Summary
La preparazione di campioni arricchiti di mitocondri da tessuti solidi archiviati precedentemente congelati ha permesso ai ricercatori di eseguire valutazioni sia funzionali che analitiche dei mitocondri in varie modalità sperimentali. Questo studio dimostra come preparare preparati arricchiti con mitocondri dal tessuto cardiaco congelato ed eseguire valutazioni analitiche dei mitocondri.
Abstract
Il profilo del complesso di trasferimento di elettroni mitocondriale (ETC) è modificato nel tessuto cardiaco della prole nata da una scrofa esercitata. L'ipotesi proposta e testata era che un regolare esercizio materno di una scrofa durante la gravidanza avrebbe aumentato l'efficienza mitocondriale della bioenergetica cardiaca della prole. Questa ipotesi è stata testata isolando i mitocondri utilizzando una procedura di isolamento lieve per valutare l'ETC mitocondriale e i profili supercomplessi. La procedura qui descritta ha permesso l'elaborazione di tessuti cardiaci archiviati precedentemente congelati ed ha eliminato la necessità di una preparazione di mitocondri freschi per la valutazione di complessi ETC mitocondriali, supercomplessi e profili di attività complessi ETC. Questo protocollo descrive la misurazione ottimale del complesso proteico ETC nell'immunoblotting a base di anticorpi multiplexati e nella valutazione super complessa utilizzando l'elettroforesi su gel blu-nativa.
Introduction
L'obiettivo di questo protocollo era quello di fornire passaggi dettagliati per ottenere una preparazione arricchita con mitocondri da tessuto cardiaco precedentemente congelato con una nuova tecnologia di interruzione meccanica a bassa energia del tessuto che migliora la lisi tissutale e l'estrazione dei mitocondri. Con questo metodo, è possibile migliorare l'efficienza di estrazione senza generare elevate sollecitazioni di taglio o alte temperature e tempi di omogeneizzazione brevi (10-12 s)12 s1.
Ottenere mitocondri da tessuti congelati archiviati è una risorsa preziosa per eseguire studi sia funzionali2 che biochimici3 altrimenti non facilmente ripetibili nelle esatte condizioni sperimentali. Un classico omogeneizzatore di vetro per pestelli Potter-Elvehjem Teflon o omogeneizzatore Dounce è stato utilizzato ed è ancora utilizzato nei laboratori di ricerca per omogeneizzare i tessuti molli come fegato, reni e cervello. Tuttavia, l'omogeneizzazione dei tessuti duri come muscoli e cuore richiede più tempo di omogeneizzazione, trattamento enzimatico, omogeneizzazione ad alta velocità e ampia esperienza utente. Questo è svantaggioso per l'estrazione di organelli intatti come i mitocondri da tessuti duri come muscoli e cuore. Il metodo descritto in questo protocollo viene utilizzato per ottenere una preparazione arricchita con mitocondri ad alto rendimento per analizzare i complessi proteici della catena di trasporto degli elettroni mitocondriali (ETC) e la loro formazione di supercomplessi nei tessuti cardiaci raccolti dalla prole nati da scrofe esercitate e sedentarie, congelati in azoto liquido e conservati a -80 ° C per un uso futuro. Questo metodo consente all'utente di isolare la preparazione arricchita con mitocondri da tessuti archiviati precedentemente congelati.
L'esposizione di nanomateriali esterni a roditori gravidi può influenzare negativamente la funzione cardiaca e la respirazione mitocondriale e la bioenergetica sulla progenie durante la gestazione4. Tuttavia, i cambiamenti positivi indotti dall'esercizio aerobico nella bioenergetica dei miociti fetali durante la gravidanza devono ancora essere documentati. Tuttavia, studi emergenti forniscono la prova che l'esercizio aerobico materno durante la gravidanza ha un'influenza positiva sulla funzione cardiaca fetale5. Al fine di fornire ulteriori prove, è stata eseguita un'analisi degli effetti longitudinali dell'esercizio materno sui complessi della catena respiratoria mitocondriale cardiaca della prole (cioè dal complesso I al complesso V) durante la gravidanza.
Questo studio ha una significativa rilevanza per la salute poiché i risultati possono suggerire che l'esercizio materno migliora l'efficienza della produzione di energia nei mitocondri cardiaci della prole. In questo studio, le scrofe (suine femmine) sono state utilizzate come modello animale per due motivi: (i) la fisiologia cardiaca è simile a quella umana6 e (ii) la raccolta di tessuto cardiaco dalla prole da diversi punti temporali è fattibile sotto un'approvazione istituzionale IACUC. Lo studio proposto mira a rispondere a molte delle domande fondamentali che collegano l'esercizio materno e i suoi potenziali effetti positivi sulla composizione cellulare e biochimica del tessuto cardiaco della prole. Questo approccio richiede tecniche di isolamento dei mitocondri delicati ma efficaci da tessuto cardiaco precedentemente congelato ottenuto da lunghi e costosi studi longitudinali che hanno affrontato i problemi dei cambiamenti bioenergetici all'interno dei miociti cardiaci fetali durante la gravidanza. Il metodo descritto in questo studio consente di utilizzare grandi somme di tessuto archiviato precedentemente congelato per la preparazione arricchita di mitocondri sia per studi analitici che funzionali. Lo studio contribuirà anche a colmare il divario di conoscenze in questo campo fornendo dati preliminari, che potrebbero portare a studi futuri che determinano gli effetti dell'esercizio materno sulla salute del cuore in utero e oltre.
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Protocol
I tessuti cardiaci congelati della prole sono stati ricevuti dal Dr. Sean Newcomer insieme alla lettera di approvazione istituzionale IACUC. I tessuti cardiaci sono stati ottenuti da uno studio longitudinale a lungo termine, congelati in azoto liquido e conservati a -80 °C per un uso futuro. Tutti i protocolli riguardanti l'elaborazione del tessuto cardiaco della prole hanno seguito le linee guida dei comitati IBC e IACUC della Kansas City University.
1. Preparazione di tamponi e reagenti
NOTA: preparare tutti i campioni secondo le linee guida del produttore. Utilizzare acqua ultra-purificata o equivalente in tutte le ricette e le fasi del protocollo. Indossare dispositivi di protezione individuale (gloats da laboratorio, maschera facciale, guanti e occhiali / visiera) durante questa procedura. I volumi tampone sono adatti per l'elaborazione di sei campioni di tessuto.
- Preparare il tampone di lavaggio del tessuto da 1,5 L combinando 154,035 g di saccarosio (0,3 M finale), 3,904 g di HEPES (10 mM finale), 0,111 g di EDTA (0,2 mM finale). Aggiungere gli ingredienti a 1,0 L di acqua mentre si è sulla piastra di agitazione, regolare il pH a 7,2 con HCl diluito e truccare il volume finale a 1,5 L.
NOTA: sono necessari circa 200 ml di tampone di lavaggio per campione (50-300 mg). Sei campioni di tessuto possono essere elaborati in un giorno. Utilizzare il buffer di lavaggio rimanente per creare un buffer di isolamento. - Preparare il tampone di isolamento dal tampone di lavaggio precedentemente descritto nel passaggio 1.1 aggiungendo 210 mg di BSA in 210 ml di tampone di lavaggio. Regolare il pH a 7,4 con la soluzione naOH diluita.
NOTA: sono necessari circa 35 mL di tampone di isolamento per campione di tessuto; pertanto, sono necessari 210 ml di tampone di isolamento per sei campioni. Preparare questo tampone aggiungendo una soluzione fresca di BSA (1 mg/ml finale) il giorno della preparazione. BSA è usato per isolare i mitocondri in quanto migliora le proprietà mitocondriali rimuovendo gli sgangheratori naturali come gli acidi grassi liberi. È stato scoperto che la BSA ha attività antiossidante aumentando il tasso di ossidazione dei substrati, in particolare il succinato, nei mitocondri cerebrali7. In alternativa, l'albumina sierica bovina può essere sostituita da analoghi privi di acidi meno costosi come l'ovalbumina. - Preparare 150 mL di tampone di risospensione combinando 0,011 g di EDTA (concentrazione finale di 0,2 mM edTA o utilizzare 150 μL di 200 mM di soluzione edTA madre per 150 mL di tampone di risospensione), 12,836 g di saccarosio (concentrazione finale di saccarosio 0,25 M) e 0,236 g di Tris (10 mM Tris-HCl finale). Regolare il pH a 7,8 con 0,1 N NaOH. Aggiungere 60 μL del cocktail inibitore della proteasi appena prima dell'uso.
- Preparare la soluzione di tripsina sciogliendo 7,5 mg di tripsina in 3,0 mL di 1 mM HCl (2,5 mg di tripsina/mL finale). Questa quantità è sufficiente per un campione.
NOTA: Preparare la soluzione di tripsina in base al numero di campioni di tessuto che si prevede di elaborare. - Preparare la soluzione di inibitore della tripsina dalla soia combinando 13,0 mg di inibitore della tripsina in 20 ml di tampone di isolamento contenente BSA (0,65 mg/mL di inibitore della tripsina finale).
NOTA: Preparare una soluzione fresca di inibitore della tripsina. - Preparare il reagente persolfato di ammonio aggiungendo 0,1 g di persolfato di ammonio in 1 mL di acqua (10% di persolfato di ammonio finale).
NOTA: il reagente di persolfato di ammonio deve essere preparato al momento o un grande volume può essere aliquotato e conservato in un congelatore a -20 °C. - Preparare la soluzione di acido aminocaproico (ACA) combinando 0,131 g di acido 6-amminocaproico in 1,0 ml di acqua ultrapurificata e conservarla a 4 °C (1 M acido 6-aminocaproico finale).
- Preparare la soluzione di colorante blu brillante Coomassie sciogliendo 1 g di Coomassie G-250 in 0,5 mL di acqua e 0,5 mL di acido aminocaproico 1 M (concentrazione finale della soluzione colorante al 10%).
- Preparare il 5% di Digitonina per Blue native-PAGE (BN-PAGE). Calcolare approssimativamente la quantità di digitonina necessaria nella preparazione del campione più un volume extra per compensare gli errori di pipettaggio (sovrastimare di 10 mg). Per 15 mg: In primo luogo, diluire 15 mg di digitonina in 30 μL di DMSO al 100%. Vortice per aiutare la digitonina ad entrare nella soluzione. Quindi, aggiungere il restante 90% di ddH2O (270 μL). Riscaldare delicatamente per mescolare la soluzione (vortice), quindi raffreddarla sul ghiaccio.
- Preparare il buffer anodico PAGE nativo. Aggiungere 50 mL di buffer di corsa PAGE nativo 20x a 950 mL di acqua per ottenere un volume finale di 1 L. Preparare un buffer anodico fresco per l'uso immediato. Usalo come buffer in esecuzione 1x.
- Preparare un tampone catodico blu scuro. Sciogliere 0,0160 g di Coomassie blu brillante G-250 in 80 mL di tampone anodico PAGE nativo; mescolare bene.
NOTA: Preparare un tampone catodico fresco per un uso immediato. Possono essere necessari solo 60 ml, ma fare un extra di 20 ml in caso di perdite. - Preparare il tampone catodico azzurro. Aggiungere 20 mL di tampone catodico blu scuro in 180 mL di buffer anodico PAGE nativo e mescolare bene.
NOTA: questo buffer può essere utilizzato una sola volta. - Preparare il 5% di Coomassie G-250 come additivo campione. Diluire 200 μL del 10% di stock di Coomassie già prodotto (fase 1.8) con 200 μL di 1 M ACA e conservare a 4 °C.
- Preparare 4 volte il tampone campione PAGE nativo combinando il 40% di glicerolo, lo 0,04% di Ponceau S, 25 mM di Tris-HCl (pH 6,8), 192 mM di glicina in 10 ml di volume finale. Aliquotarli e conservarli a -20 °C nel congelatore.
2. Isolamento dei mitocondri dal tessuto cardiaco congelato
NOTA: Eseguire la procedura di isolamento dei mitocondri in una cella frigorifera a 4 °C. Tuttavia, in caso di indisponibilità della cella frigorifera, utilizzare un bagno di ghiaccio di grandi dimensioni per eseguire la procedura.
- Prelevare campioni di tessuto cardiaco precedentemente congelati dal congelatore a -80 °C.
NOTA: Un massimo di quattro campioni di tessuto possono essere comodamente elaborati per l'isolamento dei mitocondri in un dato giorno. - Pesare il tubo contenente il campione di tessuto cardiaco e registrare il peso. Preparare tre bicchieri (ciascuno da 50 ml) contenenti 40 ml di tampone di lavaggio. Raffreddare ogni becher nel bagno di sale ghiacciato con uguali quantità di ghiaccio e sale mescolati per 3-5 minuti prima di procedere al passaggio successivo. Mettere le barre magnetiche in ogni becher e impostare l'agitatore per una velocità media.
NOTA: non congelare eccessivamente i bicchieri e usarli immediatamente dopo che iniziano ad apparire nuvole di cristalli di ghiaccio. - Mettere il tessuto cardiaco congelato direttamente nella soluzione ghiacciata nel primo becher. Attendere circa 5 minuti mescolando e applicando una leggera pressione sul tessuto usando una pinzetta per estrarre più sangue possibile.
- Pesare il tubo vuoto e sottrarre dal peso originale (passo 2.2) per ottenere un peso netto del tessuto cardiaco.
- Togliere il fazzoletto con una pinza e spremere il cuore con un tovagliolo di carta da filtro pulito per rimuovere il sangue. Quindi, posizionare il tessuto nel secondo becher. Attendere circa 5 minuti mescolando per rimuovere il sangue in eccesso.
- Asciugare delicatamente il fazzoletto su un tovagliolo di carta. Rimuovere tutto il grasso, il sangue coagulato, i padiglioni auricolari e le fasce (tessuto bianco). Quindi, raggruppare il tessuto ventricolare.
- Triturare i campioni di tessuto utilizzando il trituratore seguendo i passaggi 2.7.1-2.7.9.
- Posizionare il tessuto cardiaco (~ 50-300 mg) nella camera del trituratore di tessuti dal lato dell'ariete.
Figura 1: Camera di triturazione dei tessuti (tubo) da utilizzare con il trituratore. L'omogeneizzazione dei tessuti nel tubo del trituratore richiede circa 10-12 s per campione di tessuto. L'omogeneizzazione dei tessuti viene completata una volta che il tessuto omogeneizzato passa attraverso il disco perforato nella camera superiore. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Aggiungere ~ 0,2-0,8 ml di tampone di lavaggio sul lato del cappuccio del tubo.
NOTA: Assicurarsi che il volume totale del campione e del tampone di lavaggio combinati durante la triturazione non superi 0,7-0,8 ml. - Utilizzare lo strumento tubo per tappare la camera di triturazione con il cappuccio del trituratore in modo aderente.
NOTA: non stringere eccessivamente il tappo del trituratore. - Posizionare la camera del trituratore nell'unità portatritura con il lato dell'ariete verso il basso. L'ariete innesterà un raccordo nel supporto del trituratore.
- Inserire la parte del driver del trituratore; lasciare che il bit si impegni con il cappuccio del trituratore. Assicurati che il bit sia perfettamente bloccato in posizione.
NOTA: utilizzare sempre il driver del trituratore completamente carico. - Applicare manualmente la pressione verso il basso sul driver del trituratore e sulla camera del trituratore fino a quando l'indicatore di pressione sul supporto del trituratore raggiunge un'impostazione di circa 2 sul supporto del trituratore.
NOTA: l'impostazione può essere a un livello superiore se il tessuto di triturazione è più fibroso. - Eseguire il driver del trituratore per circa 10-12 s premendo il grilletto del driver del trituratore, mantenendo l'impostazione a 2.
- Guarda il tubo per verificare se tutta o la maggior parte della massa solida del tessuto viene triturata attraverso il disco di lisi e passata nella camera superiore della camera di triturazione guardando il tubo.
NOTA: Potrebbe essere necessario triturare il campione di tessuto per un periodo più lungo. Basta restituire il tubo al supporto del trituratore e continuare il processo. La maggior parte dei tipi di campioni di tessuto richiede solo 10-12 s di triturazione. Mentre tutta la triturazione produrrà un po 'di calore a causa dell'attrito, questo breve tempo di elaborazione non riscalderà in modo significativo il campione. - Dopo aver triturato il campione, sollevare la camera di triturazione dall'unità portante. Utilizzare lo strumento tubo per rimuovere il tappo del trituratore e posizionarlo su una superficie pulita per un uso successivo.
NOTA: il tappo del trituratore deve essere considerato contaminato con estratto del campione e, a seconda del tipo di campione, può essere contaminato da materiali infettivi. Non utilizzare lo stesso tappo trituratore per altri campioni di tessuto per prevenire la contaminazione incrociata.
- Trasferire il tessuto cardiaco triturato nel terzo becher con 40 ml di tampone di lavaggio e mescolare la barra e mescolare il tessuto per 5 minuti a una velocità media mentre si è sulla piastra di agitazione.
- Filtrare la sospensione attraverso un monofilamento in rete di nylon (dimensione dei pori di 74 μm) ed eliminare il filtrato. Lavare il tessuto triturato sul filtro 3x con 10 ml di tampone di lavaggio.
NOTA: Assicurarsi che il monofilamento in rete di nylon sia pre-bagnato con acqua. - Trasferire il tessuto lavato e triturato in un becher da 50 ml con 20 ml di tampone di lavaggio e posizionare il becher nel bagno di ghiaccio sull'agitatore magnetico. Aggiungere 0,5 ml di soluzione di tripsina mescolando costantemente per 15 minuti. Circa a metà dell'incubazione (a circa 7,5 minuti), trasferire la sospensione tissutale in un omogeneizzatore portatile vetro su vetro liberamente montato che manterrà 0-15 ml di volume.
Figura 1: Camera di triturazione dei tessuti (tubo) da utilizzare con il trituratore. L'omogeneizzazione dei tessuti nel tubo del trituratore richiede circa 10-12 s per campione di tessuto. L'omogeneizzazione dei tessuti viene completata una volta che il tessuto omogeneizzato passa attraverso il disco perforato nella camera superiore. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Omogeneizzare delicatamente con 4-5 colpi per disperdere la sospensione senza produrre schiuma. Introdurre l'omogeneizzato in un becher da 50 ml e mescolare delicatamente su una piastra di agitazione per 15 minuti a 4 °C.
- Dopo 15 minuti di incubazione, aggiungere 10 ml del tampone di isolamento che contiene l'inibitore della tripsina nel becher contenente l'omogeneizzato e incubare per 1 minuto a 4 °C mescolando delicatamente.
- Filtrare nuovamente la sospensione attraverso un filtro in nylon e salvare il filtrato in un tubo conico da 50 ml.
- Raccogliere la frazione di particolato rimasta sul filtro in nylon e posizionarla nell'omogeneizzatore vetro su vetro. Aggiungere 15-20 ml del tampone di lavaggio e omogeneizzare delicatamente a mano per 25-30 s.
NOTA: il filtrato scorre molto lentamente in questa fase. Per aumentare il flusso del filtrato, posizionare la punta dell'imbuto toccando l'interno del tubo conico. - Unire l'omogeneizzato con il filtrato, bilanciare i tubi e centrifugare a 600 x g per 15 minuti a 4 °C.
- Filtrare il surnatante risultante in un nuovo tubo conico utilizzando un filtro in nylon per evitare la contaminazione da parte del pellet. Eseguire nuovamente la centrifuga a 8.500 x g per 15 minuti a 4 °C.
NOTA: utilizzare una pipetta di trasferimento in plastica per rimuovere il surnatante e sacrificare 0,2 ml di surnatante dalla parte superiore del pellet soffice. - Scartare il surnatante e risciacquare il pellet 2-3 volte con 1 mL del tampone di isolamento. Assicurati di scartare ogni volta il soffice strato bianco del bordo esterno.
NOTA: Lavare il pellet aggiungendo il tampone di isolamento utilizzando una pipetta con punta da 1 mL o una nuova pipetta di trasferimento. Aggiungere il tampone sul lato del tubo, non direttamente sopra il pellet, per evitare la rottura del pellet e prevenire la contaminazione del surnatante. Quindi, aspirare il buffer con una pipetta di trasferimento e ripetere il processo altre due volte. - Aggiungere 5 mL del tampone di isolamento a ciascun tubo e rompere il pellet utilizzando una pipetta con una punta da 1 mL o una nuova pipetta di trasferimento.
- Diluire la sospensione con 20 mL di tampone di isolamento aggiuntivo e far funzionare nuovamente la centrifuga a 8.500 x g per 15 minuti a 4 °C.
- Scartare il surnatante e risospesciare il pellet in 5 mL del tampone di risospensione. Quindi, aggiungere 15 mL in più del tampone per un totale di 20 mL e centrifugare a 8.500 x g per 15 min. a 4 °C. Scartare il surnatante. Il pellet marrone risultante contiene mitocondri intatti lavati.
- Risospesso il pellet arricchito con mitocondri in 250 μL del tampone di risospensione, compresi gli inibitori della proteasi. Aliquota in 25 μL, congelamento rapido in azoto liquido e conservazione in un congelatore a -80 °C per diversi anni.
NOTA: 5 μL di preparazione arricchita con mitocondri per il saggio di analisi delle proteine. Per uno studio BN-PAGE (Blue native-PAGE), aliquotare il pellet risospeso in 50 μg di proteina mitocondriale per tubo. Centrifugare a 8.500 x g per 15 min a 4 °C. Aspirare accuratamente il surnatante e conservare il pellet mitocondriale (50 μg di proteina/aliquota) in un congelatore a -80 °C per diversi anni.
3. Valutazione del complesso di trasferimento di elettroni mitocondriale (ETC)
NOTA: Le singole proteine ETC mitocondriali (cioè Complex-I, II, III, IV, V) possono essere valutate mediante test immunoblotting standard. A causa della varietà di campioni (quattro punti temporali: 48 ore, 3 mesi, 6 mesi, 9 mesi), due condizioni sperimentali (esercitate e sedentarie) e un numero di anticorpi immunoprobanti (cinque anticorpi), si raccomanda un immunoblotting multiplexato. Eseguire l'immunoblotting multiplexed come segue.
- Risolvere 50 μg di campione/pozzetto proteico arricchito con mitocondri in elettroforesi su gel di poliacrilammide a gradiente 4%-20% (100 V, 90 min).
- Trasferire le proteine su una membrana PVDF (75 V; 60 min)
- Bloccare la membrana in una soluzione tampone bloccante per un minimo di 1 ora a 4 °C.
NOTA: il tempo di blocco può essere esteso fino a una notte a 4 °C. Il tampone bloccante (Table of Materials) contiene ingredienti non di mammifero (cioè proteine di pesce) che hanno meno probabilità di avere interazioni di legame specifiche con anticorpi e altre proteine di mammiferi presenti in metodi tipici. - Sondare la membrana con il cocktail di anticorpi inclusi gli anticorpi anti-Complex-I, II, III, IV, V e incubare durante la notte su uno shaker orbitale a 4 °C.
- Il giorno successivo, lavare la membrana e la sonda con anticorpo secondario con marcatura IR per 2 ore su uno shaker orbitale a RT (temperatura ambiente).
- Lavare cinque volte con 1x TBS-T (TBS contenente Tween 20) e una volta con 1x TBS (Tris buffered saline).
NOTA: per l'ultimo lavaggio, non includere il detergente nel tampone TBS. - Immagine della macchia in un analizzatore di immagini.
4. La valutazione del supercomplesso dei mitocondri mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide nativo blu (BN-PAGE)
NOTA: Un profilo supercomplesso di ETC può anche essere valutato utilizzando la tecnica BN-PAGE.
- Preparare il cocktail tampone campione per 20 μL per 50 μg di proteine del pellet arricchite con mitocondri (7 μL di acqua + 5 μL di 4x tampone di carico del campione di elettroforesi in poliacrilammide in poliacrilammide nativo + 8 μL di 5% Digitonina + 2 μL di Coomassie G-250).
NOTA: Preparare un cocktail tampone campione di stock a seconda del numero di campioni disponibili (50 μg di proteine/campioni). Scegliere le quantità appropriate di digitonina in base alla concentrazione proteica del pellet arricchito con mitocondri (Tabella 1)8. - Riscaldare il brodo di digitonina a 95 °C per 3 minuti, mescolare e raffreddare sul ghiaccio prima di fare il mix principale.
- Aggiungere l'additivo campione Coomassie G-250 appena prima di caricare i campioni nel gel.
- Aggiungere 20 μL del cocktail tampone campione in un tubo contenente 50 μg di pellet proteico mitocondriale. Solubilizzare/risospesciare il pellet mescolando delicatamente il pellet con una pipetta senza generare schiuma.
- Incubare la miscela su ghiaccio per 20 minuti per ottenere la massima solubilizzazione del pellet arricchito con mitocondri. Di tanto in tanto, far scorrere delicatamente i tubi per migliorare la solubilizzazione.
- In attesa dell'incubazione, preparare il buffer anodico PAGE nativo/1x running buffer e il buffer catodico di colore blu scuro.
- Centrifugare il pellet solubilizzato arricchito con mitocondri a 20.000 x g per 10 min a 4 °C.
- Dopo la centrifugazione, raccogliere 15 μL del surnatante in nuovi tubi posti sul ghiaccio.
- Aggiungere la quantità appropriata del reagente Coomassie G-250 al 5% al surnatante ottenuto nel passaggio 4.8 (fare riferimento alla Tabella 1).
NOTA: Il volume di Coomassie G-250 del 5% deve essere tale che la concentrazione finale del colorante sia 1/4 della concentrazione del detergente. Eseguire questo passaggio appena prima di caricare i campioni nel gel.
| Proteina | Digitonina/proteina | 4x Buffer di esempio | 5% Digitonina | Acqua | Volume finale | 5% Coomassie G-250 |
| rapporto (g/g) | additivo campione | |||||
| 50 μg | 8 | 5 | 8 | 7 | 20 | 2 |
| 50 μg | 4 | 5 | 4 | 11 | 20 | 1 |
Tabella 1: Preparazione del cocktail tampone campione con due diversi rapporti detergente/proteine. Per ottenere la massima solubilizzazione delle proteine di membrana dalla sospensione mitocondriale, la concentrazione di proteina digitonina/sospensione mitocondriale deve essere regolata tra 4-8 g di digitonina/g di proteina. Nel tessuto cardiaco, 400 μg di digitonina per 50 μg di proteine in sospensione mitocondriale (cioè 8 g di digitonina/g di proteina mitocondriale) sono stati utilizzati per massimizzare la solubilità dei supercomplessi dalla sospensione dei mitocondri.
- Versare un gel sfumato al 3% -8%, rimuovere il pettine e lavare i pozzetti del gel con 1x buffer in esecuzione tre volte.
NOTA: Il gel polimerizza meglio se versato un giorno prima. - Impostare il sistema di elettroforesi e posizionare il gel nell'apparecchio.
- Riempire i pozzetti del campione con il tampone catodico di colore blu scuro.
- Caricare 10 μL dello standard proteico non macchiato come marcatore di peso molecolare nativo sul primo e ultimo pozzo del gel.
- Caricare l'intera quantità dell'additivo campione surnatante + Coomassie preparato nel passaggio 4.9 sopra nei pozzetti utilizzando una punta di carico del gel a testa piatta.
- Riempire con attenzione la diga tampone mini cella con circa 60 ml di tampone catodico di colore blu scuro senza disturbare i campioni nei pozzetti, quindi riempire il serbatoio tampone con il buffer nativo PAGE 1x in esecuzione.
- Accendere l'alimentazione ed elettroforesi i campioni a 150 V per circa 30 min.
- Rimuovere il tampone catodico di colore blu scuro dalla diga tampone (camera interna) con una pipetta di trasferimento o aspirare i pozzetti del campione. Riempire la camera interna con 150-200 mL di tampone catodico di colore azzurro ed eseguire l'elettroforesi a 250 V per 60 min.
NOTA: Il tempo di elettroforesi può essere determinato controllando quando il fronte del colorante migra a soli 0,5 cm dal fondo della cassetta di gel. - Rimuovere il gel dalla cassetta e metterlo in un contenitore di plastica pulito. Lavare il gel con acqua distillata di buona qualità per 15 minuti su un bilanciere / agitatore orbitale.
NOTA: per rimuovere il gel sfumato dalla cassetta, maneggiare la cassetta dal basso, che è più forte, per ridurre al minimo le possibilità di rottura. - Versare acqua, immergere il gel in una quantità sufficiente di reagente per macchie Coomassie GelCode Blue e incubare per 1 ora su un orbitale / bilanciere a temperatura ambiente.
NOTA: Mescolare la soluzione di reagente Blue stain (Table of Materials) prima dell'uso ruotando delicatamente il flacone più volte. - Decantare la soluzione colorante, aggiungere acqua distillata, risciacquare più volte con acqua e quindi mettere l'orbitale / bilanciere per la decolorazione.
NOTA: Inserire un pezzo di spugna (~ 3 cm x 0,5 cm) nel contenitore di detaining gel e lasciare il gel per la decolorazione durante la notte. La spugna assorbe le particelle di colorante senza richiedere più cambi d'acqua. - Analizzare il gel in un analizzatore di immagini.
5. Valutazione dei supercomplessi dei mitocondri mediante analisi delle macchie immunoblot
- Eseguire un nuovo set di BN-PAGE senza macchiare il gel alla fine dell'elettroforesi.
- Seguire la stessa procedura del paragrafo 3 (valutazione del complesso di trasferimento di elettroni mitocondriale (ETC)) per completare l'immunoblotting.
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Representative Results
Seguendo il protocollo, è stata preparata una buona resa di miscela proteica arricchita con mitocondri dal tessuto cardiaco. Circa 15 mg/mL di miscela proteica arricchita con mitocondri sono stati ottenuti da una media di 1,2 g di tessuto cardiaco congelato raccolto dalla prole della scrofa. Le osservazioni hanno indicato che meno di 0,5 g di tessuto cardiaco congelato non producevano una quantità sufficiente di miscela proteica arricchita con mitocondriale per effettuare un test BN-PAGE. La quantità di preparazione mitocondriale è stata sufficiente per eseguire (i) un'analisi immunoblot standard per valutare i singoli complessi di trasferimento di elettroni (ETC) (cioè Complex-I, II, III, IV e Complex-V), (ii) una valutazione del supercomplesso mitocondriale mediante analisi BN-PAGE e immunoblot e (iii) saggi enzimatici limitati per il complesso selezionato. Il cocktail di anticorpi sollevati contro singoli complessi proteici ETC fornisce la fattibilità tecnica che ogni anticorpo riconoscerà la propria proteina bersaglio in un singolo test immunoblot.
La proteina arricchita con mitocondri è stata preparata dal ventricolo sinistro del cuore, ottenuta dalla prole della scrofa. La prole è nata da due gruppi di scrofe: (1) un gruppo è stato esercitato durante la gravidanza e (2) un gruppo era sedentario. I tessuti cardiaci di entrambi i gruppi sono stati raccolti in diversi punti temporali dopo la nascita (48 ore, 3 mesi, 6 mesi e 9 mesi). Se l'esercizio materno ha un impatto positivo sull'ETC mitocondriale della prole durante la gestazione è stata l'ipotesi che è stata testata in questo studio. Quattro tessuti cardiaci sono stati comodamente elaborati in un dato giorno a causa del lungo processo di isolamento arricchito con mitocondri.
Figura 2: Profilo immunoblot dei complessi ETC mitocondriali dal tessuto cardiaco della prole. La miscela proteica arricchita con mitocondriale è stata risolta in un gel gradiente del 4%-20% in condizioni di riduzione. Le proteine sono state immunoprodotte da un cocktail di anticorpi commerciali e l'anticorpo anti-VDAC è stato utilizzato per il controllo del carico (banda di colore rosso). Il cocktail di anticorpi è stato generato contro il cuore bovino Complex-I (antigene NDUFB8), il cuore bovino Complex-II (antigene C-II30 (FeS), il cuore bovino Complex II, III (antigene C-III-Core 2), umano Complex IV, subunità II (antigene C-IV-II) e cuore bovino Complex-V (antigene C-V-α). L'anticorpo secondario è stato etichettato con un tag a infrarossi e l'immagine è stata analizzata utilizzando un software di analisi delle immagini. I profili complessi individuali tra le fasce d'età sono forniti nella Figura supplementare 1 (A-E). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
La Figura 2 rappresenta un tipico profilo proteico ETC. I cocktail di anticorpi consentivano l'immunoblotting in un formato multiplex. Ogni anticorpo ha riconosciuto la propria proteina bersaglio, fornendo una risoluzione accettabile. Le intensità della banda proteica sono state analizzate digitalmente. I tessuti ottenuti dalla prole della scrofa esercitata presentavano livelli relativamente ridotti in alcuni dei complessi ETC (Figure supplementari 1A-E). La preparazione arricchita con mitocondri deve essere risolta in un gel gradiente (4%-20%) poiché l'immunoprobing è stato eseguito in un formato multiplexing. Questo approccio eliminerà la necessità di eseguire diverse percentuali fisse di gel SDS/PAGE e la variabilità run-to-run.
Le proteine mitocondriali sono state risolte in un gradiente BN-PAGE del 3%-8% (Figura 3A) e immunoprobed con cocktail di anticorpi. Sia nei gruppi esercitati che in quelli sedentari, è stata osservata una formazione multipla di supercomplessi (Figura 3B).
Figura 3: Profilo supercomplesso mitocondriale mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide blu-nativo (BN-PAGE). (A). Le miscele proteiche arricchite con mitocondriale sono state risolte in BN-PAGE al 3%-8% e colorate con un reagente blu di Coomassie (Gel Code, Blue Stain Reagent). (B). Le miscele proteiche arricchite con mitocondriale sono state risolte in un BN-PAGE del 3%-8%, trasferite su una membrana PVDF e immunoprobed con i cocktail anticorpali per i supercomplessi. In entrambi i test, il carico proteico era di 150 μg/pozzetto. Un punto di raccolta dati di 6 mesi non è stato incluso a causa di una resa proteica insufficiente durante la preparazione. L'aumento supercomplesso più importante osservato è stato a 9 mesi nel gruppo esercitato rispetto al gruppo sedentario. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Un diverso formato di gel sfumato (3% -8%) è stato preparato a causa delle grandi dimensioni dei supercomplessi che possono essere risolti in BN-PAGE. La preparazione arricchita con mitocondri descritta in questo protocollo è stata utilizzata per misurare le attività complesse dell'ETC mitocondriale. La Figura 4 rappresenta i dati registrati per la valutazione dell'attività del Complesso I-II. Questo test è stato eseguito secondo il protocollo stabilito3.
Figura 4: Misure di attività complesse I-II. Miscele proteiche arricchite con mitocondri ottenute da diverse fasce di età (48 ore, 3 mesi, 6 mesi e 9 mesi) sono state analizzate per l'attività del Complesso I-II utilizzando un test cinetico. Il gruppo esercitato ha mostrato un aumento dell'attività del Complesso I-II rispetto a quella del gruppo sedentario. La differenza tra i due gruppi non era statisticamente significativa secondo un t-test accoppiato (P > 0,05). Le barre di errore rappresentate nella figura rappresentano l'errore standard della media (SEM) per n = 4. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare 1: (A) Profilo I complesso tra gruppi di età. In generale, la prole nata dalla scrofa esercitata presentava livelli più bassi di Complesso-I rispetto a quello del gruppo sedentario (n = 4). Questo è stato più pronunciato nel gruppo di 9 mesi. (B) Profilo Complex-II tra le fasce d'età. Tutti i gruppi di età hanno mostrato bassi livelli di Complesso-II nel gruppo esercitato ad eccezione della coorte di tre mesi (n = 4). (C) Profilo complesso III tra le fasce d'età. Solo il gruppo di età di 9 mesi ha mostrato livelli più bassi di Complesso-III nel gruppo esercitato rispetto a quello del gruppo sedentario (n = 4). (D) Profilo IV complesso tra gruppi di età. È stato osservato un leggero aumento dei livelli di proteine Complex-IV del gruppo esercitato (n = 4). (E) Il profilo Complex-V (ATP sintasi) in tutte le fasce d'età. Sia i gruppi esercitati che quelli sedentari hanno mostrato bassi livelli di Complex-V tranne che nel punto dati di 48 ore (n = 4). Fare clic qui per scaricare questo file.
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Discussion
I passaggi critici per questo protocollo sono indicati qui. In primo luogo, l'omogeneizzazione dei tessuti deve essere gestita con cura in modo che non vengano applicati effetti eccessivi durante il processo di omogeneizzazione dei tessuti. Dovrebbe essere utilizzato un trituratore di tessuti, che fa parte della tecnologia del ciclo di pressione (PCT) per l'omogeneizzazione iniziale dei tessuti9. Questo passaggio ridurrà l'eccessivo ciclo di corsa dell'omogeneizzatore vetro su vetro (Figura 1B) che potrebbe distruggere ulteriormente i mitocondri già fragili a causa delle condizioni dei tessuti congelati. In secondo luogo, il peso del tessuto congelato sarà importante per ottenere quantità sufficienti della preparazione arricchita con mitocondri. La quantità di tessuto iniziale raccomandata sarà maggiore di 0,8 g, a seconda della fonte del tessuto. Il tessuto cardiaco è molto ricco di mitocondri10,11; pertanto, la quantità raccomandata sarà sufficiente per ottenere una preparazione arricchita con mitocondri. In terzo luogo, tutte le procedure dovrebbero essere eseguite in una stanza fredda. Se una stanza fredda non è disponibile, sarà sufficiente un bagno di ghiaccio di grandi dimensioni.
La fattibilità di ottenere preparati arricchiti con mitocondri da tessuto cardiaco precedentemente congelato è stata dimostrata in questo studio. Questo protocollo sarà essenziale per fornire l'accesso al tessuto congelato archiviato da cui i mitocondri possono essere isolati e da cui possono essere valutati i complessi enzimatici ETC mitocondriali. Uno studio recente ha dimostrato che anche la respirazione mitocondriale da tessuti e cellule precedentemente congelati potrebbe essere misurabile2. A causa di questo progresso, i ricercatori saranno in grado di utilizzare biosampli precedentemente raccolti per ulteriori analisi.
Valutare il profilo dei singoli ETC e supercomplessi è reso più facile eseguendo l'immunoblotting classico in un formato multiplexing che utilizza più anticorpi durante la procedura di immunoblotting sulla stessa membrana PVDH. È fondamentale per l'utente determinare la quantità di proteine da caricare nei gel per SDS-PAGE e BN-PAGE. Il volume di risospensione dovrebbe essere il più minimo possibile al fine di ottenere alte concentrazioni proteiche in modo che l'utente non abbia problemi con il volume di carico del campione. La quantità di proteine da caricare in BN-PAGE dipende dalla resa del preparato arricchito con mitocondri. Una miscela proteica arricchita con mitocondri da 150 μg è stata caricata per pozzetto in BN-PAGE a causa della piccola quantità di tessuto cardiaco originale. La preparazione di pellet arricchita con mitocondri da 50-150 μg sarebbe sufficiente per un gel di 1 mm di spessore. L'utente può preferire un gel di 1,5 mm di spessore per il caricamento del campione; tuttavia, la risoluzione delle bande proteiche potrebbe non essere di qualità accettabile. La minore risospensione proteica mitocondriale per pozzetto non è stata testata perché i cocktail di anticorpi utilizzati nei saggi immunoblot erano predeterminati nella loro concentrazione; tuttavia, gli utenti possono creare il proprio cocktail di anticorpi per aumentare la frequenza del segnale / rumore.
Si raccomanda un gel gradiente completamente polimerizzato (3%-8%) per i gel BN-PAGE. I gel sfumati del 3%-8% non sono stati disponibili in commercio; pertanto, è possibile utilizzare mini gel standard sfumati fatti in casa (3% -8%) (9 x 6 cm). Versare il gel 24 ore prima e consentire al gel di polimerizzare durante la notte in RT fornirà una formazione di gel accettabile. Se un utente ha bisogno di una migliore separazione dei supercomplessi, si consiglia di utilizzare formati di gel più grandi (gel midi 13,5 cm x 6,5 cm o gel lungo 28 cm x 16 cm).
L'applicazione di questo protocollo consentirà ai ricercatori di isolare i mitocondri e analizzare il profilo di ETC e supercomplessi in tessuti archiviati precedentemente congelati. Tutti i biospecimen depositari nazionali e regionali mantengono i biosampli in condizioni di ultragelaggio (cioè -80 °C). Un gran numero di tessuti viene archiviato da istituzioni e aziende farmaceutiche per ulteriori studi e scopi di condivisione dei reagenti. Il National Institute of Health (NIH) impone che tutti i progetti supportati da NIH siano tenuti a condividere i reagenti prodotti dai progetti supportati. Questi biorepository sono fonti molto preziose per ottenere tessuti archiviati congelati per ottenere dati preliminari per le domande di sovvenzione. Per analizzare le attività enzimatiche dei supercomplessi non è stato eseguito in questo studio; tuttavia, sono disponibili protocolli per eseguire tali test8.
Utilizzando i metodi descritti in questo articolo, sono stati analizzati singoli complessi ETC e supercomplessi di preparati arricchiti con mitocondri ottenuti dal tessuto cardiaco della prole delle scrofe. La prole nata da scrofe esercitate ha presentato bassi livelli di ETC durante i primi 6 mesi della loro vita e alla fine è salita di livello di 9 mesi.
| Complesso ETC | 48 ore | 3 mesi | 6 mesi | 9 mesi |
| Complesso-I | ↓ | ↓ | ↓ | Nessun cambiamento |
| Complesso-II | ↓ | ↓ | Nessun cambiamento | Nessun cambiamento |
| Complesso-III | ↓ | Nessun cambiamento | Nessun cambiamento | ↓ |
| Complesso-IV | ↑ | ↑ | ↑ | Nessun cambiamento |
| Complesso-V | ↓ | ↓ | ↓ | Nessun cambiamento |
Tabella 2: Profilo dei complessi proteici della catena di trasporto degli elettroni mitocondriali. La tabella riassume il profilo dei livelli di complesso ETC mitocondriale nel gruppo esercitato di scrofe. Tutti i complessi, ad eccezione del complesso IV, hanno mostrato un modello decrescente tra i gruppi di età.
Questa osservazione può suggerire che la prole nata dalle scrofe esercitate durante la gravidanza ha indicato meno complessi ETC ma più efficienti nei mitocondri del tessuto cardiaco (Figura 4). Tuttavia, la formazione di supercomplessi in 9 mesi di gruppo esercitato è risultata elevata. L'esercizio fisico può in qualche modo influenzare il riarrangiamento dei supercomplessi in condizioni di aumento della domanda di energia12. Inoltre, Complex-V (ATP sintasi) ha mostrato un basso profilo nei primi 6 mesi dopo la nascita. Questa risposta può essere dovuta alla probabilità di complessi proteici ETC epigeneticamente modificati. La piccola dimensione del campione (n = 4) per questo studio non è stata sufficiente per arrivare a tale conclusione; tuttavia, modelli di bassi livelli di proteine complesse ETC, alta attività del complesso I-II e elevata formazione di supercomplessi possono suggerire che la bioenergetica nel tessuto cardiaco della progenie delle scrofe esercitate sia influenzata dall'esercizio fisico. Meno complessi ETC mitocondriali ma più efficienti e la formazione di supercomplessi aumentati sono fenomeni interessanti da studiare. Questo progetto è ancora in corso.
In sintesi, questo protocollo fornisce una preparazione del campione arricchita con mitocondri semplice e diretta da tessuto cardiaco archiviato precedentemente congelato. I complessi ETC mitocondriali possono essere analizzati mediante immunoblotting standard con cocktail di anticorpi multiplexati. BN-PAGE seguito da immunoblotting può analizzare la presenza di supercomplessi. Questa preparazione può anche consentire agli utenti di valutare le attività complesse dell'ETC mitocondriale.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dalla sovvenzione intramurale della Kansas City University per Abdulbaki Agbas e dalla Summer Research Fellowship per Daniel Barrera. Gli autori sono grati per il lavoro editoriale del Dr. Jan Talley.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amino caproic acid | Sigma/Aldrich | A2504-100G | |
| Anti-Hu Total OxPhos complex kit | Invitrogen | 458199 | |
| anti-VDAC antibody | abcam | ab15895 | use 1 µg/mL |
| Coomassie G-250 | ThermoSientific | 20279 | |
| Coomassie GelCode Blue | ThermoScientific | 24592 | |
| Digitonin | Cabiochem | 300410 | |
| Glass-Glass pestle homogenizer | VWR | KT885451-0020 | |
| Image Studio | LICOR | ||
| IR-Dye conjugated anti-Rabbit Ab | LICOR | LC0725 | |
| Multiwell plate reader | BioTek | Synergy HT | |
| Native molecular weight marker | ThermoFisher | BN2001 | |
| Nylon mesh monofilament | Small Part Inc | CMN-74 | |
| Orbital shaker | ThermoScientfic | ||
| PCT Shredder | Pressure Bioscience Inc | ||
| SEA BLOCK Blocking buffer | ThermoScienctific | 37527 | |
| Shredder PULSE Tube | Pressure Bioscience Inc | FT500-PS | |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5418 | |
| Trypsin | Amresco | M150-1G | |
| Trypsin inhibitor | Amresco | M191-1G | Requires fresh preparation |
References
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