Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Fluorescerande mätning i realtid av synaptiska funktioner i modeller av amyotrofisk lateralskleros

Published: July 16, 2021 doi: 10.3791/62813
Automatic Translation
*1, 1, 1, *1
1Jefferson Weinberg ALS Center, Thomas Jefferson University
* These authors contributed equally

Summary

Två relaterade metoder beskrivs för att visualisera subcellulära händelser som krävs för synaptisk överföring. Dessa protokoll möjliggör realtidsövervakning av dynamiken i presynaptisk kalciuminflöde och synaptisk vesiklarmembranfusion med hjälp av levande cellavbildning av in vitro-odlade neuroner.

Abstract

Före neuronal degeneration är orsaken till motoriska och kognitiva underskott hos patienter med amyotrofisk lateralskleros (ALS) och / eller frontotemporal lobdemens (FTLD) dysfunktion i kommunikationen mellan neuroner och motorneuroner och muskler. Den underliggande processen för synaptisk överföring involverar membrandepolariseringsberoende synaptisk vesiklarfusion och frisättning av neurotransmittorer i synapsen. Denna process sker genom lokaliserad kalciuminflöde i de presynaptiska terminalerna där synaptiska vesiklar finns. Här beskriver protokollet fluorescensbaserade live-imaging-metoder som på ett tillförlitligt sätt rapporterar depolariseringsmedierad synaptisk vesikleexocytos och presynaptisk terminal kalciuminflödesdynamik i odlade neuroner.

Med hjälp av ett styrylfärgämne som ingår i synaptiska vesiklarmembran belyses den synaptiska vesiklarsättningen. Å andra sidan, för att studera kalciuminträde, används Gcamp6m, en genetiskt kodad fluorescerande reporter. Vi använder hög kaliumkloridmedierad depolarisering för att efterlikna neuronal aktivitet. För att kvantifiera synaptisk vesiklexocytos entydigt mäter vi förlusten av normaliserad styrylfärgfluorescens som en funktion av tiden. Under liknande stimuleringsbetingelser, vid kalciuminflöde, ökar Gcamp6m-fluorescensen. Normalisering och kvantifiering av denna fluorescensförändring utförs på ett liknande sätt som styrylfärgprotokollet. Dessa metoder kan multiplexeras med transfektionsbaserat överuttryck av fluorescerande märkta mutanta proteiner. Dessa protokoll har använts i stor utsträckning för att studera synaptisk dysfunktion i modeller av FUS-ALS och C9ORF72-ALS, med användning av primära gnagare kortikala och motoriska neuroner. Dessa protokoll möjliggör enkelt snabb screening av föreningar som kan förbättra neuronal kommunikation. Som sådan är dessa metoder värdefulla inte bara för studier av ALS utan för alla områden av neurodegenerativ och utvecklingsneurovetenskaplig forskning.

Introduction

Modellering av amyotrofisk lateralskleros (ALS) i laboratoriet görs unikt utmanande på grund av den överväldigande sporadiska karaktären hos över 80 % av fallen1, i kombination med det stora antalet genetiska mutationer som är kända för att vara sjukdomsorsakande2. Trots detta delar alla fall av ALS den förenande egenskapen att före direkt neuronal degeneration finns det dysfunktionell kommunikation mellan presynaptiska motorneuroner och postsynaptiska muskelceller3,4. Kliniskt, när patienter förlorar anslutningen av de återstående övre och nedre motorneuronerna, presenterar de funktioner av neuronal hyper- och hypoexcitabilitet under hela sjukdomen5,6,7,8,9, vilket återspeglar komplexa underliggande molekylära förändringar i dessa synapser, som vi som ALS-forskare försöker förstå.

Flera transgena modeller har illustrerat att försämring och desorganisation av den neuromuskulära korsningen sker med uttrycket av ALS-orsakande genetiska mutationer, inklusive SOD110, FUS11,12, C9orf7213,14,15,16 och TDP4317,18,19 genom morfologiska bedömningar, inklusive utvärdering av synaptiska boutons, ryggradstätheter och pre/postsynaptisk organisation. Mekaniskt, sedan Coles, Hodgkins och Huxleys landmärkespapper på 1930-talet, har det också varit möjligt att utvärdera synaptiska svar genom elektrofysiologiska tekniker i antingen in vitro-cellodling eller vävnadsskivberedningar20. Genom dessa strategier har många modeller av ALS visat synaptiska överföringsunderskott. Till exempel orsakar en mutant variant av TDP43 förbättrad avfyrningsfrekvens och minskar tröskeln för åtgärdspotential i NSC-34 (ryggmärg x neuroblastom hybridcellinje 34) motorneuronliknande celler21. Samma variant orsakar också dysfunktionell synaptisk överföring vid den neuromuskulära korsningen (NMJ) före uppkomsten av beteendemässiga motoriska underskott i en musmodell22. Det har tidigare visats att muterat FUS-uttryck resulterar i minskad synaptisk överföring vid NMJ i en drosophilamodell av FUS-ALS före rörelsedefekter11. En nyligen genomförd rapport med användning av inducerade pluripotenta stamceller härledda från C9orf72-expansionsbärare avslöjade en minskning av den lätt frisläppbara poolen av synaptiska vesiklar23. Sammantaget belyser dessa studier och andra vikten av att bygga en mer omfattande förståelse för mekanismerna bakom synaptisk signalering i sjukdomsrelevanta modeller av ALS. Detta kommer att vara avgörande för att förstå patobiologin för ALS och utveckla potentiella terapeutiska mål för patienter.

Metoder för ström- och spänningsklämningsceller har varit ovärderliga för att bestämma membranegenskaper såsom konduktans, vilande membranpotential och kvantinnehåll i enskilda synapser20,24. En av de betydande begränsningarna med elektrofysiologi är dock att den är tekniskt utmanande och bara ger insikter från en enda neuron åt gången. Konfokalmikroskopi med levande celler, i kombination med specifika fluorescerande sonder, ger möjlighet att undersöka den synaptiska överföringen av neuroner på ett spatiotemporalt sätt25,26,27. Även om det inte är ett direkt mått på neuronal excitabilitet, kan denna fluorescensmetod ge en relativ mätning av två molekylära korrelationer av synaptisk funktion: synaptisk vesiklarsättning och kalciumtransienter vid synaptiska terminaler.

När en åtgärdspotential når den presynaptiska terminala regionen av neuroner utlöses kalciumtransienter, vilket underlättar övergången från en elektrisk signal till processen för frisättning av neurotransmittorer28. Spänningsgrindade kalciumkanaler lokaliserade till dessa områden reglerar kalciumsignaleringen tätt för att modulera kinetiken för frisättning av neurotransmittorer29. De första rapporterade fluorescensbaserade inspelningarna av kalciumtransienter utfördes med användning av antingen dubbelvåglängdsindikatorn Fura-2 AM eller det enda våglängdsfärgämnet Fluo-3 AM30,31,32. Även om dessa färgämnen erbjöd stor ny insikt vid den tiden, lider de av flera begränsningar, såsom icke-specifik uppdelning i celler, aktiv eller passiv färgförlust från märkta celler, fotoblekning och toxicitet om de avbildas under längre tidsperioder33. Under det senaste decenniet har genetiskt kodade kalciumindikatorer blivit arbetshästar för avbildning av olika former av neuronal aktivitet. Dessa indikatorer kombinerar ett modifierat fluorescerande protein med ett kalciumkelatorprotein som snabbt växlar fluorescensintensitet efter bindningen av Ca2+ joner34. Tillämpningen av dessa nya indikatorer är omfattande, vilket möjliggör mycket enklare visualisering av intracellulära kalciumtransienter både in vitro- och in vivo-inställningar. En familj av dessa genetiskt kodade reportrar, känd som GCaMP, används nu i stor utsträckning. Dessa indikatorer innehåller en C-terminal kalmodulindomän, följt av grönt fluorescerande protein (GFP), och är begränsade av en N-terminal kalmodulinbindande region35,36. Kalciumbindning till kalmodulindomänen utlöser en interaktion med den kalmodulinbindande regionen, vilket resulterar i en konformationsförändring i den totala proteinstrukturen och en väsentlig ökning av fluorescensen hos GFP-delen35,36. Under årens lopp har denna familj av reportrar genomgått flera utvecklingar för att möjliggöra distinkta avläsningar för specifika kalciumtransienter med specifik kinetik (långsam, medium och snabb), var och en med något olika egenskaper37,38. Här har användningen av reportern GcaMP6 belysts, som tidigare har visat sig detektera enstaka åtgärdspotentialer och dendritiska kalciumtransienter i neuroner både in vivo och in vitro37.

Kalciumtransienter i den presynaptiska regionen utlöser synaptiska vesiklarfusionshändelser, vilket orsakar frisättning av neurotransmittorer i synapsen och initiering av signalhändelser i den postsynaptiska cellen28,39. Synaptiska vesiklar frigörs både snabbt och återvinns, eftersom cellen homeostatiskt upprätthåller en stabil cellmembranyta och lätt frigörbar pool av fusionskapabla membranbundna vesiklar40. Styrylfärgämnet som används här har en affinitet mot lipidmembran och ändrar specifikt dess emissionsegenskaper baserat på ordningen av den omgivande lipidmiljön41,42. Således är det ett idealiskt verktyg för märkning av återvinning av synaptiska vesiklar och efterföljande spårning av dessa vesiklar när de senare frigörs efter neuronal stimulering41,42. Protokollet som har genererats och optimerats är en anpassning av de begrepp som ursprungligen beskrevs av Gaffield och kollegor, vilket gör att vi kontinuerligt kan visualisera styrylfärgmärkt synaptisk vesiklarecta över tiden41.

Här beskrivs två relaterade fluorescensbaserade metoder som på ett tillförlitligt sätt rapporterar specifika cellulära händelser som är involverade i synaptisk överföring. Protokoll har definierats för att undersöka dynamiken i depolariseringsmedierad presynaptisk terminal kalciuminflöde och synaptisk vesikleexocytos i odlade neuroner. Här fokuseras metoder och representativa resultat på att använda primära gnagare kortikala eller motoriska neuroner som in vitro-modellsystem, eftersom det finns publicerade studier med dessa celltyper43,44. Dessa metoder är emellertid också tillämpliga på differentierade humana i3 kortikala nervceller45, eftersom vi också har haft framgång med båda protokollen i för närvarande pågående experiment i vårt laboratorium. Det allmänna protokollet beskrivs i ett stegvis linjärt format, som visas i figur 1. I korthet, för att studera kalciumdynamiken i neuriter transfekteras mogna neuroner med plasmid-DNA för att uttrycka den fluorescerande reportern GCaMP6m under en Cytomegalovirus (CMV) promotor37,46. Transfekterade celler har en låg nivå av basal grön fluorescens, vilket ökar i närvaro av kalcium. Regioner av intresse specificeras för att övervaka fluorescensförändringar under hela vår manipulation. Detta gör det möjligt att mäta mycket rumsligt och tidsmässigt lokaliserade fluktuationer i kalcium37,46. För utvärdering av synaptisk vesiklarfusion och frisättning laddas mogna neuroner med styrylfärgämne införlivat i synaptiska vesiklarmembran när de återvinns, reformeras och laddas om med neurotransmittorer i presynaptiska celler41,42,43,47,48. De nuvarande färgämnena som används för detta ändamål märker synaptiska vesiklar längs neuriter och används som proxy för dessa regioner i live-imaging-experiment, vilket visades genom samfärgning av styrylfärgämne och synaptotagmin av Kraszewski och kollegor49. Här ingår representativa bilder av liknande färgning som också har utförts (figur 2A). Tidigare utredare har i stor utsträckning använt sådana färgämnen för att rapportera synaptisk vesikeldynamik vid den neuromuskulära korsningen och hippocampala neuroner48,49,50,51,52,53,54,55,56 . Genom att välja punkterade regioner av färgladdade vesiklar och genom att övervaka minskningar av fluorescensintensiteten efter vesiklarsättning kan funktionell synaptisk överföringskapacitet och temporal frisättningsdynamik studeras efter stimulering43. För båda metoderna används ett medium innehållande en hög koncentration av kaliumklorid för att depolarisera celler för att efterlikna neuronal aktivitet. Bildparametrar anges för att fånga intervall under sekunden som spänner över en baslinjenormalisering följt av vår stimuleringsfångstperiod. Fluorescensmätningar vid varje tidpunkt bestäms, normaliseras till bakgrunden och kvantifieras under den experimentella tidsperioden. Kalciuminflödesmedierad GCaMP6m fluorescensökning eller effektiv synaptisk vesiklarexocytocytos styrylfärgämne frisättning fluorescens minskning kan detekteras genom denna strategi. Detaljerad metodologisk inställning och parametrar för dessa två protokoll och en diskussion om deras fördelar och begränsningar beskrivs nedan.

Figure 1
Bild 1: Visuell återgivning av den övergripande allmänna protokollprocessen. (1) Isolera och odla primära gnagareneuroner in vitro till vald mognadstidspunkt. (2) Introducera GCaMP-DNA eller styrylfärgämne som rapportörer av synaptisk aktivitet. (3) Inställningsavbildningsparadigm med hjälp av live-imaging-utrustat konfokalmikroskop och tillhörande programvara. Påbörja baslinjeinspelningsperioden. (4) Medan celler fortfarande genomgår live-image-fångst, stimulera neuroner via hög KCl-badperfusion. (5) Bedöma fluorescensintensitetsmätningar över tid för att mäta kalciumtransienter eller synaptisk vesiklarfusion. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla djurförsök som utfördes i denna studie godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid Jefferson University.

1. Primär kultur av neuroner från embryonal råttcortex

OBS: Primära kortikala nervceller isoleras från E17.5 råttembryon som tidigare beskrivits57,58. Ingen stambias verkar existera med framgången med detta odlingsprotokoll. Denna metod beskrivs kortfattat nedan. De tidigare angivna artiklarna bör refereras för fullständig information.

  1. Avliva gravida honråttor genom CO2-inandning följt av sekundär bekräftelse genom cervikal dislokation.
  2. Skörda embryon och isolera hjärnor i iskall 20 mM HEPES-buffrad Hanks balanserade saltlösning (HBSS). Från det yttre cortexskalet, separera och kassera sedan striatum och hippocampi. Samla kortikor.
  3. Använd fina pincett för att ta bort hjärnhinnor från kortikor. För att göra detta, håll cortex på plats med ett par slutna pincett med försiktigt tryck.
    OBS: Med det andra paret pincett i andra hand, nyp hjärnhinnor. Skala bort hjärnhinnorna med rullande rörelse med klämt par. Flytta med de slutna tångarna och upprepa vid behov tills hjärnhinnorna är helt borttagna.
  4. Inkubera kortikor med 10 μg/ml papain i HBSS i 4 min vid 37 °C.
  5. Tvätta tre gånger i HBSS och triturera sedan försiktigt 5-10 gånger med en brandpolerad pasteurpipett av glas för att erhålla en homogen cellsuspension.
    OBS: Undvik bubblor; behåll pipetten i cellsuspensionen.
  6. Plattneuroner på 100 μg / ml poly-D-lysinbelagda 35 mm glasbottenskålar med en densitet av 75 000 celler / skål i neurobasalt medium med B27-tillskott (2%) och penicillin-streptomycin.

2. Primär kultur av motorneuroner från embryonal råtta ryggmärg

OBS: Primära motorneuroner framställs av E13.5 råttembryon som tidigare beskrivits, med få modifieringar59,60. Ingen stambias verkar existera med framgången med detta odlingsprotokoll. Denna metod beskrivs kortfattat nedan. De föregående angivna artiklarna bör refereras för fullständig information.

  1. Avliva dräktiga honråttor som i steg 1.1.
  2. Dissekera 10-20 ryggmärgen från embryon och bryt in i små fragment mekaniskt med hjälp av två par pincett för att klämma respektive dra.
  3. Inkubera i 0,025% trypsin i 8 min, följt av tillsats av DNas vid 1 mg /ml.
  4. Centrifugera genom en 4% w/v BSA-kudde vid 470 x g i 5 min vid 4 °C utan avbrott.
  5. Centrifugpelleterade celler i 55 minuter vid 830 x g vid 4 °C utan broms genom en 10,4 % (v/v) densitetsgradientmedium (se materialtabellen) kudde. Bär fram motorneuronbandet vid det visuella gränssnittet.
    OBS: För att säkerställa fångst av alla celler, använd fenolfria medier för densitetsgradientsteget och fenolhaltiga medier för alla andra steg. Gränssnittet för densitetsgradienten och dissociationsmediet är lätt att identifiera baserat på färgskillnaden.
  6. Snurra uppsamlade band genom ytterligare 4% w/v BSA-kudde vid 470 x g i 5 min vid 4 °C utan paus.
  7. Resuspend renade motorneuroner i komplett neurobasalt medium med B27-tillskott (2%), glutamin (0,25%), 2-merkaptoetanol (0,1%), hästserum (2%) och penicillin-streptomycin.
  8. Plattneuroner på 100 μg / ml polylysin och 3 μg / ml lamininbelagda täckglas med en densitet av 50 000 celler / 35 mm glasbottenskål.

3. Neuronala transfektioner

OBS: Detta steg utförs för neuroner som kommer att genomgå GCaMP-kalciumavbildning och / eller neuroner där en exogen DNA-plasmid eller RNA av intresse introduceras före synaptisk utvärdering. Däremot laddas styrylfärg strax före avbildningssessionen och behandlas i avsnitt 6. Sammanfattningen nedan är transfektionsprotokollet som används för primära gnagareneuroner i de presenterade exemplen, men det kan enkelt anpassas och optimeras till användarens behov.

  1. Transfektioner för odlade primära kortikala nervceller uppträder vid dag 12 in vitro (DIV 12), medan motorneuroner transfekteras vid dag 7 in vitro (DIV 7).
    OBS: Alla följande steg sker i ett aseptiskt biosäkerhetsskåp.
  2. Transfekt 500 ng GCaMP6m med användning av transfektionsreagens i ett förhållande av 1:2 i volymprocent. För samtransfektioner, tillsätt totalt 1,25 μg totalt DNA / skål, bibehåll detta DNA till reagensförhållande.
    OBS: I de experimentella exemplen som visas har 750 ng ALS / FTD-relaterad plasmid av intresse transfekterats för att uttrycka C9orf72-ALS-länkade dipeptider, mutant FUS-protein etc. Se till att den fluorescerande taggen för den samtransfekterade plasmiden inte kommer i konflikt med FITC-kanalen för GCaMP-avbildning. På samma sätt, om du gör styrylfärgavbildning, se till att den samtransfekterade plasmiden inte kommer i konflikt med TRITC-bildkanalen. Användning av synaptophysin-GCaMP3 är lika effektiv i detta protokoll. Transfektera därför samma mängd av denna plasmid och följ alla steg som vanligt i avsnitt 7.
  3. Inkubera DNA-transfektionsreagenskomplexet vid rumstemperatur i 10 minuter.
  4. Tillsätt försiktigt det inkuberade komplexet till neuroner droppvis med virvlande. Sätt tillbaka skålen till CO2-inkubatorn vid 37 ° C i 45-60 min.
  5. Ta bort hela odlingsmediet som innehåller DNA-transfektionsreagenskomplexet och ersätt det med en 50-50 volymprocent beredning av förkondierade och färska neuronala medier. Sätt sedan tillbaka cellerna i CO2-inkubatorn i 48 timmar tills avbildning.

4. Beredning av buffertlösningar och styrylfärglösning

  1. Gör lösningar med låg och hög aCSF fräscha innan avbildning med de ingredienser som anges i tabell 1. Filtrera båda buffertlösningarna före användning.
    OBS: CaCl2-dihydrat kan bilda Ca (OH) 2 vid lagring. För maximal effekt, använd alltid en nyligen öppnad behållare. Om detta inte är möjligt, för att avlägsna Ca(OH)2 från den yttre ytan och säkerställa maximal löslighet, kan lösningar kolsyras med gasformig CO2 i 5 minuter före CaCl2-tillsats. Om detta steg tas, justera pH-värdet för den resulterande lösningen för att bibehålla ett pH-värde på 7,4, eftersom överdriven karbonatisering kommer att resultera i Ca (HCO3) 2-bildning.
Låg KCL aCSF-buffert (pH 7,40 till 7,45)
Reagens Koncentration
HEPES 10 mM
NaCl 140 mM
KCl 5 mM
Glukos 10 mM
CaCl2 2H2O 2 mM
MgCl2 4H2O 1 mM
Hög KCL aCSF-buffert (pH 7,40 till 7,45)
Reagens Koncentration
HEPES 10 mM
NaCl 95 mM
KCl 50 mM
Glukos 10 mM
CaCl2 2H2O 2 mM
MgCl2 4H2O 1 mM

Tabell 1: Sammansättning av buffertar för artificiell cerebrospinalvätska (aCSF). Denna tabell innehåller ingredienserna för beredning av låga och höga KCl artificiella cerebrospinalvätskebuffertar som används vid avbildning och stimulering av neuroner. Se avsnitt 4 för beredningsanvisningar.

  1. Bereda styrylfärglösning genom att ta en 100 μg injektionsflaska med färgämne och rekonstituera den till en beståndskoncentration på 10 mM med destillerat vatten eller neurobasalt medium.

5. Inställning av mikroskop och perfusionssystem

OBS: För avbildning av petriskålar med glasbotten föredras ett inverterat konfokalfluorescensmikroskop på grund av perfusionens flexibilitet och för användning av ett högt numeriskt bländaroljenedsänkningsmål. Se materialförteckningen för konfokalmikroskopet, kameran och målen som används för avbildning av exempel som beskrivs i avsnittet Representativa resultat .

  1. Utför alla experiment vid 37 ° C med konstanta 5% CO2-nivåer med hjälp av ett inkubatorsystemkopplat stegfäste.
  2. Kontrollera bildförvärv med hjälp av konfokal programvara. Optimera förvärvsinställningarna i början av bildsessionen för att välja excitationseffekt och förstärkning för att säkerställa optimal visualisering av signaler utan fotoblekning.
    1. Håll excitationseffekt, exponeringstid, detektorförstärkning och bildhastighet konstant över alla prover. Utför time-lapse-avbildning med ett bildförhållande på 512 x 512 och bildhastighet på 2 bilder/ s för att minimera färgblekning.
      OBS: Medan puncta bör vara tydligt synlig, bör laserintensiteten ställas in på minsta möjliga för att undvika blekning och fototoxicitet. Ställ in den konfokala bländaren på den smalaste inställningen för att uppnå optimal upplösning av fluorescerande punktering inom neuriter. Exponeringstiden är inställd på 200 ms eller mindre, konsekvent mellan prover. Den maximala bildhastigheten för den använda kameran var 2 bilder/s. Om du använder en snabbare kamera kan fler bilder tas. Temporala avbildningsinställningar bör väljas om möjligt.
  3. Välj följande kombinationer av fluorescens excitation/dikroic/emissionsfilter för avbildning med hjälp av konfokal programvara: Gcamp6m/Gcamp3 med FITC respektive styrylfärgämne med TRITC.
  4. Använd den perfekta fokusfunktionen i programvaran för insamling av konfokal bildbehandling under time-lapse-avbildning för att undvika z-drift.
    OBS: På grund av den snabba bildhastigheten avbildas ett enda plan. Att säkerställa bristen på z-drift under experimentet är mycket viktigt.
  5. Välj fliken Tid i bildinsamlingspanelen för att ställa in inspelningsperioder och intervall.
    1. Ställ in fas 1 på intervall 500 ms, varaktighet 3 - 5 min.
    2. Ställ in fas #2 på intervall 500 ms, varaktighet 5 min.
      OBS: Fas #1 motsvarar baslinjeregistrering, fas #2 till stimuleringsperioden, respektive.
  6. Montera gravitationsperfusionsapparater för aCSF med hjälp av ett ventilstyrsystem och ett kanalgrenrör.
    1. Ladda hög KCl (se tabell 1) i en 50 ml spruta högst upp på apparaten, med slangar som löper genom systemet. Ställ in flödeshastigheten på 1 ml/min.
  7. Ladda en 35 mm glasskål som innehåller neuroner på det konfokala avbildningsstadiet, med slutet av perfusionsslangen placerad vid skålkanten. Välj fältet för bildbehandling.

6. Styrylfärgsavbildning av synaptisk vesiklarsättning

  1. Inkubera celler i låg KCl aCSF (se tabell 1) i 10 min vid 37 °C, 48 h efter transfektion.
  2. Ladda primära kortikala eller motoriska neuroner på petriskålar med glasbotten med styrylfärgämne.
    1. Ta bort låg KCl aCSF genom aspiration.
    2. Använd en pipett för att ladda neuroner i mörkret med 10 μM styrylfärgämne i aCSF innehållande 50 mM KCl i 5 min.
    3. Ta bort laddningslösningen och badneuroner i låg KCl aCSF i 10 minuter för att eliminera icke-specifik färgbelastning.
  3. Placera 35 mm glasbottenskålen på bildsteget och observera sedan antingen under ett 20x luftmål eller 40x oljenedsänkningsmål för ett inverterat konfokalmikroskop.
    OBS: Använd GFP-fluorescens för att lokalisera transfekterade celler i fallet med celler som samtransfekteras med en GFP-märkt plasmid.
  4. Excitera styrylfärgämne med hjälp av en 546 nm laser, samla utsläpp med hjälp av ett 630-730 nm (TRITC) bandpassfilter.
  5. Välj bildfältet och engagera perfekt fokus. Ta sedan en enda stillbild med ljusfält, TRITC och fluorescensmarkörkanaler för att markera neuronala gränser.
  6. Initiera Kör nu i förvärvsprogramvaran. Utför basalinspelningen i 3-5 minuter för att utesluta variationer i färgämnesintensitet, om någon (fas #1).
    OBS: Det är viktigt att se till att varje minskning av färgämnesintensiteten beror på synaptisk vesiklarsättning och inte passiv färgdiffusion eller fotoblekning. Denna 3-5 minuters förstimuleringsperiod bör resultera i en stadig och bibehållen färgintensitetsnivå. De sista 30 s av denna inspelning kommer att användas för att bestämma ett genomsnittligt baslinjefluorescensvärde för varje roi. Innan experimentella förhållanden utvärderas kan ett ytterligare icke-stimuleringstillstånd på cirka 10 minuters kontinuerlig inspelning med hjälp av de avsedda förvärvsinställningarna också utföras för att säkerställa stabila fluorescensvärden med hjälp av laserinställningarna under en längre period.
  7. Vid omkopplaren till fas # 2, utlösa På knappen för perfusionssystemet. Sedan, ständigt perfusera 50 mM KCl till neuroner för att underlätta färgämneslossning (fas # 2).
    1. Utför inspelningar i 300 s efter KCl-tillägg. Efter detta stannar förvärvet; utlösa av-knappen för perfusionssystemet.
  8. Spara experimentet och analysera data med hjälp av konfokal programvara enligt beskrivningen i avsnitt 8 nedan.
    OBS: Experimentet kan stoppas vid denna tidpunkt och analys kan utföras senare. Om celler inte kräver transfektion för att uttrycka proteiner av intresse, får detta protokoll utföras när som helst in vitro när man försöker undersöka funktionaliteten hos synaptisk lossning. Efter ett test av kontrollceller för att säkerställa korrekt synaptisk lossning bör experimenteraren vara blind för de genetiska eller farmakologiska förhållandena för varje maträtt som testas för att minimera bias.

7. Fluorescensavbildning av Gcamp6m kalciumtransienter

  1. Transfekta primära kortikala nervceller från gnagare odlade på 35 mm glasbottenskålar med 500 ng Gcamp6m som anges i avsnitt 3.
    OBS: Om så önskas, samtransfektera neuroner med en plasmid av intresse som innehåller en fluorescerande tagg i det röda eller långt röda området.
  2. Inkubera neuroner med låg KCl aCSF i 15 min 48 h efter transfektion och montera sedan skålen på bildplattformen.
  3. Visualisera GCaMP6m-fluorescens med ett FITC-filter (488 nm) och ett 20x eller 40x mål.
  4. Välj bildfältet och engagera perfekt fokus. Ta sedan en enda stillbild med ljusfält, FITC och fluorescensmarkörkanaler för att markera neuronala gränser.
  5. Initiera Kör nu i förvärvsprogramvaran. Utför baslinjeregistreringen i 5 minuter och perfusera sedan med aCSF innehållande 50 mM KCL på samma sätt som beskrivs i avsnitt 6 för styrylfärgsexperiment.
    OBS: Målet med denna avbildning är att mäta framkallade kalciumtransienter. Om en neuron har basal avfyrningsaktivitet och kalciumflöden under förstimuleringsperioden används den inte i dataanalys. Istället används endast celler med stabil bakgrundsfluorescens. Efterstimuleringsperioder kan också förlängas till 60 minuter för kalciumtransienter, med eller utan ytterligare kontinuerlig hög KCl-perfusion.
  6. Spara experimentet och analysera data med hjälp av konfokal programvara enligt beskrivningen i avsnitt 8 nedan. Experimentet kan stoppas vid denna tidpunkt, och analysen kan utföras senare.
    OBS: Om cellerna inte kräver transfektion för uttryck av proteiner av intresse, kan detta protokoll utföras när som helst in vitro när man försöker undersöka kalciumtransienter. Efter ett test av kontrollceller för att säkerställa mätning av kalciumtransienter bör experimenteraren vara blind för de genetiska eller farmakologiska förhållandena för varje maträtt som testas för att minimera bias.

8. Bildanalys

  1. Öppna timelapse-bilder med konfokal programvara.
  2. Justera bilder i timelapse-serien efter kommandoserien: Bild | Bearbetning | Justera aktuellt dokument. Välj Justera till den första bildrutan.
  3. Välj intressanta regioner (ROI) längs neuriter med hjälp av ROI-urvalsverktyget, en bönformad ikon till höger om bildramen (figur 3B). Markera också en ROI som representerar bakgrundsfluorescensintensiteten.
    OBS: ROI väljs genom att välja områden med tydligt separerad puncta längs neuronala spår som indikeras av ljusfältets stillbild. Minst fem ROI per neuron väljs ut för analys. Bakgrundsavkastningen väljs i en region i synfältet som inte innehåller neuriter.
  4. Mät råfluorescens över tid för valda ROI:er med hjälp av följande kommandoserie: Mät | Tidsmätning.
    1. Initiera funktionen Mått i den övre delen av panelen Tidsmätning . En grafisk representation av rå fluorescens över tid (figur 3C) och kvantitativa data genereras båda.
      OBS: Varje datapunkt representerar den råa fluorescensen för den avkastningen för ramen som är associerad med den specifika uppmätta tidpunkten.
  5. Exportera råa fluorescensintensiteter till kalkylarksprogramvaran.
  6. Analysera varje ROI oberoende. Normalisera först data genom att subtrahera bakgrundsavkastningsintensiteten från avkastningen på ränteintensiteten vid varje tidpunkt.
    1. Ta det råa fluorescensvärdet från bakgrundsavkastningen vid varje specifik tidpunkt och subtrahera detta från ROI av intresse råintensitetsvärde vid den tidpunkten.
      OBS: Detta görs under hela inspelningsperioden, både basala och stimuleringsfaser.
  7. Bestäm den genomsnittliga avkastningen på ränteintensiteten för de senaste 30 s av baslinjen.
    1. Medelvärde av de normaliserade råa basalvärdena som genereras i steg 8.6 från de sista 30 s av den 3-5 minuters basala inspelningsperioden.
      OBS: Hela perioden med basal inspelning kan användas för att generera detta värde. Men när detta värde stabiliseras och bibehålls är 60-tidpunkterna för de sista 30 s av tillräcklig provtagningsstorlek för att representera helheten.
  8. Jämför detta baslinjevärde med det normaliserade intensitetsvärdet vid varje tidpunkt, vilket genererar en förändring i fluorescensvärdet (ΔF).
    1. Ta värdet från steg 8.7 och subtrahera det genomsnittliga fluorescerande värdet vid baslinjen. Gör detta och efterföljande steg under hela inspelningsperioden, både basala och stimuleringsfaser.
  9. Beräkna denna förändring avseende baslinjefluorescensvärdet, vilket genererar en förändring i fluorescens / baslinjefluorescens (ΔF / F). För att göra detta, ta värdet från steg 8.8 och dela det med det genomsnittliga fluorescerande värdet vid baslinjen.
  10. Slutligen ställer du in startpunktsvärdet till 1 så att ökningar eller minskningar enkelt kan visualiseras grafiskt över tiden.
    1. Ta värdet som genererades i steg 8.9 och lägg till 1.
      OBS: När detta görs korrekt bör 30 s baslinjeperiodvärden sväva nära värdet 1. I celler som effektivt frigör synaptiskt innehåll bör detta värde trenda från 1 till 0 efter stimuleringens början. Ett exempel på steg 6-9 presenteras i figur 3E.

9. Analys av data

OBS: Experimenten kan avblindas för experimentella förhållanden för att samla data för analys på lämpligt sätt. Använd en provstorlek på minst 10 neuroner per tillstånd från vart och ett av tre oberoende experiment. Överväg endast neuroner för inkludering om minst fem ROI-regioner kan utses. Denna nivå av experimentell replikation var tillräcklig i publicerade studier för att visa en djup förlust av synaptisk lossning i ALS-relaterade poly-GA-innehållande celler jämfört med GFP-kontroller (se Representativa resultat). Men om en mer subtil fenotyp observeras kan antalet biologiska och/eller tekniska replikat kräva optimering av användaren.

  1. Använd alla beräknade ΔF/F-värden över tid från ROI för ett givet experimentellt tillstånd, bestäm ett genomsnittligt ΔF / F-värde för varje tidsperiod tillsammans med en SEM.
  2. Rita data med hjälp av ett graf- och statistikprogram i xy-format, där x är den tid som gått och y är ΔF / F-värdet beräknat i steg 9.1. Presentera alla värden som medelvärde ± SEM.
  3. För att bestämma statistisk signifikans, använd studentens t-test för att jämföra två grupper och envägsanalys av varians (ANOVA) följt av Tukeys posthoc-analys för att jämföra tre eller flera grupper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Efter den framgångsrika implementeringen av ovanstående protokoll visas representativa resultat för ett typiskt styrylfärgämne synaptiskt vesiklarfrisättningsexperiment. Odlade råtta primära kortikala nervceller laddades med färgämne med hjälp av den metod som beskrivs i avsnitt 6. Specificiteten av färgämnesbelastning bestämdes genom sammärkning med synaptisk vesiklarmarkörsynaptofysin. En majoritet av styrylfärgämnets positiva puncta är medpositiva för denna markör (figur 2A). För att avgöra om inställningarna som används för avbildning av styrylfärgämne orsakar fotoblekning, laddas vanligtvis en obehandlad brunn med färgämne och avbildas under en förlängd 10 min-period utan stimulering för att säkerställa att fluorescensvärdena förblir konstanta.

Dessutom visas resultaten igen med hjälp av sammärkning av synaptofysin och styrylfärgämne som i figur 2A. Dessa fluoroforer sambildades med hjälp av det paradigm som anges i avsnitt 6 för TRITC styrylfärgsavbildning, plus dubbel infångning av synaptofysinfluorescens med hjälp av högintensiv laserkraft på DAPI-kanalen för att visualisera mTurquoise-synaptophysin. Visas representativa bilder av synaptiska regioner före och efter stimulering (figur 2B). Även om denna metod är en indirekt slutsats för brist på fotoblekning, avslöjar analys av råintensitetsvärdena under hela bildperioden att synaptofysinintensiteten förblir konstant, medan styrylfärgintensiteten sjunker efter stimulering (Figur 2C). Således, med detta experiment och våra andra kontroller av stabil fluorescens före stimulering och under längre perioder i icke-stimuleringsbrunnar, har vi fastställt att minskningar av styrylfluorescens kan hänföras till synaptisk lossning genom KCl-depolarisering snarare än fotoblekningseffekter.

Figure 2
Figur 2: Bedömning av specificitet och avbildningsparametrar för märkning av styrylfärgämnen. (A) En representativ 40x bild av en styrylfärgämnesmärkt råttkortikal neuron (röd), som transfekterades 24 timmar tidigare med en plasmid för att uttrycka mTurquoise2-synaptophysin61 som drivs av synapsinpromotorn (grön). Samlokalisering av dessa två fluoroforer indikerar att en stor majoritet av styrylfärgämnets positiva puncta är samfärgade med synaptisk vesiklarmarkörsynaptofysin. Skalstången indikerar 5 μm. (B) Kortikala neuroner transfekterades och styrylfärgämne laddades som i (A) och avbildades enligt styrylfärgparadigmet tillsammans med dubbel fluorescensfångst av mTurquoise-synaptophysin på DAPI-kanalen. Representativa bilder visar synaptofysin och styrylfärgämne puncta regioner före och efter stimulering. Skalstången indikerar 5 μm. (C) Fluorescens övervakades över tid för synaptofysin (DAPI-kanaltopp) och styrylfärgämne (FITC-kanalbotten). Synafysinintensiteten upprätthölls vid en stadig fluorescens under avbildnings- och stimuleringsperioden, medan styrylfärgfluorescensen minskade när färgämnet lossades vid stimulering. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Representativa bilder visar laddningen av styrylfärg under avbildning, med val av AVKASTNING (figur 3A-B). Den råa fluorescensintensiteten för utvalda ROI och en bakgrundsavkastning plottas med hjälp av konfokalprogramvaran (figur 3C). Neuronerna som visas här transfekterades också med plasmider för att studera effekterna av dipeptidproteiner som produceras i samband med C9ORF72-ALS, nämligen FLAG-eGFP och FLAG-GA50-eGFP som drivs av T7-promotorn. Framgångsrik synaptisk vesiklarsättning resulterar i slående förlust av färgämnesfluorescens vid hög KCl-depolarisering (figur 3D, topp två paneler) för en GFP-transfekterad kontrollneuron. En representativ video som ingår här visar hur detta visas under avbildning. Dessutom lossar en neuron selektivt styrylfärgämne i en neuritregion efter stimulering (Video 1).

Å andra sidan representeras nedsatt synaptisk överföring av bibehållen färgämnesfluorescens även efter hög KCl-depolarisering i neuroner transfekterade med en C9ORF72-länkad dipeptidupprepningskonstruktion (GA50) (Figur 3D, nedre två paneler)43. Efter kvantitativ dataanalys (figur 3E) representeras data som färgämnesintensitet under hela avbildningen för kontrollgrupperna (GFP) och ALS/FTD (GA50) (figur 3F)43. Denna metod kan också analysera mellanliggande effekter och är inte bara ett "allt eller inget" binärt mått. I experiment utformade för att rädda de synaptiska underskotten medierade av GA50 introducerades exogent synaptiskt vesikolassocierat protein 2 (SV2) genom lentiviral transduktion med användning av rSV2a-eGFP-pRRL-plasmiden som drivs av den humana PGK-promotorn. Efter avbildning och analys som beskrivits ovan räddades synaptisk avfyrning i neuroner som samuttrycker GA50 och SV2 (figur 3G).

Figure 3
Figur 3: Utvärdering av synaptisk vesiklarsättning genom märkning av styrylfärgämne. (A) En representativ 40x bild av en styrylfärgämnesmärkt neuron i lågt KCl aCSF-media i början av ett bildexperiment. Skalstången indikerar 20 μm. (B) Skildring av ROI-generering på bilden från (A). Specifika punkteringsregioner längs neuriter (#1-4) väljs med ROI-verktyget, den bönformade knappen markerad till höger. En slutlig ROI väljs i ett tomt område för att fånga bakgrundssignalintensiteten. Områden med icke-specifika, icke-neuronala ljuspunkter undviks. Skalstången indikerar 20 μm. (C) Representation av signalintensiteterna för ROI # 1-5 från (B) över tiden som graferad / avbildad av konfokal programvara. (D) Visuella representationer av ROI-regioner före / efter stimulering för en neuron som effektivt genomgår synaptisk överföring (topp två paneler). De två nedersta panelerna är zoomade bilder med ett opartiskt tröskelvärde som tillämpas för att isolera puncta från bakgrunden för att visa distinkta regioner visuellt. GFP-innehållande neuroner genomgår effektivt synaptisk frisättning, medan uttryck av C9ORF2-ALS-relaterad peptid GA50 förhindrar denna effekt. Skalstänger indikerar 10 μm-Omtryckt från Jensen et al. (E) Exempel på en kvantifieringsfil med hjälp av kalkylprogram, som visar normalisering av värden till baslinjen och generering av ΔF/F-värden över tid. Data normaliseras först till bakgrundens ROI-intensitetsvärde vid varje tidpunkt. Detta värde jämförs sedan med det genomsnittliga ROI of interest baseline value för de senaste 30 s förstimuleringen (visas här som 10 s i 1 s intervall för enkelhetens skull) (ΔF). Denna förändring beräknas därefter som en bråkdel av baslinjefluorescensen (ΔF / F). Slutligen är startpunktsvärdet inställt på 1 så att ökningar eller minskningar enkelt kan visualiseras grafiskt över tiden. Minst fem punkteringsregioner per neuron och minst tio neuroner per experimentellt tillstånd samlas in, med data som denna kombinerad för att generera genomsnittliga mätningar vid varje tidpunkt. (F) Data från en kalkylarksfil som i (E) flyttas till ett graf- och statistikprogram. För diagrammet som visas här ritas ΔF / F-värdet vid varje tidpunkt i genomsnitt över alla punkteringsregioner i ett experimentellt tillstånd, tillsammans med dess standardfel av medelvärdet. Grafen här är data från GFP kontra GA50-experimenten som anges i (D), där de sista 10 s av baslinjen och de första 10 s av stimuleringsperioden visas-omtryckta från Jensen et al. (G) Denna analys kan producera kurvor för mellanliggande synaptisk frisättning och är inte bara ett "allt eller inget" -svar. GA50 uttrycktes samtidigt med exogent synaptiskt protein SV2 (synaptiskt vesiklarassocierat protein 2), och avbildning och analys av styrylfärgämne utfördes enligt vad som indikerades i föregående steg. Liksom i figur 3F representerar diagrammet som visas här ΔF / F-värdet vid varje tidpunkt som är medelvärdet över alla punkteringsregioner i ett experimentellt tillstånd ritas, tillsammans med dess standardfel av medelvärdet. Diagrammet visar den sista minuten av baslinjen och den första minuten av stimuleringsperioden från Jensen et al. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Video 1: Representativ video av styrylfärgsbildexperiment. Visas är en representativ video av en kortikal neuron laddad med styrylfärgämne. Videon visar perioden som börjar vid tidpunkten för badperfusion av hög KCl aCSF. Den boxade regionen belyser neuriterna, med observerbar förlust av puncta fluorescens över tiden. Klicka här för att ladda ner den här videon.

Enligt den metod som beskrivs i avsnitt 7 visas representativa fluorescensbilder av kortikala nervceller transfekterade med GcaMP6m före och efter KCl-depolarisering (figur 4A). Råintensitetsgrafer visar ökade fluorescensvärden som fluktuerar, vilket indikerar kalciuminträde i neuriter efter KCl-inducerad depolarisering (Figur 4B). Denna andra representativa video visar neuroner som uttrycker GcaMP6m med låg fluorescens i slutet av inspelningsbaslinjeperioden för att visa denna effekt. I början av stimuleringen visar neuronerna en dramatisk fluorescensökning (Video 2). Detta tillvägagångssätt har framgångsrikt använts för att demonstrera kalciuminträdesförändringar i en mutant FUS-ALS-modell. Astrocyter i denna modell transducerades med adenovirus innehållande CMV-promotordrivna eGFP-FUS-plasmider. När konditionerat medium från muterade FUS-uttryckande astrocyter placerades på motorneuroner observerades ökad kalciumtillströmning jämfört med icke-mutanta FUS-tillstånd efter α-amino-3-hydroxi-5-metyl-4-isoxazolpropionsyra (AMPA) +cyklotiazidstimulering (figur 4C)44. Känsligheten hos denna analys har testats genom att utföra experiment med och utan kalcium som ingår i perfusionsmediet. I inställningen av GFP kontra GA50 som nämns ovan observerades ökade toppkalciumtransienter i GA50 innehållande motorneuroner. I synnerhet berodde detta på kalcium som kom in i cellen och inte frisättningen av interna kalciumbutiker. När kalcium avlägsnades från det stimulerande aCSF-mediet noterades inga kalciumövergående svar i något av experimenttillstånden (figur 4D)43.

Figure 4
Figur 4: Observera kalciumtransienter i realtid med GCaMP-reportrar. (A) En 40x bild av en GCaMP6m som uttrycker neuron, pseudofärgad för att visa intensiteten av GFP-fluorescens (låg i blått till högt i rött). Vänstra paneler visar hela 40x synfältet före och efter stimulering. Skalstången indikerar 20 μm. Bilderna till höger är zoomade versioner av de boxade områdena som avslöjas. Genom dessa bilder är det uppenbart för ögat att det finns en robust ökning av fokala neuritiska kalciumnivåer efter stimulering. Skalstången indikerar 12 μm. (B) ROI-urval och fluorescensintensitetsövervakning under hela experimentet utförs som i figur 3. De sista 30 s av baslinjen och 1 min stimulering för två utvalda ROI för en neuron som genomgår GCaMP6m fluorescensövervakning visas här. Till skillnad från styrylfärgsavbildning ökar fluorescensintensiteten efter neuronal stimulering. Dessutom, som noteras här, fluktuerar kalciumtransienter i neuriter över tiden; Därför representeras resultaten vanligtvis som det genomsnittliga högsta normaliserade fluorescensförändringsvärdet för varje ROI-region. (C) Representativ kvantifiering av ett sådant experiment visas som publicerades i Kia-McAvoy et al. 201844, där primära motorneuroner som fick supernatant härrörande från mutanta FUS-ALS-astrocyter visade signifikant ökad tillströmning av kalcium efter AMPA-receptorstimulering, jämfört med neuroner som fick supernatant från vildtyp FUS som uttrycker astrocyter. (D) Representativ kvantifiering av kalciumövergående avbildning där kalcium inte ingick i den stimulerande aCSF. Visas är villkor för mCherry kontra GA50-mCherry stimulerad med hög KCl aCSF med eller utan kalcium som publicerades i Jensen et al. GA50 innehållande nervceller uppvisade ökad topp kalciuminflöde jämfört med mCherry innehållande celler. Det fanns ingen förhöjning av interna kalciumnivåer i något experimentellt tillstånd när kalcium avlägsnades från att stimulera hög KCL aCSF. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Video 2: Representativ video av GCaMP kalcium övergående experiment. Visas är en representativ video av ett fält av kortikala neuroner transfekterade med GCaMP6m. Efter en baslinjeperiod noteras en stor kalciumtillströmning vid 6 s-märket när hög KCl aCSF applicerades. Kalciuminträde kan mätas antingen för hela cellen eller vid specifika neuritregioner enligt beskrivningen. Klicka här för att ladda ner den här videon.

Potentiella problem Möjliga orsaker/lösning
1 Icke-specifik lastning Var exakt med laddningstiden. Längre laddningstider resulterar i icke-specifik laddning av FM4-64 i endosomer och lysosomer
2 Ingen märkbar exocytos i kontrollneuroner Kontrollera pH för hög KCl aCSF-lösning.
3 Förlust av fokus och lateral drift Se till att perfekt fokus är på. Justera bilderna efter avbildning med Nikon-programvaran eller ImageJ-plugin-programmet.
4 Blekning av FM4-64 fluorescens Kontrollera laserintensiteten som används för avbildning. Försök alltid att använda lägsta möjliga intensitet. Bekräfta att den laserintensitet som används inte resulterar i blekning genom att köra provkörningar.

Tabell 2: Möjliga problem och felsökning för styrylfärgexperiment. Vanliga scenarier för problem och allmän felsökning för synaptiska lossningsexperiment.

Potentiella problem Möjliga orsaker/lösning
1 Transfektionseffektiviteten är för låg Kontrollera neuronal hälsa. Om nervceller är svåra att transfektera kan man byta till AAV eller lentiviral transduktion av GCaMP.
2 Ackumulering av GCaMP6-fluorescens i kärnan Äventyrad neuronal hälsa. Kontrollera transfektionsprotokollet.
3 Förlust av fokus och lateral bilddrift Se till att perfekt fokus är på. Justera bilderna efter avbildning med Nikon-programvaran eller ImageJ-plugin-programmet.
4 Inget kalciumsvar vid KCL-stimulering Se till att pH för aCSF är korrekt.
5 Blekning av GCaMP6-fluorescens Kontrollera laserintensiteten som används för avbildning. Försök alltid att använda lägsta möjliga intensitet. Bekräfta att den laserintensitet som används inte resulterar i blekning genom att köra provkörningar.
6 Blebbing av neuriter Komprometterad neuronal hälsa på grund av transfektion. Använd en ny sats neuronala kulturer.

Tabell 3: Möjliga problem och felsökning för avbildning av kalciumtransienter i neuriter. Typiska scenarier för problem och allmän felsökning för GCaMP-kalciumövergående experiment.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tre steg som är gemensamma för båda metoderna som beskrivs är av avgörande betydelse för experimentell framgång och kvantifierbara resultat. För det första är det viktigt att förbereda färsk aCSF före varje experimentomgång enligt bifogade instruktioner. Underlåtenhet att göra detta kan förhindra lämplig neuronal depolarisering. Ett prov av obehandlade kontrollneuroner bör ständigt testas före stimulering av några experimentella grupper för att säkerställa korrekt cellulär depolarisering och ge ett riktmärke för positiva resultat som erhållits under den avbildningssessionen. För det andra, för att framgångsrikt spåra fluorescens över tid för specifika synaptiska regioner, bör särskild försiktighet också iakttas vid fastställandet av bildparametrar och områden med avkastning på marknaden för övervakning. Registreringen av referensperioden bör omedelbart övergå till registreringsperioden för stimulering. En tillräckligt snabb bildhastighet (2 bilder / s) krävs för att fånga den enda sönderfallsdynamiken för frisättning av styrylfärgämne. Slutligen är ett kritiskt steg i analysen av experiment normaliseringen av fluorescensmätningar först till bildbakgrunden och sedan till den förstimulerade baslinjen. Som med andra bildprotokoll utförs subtraktion av ett tomt bildområde först över alla parade tidsfluorescensmätningar för att avlägsna eventuell bakgrundsautofluorescens som tillsatsen av KCl-media kan införa. Det är också viktigt att mäta och beräkna den genomsnittliga fluorescensavläsningen för varje ROI från de senaste 30 s baslinjen före stimulering. Detta genomsnittliga startvärde används sedan i alla tidsmätningar för den avkastningen som en definierad utgångspunkt för att kvantifiera intensiteten "förändring från baslinjen".

Primär neuronal kultur är notoriskt svår att transfektera med exogent DNA, och även optimerade protokoll ger ofta låg effektivitet av totala celler i odling. 20% -25% av transfektionseffektiviteten uppnås vanligtvis i våra neuronala kulturer, utan tecken på transfektionsinducerad toxicitet. Medan ganska konsekventa uttryck ses över celler som innehåller GCaMP, betraktas subtilt olika nivåer av sonduttryck inom enskilda celler baserat på metoden för individuell regionkvantifiering av förändring i baslinjefluorescens jämfört med den baslinjen. Med denna relativt låga effektivitet är det emellertid inte tillräckligt robust att använda transfektionsbaserade metoder för att introducera GCaMP-reportern för storskaliga biologiska replikat för screeningstudier med hög genomströmning. För att övervinna detta är flera variantkonstruktioner kommersiellt tillgängliga för lentiviral eller adenoviral förpackning eller celllinjespecifikt uttryck, vilket möjliggör högre transduktionseffektivitet. En primär modifiering som kan önskas vid användning av dessa protokoll är att använda optogenetisk stimulering av neuroner istället för badapplikation av KCl62. Transduktion med lentivirala konstruktioner utformade för att uttrycka en av familjerna av nu tillgängliga kanalrhodopsiner, följt av aktivering med specifika våglängder av ljus, möjliggör rumslig kontroll för depolarisering av delmängder av neuroner och även för utvärdering av effekten av tåg av åtgärdspotentialer på repetitiva kalciuminflödesnivåer och utarmning av synaptiska vesikollagrener63 . Det är emellertid viktigt att komma ihåg att användningen av denna metod för närvarande är något begränsad, eftersom användaren måste se till att deras optogenetiska reporter, synaptiska reporter och eventuella ytterligare exogent införda proteiner inte har spektral överlappning mellan använda fluoroforer. Ett vanligt felsökningsproblem med styrylfärgämnet är passiv intensitetsminskning under baslinjeinspelningsperioden. Före experimentella studier är det viktigt att optimera laserintensiteten och fotograferingsintervallen för att minimera fotoblekningseffekterna. För att experiment ska kunna övervägas krävs stabilisering av intensiteten under minst de sista 30 s av baslinjeperioden. Se tabellerna 2 och 3 för vanliga problem och deras lösningar för styrylfärgämne respektive kalciumövergående experiment.

Den primära begränsningen av dessa två metoder är att kulturer endast kan stimuleras och undersökas i ett enda fall. Eftersom badapplikation används för att introducera det depolariserande medlet KCl, måste alla neuroner som ska undersökas från det tillståndet i den skålen ligga inom det ursprungliga synfältet för mikroskopmålet. Om funktionalitet över tid är av intresse krävs parade kulturer. Den ovan nämnda optogenetiska metoden gör emellertid att kalciumdynamiken kan observeras över tiden om så önskas. Dessutom, om neuroner har en defekt i återvinningen av synaptiska vesiklar, kommer den initiala belastningen av styrylfärgämnet att försämras. Medan normalisering av intern intensitet möjliggör jämförelse mellan förhållanden, kan små skillnader i svarens storlek vara svåra att upptäcka. Slutligen har nya iterationer av dessa reportrar snabbt blivit tillgängliga och kan bytas ut för snabbare detekteringstider eller mer robusta resultat. Till exempel anses GCaMP6m inte längre vara den snabbaste reportern av kalciumtransienter vid synaptiska terminaler. Istället kan man använda den senaste generationen jGCaMP864.

De metoder som beskrivs här är ett snabbt och tillförlitligt sätt att avgöra om genetisk eller farmakologisk manipulation av neuroner stör funktionell synaptisk signalering och frisättning. De detaljerade experimenten är mindre tekniskt utmanande och billigare än traditionell spännings- / strömklämelektrofysiologi och elektronmikroskopi. Dessutom, medan elektrofysiologi av naturen är låg genomströmning och på den enskilda cellnivån, är protokollen som beskrivs här högre genomströmning och snabb, vilket gör att flera neuroner kan avbildas samtidigt och många iterationer kan utföras i en enda bildsession. Det föreslås att dessa kalciumdynamik och synaptiska frisättningsparadigmer används som den första indikatorn på synaptiska överföringsförändringar i ALS-modeller och studien av andra former av neuronal degeneration. Även om slutsatserna från Gcamp6m och styrylfärgsavbildning inte exakt kan reta ut en specifik mekanism för synaptisk dysfunktion, baserat på sådana fynd, kan forskare sedan genomföra riktade, evidensbaserade kompletterande studier med traditionella metoder för att bestämma involverade kanaler, synaptiskt vesiblad eller kvantinnehåll.

Nyttan i dessa protokoll är den snabba och enkla bedömningen av förändringar i korrekt depolariseringsmedierad kalciuminflöde och / eller synaptisk vesiklarfusion i specifika ALS-modeller. Vi har nyligen visat detta i en publikation som visar ökad kalciumtillströmning och upphävande av synaptisk lossning i kortikala nervceller som uttrycker dipeptidproteinet (glycin-alanin)50 till följd av C9ORF72 hexanukleotidupprepningsexpansion43. Som framgår av vårt publicerade arbete kan dessa metoder enkelt utföras i kombination med samtransfektion av muterade RNA eller proteiner av intresse eller i celler odlade direkt från transgena djurmodeller43. Dessutom har tillförlitligheten och robustheten hos dessa protokoll framgångsrikt testats i neuronalt differentierade humant inducerade pluripotenta stamceller45, vilket gör det möjligt att göra framtida studier direkt i patienthärledda sjukdomsrelevanta celler. I ett annat nytt manuskript ger vi bevis för att motorneuroner av vild typ genomgår hög kalciuminflöde efter stimulering när de är i närvaro av en löslig faktor som frigörs från mutant FUS som uttrycker astrocyter44. Astrocytiska kalciumsignalhändelser är också djupt sammanflätade med den synaptiska överföringen i närliggande nervceller65. Kalciumdynamikprotokollet har tillämpats för att undersöka helcelliga kalciumtransienter i modeller av astrocytisk odling, vilket har visat sig vara effektivt i både gnagare primära och mänskliga IPS-härledda celler. Ytterligare förståelse av astrocytisk kalciumdynamik och signalering i ALS-modeller kommer att ge värdefull insikt i hur synaptisk överföring följaktligen påverkas. I slutändan kommer att använda celltypsspecifika GCaMP-reportrar också att vara ett kraftfullt verktyg för att undersöka neuronal och astrocytisk kalciumdynamik i blandade samodlingsinställningar och specifikt utvärdera icke-cellautonoma effekter som härrör från varje cellpopulation.

Slutligen sträcker sig den potentiella användningen av dessa metoder inte bara utöver studien av ALS, utan också till de bredare områdena neurodegenerativ och till och med utvecklingsneurovetenskap. Detaljerad information om de specifika plasmider som används för att generera de representativa resultaten tillhandahålls och lyckas vid transfektering av plasmider som innehåller många olika genetiska varianter av FUS, SOD1 och C9ORF72 hexanukleotidupprepningar och dipeptider43,44,66,67,68. Förutsatt att plasmider innehåller en promotor som används i neuroner, finns det ingen begränsning för vilka modeller av ALS eller degenerativ sjukdom som kan studeras med hjälp av dessa metoder. Dessutom är transfektion för att uttrycka muterade proteiner ett helt valfritt steg. Kulturer som genereras från transgena djur eller mänskliga patient-härledda celler eliminerar behovet av att identifiera celler som innehåller det mutanta proteinet av intresse. För närvarande är dessa system begränsade på det sättet att om styrylfärg kommer att användas, är TRITC-kanalen upptagen, och om GcaMP6 används är FITC-kanalen upptagen. Tekniker som möjliggör undersökning av neuronal och astrocytisk aktivitet i realtid breddar möjligheterna att förstå tidskursanalys för synaptisk mognad / degeneration, samt snabbtester för effekten av farmakologiska föreningar för att främja eller undertrycka neuronal kommunikation. Dessa två metoder är mottagliga för skalning med högt dataflöde för screening. I stället för att plätera neuroner i enskilda 35 mm-diskar kan bildparametrarna för dessa två protokoll användas på ett automatiserat sätt över 96-brunnsplattor. Med hjälp av en sådan plattform kan sammansatta bibliotek snabbt testas för terapier, som modulerar kalciuminträde eller förbättrar synaptisk frisättning med hjälp av en genetisk modell av sjukdom eller till och med celler som härrör direkt från patienter. Denna metod kan påskynda möjligheten till subgruppsspecifika eller till och med personliga terapier genom att snabbt identifiera kandidatmolekyler för vidare undersökning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några intressekonflikter.

Acknowledgments

Vi vill tacka de nuvarande och tidigare medlemmarna i Jefferson Weinberg ALS Center för kritisk feedback och förslag för att optimera dessa tekniker och deras analyser. Detta arbete stöddes av finansiering från NIH (RF1-AG057882-01 och R21-NS0103118 till D.T), NINDS (R56-NS092572 och R01-NS109150 till P.P), Muscular Dystrophy Association (D.T.), Robert Packard Center for ALS Research (D.T.), Family Strong 4 ALS Foundation och Farber Family Foundation (B.K.J., K.K och P.P).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20x air objective Nikon For imaging
40x oil immersion objective Nikon For imaging
B27 supplement Thermo Scientific 17504044 Neuronal growth supplement
BD Syringes without Needle, 50 mL Thermo Scientific 13-689-8 Part of gravity perfusion assembly
Biosafety cell culture hood Baker SterilGARD III SG403A Asceptic cell culturing, transfection, and dye loading
b-Mercaptoethanol Millipore Sigma M3148 For culturing and maintenance of neuronal cultures
Bovine Serum Albumin Millipore Sigma A9418 For preparing neuronal cultures
Calcium chloride dihydrate Millipore Sigma 223506 Component of aCSF solutions
Cell culture CO2 incubator Thermo Scientific 13-998-123 For culturing and maintenance of neurons
Centrifuge Eppendorf 5810R For neuronal culture preparation
Confocal microscope Nikon Eclipse Ti +A1R core For fluorescence imaging
CoolSNAP ES2  CCD camera Photometrics For image acquisition
D-Glucose Millipore Sigma G8270 Component of aCSF solutions
DNase Millipore Sigma D5025 For neuronal culture preparation
Female, timed-pregnancy Sprague Dawley rats Charles river 400SASSD For preparing embryonic cortical and spinal motor neuron cultures
FITC Filter cube Nikon 77032509 For imaging Gcamp calcium transients
FM4-64 styryl dye Invitrogen T13320 For imaging synaptic vesicle release
Glass bottom petri dishes (Thickness #1.5) CellVis D35-10-1.5-N For growth of neurons on imaging-compatible culture dish
Glass Pasteur pipette Grainger 52NK56 For preparing neuronal cultures
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Millipore Sigma H6648 For preparing neuronal cultures
HEPES Millipore Sigma H3375 Component of aCSF solutions
High KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF) For imaging. Please see recipes*
horse serum Millipore Sigma H1138 For culturing and maintenance of neurons
Laminar flow dissection hood NUAIRE NU-301-630 For preparing neuronal cultures
Laminin Thermo Scientific 23017015 For preparing neuronal cultures
Leibovitz's L-15 Medium Thermo Scientific 11415064 For preparing neuronal cultures
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red Thermo Scientific 21083027 For preparing neuronal cultures
L-Glutamine (200 mM) Thermo Scientific 25030149 Neuronal culture supplement
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Scientific 11668019 For neuronal transfections
Low KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF) For imaging. Please see recipes*
Magnesium chloride Millipore Sigma 208337 Component of aCSF solutions
Microsoft Excel Microsoft Software for data analysis/normalization
Nalgene  Filter Units, 0.2 µm PES Thermo Scientific 565-0020 Filter unit for aCSF solution
Neurobasal medium Thermo Scientific 21103049 For culturing and maintenance of neuronal cultures
NIS-Elements Advanced Research Nikon Software for image capture and analysis
Nunc 15 mL Conical tubes Thermo Scientific 339650 For preparing neuronal culture and buffer solutions
Nunc 50 mL conical tubes Thermo Scientific 339652 For preparing neuronal culture and buffer solutions
Optiprep Millipore Sigma D1556 For preparing neuronal cultures
Papain Millipore Sigma P4762 For preparing neuronal cultures
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Scientific 15140122 To prevent bacterial contamination of neuronal cultures
Perfusion system Warner Instruments SF-77B For exchange of aCSF
Perfusion tubing Cole-Parmer UX-30526-14 Part of gravity perfusion assembly
pGP-CMV-Gcamp6m plasmid Addgene 40754 For imaging calcium transients
Poly-D-lysine hydrobromide Millipore Sigma P7886 Coating agent for glass bottom petri dishes
Potassium chloride Millipore Sigma P3911 Component of aCSF solutions
Sodium bicarbonate Millipore Sigma S5761 Component of aCSF solutions
Sodium Chloride Millipore Sigma S9888 Component of aCSF solutions
Stage Top Incubator Tokai Hit For incubation of live neurons during imaging period
TRITC Filter cube Nikon 77032809 For imaging FM4-64
Trypsin Inhibitor Millipore Sigma T6414 For preparing neuronal cultures
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Thermo Scientific 25200056 For preparing neuronal cultures
Vibration Isolation table New Port VIP320X2430-135520 Table/stand for microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gibson, S. B., et al. The evolving genetic risk for sporadic ALS. Neurology. 89 (3), 226-233 (2017).
  2. Kim, G., Gautier, O., Tassoni-Tsuchida, E., Ma, X. R., Gitler, A. D. ALS genetics: Gains, losses, and implications for future therapies. Neuron. 108 (5), 822-842 (2020).
  3. Nijssen, J., Comley, L. H., Hedlund, E. Motor neuron vulnerability and resistance in amyotrophic lateral sclerosis. Acta Neuropathologica. 133 (6), 863-885 (2017).
  4. Marttinen, M., Kurkinen, K. M., Soininen, H., Haapasalo, A., Hiltunen, M. Synaptic dysfunction and septin protein family members in neurodegenerative diseases. Molecular Neurodegeneration. 10, 16 (2015).
  5. Bae, J. S., Simon, N. G., Menon, P., Vucic, S., Kiernan, M. C. The puzzling case of hyperexcitability in amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Clinical Neurology. 9 (2), 65-74 (2013).
  6. Kiernan, M. C. Hyperexcitability, persistent Na+ conductances and neurodegeneration in amyotrophic lateral sclerosis. Experimental Neurology. 218 (1), 1-4 (2009).
  7. Krarup, C. Lower motor neuron involvement examined by quantitative electromyography in amyotrophic lateral sclerosis. Clinical Neurophysiology. 122 (2), 414-422 (2011).
  8. Vucic, S., Nicholson, G. A., Kiernan, M. C. Cortical hyperexcitability may precede the onset of familial amyotrophic lateral sclerosis. Brain. 131, Pt 6 1540-1550 (2008).
  9. Marchand-Pauvert, V., et al. Absence of hyperexcitability of spinal motoneurons in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Physiology. 597 (22), 5445-5467 (2019).
  10. Fischer, L. R., et al. Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: evidence in mice and man. Experimental Neurology. 185 (2), 232-240 (2004).
  11. Markert, S. M., et al. Overexpression of an ALS-associated FUS mutation in C. elegans disrupts NMJ morphology and leads to defective neuromuscular transmission. Biology Open. 9 (12), (2020).
  12. Shahidullah, M., et al. Defects in synapse structure and function precede motor neuron degeneration in Drosophila models of FUS-related ALS. Journal of Neuroscience. 33 (50), 19590-19598 (2013).
  13. Liu, Y., et al. C9orf72 BAC Mouse Model with Motor Deficits and Neurodegenerative Features of ALS/FTD. Neuron. 90 (3), 521-534 (2016).
  14. Freibaum, B. D., et al. GGGGCC repeat expansion in C9orf72 compromises nucleocytoplasmic transport. Nature. 525 (7567), 129-133 (2015).
  15. Zhang, K., et al. The C9orf72 repeat expansion disrupts nucleocytoplasmic transport. Nature. 525 (7567), 56-61 (2015).
  16. Perry, S., Han, Y., Das, A., Dickman, D. Homeostatic plasticity can be induced and expressed to restore synaptic strength at neuromuscular junctions undergoing ALS-related degeneration. Human Molecular Genetics. 26 (21), 4153-4167 (2017).
  17. Romano, G., et al. Chronological requirements of TDP-43 function in synaptic organization and locomotive control. Neurobiology of Disease. 71, 95-109 (2014).
  18. Armstrong, G. A., Drapeau, P. Calcium channel agonists protect against neuromuscular dysfunction in a genetic model of TDP-43 mutation in ALS. Journal of Neuroscience. 33 (4), 1741-1752 (2013).
  19. Diaper, D. C., et al. Loss and gain of Drosophila TDP-43 impair synaptic efficacy and motor control leading to age-related neurodegeneration by loss-of-function phenotypes. Human Molecular Genetics. 22 (8), 1539-1557 (2013).
  20. Schwiening, C. J. A brief historical perspective: Hodgkin and Huxley. Journal of Physiology. 590 (11), 2571-2575 (2012).
  21. Dong, H., et al. Curcumin abolishes mutant TDP-43 induced excitability in a motoneuron-like cellular model of ALS. Neuroscience. 272, 141-153 (2014).
  22. Chand, K. K., et al. Defects in synaptic transmission at the neuromuscular junction precede motor deficits in a TDP-43(Q331K) transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 32 (5), 2676-2689 (2018).
  23. Perkins, E. M., et al. Altered network properties in C9ORF72 repeat expansion cortical neurons are due to synaptic dysfunction. Molecular Neurodegeneration. 16 (1), 13 (2021).
  24. Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P. Vesicle hypothesis of the release of quanta of acetylcholine. Physiological Reviews. 60 (2), 396-441 (1980).
  25. Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
  26. Ryan, J., Gerhold, A. R., Boudreau, V., Smith, L., Maddox, P. S. Introduction to Modern Methods in Light Microscopy. Methods in Molecular Biology. 1563, 1-15 (2017).
  27. Wang, L., Frei, M. S., Salim, A., Johnsson, K. Small-molecule fluorescent probes for live-cell super-resolution microscopy. Journal of the American Chemical Society. 141 (7), 2770-2781 (2019).
  28. Neher, E. Vesicle pools and Ca2+ microdomains: new tools for understanding their roles in neurotransmitter release. Neuron. 20 (3), 389-399 (1998).
  29. Dolphin, A. C., Lee, A. Presynaptic calcium channels: specialized control of synaptic neurotransmitter release. Nature Reviews Neuroscience. 21 (4), 213-229 (2020).
  30. Tsien, R. Y., Rink, T. J., Poenie, M. Measurement of cytosolic free Ca2+ in individual small cells using fluorescence microscopy with dual excitation wavelengths. Cell Calcium. 6 (1-2), 145-157 (1985).
  31. Takahashi, N., et al. Cytosolic Ca2+ dynamics in hamster ascending thin limb of Henle's loop. American Journal of Physiology. 268 (6), Pt 2 1148-1153 (1995).
  32. Cleemann, L., DiMassa, G., Morad, M. Ca2+ sparks within 200 nm of the sarcolemma of rat ventricular cells: evidence from total internal reflection fluorescence microscopy. Advances in Experimental Medicine and Biology. 430, 57-65 (1997).
  33. Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B. Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium. Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).
  34. Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).
  35. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  36. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
  37. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  38. Horikawa, K. Recent progress in the development of genetically encoded Ca2+ indicators. Journal of Medical Investigation. 62 (1-2), 24-28 (2015).
  39. Bohme, M. A., Grasskamp, A. T., Walter, A. M. Regulation of synaptic release-site Ca(2+) channel coupling as a mechanism to control release probability and short-term plasticity. Federation of European Biochemical Society Letters. 592 (21), 3516-3531 (2018).
  40. Li, Y. C., Kavalali, E. T. Synaptic vesicle-recycling machinery components as potential therapeutic targets. Pharmacological Reviews. 69 (2), 141-160 (2017).
  41. Gaffield, M. A., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle exocytosis and endocytosis with FM dyes. Nature Protocols. 1 (6), 2916-2921 (2006).
  42. Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the Drosophila neuromuscular junction. Methods in Molecular Biology. 440, 349-369 (2008).
  43. Jensen, B. K., et al. Synaptic dysfunction induced by glycine-alanine dipeptides in C9orf72-ALS/FTD is rescued by SV2 replenishment. European Molecular Biology Organization Molecular Medicine. 12 (5), 10722 (2020).
  44. Kia, A., McAvoy, K., Krishnamurthy, K., Trotti, D., Pasinelli, P. Astrocytes expressing ALS-linked mutant FUS induce motor neuron death through release of tumor necrosis factor-alpha. Glia. 66 (5), 1016-1033 (2018).
  45. Fernandopulle, M. S., et al. Transcription Factor-Mediated Differentiation of Human iPSCs into Neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 51 (2018).
  46. Ye, L., Haroon, M. A., Salinas, A., Paukert, M. Comparison of GCaMP3 and GCaMP6f for studying astrocyte Ca2+ dynamics in the awake mouse brain. Public Library of Science One. 12 (7), 0181113 (2017).
  47. Angleson, J. K., Betz, W. J. Monitoring secretion in real time: capacitance, amperometry and fluorescence compared. Trends in Neuroscience. 20 (7), 281-287 (1997).
  48. Ryan, T. A., et al. The kinetics of synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic boutons. Neuron. 11 (4), 713-724 (1993).
  49. Kraszewski, K., et al. Synaptic vesicle dynamics in living cultured hippocampal neurons visualized with CY3-conjugated antibodies directed against the lumenal domain of synaptotagmin. Journal of Neuroscience. 15 (6), 4328-4342 (1995).
  50. Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. Journal of Neuroscience. 12 (2), 363-375 (1992).
  51. Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255 (5041), 200-203 (1992).
  52. Ryan, T. A., Smith, S. J. Vesicle pool mobilization during action potential firing at hippocampal synapses. Neuron. 14 (5), 983-989 (1995).
  53. Betz, W. J., Ridge, R. M., Bewick, G. S. Comparison of FM1-43 staining patterns and electrophysiological measures of transmitter release at the frog neuromuscular junction. Journal of Physiology-Paris. 87 (3), 193-202 (1993).
  54. Wu, L. G., Betz, W. J. Nerve activity but not intracellular calcium determines the time course of endocytosis at the frog neuromuscular junction. Neuron. 17 (4), 769-779 (1996).
  55. Ryan, T. A., Smith, S. J., Reuter, H. The timing of synaptic vesicle endocytosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (11), 5567-5571 (1996).
  56. Ramaswami, M., Krishnan, K. S., Kelly, R. B. Intermediates in synaptic vesicle recycling revealed by optical imaging of Drosophila neuromuscular junctions. Neuron. 13 (2), 363-375 (1994).
  57. Kayser, M. S., McClelland, A. C., Hughes, E. G., Dalva, M. B. Intracellular and trans-synaptic regulation of glutamatergic synaptogenesis by EphB receptors. Journal of Neuroscience. 26 (47), 12152-12164 (2006).
  58. Washburn, H. R., Xia, N. L., Zhou, W., Mao, Y. T., Dalva, M. B. Positive surface charge of GluN1 N-terminus mediates the direct interaction with EphB2 and NMDAR mobility. Nature Communications. 11 (1), 570 (2020).
  59. Magrane, J., Sahawneh, M. A., Przedborski, S., Estevez, A. G., Manfredi, G. Mitochondrial dynamics and bioenergetic dysfunction is associated with synaptic alterations in mutant SOD1 motor neurons. Journal of Neuroscience. 32 (1), 229-242 (2012).
  60. Casci, I., et al. Muscleblind acts as a modifier of FUS toxicity by modulating stress granule dynamics and SMN localization. Nature Communications. 10 (1), 5583 (2019).
  61. Hruska, M., Henderson, N., Le Marchand, S. J., Jafri, H., Dalva, M. B. Synaptic nanomodules underlie the organization and plasticity of spine synapses. Nature Neuroscience. 21 (5), 671-682 (2018).
  62. Rein, M. L., Deussing, J. M. The optogenetic (r)evolution. Molecular Genetics and Genomics. 287 (2), 95-109 (2012).
  63. Bertucci, C., Koppes, R., Dumont, C., Koppes, A. Neural responses to electrical stimulation in 2D and 3D in vitro environments. Brain Research Bulletin. 152, 265-284 (2019).
  64. Zhang, Y., et al. jGCaMP8 Fast genetically encoded calcium indicators. Janelia Research Campus. , (2020).
  65. Guerra-Gomes, S., Sousa, N., Pinto, L., Oliveira, J. F. Functional roles of astrocyte calcium elevations: From synapses to behavior. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 427 (2017).
  66. Westergard, T., et al. Cell-to-cell transmission of dipeptide repeat proteins linked to C9orf72-ALS/FTD. Cell Reports. 17 (3), 645-652 (2016).
  67. Wen, X., et al. Antisense proline-arginine RAN dipeptides linked to C9ORF72-ALS/FTD form toxic nuclear aggregates that initiate in vitro and in vivo neuronal death. Neuron. 84 (6), 1213-1225 (2014).
  68. Daigle, J. G., et al. Pur-alpha regulates cytoplasmic stress granule dynamics and ameliorates FUS toxicity. Acta Neuropathologica. 131 (4), 605-620 (2016).

Tags

Neurovetenskap utgåva 173
Fluorescerande mätning i realtid av synaptiska funktioner i modeller av amyotrofisk lateralskleros
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Krishnamurthy, K., Trotti, D.,… More

Krishnamurthy, K., Trotti, D., Pasinelli, P., Jensen, B. Real-Time Fluorescent Measurement of Synaptic Functions in Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis. J. Vis. Exp. (173), e62813, doi:10.3791/62813 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter