamp (~3 cm x 0,5 cm) i gelavstickningsbehållaren och lämna gelén för över natten avståning. Svampen adsorberar färgpartiklarna utan att kräva flera vattenförändringar. - Analysera gelén i en bildanalysator.
5. Mitokondrier superkomplex bedömning genom immunoblot blot analys
- Utför en ny uppsättning BN-PAGE utan att färga gelén i slutet av elektroforesen.
- Följ samma förfarande som i avsnitt 3 (mitokondriell elektronöverföringskomplex (ETC) för att slutföra immunoblotting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Enligt protokollet bereddes ett bra utbyte av mitokondrier-berikad proteinblandning från hjärtvävnad. Cirka 15 mg/ml mitokondriberikad proteinblandning erhölls från i genomsnitt 1, 2 g fryst hjärtvävnad som skördats från avkomman till suggan. Mängden mitokondriell beredning var tillräcklig för att utföra (i) en standard immunoblot analys för bedömning av enskilda elektron överföring komplex (ETC) (dvs. Complex-I, II, III, IV och Complex-V), (ii) en mitokondriell superkomplex bedömning av BN-PAGE och immunoblot analys, och (iii) begränsade enzymatiska analyser för det valda komplexet. Cocktailen av antikroppar mot enskilda ETC-proteinkomplex ger teknisk genomförbarhet att varje antikropp kommer att känna igen sitt eget målprotein i en enda immunoblotanalys.
Mitokondriberikat protein framställdes från hjärtats vänstra kammare, erhållen från suggens avkomma. Hjärtvävnaderna i båda grupperna skördades vid olika tidpunkter efter födseln (48 h, 3 månader, 6 månader och 9 månader). Huruvida moderns träning har en positiv inverkan på mitokondriell ETC av avkomman under dräktigheten var hypotesen som testades i denna studie. Fyra hjärt vävnader var bekvämt bearbetas på en viss dag på grund av att långa mitokondrier-berikade isoleringsprocessen.
Figur 2: Immunoblotprofil av mitokondriella ETC-komplex från avkommans hjärtvävnad. Mitokondriellt berikad proteinblandning löstes i en 4%-20% gradient gel under reducerande förhållanden. Proteiner immunskyddades av en kommersiell antikroppscocktail, och anti-VDAC-antikropp användes för lastningskontroll (rött färgband). Cocktailen av antikroppar togs upp mot bovin hjärta Complex-I (antigen NDUFB8), bovin hjärta Complex-II (antigen C-II30 (FeS), bovin hjärta Complex II, III (antigen C-III-Core 2), human Complex IV, subunit II (antigen C-IV-II) och bovin hjärta Complex-V (antigen C-V-α). Den sekundära antikroppen var märkt med en infraröd tagg, och bilden analyserades med hjälp av en bildanalys programvara. Individuella komplexa profiler i åldersgrupperna anges i kompletterande figur 1 (A-E). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2 representerar en typisk ETC-proteinprofil. Antikroppscocktails tillåtna för immunblåsning i ett multiplexformat. Varje antikropp kände igen sitt eget målprotein, vilket ger en acceptabel upplösning. Protein bandet intensiteter analyserades digitalt. Vävnader som erhållits från avkomman till tränad sugga uppvisade relativt reducerade nivåer i några av ETC-komplexen (kompletterande siffror 1A-E). Mitokondri-berikade preparatet måste lösas i en gradient gel (4%-20%) som immunoprobing utfördes i ett multiplexering format. Detta tillvägagångssätt kommer att eliminera behovet av att köra flera fasta procent av SDS/ PAGE geler och run-to-run variabilitet.
Mitokondriella proteiner löstes i en 3%-8% gradient BN-PAGE (figur 3A) och immunprobed med antikropp cocktails. I både motionerade och stillasittande grupper observerades flera superkomplexbildning (figur 3B).
Figur 3: Mitokondriell superkomplexprofil av Blue-Native Polyacrylamide gel elektrofores (BN-PAGE). (A). Mitokondriellt berikade proteinblandningar löstes i 3%-8% BN-PAGE och färgades med en Coomassie blå reagens (Gel Code, Blue Stain Reagent). (B). Mitokondriellt berikade proteinblandningar löstes i en 3%-8% BN-PAGE, överförs till ett PVDF-membran och immunprobed med antikropp cocktails för superkomplex. I båda analyserna var proteinbelastningen 150 μg/brunn. En 6-månaders datainsamlingspunkt inkluderades inte på grund av otillräckligt proteinutbyte under beredningen. Den mest framträdande superkomplexökningen som observerades var 9 månader i den tränade gruppen jämfört med stillasittande gruppen. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Ett annat gradient gel format (3%-8%) förbereddes på grund av den stora storleken på superkomplex som kan lösas i BN-PAGE. Mitokondrier-berikade preparat som beskrivs i detta protokoll användes för att mäta mitokondriella ETC komplexa aktiviteter. Figur 4 representerar uppgifter som registrerats för komplex I-II-verksamhetsbedömning. Denna analys utfördes enligt det fastställda protokollet3.
Figur 4: Komplexa I-II-aktivitetsmätningar. Mitokondrier-berikade proteinblandningar som erhållits från olika åldersgrupper (48 h, 3 månader, 6 månader och 9 månader) analyserades för den komplexa I-II-aktiviteten med hjälp av en kinetisk analys. Den tränade gruppen visade en ökad komplex I-II aktivitet jämfört med den stillasittande gruppen. Skillnaden mellan de två grupperna var inte statistiskt signifikant enligt ett parat t-test (P > 0,05). Felstaplarna som visas i figuren representerar standardfelet för medelvärdet (SEM) för n = 4. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Kompletterande figur 1: (A) Komplex-I-profil mellan åldersgrupper. I allmänhet presenteras avkommor födda till den tränade suggen med lägre nivåer av Complex-I jämfört med den stillasittande gruppen (n = 4). Detta var mer uttalat i 9-månadersgruppen. B) Komplex II-profil mellan åldersgrupper. Alla åldersgrupper uppvisade låga nivåer av Complex-II i den utövade gruppen med undantag för tre månaders kohort (n = 4). C) Komplex III-profil i olika åldersgrupper. Endast 9-månaders åldersgruppen visade lägre nivåer av Complex-III i den tränade gruppen jämfört med den stillasittande gruppen (n = 4). (D) Komplex IV-profil mellan åldersgrupper. En liten ökning av complex-IV proteinnivåerna i den utövade gruppen observerades (n = 4). (E) Profilen för komplex-V (ATP-syntas) i olika åldersgrupper. Både motionerade och stillasittande grupper uppvisade låga nivåer av Complex-V utom vid 48 h datapunkten (n = 4). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De kritiska stegen för det här protokollet anges här. För det första bör vävnadshomogenisering hanteras noggrant så att överdrivna rena effekter inte kommer att appliceras under vävnadshomogeniseringsprocessen. En vävnadsförstörare bör användas, som är en del av tryckcyklingsteknik (PCT) för initial vävnads homogenisering9. Detta steg kommer att minska den överdrivna slagcykeln för homogenisator av glas mot glas (figur 1B) som ytterligare kan förstöra redan bräckliga mitokondrier på grund av frusna vävnadsförhållanden. För det andra kommer den frysta vävnadsvikten att vara viktig för att få tillräckliga mängder av mitokondriberikad beredning. Den rekommenderade startvävnadsmängden kommer att vara större än 0, 8 g, beroende på vävnadens källa. Hjärtvävnaden är mycket rik på mitokondrier10,11; Därför kommer den rekommenderade mängden att vara tillräcklig för att erhålla ett mitokondriberikat preparat. För det tredje bör alla procedurer utföras i ett kallt rum. Om ett kylrum inte är tillgängligt kommer ett stort isbad att räcka.
Möjligheten att erhålla mitokondriberikade preparat från tidigare frusen hjärtvävnad har visats i denna studie. Detta protokoll kommer att vara avgörande för att ge tillgång till arkiverad fryst vävnad från vilken mitokondrier kan isoleras och från vilka mitokondriella ETC enzymkomplex kan bedömas. En ny studie visade att mitokondriell andning från tidigare frusna vävnader och celler också kan vara mätbar2. På grund av denna utveckling kommer forskare att kunna använda tidigare insamlade biosamples för ytterligare analyser.
Att bedöma profilen för enskilda ETC och superkomplex underlättas genom att utföra klassisk immunoblotting i ett multiplexerande format som använder flera antikroppar under immunblåsningsförfarandet på samma PVDH-membran. Det är viktigt för användaren att bestämma mängden protein som ska laddas i geler för SDS-PAGE och BN-PAGE. Resuspensionsvolymen bör vara så minimal som möjligt för att få höga proteinkoncentrationer så att användaren inte får problem med provbelastningsvolymen. Proteinmängden som ska laddas i BN-PAGE beror på utbytet av det mitokondriberikade preparatet. En 150 μg mitokondri-berikad proteinblandning laddades per brunn i BN-PAGE på grund av den lilla mängden original hjärtvävnad. Den 50-150 μg mitokondriberikade pelletspreparatet skulle räcka för 1 mm tjock gel. Användaren kan föredra en 1,5 mm tjock gel för provbelastning; Upplösningen av proteinband kanske dock inte är av acceptabel kvalitet. Det mindre mitokondriella protein resuspension per brunn testades inte eftersom antikroppscocktails som används i immunoblotanalyser var förutbestämda i deras koncentration. Användare kan dock göra sin egen antikroppscocktail för att öka signal-/brushastigheten.
En helt polymeriserad gradientgel (3%-8%) för BN-PAGE geler rekommenderas. Gradient geler på 3%-8% har inte varit kommersiellt tillgängliga; Därför kan hemlagad gradient (3%-8%) standard mini geler (9 x 6 cm) användas. Att hälla gelén 24 h innan och låta gelén polymerisera över natten i RT kommer att ge en acceptabel gelformation. Om en användare behöver bättre separation av superkomplex, rekommenderas att använda större gelformat (antingen midi gel 13,5 cm x 6,5 cm eller lång gel 28 cm x 16 cm).
Tillämpningen av detta protokoll kommer att göra det möjligt för utredare att isolera mitokondrier och analysera profilen för ETC och superkomplex i tidigare frysta arkiverade vävnader. Alla nationella och regionala biospecimendepåer håller biosamplarna under ultrafrysningsförhållanden (dvs. -80 °C). Ett stort antal vävnader arkiveras av institutioner och läkemedelsföretag för vidare studier och utbyte av reagensdelning. National Institute of Health (NIH) föreskriver att alla NIH-stödda projekt måste dela de reagenser som produceras från de projekt som stöds. Dessa biodatabaser är mycket värdefulla källor för att erhålla frysta arkiverade vävnader för att erhålla preliminära uppgifter för bidragsansökningar. Att analysera enzym aktiviteter av superkomplexes utfördes inte i denna studie; Protokoll finns dock tillgängliga för att utföra sådana analyser8.
Med hjälp av de metoder som beskrivs i detta papper analyserades enskilda ETC-komplex och superkomplex av mitokondrier-berikade preparat som erhållits från hjärtvävnaden hos avkomman av suggor. Avkommor födda till motionerade suggor presenterade låga nivåer av ETC under de första 6 månaderna av sitt liv och så småningom planade upp med 9 månader.
| ETC-komplex | 48 h | 3 månader | 6 månader | 9 månader |
| Komplex-I | ↓ | ↓ | ↓ | Ingen ändring |
| Komplex-II | ↓ | ↓ | Ingen ändring | Ingen ändring |
| Komplex-III | ↓ | Ingen ändring | Ingen ändring | ↓ |
| Komplex-IV | ↑ | ↑ | ↑ | Ingen ändring |
| Komplex-V | ↓ | ↓ | ↓ | Ingen ändring |
Tabell 2: Profil för mitokondriell elektrontransportkedja. Tabellen sammanfattar profilen för mitokondriella ETC-komplexa nivåer i den utövade gruppen suggor. Alla komplex, utom Complex-IV, visade ett minskande mönster över åldersgrupperna.
Denna iakttagelse kan tyda på att avkommor födda till de tränade suggorna under graviditeten indikerade färre men effektivare ETC-komplex i deras hjärtvävnad mitokondrier (figur 4). Superkomplex bildas dock i 9 månader utövade gruppen har visat sig vara förhöjda. Motion kan på något sätt påverka omorganisering av superkomplexer under förhållanden med ökad energiefterfrågan12. Dessutom har Complex-V (ATP syntas) uppvisat en låg profil under de första 6 månaderna efter födseln. Detta svar kan bero på sannolikheten för epigenetiskt modifierade ETC proteinkomplex. Den lilla urvalsstorleken (n = 4) för denna studie var inte tillräcklig för att komma fram till en sådan slutsats. mönster av låga ETC komplexa proteinnivåer, hög komplex I-II aktivitet och förhöjda superkomplex bildas kan dock föreslå att bioenergetik i hjärtat vävnad av avkomman av utövade suggor påverkas av motion. Färre men mer effektivt fungerande mitokondriella ETC-komplex och bildandet av ökade superkomplex är intressanta fenomen som ska undersökas. Detta projekt pågår fortfarande.
Sammanfattningsvis ger detta protokoll enkel och enkel mitokondriberikad provberedning från tidigare frusen arkiverad hjärtvävnad. Mitokondriella ETC-komplex kan analyseras genom standardimmunblåsning med multiplexerade antikroppscocktails. BN-PAGE följt av immunoblotting kan analysera förekomsten av superkomplex. Denna förberedelse kan också göra det möjligt för användare att bedöma mitokondriella ETC komplexa aktiviteter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes ekonomiskt av Kansas City Universitys intramurala anslag för Abdulbaki Agbas och Summer Research Fellowship för Daniel Barrera. Författarna är tacksamma för Dr. Jan Talleys redaktionella arbete.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amino caproic acid | Sigma/Aldrich | A2504-100G | |
| Anti-Hu Total OxPhos complex kit | Invitrogen | 458199 | |
| anti-VDAC antibody | abcam | ab15895 | use 1 µg/mL |
| Coomassie G-250 | ThermoSientific | 20279 | |
| Coomassie GelCode Blue | ThermoScientific | 24592 | |
| Digitonin | Cabiochem | 300410 | |
| Glass-Glass pestle homogenizer | VWR | KT885451-0020 | |
| Image Studio | LICOR | ||
| IR-Dye conjugated anti-Rabbit Ab | LICOR | LC0725 | |
| Multiwell plate reader | BioTek | Synergy HT | |
| Native molecular weight marker | ThermoFisher | BN2001 | |
| Nylon mesh monofilament | Small Part Inc | CMN-74 | |
| Orbital shaker | ThermoScientfic | ||
| PCT Shredder | Pressure Bioscience Inc | ||
| SEA BLOCK Blocking buffer | ThermoScienctific | 37527 | |
| Shredder PULSE Tube | Pressure Bioscience Inc | FT500-PS | |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5418 | |
| Trypsin | Amresco | M150-1G | |
| Trypsin inhibitor | Amresco | M191-1G | Requires fresh preparation |
References
- Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Analytical Biochemistry. 418 (2), 213-223 (2011).
- Osto, C., et al. Measuring mitochondrial respiration in previously frozen biological samples. Current Protocols in Cell Biology. 89 (1), 116 (2020).
- Agbas, A., et al. Mitochondrial electron transfer cascade enzyme activity assessment in cultured neurons and select brain regions. Current Protocols in Toxicology. 80, 73 (2019).
- Hathaway, Q. A., et al. Maternal-engineered nanomaterial exposure disrupts progeny cardiac function and bioenergetics. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 312 (3), 446-458 (2017).
- May, L. E., et al. Influence of maternal aerobic exercise during pregnancy on fetal cardiac function and outflow. American Journal of Obstetrics & Gynecology MFM. 2 (2), 100095 (2020).
- Ehler, W. J., et al. Avoidance of malignant hyperthermia in a porcine model for experimental open heart surgery. Laboratory Animal Science. 35 (2), 172-175 (1985).
- Panov, A. V., et al. Effect of bovine serum albumin on mitochondrial respiration in the brain and liver of mice and rats. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 149 (2), 187-190 (2010).
- Jha, P., Wang, X., Auwerx, J. Analysis of mitochondrial respiratory chain supercomplexes using blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Current Protocols in Mouse Biology. 6 (1), 1-14 (2016).
- Pressure Biosciences Inc. Isolation of Functional Mitochondria from Whole Rat Heart Using a PBI Shredder and Pressure Cycling Technology (PCT). , South Easton, MA. (2010).
- McLaughlin, K. L., et al. Novel approach to quantify mitochondrial content and intrinsic bioenergetic efficiency across organs. Scientific Reports. 10 (1), 17599 (2020).
- Hom, J., Sheu, S. S. Morphological dynamics of mitochondria--a special emphasis on cardiac muscle cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46 (6), 811-820 (2009).
- Greggio, C., et al. Enhanced respiratory chain supercomplex formation in response to exercise in human skeletal muscle. Cell Metabolism. 25 (2), 301-311 (2017).
