Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Измерение митохондриальных комплексов переноса электронов в ранее замороженной сердечной ткани от потомства свиноматки: модель для оценки изменений митохондриальной биоэнергетики, вызванных физической нагрузкой

Published: August 16, 2021 doi: 10.3791/62809
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 7, 7,13
1AdventHelath, 2University of Illinois Chicago School of Public Health, 3Lincoln Memorial University, 4Children’s Mercy Hospital, 5Scripps Clinic, 6Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, 7Kansas City University, 8Roblex Rex Veterans Affairs Medical Center, 9California State University San Marcos, 10East Carolina University, 11Massachusetts Institute of Technology, 12Boehringer Ingelheim Norway KS, 13Heartland Center for Mitochondrial Medicine

Summary

Подготовка образцов, обогащенных митохондриями, из ранее замороженных архивных твердых тканей позволила исследователям выполнить как функциональные, так и аналитические оценки митохондрий в различных экспериментальных модальностях. Это исследование демонстрирует, как готовить обогащенные митохондриями препараты из замороженной сердечной ткани и выполнять аналитические оценки митохондрий.

Abstract

Профиль митохондриального комплекса переноса электронов (ETC) модифицируется в сердечной ткани потомства, рожденного от тренированной свиноматки. Предложенная и проверенная гипотеза заключалась в том, что регулярное материнское упражнение свиноматки во время беременности повысит митохондриальную эффективность биоэнергетики сердца потомства. Эта гипотеза была проверена путем выделения митохондрий с использованием процедуры мягкой изоляции для оценки митохондриальных внеземных и суперкомплексных профилей. Описанная здесь процедура позволила обработать ранее замороженные архивные ткани сердца и исключила необходимость подготовки свежих митохондрий для оценки митохондриальных комплексов внеземных цивилизаций, суперкомплексов и сложных профилей активности внеземных цивилизаций. Этот протокол описывает оптимальное измерение белкового комплекса ETC в мультиплексированном иммуноблоттинге на основе антител и суперсложную оценку с использованием электрофореза синего геля.

Introduction

Цель этого протокола состояла в том, чтобы предоставить подробные шаги для получения обогащенного митохондриями препарата из ранее замороженной сердечной ткани с новой технологией низкоэнергетического механического разрушения ткани, которая улучшает лизис тканей и извлечение митохондрий. При этом методе повышается эффективность экстракции без создания высокого напряжения сдвига или высокой температуры и достигается короткое время гомогенизации (10-12 с)1.

Получение митохондрий из архивной замороженной ткани является ценным активом для выполнения как функциональных2 , так и биохимических исследований3, которые в противном случае нелегко повторить в точных экспериментальных условиях. Классический гомогенизатор стекла Potter-Elvehjem Teflon pestle или гомогенизатор Dounce использовался и до сих пор используется в исследовательских лабораториях для гомогенизации мягких тканей, таких как печень, почки и мозг. Тем не менее, гомогенизация твердых тканей, таких как мышцы и сердце, требует большего времени гомогенизации, ферментной обработки, высокоскоростной гомогенизации и обширного пользовательского опыта. Это невыгодно для извлечения интактных органелл, таких как митохондрии, из твердых тканей, таких как мышцы и сердце. Способ, описанный в этом протоколе, используется для получения высокопродуктивного обогащенного митохондриями препарата для анализа белковых комплексов митохондриальной электронной транспортной цепи (ETC) и их суперкомплексного образования в тканях сердца, собранных от потомства, рожденного от тренируемой и сидячей свиноматки, замороженного в жидком азоте и хранящегося при -80 °C для будущего использования. Этот метод позволяет пользователю изолировать обогащенный митохондриями препарат из ранее замороженных архивных тканей.

Внешнее воздействие наноматериалов на беременных грызунов может негативно повлиять на сердечную функцию и митохондриальное дыхание и биоэнергетику на потомство во время беременности4. Тем не менее, вызванные аэробными упражнениями положительные изменения в биоэнергетике миоцитов плода во время беременности еще предстоит задокументировать. Тем не менее, новые исследования свидетельствуют о том, что материнские аэробные упражнения во время беременности оказывают положительное влияние на сердечную функцию плода5. Чтобы предоставить дополнительные доказательства, был проведен анализ продольного воздействия материнских упражнений на митохондриальные комплексы дыхательной цепи сердца потомства (т.е. комплекс I через комплекс V) во время беременности.

Это исследование имеет важное значение для здоровья, поскольку результаты могут свидетельствовать о том, что материнские физические упражнения улучшают эффективность производства энергии в сердечных митохондриях потомства потомства. В этом исследовании свиноматки (самки свиней) использовались в качестве животной модели по двум причинам: (i) физиология сердца аналогична человеческой6, и (ii) сбор сердечной ткани у потомства из разных временных периодов возможен при институциональном одобрении IACUC. Предлагаемое исследование направлено на то, чтобы ответить на многие фундаментальные вопросы, связывающие материнские физические упражнения и их потенциальное положительное влияние на клеточный и биохимический состав сердечной ткани потомства. Этот подход требует мягких, но эффективных методов выделения митохондрий из ранее замороженной сердечной ткани, полученных в результате длительных и дорогостоящих продольных исследований, которые рассматривали вопросы биоэнергетических изменений в сердечных миоцитах плода во время беременности. Метод, описанный в данном исследовании, позволяет использовать большие суммы ранее замороженной архивной ткани для обогащенной митохондриями подготовки как для аналитических, так и для функциональных исследований. Исследование также поможет заполнить пробел в знаниях в этой области, предоставив предварительные данные, которые могут привести к будущим исследованиям, определяющим влияние материнских упражнений на здоровье сердца в утробе матери и за ее пределами.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Замороженные сердечные ткани потомства были получены от доктора Шона Ньюкомера вместе с письмом об одобрении IACUC. Ткани сердца были получены в результате долгосрочного продольного исследования, заморожены во флеш-фазе в жидком азоте и сохранены при -80 °C для будущего использования. Все протоколы, касающиеся обработки сердечной ткани потомства, соответствовали рекомендациям комитетов IBC Университета Канзас-Сити и IACUC.

1. Подготовка буферов и реагентов

ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте все образцы в соответствии с рекомендациями производителя. Используйте ультраочищенную воду или эквивалент во всех рецептах и шагах протокола. Носите средства индивидуальной защиты (лабораторные перчатки, маски для лица, перчатки и защитные очки / лицевой щиток) во время этой процедуры. Буферные объемы подходят для обработки шести образцов тканей.

  1. Приготовьте 1,5 л промывочного буфера ткани, соединив 154,035 г сахарозы (0,3 М финала), 3,904 г HEPES (10 мМ финала), 0,111 г ЭДТА (0,2 мМ финала). Добавьте ингредиенты в 1,0 л воды, находясь на перемешиваемой пластине, отрегулируйте рН до 7,2 с разбавленным HCl и внесите до окончательного объема до 1,5 л.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На образец необходимо приблизительно 200 мл промывочного буфера (50-300 мг). Шесть образцов тканей могут быть обработаны за день. Используйте оставшийся буфер промывки, чтобы создать буфер изоляции.
  2. Подготовьте изоляционный буфер из промывочного буфера, ранее описанного на этапе 1.1, добавив 210 мг BSA в 210 мл промывочного буфера. Отрегулируйте рН до 7,4 с помощью разбавленного раствора NaOH.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На образец ткани необходимо приблизительно 35 мл изоляционного буфера; поэтому для шести образцов требуется 210 мл изоляционного буфера. Подготовьте этот буфер, добавив свежий раствор BSA (1 мг/мл в день приготовления. BSA используется для выделения митохондрий, поскольку он улучшает митохондриальные свойства, удаляя естественные разъединители, такие как свободные жирные кислоты. Было обнаружено, что BSA обладает антиоксидантной активностью, увеличивая скорость окисления субстратов, особенно сукцината, в митохондриях мозга7. Альтернативно, бычий сывороточный альбумин может быть заменен менее дорогими бескислотными аналогами, такими как овальбумин.
  3. Готовят 150 мл буфера повторной суспензии путем объединения 0,011 г ЭДТА (конечная концентрация 0,2 мМ ЭДТА или используют 150 мкл 200 мМ запаса раствора ЭДТА для 150 мл буфера повторной суспензии), 12,836 г сахарозы (конечная концентрация сахарозы 0,25 М) и 0,236 г Tris (10 мМ Tris-HCl финала). Отрегулируйте pH до 7,8 с 0,1 N NaOH. Добавьте 60 мкл коктейля ингибитора протеазы непосредственно перед использованием.
  4. Готовят раствор трипсина, растворяя 7,5 мг трипсина в 3,0 мл 1 мМ HCl (2,5 мг трипсина/мл финала). Этого количества достаточно для одного образца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте раствор трипсина на основе количества образцов тканей, которые планируется обработать.
  5. Готовят раствор ингибитора трипсина из сои, комбинируя 13,0 мг ингибитора трипсина в 20 мл изоляционного буфера, содержащего BSA (0,65 мг/мл финала ингибитора трипсина).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте свежий раствор ингибитора трипсина.
  6. Готовят реагент персульфата аммония, добавляя 0,1 г персульфата аммония в 1 мл воды (10% персульфата аммония).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Реагент персульфата аммония должен быть либо свежеприготовленным, либо большой объем может быть аликвотирован и храниться в морозильной камере с температурой -20 °C.
  7. Готовят раствор аминокапроновой кислоты (ACA), соединяя 0,131 г 6-аминокапроновой кислоты в 1,0 мл ультраочищенной воды и хранят его при 4 °C (1 M 6-аминокапроновой кислоты).
  8. Готовят раствор красителя Coomassie brilliant blue, растворяя 1 г Coomassie G-250 в 0,5 мл воды и 0,5 мл 1 М аминокапроновой кислоты (конечная концентрация 10% раствора красителя).
  9. Подготовьте 5% Digitonin для Синей нативной СТРАНИЦЫ (BN-PAGE). Приблизительно рассчитайте, сколько дигитонина необходимо в пробоподготовке плюс некоторый дополнительный объем, чтобы компенсировать ошибки дозирования (завышенная оценка на 10 мг). Для 15 мг: Во-первых, развести 15 мг дигитонина в 30 мкл 100% ДМСО. Вихрь, чтобы помочь дигитонину попасть в раствор. Далее добавляют оставшиеся 90% ddH2O (270 мкл). Осторожно нагреть, чтобы перемешать раствор (вихрь), а затем охладить его на льду.
  10. Подготовьте собственный буфер анодов PAGE. Добавьте 50 мл 20-кратного собственного рабочего буфера PAGE в воду объемом 950 мл, чтобы получить конечный объем 1 л. Подготовьте свежий анодный буфер для немедленного использования. Используйте его в качестве 1x работающего буфера.
  11. Подготовьте темно-синий катодный буфер. Растворить 0,0160 г Coomassie бриллиантового синего G-250 в 80 мл нативного анодного буфера PAGE; хорошо перемешать.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте свежий катодный буфер для немедленного использования. Может потребоваться только 60 мл, но сделайте дополнительные 20 мл в случае каких-либо утечек.
  12. Подготовьте светло-синий катодный буфер. Добавьте 20 мл темно-синего катодного буфера в 180 мл собственного анодного буфера PAGE и хорошо перемешайте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот буфер можно использовать только один раз.
  13. Приготовьте 5% Coomassie G-250 в качестве добавки к образцу. Разбавить 200 мкл уже изготовленного 10% бульона Coomassie (стадия 1.8) 200 мкл 1 M ACA и хранить при 4 °C.
  14. Подготовьте 4-кратный буфер образцов PAGE, объединив 40% глицерина, 0,04% Ponceau S, 25 мМ Tris-HCl (рН 6,8), 192 мМ глицина в 10 мл конечного объема. Аликвоцитируйте их и храните при -20 °C в морозильной камере.

2. Выделение митохондрий из замороженной сердечной ткани

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните процедуру изоляции митохондрий в холодной камере с температурой 4 °C. Однако в случае недоступности холодильного помещения используйте для выполнения процедуры ледяную ванну большого размера.

  1. Извлеките ранее замороженные образцы сердечной ткани из морозильной камеры с температурой -80 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Максимум четыре образца ткани могут быть комфортно обработаны для выделения митохондрий в данный день.
  2. Взвесьте трубку, содержащую образец сердечной ткани, и запишите вес. Приготовьте три стакана (каждый по 50 мл), содержащие 40 мл промывочного буфера. Охладите каждый стакан в ледяной соляной ванне с равным количеством льда и соли, смешанных в течение 3-5 минут, прежде чем перейти к следующему этапу. Поместите магнитные перемешивающие стержни в каждый стакан и установите мешалку на среднюю скорость.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не замораживайте стаканы и используйте их сразу после того, как начнут появляться облака кристаллов льда.
  3. Поместите замороженную сердечную ткань непосредственно в ледяной раствор в первом стакане. Подождите примерно 5 минут, помешивая и оказывая небольшое давление на ткани с помощью пинцета, чтобы получить как можно больше крови.
  4. Взвесьте пустую трубку и вычтите из исходного веса (шаг 2.2), чтобы получить чистый вес сердечной ткани.
  5. Выньте ткань щипцами и сожмите сердце чистым бумажным полотенцем из фильтровальной бумаги, чтобы удалить кровь. Затем поместите ткань во второй стакан. Подождите примерно 5 минут при перемешивании, чтобы удалить лишнюю кровь.
  6. Аккуратно высушите салфетку на бумажном полотенце. Удалите весь жир, свернувшуюся кровь, ушные раковины и фасции (белую ткань). Затем опустите желудочковую ткань.
  7. Измельчите образцы тканей с помощью измельчителя, выполнив шаги 2.7.1-2.7.9.
    1. Поместите сердечную ткань (~50-300 мг) в камеру измельчителя тканей со стороны барана.

Figure 1
Рисунок 1: Камера измельчителя тканей (трубка) для использования с измельчителем. Гомогенизация тканей в трубке измельчителя требует около 10-12 с на образец ткани. Гомогенизация ткани завершается после того, как гомогенизированная ткань проходит через перфорированный диск в верхнюю камеру. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

  1. Добавьте ~0,2-0,8 мл промывочного буфера на сторону колпачка трубки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что общий объем образца и промывочного буфера, объединенных во время измельчения, не превышает 0,7-0,8 мл.
  2. Используйте трубчатый инструмент, чтобы плотно закрыть камеру измельчителя крышкой измельчителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не затягивайте крышку измельчителя.
  3. Поместите камеру измельчителя в держатель шредера стороной тарана вниз. Таран задействует фитинг в держателе измельчителя.
  4. Вставьте бит драйвера измельчителя; пусть бит взаимодействует с колпачком измельчителя. Убедитесь, что бит плотно закреплен на месте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда используйте полностью заряженный драйвер шредера.
  5. Вручную применяйте давление вниз к драйверу измельчителя и камере измельчителя до тех пор, пока индикатор давления на держателе измельчителя не достигнет значения приблизительно 2 на держателе измельчителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Настройка может быть на более высоком уровне, если измельченная ткань более волокнистая.
  6. Запускайте драйвер шредера в течение примерно 10-12 с, нажав на спусковой крючок водителя измельчителя, сохраняя при этом настройку на уровне 2.
  7. Посмотрите на трубку, чтобы проверить, вся или большая часть твердой массы ткани измельчена через лизисный диск и пропущена в верхнюю камеру камеры измельчителя, глядя на трубку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Может потребоваться измельчение образца ткани в течение более длительного периода. Просто верните трубку в держатель измельчителя и продолжайте процесс. Большинство видов образцов тканей требуют только 10-12 с измельчения. В то время как все измельчение будет производить некоторое тепло из-за трения, это короткое время обработки не будет значительно нагревать образец.
  8. После измельчения образца поднимите камеру измельчителя из держателя. С помощью трубчатого инструмента снимите колпачок измельчителя и поместите его на чистую поверхность для последующего использования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Крышка измельчителя должна рассматриваться как загрязненная экстрактом образца и, в зависимости от типа образца, может быть загрязнена инфекционными материалами. Не используйте тот же колпачок измельчителя для любых других образцов тканей, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение.
  1. Переложите измельченную сердечную ткань в третий стакан с 40 мл промывочного буфера и перемешайте батончик и перемешайте ткань в течение 5 мин на средней скорости, находясь на перемешиваемой пластине.
  2. Отфильтруйте суспензию через мононитью из нейлоновой сетки (размер пор 74 мкм) и выбросьте фильтрат. Промыть измельченную ткань на фильтре 3x с 10 мл промывочного буфера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что мононитя из нейлоновой сетки предварительно смачивается водой.
  3. Переложите промытую и измельченную ткань в стакан объемом 50 мл с 20 мл промывочного буфера и поместите стакан в ледяную ванну на магнитной мешалке. Добавьте 0,5 мл раствора трипсина, постоянно помешивая в течение 15 мин. Примерно на полпути через инкубацию (примерно через 7,5 мин) переместите суспензию ткани в свободно установленный ручной гомогенизатор «стекло на стекле», который будет удерживать 0-15 мл объема.

Figure 1
Рисунок 1: Камера измельчителя тканей (трубка) для использования с измельчителем. Гомогенизация тканей в трубке измельчителя требует около 10-12 с на образец ткани. Гомогенизация ткани завершается после того, как гомогенизированная ткань проходит через перфорированный диск в верхнюю камеру. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

  1. Аккуратно гомогенизируйте 4-5 ходами, чтобы диспергировать суспензию без образования пены. Поместите гомогенат в стакан объемом 50 мл и аккуратно перемешайте на перемешивающей пластине в течение 15 мин при 4 °C.
  2. После 15 мин инкубации добавляют 10 мл изоляционного буфера, содержащего ингибитор трипсина, в стакан, содержащий гомогенат, и инкубируют в течение 1 мин при 4°С при осторожном перемешивании.
  3. Снова отфильтруйте суспензию через нейлоновый фильтр и сохраните фильтрат в конической трубке объемом 50 мл.
  4. Соберите фракцию твердых частиц, оставленную на нейлоновом фильтре, и поместите ее в гомогенизатор «стекло на стекле». Добавьте 15-20 мл моечного буфера и аккуратно гомогенизируйте вручную в течение 25-30 с.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фильтрат течет очень медленно на этом этапе. Чтобы увеличить поток фильтрата, поместите наконечник воронки, касающийся внутренней части конической трубки.
  5. Соедините гомогенат с фильтратом, сбалансируйте трубки и центрифугу при 600 х г в течение 15 мин при 4 °C.
  6. Отфильтруйте полученный супернатант в новую коническую трубку с помощью нейлонового фильтра, чтобы избежать загрязнения гранулой. Снова запустите центрифугу при 8 500 х г в течение 15 мин при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте пластиковую переносную пипетку, чтобы удалить супернатант и пожертвовать 0,2 мл супернатанта с верхней части пушистой гранулы.
  7. Откажитесь от супернатанта и промыть гранулу 2-3 раза 1 мл изоляционного буфера. Убедитесь, что пушистый белый слой внешнего обода каждый раз отбрасывается.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вымойте гранулу, добавив изоляционный буфер с помощью пипетки с наконечником 1 мл или новой передаточной пипетки. Добавьте буфер сбоку трубки, а не непосредственно над гранулой, чтобы предотвратить разрушение гранулы и предотвратить загрязнение супернатанта. Затем аспирируйте буфер передаточной пипеткой и повторите процесс еще два раза.
  8. Добавьте 5 мл изоляционного буфера в каждую трубку и разбейте гранулу, используя пипетку с наконечником 1 мл или новую передаточную пипетку.
  9. Разбавьте суспензию 20 мл дополнительного изоляционного буфера и снова запустите центрифугу при 8 500 х г в течение 15 мин при 4 °C.
  10. Выбросьте супернатант и повторно суспендируйте гранулу в 5 мл буфера повторного использования. Затем добавьте еще 15 мл буфера в общей сложности 20 мл и центрифугу при 8 500 х г в течение 15 мин. при 4 °C. Выбросьте супернатант. Полученная коричневая гранула содержит промытые интактные митохондрии.
  11. Повторное суспендирование обогащенной митохондриями гранулы в 250 мкл повторного буфера, включая ингибиторы протеазы. Аликвот в 25 мкл, быстро заморозить в жидком азоте и хранить в морозильной камере -80 °C в течение нескольких лет.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Запасной 5 мкл обогащенного митохондриями препарата для анализа белка. Для исследования BN-PAGE (Blue native-PAGE) аликвотировать повторно суспендированную гранулу в 50 мкг митохондриального белка на трубку. Центрифуга при 8 500 х г в течение 15 мин при 4 °C. Тщательно аспирируйте супернатант и храните митохондриальную гранулу (50 мкг белка / аликвоты) в морозильной камере с температурой -80 °C в течение нескольких лет.

3. Оценка митохондриального комплекса переноса электронов (ETC)

ПРИМЕЧАНИЕ: Отдельные митохондриальные белки ETC (т.е. Complex-I, II, III, IV, V) могут быть оценены с помощью стандартного иммуноблоттинга. Из-за разнообразия образцов (четыре временные точки: 48 ч, 3 месяца, 6 месяцев, 9 месяцев), двух экспериментальных условий (физический и сидячий) и ряда иммунозондирующих антител (пять антител) рекомендуется мультиплексированное иммуноблоттинг. Выполните мультиплексированное иммуноблоттинг следующим образом.

  1. Разрешить 50 мкг обогащенного митохондриями образца белка в 4%-20% градиентном полиакриламидном гелевом электрофорезе (100 В, 90 мин).
  2. Перенос белков на PVDF-мембрану (75 В; 60 мин)
  3. Блокируют мембрану в блокирующем буферном растворе не менее чем на 1 ч при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время блокировки может быть продлено до ночи при 4 °C. Блокирующий буфер (Таблица материалов) содержит ингредиенты, не относящиеся к млекопитающим (т.е. рыбьи белки), которые с меньшей вероятностью имеют специфические связывающие взаимодействия с антителами, а также с другими белками млекопитающих, присутствующими в типичных способах.
  4. Исследуйте мембрану коктейлем антител, включая антикомплекс-I, II, III, IV, V, и инкубируйте в течение ночи на орбитальном шейкере при 4 °C.
  5. На следующий день промыть мембрану и зонд вторичным антителом с ИК-меткой в течение 2 ч на орбитальном шейкере при RT (комнатной температуре).
  6. Промыть пять раз 1x TBS-T (TBS, содержащий Tween 20) и один раз 1x TBS (tris буферизованный физиологический раствор).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для последней стирки не включайте моющее средство в буфер TBS.
  7. Создайте пятно в анализаторе изображений.

4. Оценка суперкомплекса митохондрий методом электрофореза Blue Native Poly Acrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE)

ПРИМЕЧАНИЕ: Сверхсложный профиль ETC также может быть оценен с помощью метода BN-PAGE.

  1. Подготовьте образец буферного коктейля на 20 мкл на 50 мкг обогащенного митохондриями белка гранул (7 мкл воды + 5 мкл 4x нативного полиакриламидного геля электрофореза буфера загрузки образца + 8 мкл 5% digitonin + 2 мкл Coomassie G-250).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сделайте запасной образец буферного коктейля в зависимости от количества доступных образцов (50 мкг белка на образец). Выбирайте соответствующие количества дигитонина на основе концентрации белка в гранулах, обогащенных митохондриями (таблица 1)8.
  2. Нагрейте дигитонин при 95 °C в течение 3 минут, перемешайте и остудите на льду, прежде чем сделать мастер-микс.
  3. Добавьте добавку для образца Coomassie G-250 непосредственно перед загрузкой образцов в гель.
  4. Добавьте 20 мкл буферного коктейля образца в пробирку, содержащую 50 мкг митохондриальной белковой гранулы. Солюбилизируйте/повторно суспендируйте гранулу, аккуратно смешивая гранулу с пипеткой без образования пены.
  5. Инкубируйте смесь на льду в течение 20 минут для достижения максимальной солюбилизации гранул, обогащенных митохондриями. Время от времени осторожно щелкайте трубками, чтобы усилить солюбилизацию.
  6. В ожидании инкубации подготовьте собственный буфер анода PAGE/работающий буфер 1x и катодный буфер темно-синего цвета.
  7. Центрифуга солюбилизированной гранулы, обогащенной митохондриями, при 20 000 х г в течение 10 мин при 4 °C.
  8. После центрифугирования соберите 15 мкл супернатанта в новые трубки, помещенные на лед.
  9. Добавьте соответствующее количество 5% реагента Coomassie G-250 к супернатанту, полученному на стадии 4.8 (см. таблицу 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем 5% Coomassie G-250 должен быть таким, чтобы конечная концентрация красителя составляла 1/4 от концентрации моющего средства. Выполните этот шаг непосредственно перед загрузкой образцов в гель.
Белок Дигитонин/белок 4x буфер образцов 5% Дигитонин Вода Заключительный том 5% Кумасси G-250
соотношение (г/г) добавка к образцу
50 мкг 8 5 8 7 20 2
50 мкг 4 5 4 11 20 1

Таблица 1: Приготовление проб буферного коктейля с двумя различными соотношениями моющее средство/белок. Для достижения максимальной солюбилизации мембранных белков из митохондриальной суспензии концентрация белка дигитонина/митохондриальной суспензии должна быть скорректирована до 4-8 г дигитонина/г белка. В сердечной ткани 400 мкг дигитонина на 50 мкг белков митохондриальной суспензии (т.е. 8 г дигитонина/г белка митохондрий) использовали для максимизации растворимости суперкомплексов из суспензии митохондрий.

  1. Залейте 3%-8% градиентным гелем, удалите гребень и трижды промойте колодцы геля с 1x рабочим буфером.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гель лучше всего полимеризуется, если его влить за день до этого.
  2. Настройте систему электрофореза и поместите гель в аппарат.
  3. Заполните пробные колодцы катодным буфером темно-синего цвета.
  4. Загрузка 10 мкл неокрашенного белкового стандарта в качестве нативного молекулярно-массового маркера на первой и последней лунке геля.
  5. Загрузите все количество пробы супернатанта + добавки для пробы Coomassie, приготовленной на этапе 4.9 выше, в скважины с использованием наконечника для загрузки геля с плоской головкой.
  6. Осторожно заполните буферную плотину мини-ячейки приблизительно 60 мл катодного буфера темно-синего цвета, не нарушая образцы в скважинах, а затем заполните буферный резервуар собственным рабочим буфером PAGE 1x.
  7. Включите блок питания и электрофоризируйте образцы при напряжении 150 В в течение примерно 30 минут.
  8. Извлеките катодный буфер темно-синего цвета из буферной плотины (внутренней камеры) с помощью передаточной пипетки или аспирируйте пробоотборные скважины. Заполните внутреннюю камеру 150-200 мл катодного буфера голубого цвета и запустите электрофорез при 250 В в течение 60 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время электрофореза можно определить, проверив, когда передняя часть красителя мигрирует всего на 0,5 см выше нижней части гелевой кассеты.
  9. Извлеките гель из кассеты и поместите в чистый пластиковый контейнер. Промыть гель дистиллированной водой хорошего качества в течение 15 мин на коромысле/орбитальном шейкере.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы удалить градиентный гель из кассеты, обработайте кассету снизу, которая прочнее, чтобы свести к минимуму вероятность поломки.
  10. Залейте водой, погрузите гель в достаточное количество реагента для окрашивания Coomassie GelCode Blue и инкубируйте в течение 1 ч на орбитали/коромысле при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием смешайте раствор реагента Blue stain (Таблица материалов), осторожно закрутив флакон несколько раз.
  11. Декантировать раствор красителя, добавить дистиллированную воду, несколько раз промыть водой, а затем положить на орбиталь/коромысло для очистки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вставьте кусочек губки (~3 см х 0,5 см) в контейнер для удаления геля и оставьте гель для ночного окрашивания. Губка адсорбирует частицы красителя, не требуя многократной замены воды.
  12. Проанализируйте гель в анализаторе изображений.

5. Оценка суперкомплекса митохондрий иммуноблот-анализом

  1. Выполните новый набор BN-PAGE без окрашивания геля в конце электрофореза.
  2. Следуйте той же процедуре, что и в разделе 3 (оценка митохондриального комплекса переноса электронов (ETC)), чтобы завершить иммуноблоттинг.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Следуя протоколу, был получен хороший выход обогащенной митохондриями белковой смеси из сердечной ткани. Приблизительно 15 мг/мл обогащенной митохондриями белковой смеси было получено в среднем из 1,2 г замороженной сердечной ткани, собранной у потомства свиноматки. Наблюдения показали, что менее 0,5 г замороженной сердечной ткани не давали достаточного количества обогащенной митохондриями белковой смеси для проведения анализа BN-PAGE. Количество митохондриального препарата было достаточным для выполнения (i) стандартного иммуноблот-анализа для оценки отдельных комплексов переноса электронов (ETC) (т.е. Complex-I, II, III, IV и Complex-V), (ii) оценки митохондриального суперкомплекса с помощью BN-PAGE и иммуноблот-анализа и (iii) ограниченных ферментативных анализов для выбранного комплекса. Коктейль из антител, выращенных против отдельных белковых комплексов ETC, обеспечивает техническую возможность того, что каждое антитело будет распознавать свой собственный целевой белок в одном иммуноблотическом анализе.

Обогащенный митохондриями белок получали из левого желудочка сердца, полученного от потомства свиноматки. Потомство рождалось у двух групп свиноматок: (1) одна группа тренировалась во время беременности и (2) одна группа вела сидячий образ жизни. Сердечные ткани обеих групп были собраны в разные моменты времени после рождения (48 ч, 3 месяца, 6 месяцев и 9 месяцев). Оказывают ли материнские физические упражнения положительное влияние на митохондриальные внеземные цивилизации потомства во время беременности, была гипотеза, которая была проверена в этом исследовании. Четыре сердечные ткани были комфортно обработаны в любой день из-за длительного процесса выделения, обогащенного митохондриями.

Figure 2
Рисунок 2: Иммуноблот-профиль митохондриальных комплексов ETC из сердечной ткани потомства. Обогащенную митохондриями белковую смесь растворяли в 4%-20% градиентном геле в восстановительных условиях. Белки были иммунопробуждены коммерческим коктейлем антител, а антитело против VDAC использовалось для контроля нагрузки (красная цветовая полоса). Коктейль антител был поднят против бычьего сердечного комплекса-I (антиген NDUFB8), бычьего сердечного комплекса-II (антиген C-II30 (FeS), бычьего сердечного комплекса II, III (антиген C-III-Core 2), человеческого комплекса IV, субъединицы II (антиген C-IV-II) и бычьего сердечного комплекса-V (антиген C-V-α). Вторичное антитело маркировали инфракрасной меткой, а изображение анализировали с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Индивидуальные комплексные профили по возрастным группам приведены на дополнительном рисунке 1 (A-E). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2 представляет собой типичный профиль белка ETC. Коктейли с антителами позволяли проводить иммуноблоттинг в мультиплексном формате. Каждое антитело распознавало свой собственный целевой белок, обеспечивая приемлемое разрешение. Интенсивность белковой полосы была проанализирована в цифровом виде. Ткани, полученные от потомства тренируемой свиноматки, представляли относительно сниженные уровни в некоторых комплексах ETC (дополнительные рисунки 1A-E). Препарат, обогащенный митохондриями, должен быть разрешен в градиентном геле (4%-20%), поскольку иммунозондирование проводилось в формате мультиплексирования. Такой подход устранит необходимость запуска нескольких фиксированных процентов гелей SDS/PAGE и вариативность от запуска к запуску.

Митохондриальные белки были разрешены в 3%-8% градиенте BN-PAGE (Рисунок 3A) и иммунопробированы коктейлями антител. Как в тренированных, так и в сидячих группах наблюдалось образование нескольких суперкомплексов (рисунок 3B).

Figure 3
Рисунок 3: Митохондриальный суперкомплексный профиль методом электрофореза сине-нативного полиакриламидного геля (BN-PAGE). (A). Обогащенные митохондриалами белковые смеси разрешали в 3%-8% BN-PAGE и окрашивали синим реагентом Coomassie (Gel Code, Blue Stain Reagent). (B). Митохондриально-обогащенные белковые смеси разрешали в 3%-8% BN-PAGE, переносили на PVDF-мембрану и иммунопрощупывали коктейлями антител для суперкомплексов. В обоих анализах белковая нагрузка составляла 150 мкг/лунку. 6-месячная точка сбора данных не была включена из-за недостаточного выхода белка во время приготовления. Наиболее заметное наблюдаемое увеличение суперкомплекса наблюдалось через 9 месяцев в тренируемой группе по сравнению с сидячей группой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Другой формат градиентного геля (3%-8%) был подготовлен из-за большого размера суперкомплексов, которые могут быть разрешены в BN-PAGE. Обогащенный митохондриями препарат, описанный в этом протоколе, использовался для измерения комплексной активности митохондриальных внеземных цивилизаций. На рисунке 4 представлены данные, записанные для комплексной оценки деятельности I-II. Этот анализ проводился в соответствии с установленным протоколом3.

Figure 4
Рисунок 4: Комплексные измерения активности I-II. Обогащенные митохондриями белковые смеси, полученные из разных возрастных групп (48 ч, 3 месяца, 6 месяцев и 9 месяцев), анализировали на комплексную активность I-II с использованием кинетического анализа. Тренируемая группа показала повышенную активность комплекса I-II по сравнению с сидячей группой. Разница между двумя группами не была статистически значимой в соответствии с парным t-тестом (P > 0,05). Полосы погрешностей, изображенные на рисунке, представляют стандартную погрешность среднего значения (SEM) для n = 4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный рисунок 1: (A) Комплексный I профиль по возрастным группам. В целом, потомство, рожденное от тренированной свиноматки, имело более низкие уровни Комплекса-I по сравнению с оседлой группой (n = 4). Это было более выражено в 9-месячной группе. (B) Комплексный профиль II по возрастным группам. Все возрастные группы показали низкие уровни Комплекса-II в тренируемой группе, за исключением трехмесячной когорты (n = 4). (C) Комплекс-III профиль по возрастным группам. Только 9-месячная возрастная группа показала более низкие уровни Комплекса-III в тренируемой группе по сравнению с сидячей группой (n = 4). D) комплексный профиль IV по возрастным группам. Наблюдалось незначительное повышение уровня белка Complex-IV в тренируемой группе (n = 4). (E) Комплекс-V (АТФ-синтаза) профиль в разных возрастных группах. Как в физических, так и в сидячих группах наблюдался низкий уровень Комплекса V, за исключением 48-часовой точки данных (n = 4). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Критические шаги для этого протокола указаны здесь. Во-первых, гомогенизация тканей должна быть тщательно обработана, чтобы во время процесса гомогенизации тканей не применялись чрезмерные эффекты. Следует использовать тканевой измельчитель, который является частью технологии циклического давления (PCT) для первоначальной гомогенизации тканей9. Этот шаг уменьшит чрезмерный цикл инсульта гомогенизатора «стекло на стекле» (рисунок 1B), который может еще больше разрушить и без того хрупкие митохондрии из-за замороженных тканей. Во-вторых, замороженная масса тканей будет важна для получения достаточного количества обогащенного митохондриями препарата. Рекомендуемое начальное количество ткани будет больше 0,8 г, в зависимости от источника ткани. Сердечная ткань очень богата митохондриями10,11; поэтому рекомендуемое количество будет достаточным для получения препарата, обогащенного митохондриями. В-третьих, все процедуры должны проводиться в холодном помещении. Если холодная комната недоступна, будет достаточно большой ледяной ванны.

В этом исследовании была продемонстрирована возможность получения препаратов, обогащенных митохондриями, из ранее замороженной сердечной ткани. Этот протокол будет иметь важное значение для обеспечения доступа к архивированной замороженной ткани, из которой могут быть выделены митохондрии и из которых могут быть оценены митохондриальные ферментные комплексы ETC. Недавнее исследование показало, что митохондриальное дыхание из ранее замороженных тканей и клеток также может быть измеримым2. Благодаря этому прогрессу исследователи смогут использовать ранее собранные биообразцы для дальнейшего анализа.

Оценить профиль отдельных внеземных цивилизаций и суперкомплексов легче, выполнив классическое иммуноблоттинг в формате мультиплексирования, в котором используются множественные антитела во время процедуры иммуноблоттинга на одной и той же мембране PVDH. Для пользователя важно определить количество белка, которое будет загружено в гели для SDS-PAGE и BN-PAGE. Объем повторного суспендирования должен быть как можно более минимальным, чтобы получить высокие концентрации белка, чтобы у пользователя не было проблем с объемом загрузки образца. Количество белка, загружаемого в BN-PAGE, зависит от выхода обогащенного митохондриями препарата. 150 мкг обогащенной митохондриями белковой смеси были загружены на лунку в BN-PAGE из-за небольшого количества исходной сердечной ткани. 50-150 мкг обогащенного митохондриями грануляционного препарата будет достаточно для геля толщиной 1 мм. Пользователь может предпочесть гель толщиной 1,5 мм для загрузки образца; однако разрешение белковых полос может быть неприемлемым по качеству. Меньшая ресуспензия митохондриального белка на лунку не тестировалась, поскольку коктейли антител, используемые в иммуноблот-анализах, были предопределены по их концентрации; тем не менее, пользователи могут создавать свой собственный коктейль антител для увеличения скорости сигнал/шум.

Рекомендуется полностью полимеризованный градиентный гель (3%-8%) для гелей BN-PAGE. Градиентные гели 3%-8% не были коммерчески доступны; поэтому можно использовать домашние градиентные (3%-8%) стандартные мини-гели (9 х 6 см). Заливка геля за 24 часа до этого и предоставление гелю полимеризации в течение ночи в RT обеспечит приемлемое образование геля. Если пользователю необходимо лучшее разделение суперкомплексов, рекомендуется использовать более крупные форматы гелей (либо миди-гель 13,5 см х 6,5 см, либо длинный гель 28 см х 16 см).

Применение этого протокола позволит исследователям выделить митохондрии и проанализировать профиль внеземных цивилизаций и суперкомплексов в ранее замороженных архивных тканях. Все национальные и региональные биообразцовые хранилища хранят биообразцы в условиях ультразамерзания (т.е. -80 °C). Большое количество тканей архивируется учреждениями и фармацевтическими компаниями для дальнейших исследований и обмена реагентами. Национальный институт здравоохранения (NIH) предписывает, чтобы любые проекты, поддерживаемые NIH, были обязаны совместно использовать реагенты, произведенные в результате поддерживаемых проектов. Эти биорепозитории являются очень ценными источниками для получения замороженных архивных тканей для получения предварительных данных для заявок на гранты. Анализ ферментной активности суперкомплексов в данном исследовании не проводился; однако для выполнения таких анализов доступны протоколы8.

С помощью методов, описанных в данной работе, были проанализированы отдельные внеземные комплексы и суперкомплексы обогащенных митохондриями препаратов, полученных из сердечной ткани потомства свиноматок. Потомство, рожденное от физических свиноматок, имело низкий уровень внеземных цивилизаций в течение первых 6 месяцев своей жизни и в конечном итоге выравнивалось на 9 месяцев.

Комплекс внеземных цивилизаций 48 ч 3 месяца 6 мес. 9 мес.
Комплекс-I ↓ ↓ ↓ Без изменений
Комплекс-II ↓ ↓ Без изменений Без изменений
Комплекс-III ↓ Без изменений Без изменений ↓
Комплекс-IV ↑ ↑ ↑ Без изменений
Комплекс-V ↓ ↓ ↓ Без изменений

Таблица 2: Профиль белковых комплексов митохондриальной электронной транспортной цепи. В таблице обобщен профиль комплексных уровней митохондриальных внеземных цивилизаций в тренируемой группе свиноматок. Все комплексы, за исключением Комплекса-IV, показали тенденцию к снижению в разных возрастных группах.

Это наблюдение может свидетельствовать о том, что потомство, рожденное от тренированных свиноматок во время беременности, показало меньшее, но более эффективное количество комплексов ETC в митохондриях сердечной ткани (рисунок 4). Тем не менее, образование суперкомплекса за 9 месяцев тренируемой группы было признано повышенным. Физические упражнения могут как-то повлиять на перестановку суперкомплексов в условиях повышенной потребности в энергии12. Кроме того, Комплекс-V (АТФ-синтаза) демонстрирует низкий профиль в первые 6 месяцев после рождения. Этот ответ может быть обусловлен вероятностью эпигенетически модифицированных белковых комплексов ETC. Небольшой размер выборки (n = 4) для этого исследования был недостаточным для того, чтобы прийти к такому выводу; однако закономерности низких уровней сложных белков ВНЕЭК, высокой активности комплекса I-II и повышенного образования суперкомплексов могут свидетельствовать о том, что биоэнергетика в сердечной ткани потомства тренируемых свиноматок находится под влиянием физических упражнений. Меньшее, но более эффективно работающее митохондриальное комплексы внеземных цивилизаций и образование повышенных суперкомплексов являются интересными явлениями, подлежащими исследованию. Этот проект все еще продолжается.

Таким образом, этот протокол обеспечивает простую и понятную обогащенную митохондриями пробоподготовку из ранее замороженной архивной ткани сердца. Митохондриальные комплексы ETC могут быть проанализированы стандартным иммуноблоттингом с мультиплексированными коктейлями антител. BN-PAGE с последующим иммуноблоттингом позволяет анализировать наличие суперкомплексов. Этот препарат также может позволить пользователям оценить сложную деятельность митохондриальных внеземных цивилизаций.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Acknowledgments

Эта работа была финансово поддержана внутренним грантом Университета Канзас-Сити для Абдулбаки Агбаса и Летней исследовательской стипендией для Даниэля Барреры. Авторы благодарны за редакционную работу доктора Яна Тэлли.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amino caproic acid Sigma/Aldrich A2504-100G
Anti-Hu Total OxPhos complex kit Invitrogen 458199
anti-VDAC antibody abcam ab15895 use 1 µg/mL
Coomassie G-250 ThermoSientific 20279
Coomassie GelCode Blue ThermoScientific 24592
Digitonin Cabiochem 300410
Glass-Glass pestle homogenizer VWR KT885451-0020
Image Studio LICOR
IR-Dye conjugated anti-Rabbit Ab LICOR LC0725
Multiwell plate reader BioTek Synergy HT
Native molecular weight marker ThermoFisher BN2001
Nylon mesh monofilament Small Part Inc CMN-74
Orbital shaker ThermoScientfic
PCT Shredder Pressure Bioscience Inc
SEA BLOCK Blocking buffer ThermoScienctific 37527
Shredder PULSE Tube Pressure Bioscience Inc FT500-PS
Table top centrifuge Eppendorf 5418
Trypsin Amresco M150-1G
Trypsin inhibitor Amresco M191-1G Requires fresh preparation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Analytical Biochemistry. 418 (2), 213-223 (2011).
  2. Osto, C., et al. Measuring mitochondrial respiration in previously frozen biological samples. Current Protocols in Cell Biology. 89 (1), 116 (2020).
  3. Agbas, A., et al. Mitochondrial electron transfer cascade enzyme activity assessment in cultured neurons and select brain regions. Current Protocols in Toxicology. 80, 73 (2019).
  4. Hathaway, Q. A., et al. Maternal-engineered nanomaterial exposure disrupts progeny cardiac function and bioenergetics. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 312 (3), 446-458 (2017).
  5. May, L. E., et al. Influence of maternal aerobic exercise during pregnancy on fetal cardiac function and outflow. American Journal of Obstetrics & Gynecology MFM. 2 (2), 100095 (2020).
  6. Ehler, W. J., et al. Avoidance of malignant hyperthermia in a porcine model for experimental open heart surgery. Laboratory Animal Science. 35 (2), 172-175 (1985).
  7. Panov, A. V., et al. Effect of bovine serum albumin on mitochondrial respiration in the brain and liver of mice and rats. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 149 (2), 187-190 (2010).
  8. Jha, P., Wang, X., Auwerx, J. Analysis of mitochondrial respiratory chain supercomplexes using blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Current Protocols in Mouse Biology. 6 (1), 1-14 (2016).
  9. Pressure Biosciences Inc. Isolation of Functional Mitochondria from Whole Rat Heart Using a PBI Shredder and Pressure Cycling Technology (PCT). , South Easton, MA. (2010).
  10. McLaughlin, K. L., et al. Novel approach to quantify mitochondrial content and intrinsic bioenergetic efficiency across organs. Scientific Reports. 10 (1), 17599 (2020).
  11. Hom, J., Sheu, S. S. Morphological dynamics of mitochondria--a special emphasis on cardiac muscle cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46 (6), 811-820 (2009).
  12. Greggio, C., et al. Enhanced respiratory chain supercomplex formation in response to exercise in human skeletal muscle. Cell Metabolism. 25 (2), 301-311 (2017).

Tags

Биохимия выпуск 174
Измерение митохондриальных комплексов переноса электронов в ранее замороженной сердечной ткани от потомства свиноматки: модель для оценки изменений митохондриальной биоэнергетики, вызванных физической нагрузкой
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Barrera, D., Upton, S., Rauch, M.,… More

Barrera, D., Upton, S., Rauch, M., Notarianni, T., Eum, K. S., Liberty, M., Sah, S. V., Liu, R., Newcomer, S., May, L. E., Agbas, E., Sage, J., Kosa, E., Agbas, A. Measuring Mitochondrial Electron Transfer Complexes in Previously Frozen Cardiac Tissue from the Offspring of Sow: A Model to Assess Exercise-Induced Mitochondrial Bioenergetics Changes. J. Vis. Exp. (174), e62809, doi:10.3791/62809 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter