Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Sanntids fluorescerende måling av synaptiske funksjoner i modeller av amyotrofisk lateral sklerose

Published: July 16, 2021 doi: 10.3791/62813
Automatic Translation
*1, 1, 1, *1
1Jefferson Weinberg ALS Center, Thomas Jefferson University
* These authors contributed equally

Summary

To relaterte metoder er beskrevet for å visualisere subcellulære hendelser som kreves for synaptisk overføring. Disse protokollene muliggjør sanntidsovervåking av dynamikken i presynaptisk kalsiumtilstrømning og synaptisk vesiclemembranfusjon ved hjelp av levende celleavbildning av in vitrokulturerte nevroner.

Abstract

Før nevronal degenerasjon er årsaken til motoriske og kognitive underskudd hos pasienter med amyotrofisk lateral sklerose (ALS) og/eller frontotemporal lobe demens (FTLD) dysfunksjon av kommunikasjon mellom nevroner og motoriske nevroner og muskler. Den underliggende prosessen med synaptisk overføring innebærer membrandepolariseringsavhengig synaptisk vesiclefusjon og frigjøring av nevrotransmittere i synapsen. Denne prosessen skjer gjennom lokalisert kalsiumtilstrømning i presynaptiske terminaler der synaptiske vesikler ligger. Her beskriver protokollen fluorescensbaserte live-imaging metoder som pålitelig rapporterer depolarisering-mediert synaptisk vesicle exocytose og presynaptisk terminal kalsiumtilstrømningsdynamikk i dyrkede nevroner.

Ved hjelp av et styrylfargestoff som er innlemmet i synaptiske vesiclemembraner, blir den synaptiske vesicle-frigjøringen belyst. På den annen side, for å studere kalsiuminngang, brukes Gcamp6m, en genetisk kodet fluorescerende reporter. Vi bruker høy kaliumkloridmediert depolarisering for å etterligne nevronaktivitet. For å kvantifisere synaptisk vesicle exocytosis entydig, måler vi tapet av normalisert styrylfargefluorescens som en funksjon av tid. Under lignende stimuleringsforhold, i tilfelle kalsiumtilstrømning, øker Gcamp6m fluorescens. Normalisering og kvantifisering av denne fluorescensendringen utføres på samme måte som styrylfargeprotokollen. Disse metodene kan multiplekses med transfeksjonsbasert overekspression av fluorescerende merkede mutantproteiner. Disse protokollene har blitt mye brukt til å studere synaptisk dysfunksjon i modeller av FUS-ALS og C9ORF72-ALS, ved hjelp av primære gnagerkortikale og motoriske nevroner. Disse protokollene tillater lett rask screening av forbindelser som kan forbedre nevronkommunikasjon. Som sådan er disse metodene verdifulle, ikke bare for studiet av ALS, men for alle områder av nevrodegenerativ og utviklingsmessig nevrovitenskapelig forskning.

Introduction

Modellering av amyotrofisk lateral sklerose (ALS) i laboratoriet er gjort unikt utfordrende på grunn av den overveldende sporadiske naturen til over 80% av tilfellene1, kombinert med det store antallet genetiske mutasjoner kjent for å være sykdomsfremkallende2. Til tross for dette deler alle tilfeller av ALS den samlende funksjonen at før direkte nevronal degenerasjon, er det dysfunksjonell kommunikasjon mellom presynaptiske motoriske nevroner og postsynaptiske muskelceller3,4. Klinisk, når pasienter mister tilkoblingen til de gjenværende øvre og nedre motoriske nevronene, presenterer de funksjoner av nevronal hyper- og hypoeksitabilitet gjennom hele sykdommen5,6,7,8,9, som reflekterer komplekse underliggende molekylære endringer i disse synapsene, som vi som ALS-forskere søker å forstå.

Flere transgene modeller har illustrert at forverring og uorganisering av det nevromuskulære krysset forekommer med uttrykk for ALS-forårsakende genetiske mutasjoner, inkludert SOD110, FUS11,12, C9orf7213,14,15,16 og TDP4317,18,19 gjennom morfologiske vurderinger, inkludert evaluering av synaptiske boutons, ryggtetthet og pre/postsynaptisk organisering. Mekanistisk, siden landemerkepapirene til Cole, Hodgkin og Huxley på 1930-tallet, har det også vært mulig å evaluere synaptiske responser gjennom elektrofysiologiske teknikker i enten in vitro cellekultur eller vevsskivepreparater20. Gjennom disse strategiene har mange modeller av ALS vist synaptiske overføringsunderskudd. For eksempel forårsaker en mutantvariant av TDP43 forbedret avfyringsfrekvens og reduserer handlingspotensialterskelen i NSC-34 (ryggmargen x nevroblastomhybridcellelinje 34) motor-neuron-lignende celler21. Den samme varianten forårsaker også dysfunksjonell synaptisk overføring ved det nevromuskulære krysset (NMJ) før utbruddet av atferdsmotoriske underskudd i en musemodell22. Det ble tidligere vist at mutant FUS-uttrykk resulterer i redusert synaptisk overføring ved NMJ i en drosophila-modell av FUS-ALS før lokomotoriske defekter11. En fersk rapport ved hjelp av induserte pluripotente stamceller avledet fra C9orf72-ekspansjonsbærere avslørte en reduksjon i det lett utleide bassenget med synaptiske vesikler23. Til sammen fremhever disse studiene og andre viktigheten av å bygge en mer omfattende forståelse av mekanismene som ligger til grunn for synaptisk signalering i sykdomsrelevante modeller av ALS. Dette vil være avgjørende for å forstå als patobiologi og utvikle potensielle terapeutiske mål for pasienter.

Metoder for strøm- og spenningsklemmeceller har vært uvurderlige for å bestemme membranegenskaper som ledning, hvilemembranpotensial og sløsing med individuelle synapser20,24. En av de betydelige begrensningene ved elektrofysiologi er imidlertid at den er teknisk utfordrende og bare gir innsikt fra en enkelt nevron om gangen. Live-celle konfokal mikroskopi, kombinert med spesifikke fluorescerende sonder, gir muligheten til å undersøke synaptisk overføring av nevroner på en romlig måte25,26,27. Selv om det ikke er et direkte mål på nevronal spenning, kan denne fluorescenstilnærmingen gi en relativ måling av to molekylære korrelasjoner av synaptisk funksjon: synaptisk vesiclefrigjøring og kalsiumtransienter ved synaptiske terminaler.

Når et handlingspotensial når den presynaptiske terminalregionen av nevroner, utløses kalsiumtransienter, noe som letter overgangen fra et elektrisk signal til prosessen med nevrotransmitterutløsning28. Spenningsporterte kalsiumkanaler lokalisert til disse områdene regulerer kalsiumsignalering tett for å modulere kinetikken til nevrotransmitterutløsning29. De første rapporterte fluorescensbaserte opptakene av kalsiumtransienter ble utført enten ved hjelp av dual-wavelength-indikatoren Fura-2 AM eller enkeltbølgelengdefargen Fluo-3 AM30,31,32. Selv om disse fargestoffene ga stor ny innsikt på den tiden, lider de av flere begrensninger som ikke-spesifikk oppdeling i celler, aktivt eller passivt fargetap fra merkede celler, fotobleaching og toksisitet hvis de er avbildet over lengre perioder på tid33. I løpet av det siste tiåret har genetisk kodede kalsiumindikatorer blitt arbeidshester for avbildning av ulike former for nevronaktivitet. Disse indikatorene kombinerer et modifisert fluorescerende protein med et kalsiumchelatorprotein som raskt bytter fluorescensintensitet etter bindingen av Ca2 + ions34. Anvendelsen av disse nye indikatorene er enorm, noe som gir mye enklere visualisering av intracellulære kalsiumtransienter både i in vitro- og in vivo-innstillinger. En familie av disse genetisk kodede reporterne, kjent som GCaMP, er nå bredt utnyttet. Disse indikatorene inneholder et C-terminal calmodulin-domene, etterfulgt av grønt fluorescerende protein (GFP), og er avkortet av en N-terminal calmodulin-bindende region35,36. Kalsiumbindende til calmodulin-domenet utløser en interaksjon med calmodulinbindingsområdet, noe som resulterer i en konformasjonsendring i den totale proteinstrukturen og en betydelig økning i fluorescensen til GFP-moiety35,36. Gjennom årene har denne familien av reportere gjennomgått flere evolusjoner for å muliggjøre tydelige avlesninger for bestemte kalsiumtransienter med spesifikke kinetikk (langsom, middels og rask), hver med litt forskjellige egenskaper37,38. Her har bruken av reporteren GcaMP6 blitt fremhevet, som tidligere har vist seg å oppdage enkelthandlingspotensialer og dendrittiske kalsiumtransienter i nevroner både in vivo og in vitro37.

Kalsiumtransienter i den presynaptiske regionen utløser synaptiske vesiclefusjonshendelser, forårsaker nevrotransmitterutløsning i synapse og initiering av signalhendelser i den postsynaptiske cellen28,39. Synaptiske vesicles frigjøres og resirkuleres både raskt og resirkuleres, da cellen homeostatically opprettholder et stabilt cellemembranoverflateområde og lett utgilig basseng med fusjonsdyktige membranbundne vesicles40. Styrylfargen som brukes her har en affinitet mot lipidmembraner og endrer spesielt utslippsegenskapene basert på bestilling av det omkringliggende lipidmiljøet41,42. Dermed er det et ideelt verktøy for merking av synaptiske vesikler og etterfølgende sporing av disse vesiklene når de senere slippes ut etter nevronal stimulering41,42. Protokollen som er generert og optimalisert er en tilpasning av konseptene beskrevet i utgangspunktet av Gaffield og kolleger, som lar oss visualisere styrylfargemerket synaptisk vesicle puncta over tid kontinuerlig41.

Her beskrives to relaterte fluorescensbaserte metoder, og rapporterer pålitelig spesifikke cellulære hendelser involvert i synaptisk overføring. Protokoller har blitt definert for å sondere dynamikken i depolariseringsmediert presynaptisk terminal kalsiumtilstrømning og synaptisk vesicle exocytose hos dyrkede nevroner. Her er metoder og representative resultater fokusert på å bruke primære gnagerkortikale eller motoriske nevroner som in vitro-modellsystem, da det er publiserte studier ved hjelp av disse celletypene43,44. Imidlertid gjelder disse metodene også for differensiert human i3 kortikale nevroner45, da vi også har hatt suksess med begge protokollene i dagens pågående eksperimentering i laboratoriet vårt. Den generelle protokollen er skissert i et trinnvis lineært format, vist i figur 1. Kort sagt, for å studere kalsiumdynamikk i nevritter, blir modne nevroner transfektert med plasmid DNA for å uttrykke fluorescerende reporter GCaMP6m under en Cytomegalovirus (CMV) promotor37,46. Transfekterte celler har et lavt nivå av basal grønn fluorescens, noe som øker i nærvær av kalsium. Interesseregioner er spesifisert for å overvåke fluorescensendringer gjennom hele manipulasjonen vår. Dette gjør det mulig å måle svært romlige og tidsmessig lokaliserte svingninger i kalsium som skal måles37,46. For evaluering av synaptisk vesiclefusjon og frigjøring, er modne nevroner lastet med styrylfarge innlemmet i synaptiske vesiclemembraner når de resirkuleres, reformeres og lastes på nytt med nevrotransmittere i presynaptiske celler41,42,43,47,48. De nåværende fargestoffene som brukes til dette formålet etikett synaptiske vesicles langs nevritter og brukes som proxy for disse regionene i live-imaging eksperimenter, som vist ved co-farging av styryl fargestoff og synaptotagmin av Kraszewski og kolleger49. Inkludert her er representative bilder av lignende farging som også er utført (figur 2A). Tidligere etterforskere har i stor grad brukt slike fargestoffer til å rapportere synaptisk vesicledynamikk ved det nevromuskulære krysset og hippocampale nevroner48,49,50,51,52,53,54,55,56 . Ved å velge punkteringsregioner av fargebelastede vesikler og ved å overvåke reduksjoner i fluorescensintensitet etter vesicle-frigjøring, kan funksjonell synaptisk overføringskapasitet og tidsdynamikk for frigjøring studeres etter stimulering43. For begge metodene brukes et medium som inneholder en høy konsentrasjon av kaliumklorid for å depolarisere celler for å etterligne nevronaktivitet. Bildeparametere er spesifisert for å fange opp intervaller på under sekund som spenner over en baseline normalisering etterfulgt av vår stimuleringsfangstperiode. Fluorescensmålinger på hvert tidspunkt bestemmes, normaliseres til bakgrunnen og kvantifiseres over den eksperimentelle tidsperioden. Kalsiumtilstrømning mediert GCaMP6m fluorescensøkning eller effektiv synaptisk vesicle exocytosis styryl fargestofffrigjøring fluorescensreduksjon kan oppdages gjennom denne strategien. Detaljert metodisk oppsett og parametere for disse to protokollene og en diskusjon om deres fordeler og begrensninger er beskrevet nedenfor.

Figure 1
Figur 1: Visuell gjengivelse av generell generell protokollprosess. (1) Isolere og kultur primære gnager nevroner in vitro til valgt modningstidspunkt. (2) Introduser GCaMP DNA eller styrylfargestoff som reportere av synaptisk aktivitet. (3) Oppsett bildebehandling paradigme ved hjelp av live-imaging utstyrt konfekt mikroskop og tilhørende programvare. Start planlagt registreringsperiode. (4) Mens celler fortsatt gjennomgår live-image fangst, stimulere nevroner via høy KCl bad perfusjon. (5) Vurdere fluorescensintensitetsmålinger over tid for å måle kalsiumtransienter eller synaptisk vesiclefusjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreprosedyrer utført i denne studien ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Jefferson University.

1. Primærkultur av nevroner fra embryonal rottebark

MERK: Primære kortikale nevroner er isolert fra E17,5 rotteembryoer som tidligere beskrevet57,58. Ingen belastningsbias ser ut til å eksistere med suksessen til denne kulturingprotokollen. Denne metoden er beskrevet kort nedenfor. De tidligere artiklene som er angitt, bør refereres til for fullstendig informasjon.

  1. Euthanize gravide kvinnelige rotter ved CO2 innånding etterfulgt av sekundær bekreftelse av Cervical dislokasjon.
  2. Høst embryoer og isoler hjerner i iskald 20 mM HEPES-bufret Hanks balanserte saltløsning (HBSS). Fra ytre cortex skallet, skille og deretter kaste striatum og hippocampi. Samle kortikaler.
  3. Bruk fine tang for å fjerne meninger fra kortikaler. For å gjøre dette, hold cortexen på plass med ett par lukkede tang ved hjelp av forsiktig trykk.
    MERK: Med det andre paret tang i den andre hånden, klyp meninges. Skrell bort meninger ved hjelp av rullende bevegelse med klemt par. Omplasser med de lukkede tangene og gjenta etter behov til meningene er helt fjernet.
  4. Inkuber kortikaler med 10 μg/ml papain i HBSS i 4 min ved 37 °C.
  5. Vask tre ganger i HBSS, og trianturer deretter forsiktig 5-10 ganger med en brannpolert pasteurpipette for å oppnå en homogen celleoppheng.
    MERK: Unngå bobler; opprettholde pipetten i celleopphenget.
  6. Plate neuroner på 100 μg/ ml poly-D-lysin belagt 35 mm glassbunn retter med en tetthet på 75,000 celler / tallerken i nevrobasal medium med B27 supplement (2%), og penicillin-streptomycin.

2. Primærkultur av motoriske nevroner fra embryonal rotte ryggmarg

MERK: Primærmotoriske nevroner fremstilles fra E13,5 rotteembryoer som tidligere beskrevet, med få modifikasjoner59,60. Ingen belastningsbias ser ut til å eksistere med suksessen til denne kulturingprotokollen. Denne metoden er beskrevet kort nedenfor. Det skal refereres til de angitte artiklene for fullstendig informasjon.

  1. Euthanize gravide kvinnelige rotter som i trinn 1.1.
  2. Disseker 10-20 ryggmarger fra embryoer og bryte inn i små fragmenter mekanisk ved hjelp av to par tang for å klemme og trekke, henholdsvis.
  3. Inkuber i 0,025% trypsin i 8 min, etterfulgt av tilsetning av DNase ved 1 mg / ml.
  4. Sentrifuger gjennom en 4% m / v BSA pute på 470 x g i 5 min ved 4 ° C uten pause.
  5. Sentrifuge pelleted celler i 55 min ved 830 x g ved 4 °C uten brems gjennom en 10,4% (v / v) tetthet gradient medium (se Tabell over materialer) pute. Viderefør motor neuronbåndet ved det visuelle grensesnittet.
    MERK: For å sikre fangst av alle celler, bruk fenolfrie medier for tetthetsgradienttrinnet og fenolholdige medier for alle de andre trinnene. Grensesnittet til tetthetsgradienten og dissosiasjonsmediet er lett identifiserbart basert på fargeforskjellen.
  6. Spinn innsamlede bånd gjennom en annen 4% m / v BSA pute på 470 x g i 5 min ved 4 ° C uten pause.
  7. Resuspend renset motoriske nevroner i komplett nevrobasal medium med B27 supplement (2%), glutamin (0,25%), 2-mercaptoethanol (0,1%), hesteserum (2%), og penicillin-streptomycin.
  8. Plate neuroner på 100 μg/ml polylyin og 3 μg/ml lamininbelagte deksler med en tetthet på 50 000 celler/35 mm glassbunnsfat.

3. Nevronale transfeksjoner

MERK: Dette trinnet utføres for nevroner som vil gjennomgå GCaMP kalsiumavbildning og / eller nevroner der en eksogen DNA-plasmid eller RNA av interesse blir introdusert i forkant av synaptisk evaluering. I motsetning til dette lastes styrylfarge like før bildebehandlingsøkten og behandles i avsnitt 6. Sammendraget nedenfor er transfeksjonsprotokollen som brukes for primære gnagernevroner i de presenterte eksemplene, men den kan enkelt tilpasses og optimaliseres til brukerens behov.

  1. Transfeksjoner for dyrkede primære kortikale nevroner forekommer på dag 12 in vitro (DIV 12), mens motoriske nevroner transfekteres på dag 7 in vitro (DIV 7).
    MERK: Alle følgende trinn skjer i et aseptisk biosikkerhetsskap.
  2. Transfekt 500 ng GCaMP6m ved bruk av transfeksjonsreagens med et forhold på 1:2 etter volum. For co-transfections, legg til totalt 1,25 μg totalt DNA / tallerken, opprettholde dette DNA til reagensforholdet.
    MERK: I de eksperimentelle eksemplene som er vist, har 750 ng ALS/FTD-relatert plasmid av interesse blitt transfektert for å uttrykke C9orf72-ALS-koblede dipeptider, mutant FUS-protein, etc. Forsikre deg om at fluorescerende taggen til den samtidig transfekterte plasmiden ikke vil være i konflikt med FITC-kanalen til GCaMP-avbildning. På samme måte, hvis du gjør styryl fargestoff avbildning, sørg for at co-transfektert plasmid ikke vil være i konflikt med TRITC-kanalen for avbildning. Bruk av synaptofysin-GCaMP3 er like effektiv i denne protokollen. Transfekter derfor samme mengde av denne plasmiden og følg alle trinnene som vanlig i avsnitt 7.
  3. Inkuber DNA-transfeksjonsreagenskomplekset ved romtemperatur i 10 min.
  4. Legg forsiktig det inkuberte komplekset til nevroner dråpevis med virvlende. Returner retten til CO2 inkubator ved 37 °C i 45–60 min.
  5. Fjern hele kulturmediet som inneholder DNA-transfeksjonsreagenskomplekset og erstatt det med en 50-50 ved volumforberedelse av prekondisjonerte og friske nevronmedier. Sett deretter cellene tilbake i CO2-inkubatoren i 48 timer til avbildning.

4. Tilberedning av bufferløsninger og styrylfargebestandsløsning

  1. Gjør lave og høye aCSF-løsninger ferske før du ser på bildet ved hjelp av ingrediensene som er oppført i tabell 1. Filtrer begge bufferløsningene før bruk.
    MERK: CaCl2-dihydrat kan danne Ca(OH)2 ved lagring. For maksimal effekt, bruk alltid en nylig åpnet beholder. Hvis dette ikke er mulig, for å fjerne Ca(OH)2 fra den ytre overflaten og sikre maksimal løselighet, kan løsninger karboneres med gassformige CO2 i 5 minutter før CaCl2-tilsetning. Hvis dette trinnet tas, juster pH for den resulterende løsningen for å opprettholde en pH-verdi på 7,4, da overdreven karbonering vil resultere i Ca(HCO3)2-formasjon.
Lav KCL aCSF-buffer (pH 7,40 til 7,45)
Reagent Konsentrasjon
HEPES 10 mM
NaCl 140 mM
KCl 5 mM
Glukose 10 mM
CaCl2 2H2O 2 mM
MgCl2 4H2O 1 mM
Høy KCL aCSF-buffer (pH 7,40 til 7,45)
Reagent Konsentrasjon
HEPES 10 mM
NaCl 95 mM
KCl 50 mM
Glukose 10 mM
CaCl2 2H2O 2 mM
MgCl2 4H2O 1 mM

Tabell 1: Sammensetning av kunstige cerebrospinale væskebuffere (aCSF). Denne tabellen inneholder ingrediensene for å forberede lave og høye KCl kunstige cerebrospinale væskebuffere som brukes under avbildning og stimulerende nevroner. Se avsnitt 4 for klargjøringsinstruksjoner.

  1. Forbered styrylfargebestandsløsning ved å ta et 100 μg hetteglass med fargestoff og rekonstituere det til en lagerkonsentrasjon på 10 mM med destillert vann eller nevrobasalt medium.

5. Oppsett av mikroskop og perfusjonssystem

MERK: For avbildning av glassbunn Petri-retter foretrekkes et invertert konfokalt fluorescensmikroskop på grunn av fleksibiliteten til perfusjon og for bruk av et høyt numerisk blenderåpningsoljeinnlevelsesmål. Se materialtabellen for det konfiskeringsmikroskopet, kameraet og målene som brukes for avbildning av eksempler som er beskrevet i delen Representative resultater .

  1. Utfør alle forsøkene ved 37 °C med konstante 5 % CO2-nivåer ved hjelp av en inkubatorsystemkoling.
  2. Kontroller bildeanskaffelse ved hjelp av konfektprogramvare. Optimaliser anskaffelsesinnstillingene ved starten av bildebehandlingsøkten for å velge eksitasjonskraft og få for å sikre optimal visualisering av signaler uten fotobleaching.
    1. Hold eksitasjonskraft, eksponeringstid, detektorforsterkning og bildefrekvens konstant på tvers av alle prøver. Utfør tidsforløpavbildning ved hjelp av et størrelsesforhold på 512 x 512 og bildefrekvensen på 2 bilder/s for å minimere fargebleking.
      MERK: Selv om puncta skal være godt synlig, bør laserintensiteten stilles inn på et minimum som er mulig for å unngå bleking og fototoksisitet. Sett den konfokale blenderåpningen til den smaleste innstillingen for å oppnå optimal oppløsning av fluorescerende punktering i nevritter. Eksponeringstiden er satt til 200 ms eller mindre, konsekvent på tvers av prøver. Den maksimale bildehastigheten til kameraet som ble brukt var 2 bilder/s. Hvis du bruker et raskere kamera, kan flere bilder/bilder tas. Innstillinger for temporal avbildning bør velges hvis det er mulig.
  3. Velg følgende fluorescenseksitasjons-/dikroic/utslippsfilterkombinasjoner for avbildning ved hjelp av konfikal programvare: henholdsvis Gcamp6m/Gcamp3 med FITC og styrylfargestoff med TRITC.
  4. Bruk den perfekte fokusfunksjonen i den kondolerende bildeinnsamlingsprogramvaren under tidsforløpavbildning for å unngå z-drift.
    MERK: På grunn av den raske hastigheten på bildet, er et enkelt plan avbildet. Å sikre mangel på z-drift under eksperimentet er svært viktig.
  5. Velg kategorien Klokkeslett i bildeanskaffelsespanelet for å angi opptaksperioder og intervaller.
    1. Sett fase #1 til Intervall 500 ms, Varighet 3 - 5 min.
    2. Sett fase #2 til Intervall 500 ms, Varighet 5 min.
      MERK: Fase #1 tilsvarer baseline opptak, henholdsvis fase #2 til stimuleringsperioden.
  6. Monter gravitasjonsperfusjonsapparatet for aCSF ved hjelp av et ventilkontrollsystem og en kanalmanifold.
    1. Legg høy KCl (se tabell 1) i en 50 ml sprøyte på toppen av apparatet, med slanger som går gjennom systemet. Sett strømningshastigheten til 1 ml/min.
  7. Legg en 35 mm glassfat som inneholder nevroner på det konfokale bildestadiet, med enden av perfusjonsslangen plassert ved tallerkenkanten. Velg feltet for avbildning.

6. Styryl fargestoffavbildning av synaptisk vesicle frigjøring

  1. Inkuber celler i lav KCl aCSF (se tabell 1) i 10 min ved 37 °C, 48 t etter transfeksjon.
  2. Last primære kortikale eller motoriske nevroner på glassbunn Petri retter med styrylfarge.
    1. Fjern lav KCl aCSF ved aspirasjon.
    2. Bruk en pipette til å laste nevroner i mørket med 10 μM styrylfargestoff i aCSF som inneholder 50 mM KCl i 5 minutter.
    3. Fjern lasteløsningen og bade nevroner i lav KCl aCSF i 10 min for å eliminere ikke-spesifikk fargebelastning.
  3. Plasser den 35 mm glassbunnsfatet på bildetrinnet, og følg deretter enten under et 20x luftmål eller 40x oljeinnlevelsesmål for et invertert konfokalt mikroskop.
    MERK: Bruk GFP-fluorescens til å finne transfekterte celler i tilfelle celler som er krysset med en GFP-merket plasmid.
  4. Opphisse styrylfargestoff ved hjelp av en 546 nm laser, samle utslipp ved hjelp av et 630-730 nm (TRITC) bandpassfilter.
  5. Velg bildefeltet og sett perfekt fokus. Deretter tar du et enkelt stillbilde med brightfield, TRITC og fluorescensmarkørkanaler for å markere nevronale grenser.
  6. Start Kjør nå i anskaffelsesprogramvaren. Utfør basalopptaket i 3-5 min for å utelukke variasjoner i fargeintensitet, hvis noen (fase # 1).
    MERK: Det er viktig å sikre at enhver reduksjon i fargeintensiteten skyldes synaptisk vesicle-frigjøring og ikke passiv fargestoffdiffusjon eller fotobleaching. Denne 3-5 min pre-stimuleringsperioden skal resultere i et jevnt og vedlikeholdt fargeintensitetsnivå. De siste 30 s av denne registreringen vil bli brukt til å bestemme en gjennomsnittlig fluorescensverdi for hver avkastning. Før du evaluerer eksperimentelle forhold, kan en ekstra ikke-stimuleringstilstand på ca. 10 min kontinuerlig opptak ved hjelp av de tiltenkte anskaffelsesinnstillingene også utføres for å sikre stabile fluorescensverdier ved hjelp av laserinnstillingene i en lengre periode.
  7. Ved bryteren til fase #2, avtrekker på knappen for perfusjonssystemet. Deretter gjennomsyrer kontinuerlig 50 mM KCl til nevroner for å lette fargeavlastning (fase # 2).
    1. Utfør opptak for 300 s etter KCl-tillegg. Etter dette stopper oppkjøpet; avtrekker du av-bryteren for perfusjonssystemet.
  8. Lagre eksperimentet og analyser data ved hjelp av konfektprogramvare som beskrevet i avsnitt 8 nedenfor.
    MERK: Eksperimentet kan stoppes på dette tidspunktet, og analysen kan utføres senere. I tilfelle der celler ikke krever transfeksjon for uttrykk for proteiner av interesse, kan denne protokollen utføres når som helst in vitro når du søker å undersøke funksjonaliteten til synaptisk lossing. Etter en test av kontrollceller for å sikre riktig synaptisk lossing, bør eksperimentet bli blindet for de genetiske eller farmakologiske forholdene til hver tallerken som testes for å minimere skjevheter.

7. Fluorescensavbildning av Gcamp6m kalsium forbigående

  1. Transfekt primær gnager kortikale nevroner dyrket på 35 mm glassbunnsretter med 500 ng Gcamp6m som angitt i avsnitt 3.
    MERK: Om ønskelig, co-transfekt nevroner med en plasmid av interesse som inneholder en fluorescerende tag i det røde eller fjernrøde området.
  2. Inkuber nevroner med lav KCl aCSF i 15 min 48 h post-transfeksjon og monter deretter parabolen på bildeplattformen.
  3. Visualiser GCaMP6m fluorescens ved hjelp av et FITC-filter (488 nm) og et mål på 20x eller 40x.
  4. Velg bildefeltet og sett perfekt fokus. Deretter tar du et enkelt stillbilde med brightfield-, FITC- og fluorescensmarkørkanaler for å markere nevronale grenser.
  5. Start Kjør nå i anskaffelsesprogramvaren. Utfør basisopptaket i 5 min, og forvreng deretter med aCSF som inneholder 50 mM KCL på samme måte som beskrevet i avsnitt 6 for styrylfargeeksperimenter.
    MERK: Målet med denne avbildningen er å måle fremkalte kalsiumtransienter. Skulle en nevron ha basal avfyringsaktivitet og kalsiumflukser i forstimuleringsperioden, brukes den ikke i dataanalyse. I stedet brukes bare celler med stabil bakgrunnsfluorescens. Etterstimuleringsperioder kan også forlenges til 60 min for kalsiumtransienter, med eller uten ytterligere kontinuerlig høy KCl-perfusjon.
  6. Lagre eksperimentet og analyser data ved hjelp av konfektprogramvare som beskrevet i avsnitt 8 nedenfor. Eksperimentet kan stoppes på dette tidspunktet, og analysen kan utføres senere.
    MERK: Hvis cellene ikke krever transfeksjon for uttrykk for proteiner av interesse, kan denne protokollen utføres når som helst in vitro når du søker å undersøke kalsiumtransienter. Etter en test av kontrollceller for å sikre måling av kalsiumtransienter, bør eksperimentet bli blindet for de genetiske eller farmakologiske forholdene til hver tallerken som testes for å minimere skjevheter.

8. Bildeanalyse

  1. Åpne tidsforløpbilder med konfektprogramvare.
  2. Justere bilder i intervallserier etter kommandoserien : Bilde | Behandler | Juster gjeldende dokument. Velg Juster til første delbilde.
  3. Velg interesseområder (ROIer) langs neurittene ved hjelp av ROI-markeringsverktøyet, et bønneformet ikon til høyre for bilderammen (figur 3B). Merk også en avkastning som representerer bakgrunnsfluorescensintensitet.
    MERK: ROIer velges ved å velge områder med tydelig separert puncta langs nevronale spor indikert av brightfield stillbilde. Minst fem ROIer per neuron er valgt for analyse. Bakgrunnen avkastning er valgt i en region av synsfeltet som ikke inneholder nevritter.
  4. Mål rå fluorescens over tid for utvalgte ROIer ved hjelp av følgende kommandoserie: Mål | Tidsmåling.
    1. Start Mål-funksjonen i den øvre delen av Tidsmåling-panelet . En grafisk fremstilling av rå fluorescens over tid (figur 3C) og kvantitative data genereres begge.
      MERK: Hvert datapunkt representerer rå fluorescens for den avkastningen for rammen som er knyttet til det spesifikke målte tidspunktet.
  5. Eksporter rå fluorescensintensiteter til regnearkprogramvaren.
  6. Analyser hver avkastning uavhengig av hverandre. Først normaliserer du data ved å trekke avkastningen på bakgrunnen fra avkastningen av interesseintensiteten ved hvert tidspunkt.
    1. Ta den rå fluorescensverdien fra bakgrunns-AVKASTNINGEN på hvert bestemt tidspunkt, og trekk dette fra avkastningen av renteråintensitetsverdien på det tidspunktet.
      MERK: Dette gjøres for hele opptaksperioden, både basale og stimuleringsfaser.
  7. Bestem gjennomsnittlig avkastning for renteintensitet for de siste 30 s med baseline.
    1. Gjennomsnittlig normaliserte rå basale verdier generert i trinn 8.6 fra de siste 30 s av 3-5 min basal opptaksperioden.
      MERK: Hele perioden med basalopptak kan brukes til å generere denne verdien. Men etter hvert som denne verdien stabiliserer seg og opprettholdes, er de 60 gangene på de siste 30 s av tilstrekkelig utvalgsstørrelse til å representere helheten.
  8. Sammenlign denne basislinjeverdien med den normaliserte intensitetsverdien ved hvert tidspunkt, og generering av en endring i fluorescensverdien (ΔF).
    1. Ta verdien fra trinn 8.7 og trekk fra den gjennomsnittlige fluorescerende verdien for baseline. Gjør dette og påfølgende trinn for hele opptaksperioden, både basale og stimuleringsfaser.
  9. Beregn denne endringen for fluorescensverdien ved baseline, og generering av en endring i fluorescens/baseline fluorescens (ΔF/F). For å gjøre dette, ta verdien fra trinn 8.8 og del den med den gjennomsnittlige baseline fluorescerende verdien.
  10. Til slutt setter du startpunktverdien til 1 slik at økninger eller reduksjoner enkelt kan visualiseres grafisk over tid.
    1. Ta verdien som genereres i trinn 8.9, og legg til 1.
      MERK: Når dette gjøres riktig, bør verdiene for 30 s med baseline-periode sveve nær verdien 1. I celler som effektivt frigjør synaptisk innhold, bør denne verdien trende fra 1 til 0 etter starten av stimuleringen. Et eksempel på trinn 6-9 er presentert i figur 3E.

9. Dataanalyse

MERK: Eksperimentet kan ikke brukes til eksperimentelle forhold for å samle data for analyse på riktig måte. Bruk en prøvestørrelse på minst 10 nevroner per tilstand fra hvert av tre uavhengige eksperimenter. Vurder bare nevroner for inkludering hvis minst fem ROI-regioner kan betegnes. Dette nivået av eksperimentell replikasjon var tilstrekkelig i publiserte studier for å demonstrere et dypt tap av synaptisk lossing i ALS-relaterte poly-GA-inneholdende celler versus GFP-kontroller (se Representative Results). Men hvis en mer subtil fenotype observeres, kan antall biologiske og / eller tekniske replikeringer kreve optimalisering av brukeren.

  1. Bruk alle beregnede ΔF/F-verdier over tid fra ROIer av en gitt eksperimentell tilstand, og bestem en gjennomsnittlig ΔF/F-verdi for hvert tidspunkt sammen med en SEM.
  2. Tegn inn data ved hjelp av et graf- og statistikkprogram i xy-format, der x er tiden som er gått, og y er ΔF/F-verdien som ble beregnet i trinn 9.1. Presenter alle verdiene som gjennomsnittlig ± SEM.
  3. For å bestemme statistisk signifikans , bruk Student t-testen for å sammenligne to grupper og enveis variansanalyse (ANOVA) etterfulgt av Tukeys posthoc-analyse for å sammenligne tre eller flere grupper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Etter vellykket implementering av protokollen ovenfor, vises representative resultater for et typisk styrylfargesynaptisk vesicle release-eksperiment. Kultivert rotte primær kortikale nevroner ble lastet med fargestoff ved hjelp av metoden beskrevet i avsnitt 6. Spesifisiteten av fargestoffbelastning ble bestemt ved sammerking med synaptisk vesiclemarkør synaptofysin. Et flertall av styrylfargepositiv puncta er medpositive for denne markøren (figur 2A). For å avgjøre om innstillingene som brukes for styrylfargeavbildning forårsaker fotobleking, er vanligvis en ubehandlet brønn lastet med fargestoff og avbildet i en lengre 10 min periode uten stimulering for å sikre at fluorescensverdiene forblir konstante.

I tillegg vises resultatene igjen ved hjelp av medmerking av synaptofysin og styrylfargestoff som i figur 2A. Disse fluoroforene ble co-avbildet ved hjelp av paradigmet som er angitt i avsnitt 6 for TRITC styrylfargeavbildning, pluss dobbeltopptak av synaptofysinfluorescens ved hjelp av høyintensitets lasereffekt på DAPI-kanalen for å visualisere mTurquoise-synaptofysin. Vist er representative bilder av synaptiske regioner før og etter stimulering (figur 2B). Selv om denne metoden er en indirekte slutning for mangel på fotobleaching, viser analyse av råintensitetsverdiene over hele bildeperioden at synaptofysinintensiteten forblir konstant, mens styrylfargeintensiteten går ned etter stimulering (figur 2C). Ved å ta dette eksperimentet og våre andre kontroller av stabil fluorescens før stimulering og over lengre perioder i ikke-stimuleringsbrønner, har vi derfor fastslått at reduksjon i styrylfluorescens kan tilskrives synaptisk lossing gjennom KCl-depolarisering i stedet for fotobleaching effekter.

Figure 2
Figur 2: Vurdering av spesifisitets- og bildeparametere for styrylfargemerking. (A) Et representativt 40x bilde av en styrylfarget farget rotte kortikale nevron (rød), som tidligere ble transfektert 24 timer med en plasmid for å uttrykke mTurquoise2-synaptophysin61 drevet av synapsinpromotoren (grønn). Colokalisering av disse to fluoroforene indikerer at et stort flertall av styrylfarge positiv puncta er co-farget med synaptisk vesicle markør synaptofysin. Skalalinjen indikerer 5 μm. (B) Kortikale nevroner ble transfektert og styrylfarge lastet som i (A) og avbildet i henhold til styrylfargeparadigmet sammen med dobbel fluorescensfangst av mTurquoise-synaptophysin på DAPI-kanalen. Representative bilder viser synaptofysin og styrylfarge puncta regioner pre- og post-stimulering. Skalalinjen indikerer 5 μm. (C) Fluorescens ble overvåket over tid for synaptofysin (DAPI-kanaltopp) og styrylfargestoff (FITC-kanalbunn). Synaptofysinintensiteten ble opprettholdt ved en jevn fluorescens over bilde- og stimuleringsperioden, mens styrylfargefluorescensen ble redusert etter hvert som fargestoffet ble losset ved stimulering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Representative bilder viser lasting av styrylfarge under bildebehandling, med valg av ROIer (figur 3A-B). Den rå fluorescensintensiteten til utvalgte ROIer og en bakgrunns-AVKASTNING plottes ved hjelp av den konfokale programvaren (figur 3C). Nevronene som ble vist her ble også transfektert med plasmider for å studere effekten av dipeptidproteiner produsert i sammenheng med C9ORF72-ALS, nemlig FLAG-eGFP og FLAG-GA50-eGFP drevet av T7-promotoren. Vellykket synaptisk vesicle-frigjøring resulterer i slående tap av fargestofffluorescens ved høy KCl-depolarisering (figur 3D, topp to paneler) for en GFP-transfektert kontrollnevron. En representativ video som er inkludert her, viser hvordan dette vises under bildebehandling. I tillegg losser en nevron selektivt styrylfarge i en nevrittregion etter stimulering (Video 1).

På den annen side er nedsatt synaptisk overføring representert ved beholdt fargestofffluorescens selv etter høy KCl-depolarisering i nevroner transfektert med en C9ORF72-koblet dipeptid repetisjonskonstruksjon (GA50) (figur 3D, nederste to paneler)43. Etter kvantitativ dataanalyse (figur 3E) representeres data som fargeintensitet i hele bildet for kontrollgruppene (GFP) og ALS/FTD (GA50) (figur 3F)43. Denne metoden kan også analysere mellomliggende effekter og er ikke bare et "alt eller ingenting" binært mål. I eksperimenter designet for å redde de synaptiske underskuddene formidlet av GA50, ble eksogen synaptisk vesicle-assosiert protein 2 (SV2) introdusert ved lentiviral transduksjon ved hjelp av rSV2a-eGFP-pRRL plasmid drevet av den menneskelige PGK-promotoren. Etter avbildning og analyse som beskrevet ovenfor, ble synaptisk avfyring reddet i nevroner som uttrykte GA50 og SV2 (figur 3G).

Figure 3
Figur 3: Evaluering av synaptisk vesicle-frigjøring gjennom styrylfargemerking. (A) Et representativt 40x bilde av en styrylfarget nevron i lave KCl aCSF-medier ved starten av et bildeeksperiment. Skalalinjen indikerer 20 μm. (B) Skildring av avkastningsgenerering på bildet fra (A). Spesifikke puncta-regioner langs neuritter (#1-4) velges ved hjelp av ROI-verktøyet, den bønneformede knappen uthevet til høyre. En endelig avkastning (#5) velges i et tomt område for å fange opp bakgrunnssignalintensiteten. Områder med ikke-spesifikke, ikke-nevronale lyse flekker unngås. Skalalinjen indikerer 20 μm. (C) Representasjon av signalintensitetene for ROIer #1-5 fra (B) over tid som grafert/avbildet av konfektprogramvare. (D) Visuelle representasjoner av ROI-regioner før/etter stimulering for en nevron som effektivt gjennomgår synaptisk overføring (de to øverste panelene). De to nederste panelene er zoomede bilder med en objektiv terskel som brukes til å isolere puncta fra bakgrunnen for å vise forskjellige områder visuelt. GFP-inneholdende nevroner gjennomgår effektivt synaptisk frigjøring, mens uttrykk for C9ORF2-ALS-relatert peptid GA50 forhindrer denne effekten. Skalastenger indikerer 10 μm-Reprinted fra Jensen et al. 202043. (E) Eksempel på en kvantifiseringsfil som bruker regnearkprogramvare, som viser normalisering av verdier til grunnlinje og generering av ΔF/F-verdier over tid. Data normaliseres først til roi-intensitetsverdien i bakgrunnen ved hvert tidspunkt. Denne verdien sammenlignes deretter med den gjennomsnittlige avkastning av rentelinjeverdien for de siste 30 s prestimulering (vist her som 10 s i 1 s intervaller for enkelhet) (ΔF). Denne endringen beregnes deretter som en brøkdel av baseline fluorescens (ΔF/F). Til slutt settes startpunktverdien til 1, slik at økninger eller reduksjoner enkelt kan visualiseres grafisk over tid. Minst fem punctaregioner per nevron og minst ti nevroner per eksperimentell tilstand samles inn, med data som dette kombinert for å generere gjennomsnittlige målinger på hvert tidspunkt. (F) Data fra en regnearkfil, for eksempel i (E), flyttes til et graf- og statistikkprogram. For grafen som vises her, plottes ΔF / F-verdien ved hvert tidspunkt som er gjennomsnittet over alle puncta-regioner av en eksperimentell tilstand, sammen med standardfeilen av gjennomsnittet. Grafen her er data fra GFP versus GA50-eksperimentene angitt i (D), der de siste 10 s med baseline og første 10 s av stimuleringsperioden vises på nytt fra Jensen et al. 202043. (G) Denne analysen kan produsere kurver for mellomliggende synaptisk frigjøring og er ikke bare en "alt eller ingenting" respons. GA50 ble co-uttrykt sammen med eksogent synaptisk protein SV2 (synaptisk vesikel-assosiert protein 2), og styrylfargeavbildning og analyse ble utført som angitt i de forrige trinnene. Som i figur 3F representerer grafen som vises her ΔF/F-verdien ved hvert tidspunkt som er gjennomsnittet over alle puncta-regioner i en eksperimentell tilstand, plottet, sammen med standardfeilen for gjennomsnittet. Grafen viser siste minutt av baseline og det første minuttet av stimuleringsperioden fra Jensen et al. 202043. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Video 1: Representativ video av styryl fargestoff bildebehandling eksperiment. Vist er en representativ video av en kortikale nevron lastet med styrylfargestoff. Videoen viser perioden som begynner på tidspunktet for badperfusjon av høy KCl aCSF. Den boksede regionen fremhever nevrittene, med observerbart tap av puncta fluorescens over tid. Klikk her for å laste ned denne videoen.

Etter metoden beskrevet i avsnitt 7, vist er representative fluorescensbilder av kortikale nevroner transfektert med GcaMP6m før og etter KCl-depolarisering (figur 4A). Råintensitetsdiagrammer viser økte fluorescensverdier som svinger, noe som indikerer kalsiuminngang i nevritter etter KCl-indusert depolarisering (figur 4B). Denne andre representative videoen viser nevroner som uttrykker GcaMP6m med lav fluorescens på slutten av opptakstidslinjen for å demonstrere denne effekten. Ved starten av stimuleringen viser nevronene en dramatisk fluorescensøkning (video 2). Denne tilnærmingen har blitt brukt til å demonstrere kalsiuminngangsendringer i en mutant FUS-ALS-modell. Astrocytter i denne modellen ble transdusert med adenovirus som inneholder CMV-promotordrevne eGFP-FUS-plasmider. Når kondisjonert medium fra mutant FUS-uttrykkende astrocytter ble plassert på motoriske nevroner, ble det observert økt kalsiumtilstrømning sammenlignet med ikke-mutant FUS-forhold etter α-amino-3-hydroksy-5-metyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) +cyclothiazide stimulering (figur 4C)44. Følsomheten til denne analysen har blitt testet ved å utføre eksperimenter med og uten kalsium inkludert i perfusjonsmediet. I innstillingen av GFP versus GA50 nevnt ovenfor ble det observert økte topp kalsiumtransienter i GA50 som inneholder motoriske nevroner. Spesielt var dette avhengig av kalsium som kom inn i cellen og ikke frigjøring av interne kalsiumlagre. Når kalsium ble fjernet fra det stimulerende aCSF-mediet, ble ingen kalsium forbigående responser notert i noen av eksperimentelle tilstandene (figur 4D)43.

Figure 4
Figur 4: Observere kalsiumtransienter i sanntid ved hjelp av GCaMP-reportere. (A) Et 40x bilde av en GCaMP6m som uttrykker nevron, pseudofarget for å vise intensiteten av GFP-fluorescens (lav i blått til høyt i rødt). Venstrepaneler viser hele 40x synsfeltet før og etter stimulering. Skalalinjen indikerer 20 μm. Bildene til høyre er zoomede versjoner av de innfelte områdene som vises. Gjennom disse bildene er det tydelig for øyet at det er en robust økning i fokale neuritiske kalsiumnivåer etter stimulering. Skalalinjen indikerer 12 μm. (B) ROI-seleksjon og fluorescensintensitetsovervåking gjennom hele eksperimentet utføres som i figur 3. De siste 30 s med baseline og 1 min stimulering for to utvalgte ROIer av en nevron som gjennomgår GCaMP6m fluorescensovervåking er vist her. I motsetning til styrylfargeavbildning øker fluorescensintensiteten etter nevronstimulering. I tillegg, som nevnt her, svinger kalsiumtransienter i nevritter over tid; Derfor er resultatene vanligvis representert som den gjennomsnittlige topp normaliserte fluorescensendringsverdien for hver avkastningsregion. (C) Representativ kvantifisering av et slikt eksperiment er vist som det ble publisert i Kia-McAvoy et al. 201844, hvor primære motoriske nevroner som fikk supernatant avledet fra mutant FUS-ALS astrocytter viste betydelig økt tilstrømning av kalsium etter AMPA-reseptorstimulering, sammenlignet med nevroner som fikk supernatant fra villtype FUS som uttrykker astrocytter. (D) Representativ kvantifisering av kalsium forbigående avbildning der kalsium ikke var inkludert i den stimulerende aCSF. Vist er forholdene til mCherry versus GA50-mCherry stimulert med høy KCl aCSF med eller uten kalsium som publisert i Jensen et al. 202043. GA50 som inneholder nevroner viste økt maksimal kalsiumtilstrømning sammenlignet med mCherry som inneholder celler. Det var ingen høyde for interne kalsiumnivåer i noen av eksperimentelle tilstandene da kalsium ble fjernet fra å stimulere høy KCL aCSF. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Video 2: Representativ video av GCaMP kalsium forbigående eksperiment. Vist er en representativ video av et felt av kortikale nevroner transfektert med GCaMP6m. Etter en basisperiode noterer en stor kalsiumtilstrømning seg ved 6-merket når høy KCl aCSF ble brukt. Kalsiumregistrering kan måles enten for hele cellen, eller ved bestemte neurittregioner som beskrevet. Klikk her for å laste ned denne videoen.

Potensielle problemer Mulige årsaker/løsning
1 Ikke-spesifikk innlasting Vær presis med lastetiden. Lengre lastetider resulterer i ikke-spesifikk lasting av FM4-64 i endosomer og lysosomer
2 Ingen merkbar eksocytose i kontrollnevroner Kontroller pH-verdien for høy KCl aCSF-løsning.
3 Tap av fokus og lateral drift Sørg for at perfekt fokus er på. Juster bildene etter bildebehandling ved hjelp av Nikon-programvare eller ImageJ-plugin.
4 Bleking av FM4-64 fluorescens Kontroller laserintensiteten som brukes til avbildning. Prøv alltid å bruke lavest mulig intensitet. Bekreft at laserintensiteten som brukes, ikke fører til bleking ved å kjøre prøvekjøringer.

Tabell 2: Mulige problemer og feilsøking for styrylfargeforsøk. Typiske scenarier for problemer og generell feilsøking for synaptiske utlastingsforsøk.

Potensielle problemer Mulige årsaker/løsning
1 Transfeksjonseffektiviteten er for lav Sjekk nevronal helse. Hvis nevroner er vanskelige å transfektere, kan man bytte til AAV eller lentiviral transduksjon av GCaMP.
2 Akkumulering av GCaMP6 fluorescens i kjernen Kompromittert nevronal helse. Kontroller transfeksjonsprotokollen.
3 Tap av fokus og lateral bildedrift Sørg for at perfekt fokus er på. Juster bildene etter bildebehandling ved hjelp av Nikon-programvare eller ImageJ-plugin.
4 Ingen kalsiumrespons ved KCL-stimulering Kontroller at pH for aCSF er riktig.
5 Bleking av GCaMP6 fluorescens Kontroller laserintensiteten som brukes til avbildning. Prøv alltid å bruke lavest mulig intensitet. Bekreft at laserintensiteten som brukes, ikke fører til bleking ved å kjøre prøvekjøringer.
6 Blebbing av nevritter Kompromittert nevronal helse på grunn av transfeksjon. Bruk en ny gruppe nevronkulturer.

Tabell 3: Mulige problemer og feilsøking for avbildning av kalsiumtransienter i nevritter. Typiske scenarier for problemer og generell feilsøking for GCaMP kalsium forbigående eksperimenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tre trinn som er felles for begge metodene som beskrives, er av avgjørende betydning for eksperimentell suksess og kvantifiserbare resultater. For det første er forberedelse av fersk aCSF før hver runde eksperimenter viktig, etter vedlagte instruksjoner. Unnlatelse av å gjøre dette kan forhindre passende nevronal depolarisering. Et utvalg av ubehandlede kontrollnevroner bør hele tiden testes før stimulering av eksperimentelle grupper for å sikre riktig cellulær depolarisering og gi en målestokk for positive resultater oppnådd i den bildebehandlingsøkten. For det andre, for å spore fluorescens over tid for spesifikke synaptiske regioner, bør det også tas særlig hensyn til når du setter opp bildeparametere og områder av ROIer for overvåking. Registreringen av basisperioden skal umiddelbart gå over til stimuleringsregistreringsperioden. En tilstrekkelig rask bildefrekvens (2 bilder/er) kreves for å fange enkeltforfallsdynamikken til styrylfargeutgivelse. Til slutt er et kritisk skritt i analysen av eksperimentering normaliseringen av fluorescensmålinger først til bildebakgrunnen og deretter til den pre-stimulerte basislinjen. Som med andre bildeprotokoller utføres subtraksjon av et tomt bildeområde først på tvers av alle parvise tidsfluorescensmålinger for å fjerne eventuelle autofluorescens i bakgrunnen som KCl-medier kan introdusere. Det er også viktig å måle og beregne gjennomsnittlig fluorescensavlesning for hver avkastning fra de siste 30 s baseline før stimulering. Denne gjennomsnittlige startverdien brukes deretter på tvers av alle tidsmålinger for denne avkastningen som et definert utgangspunkt for å kvantifisere intensiteten "endring fra baseline".

Primær nevronkultur er notorisk vanskelig å transfektere med eksogent DNA, og selv optimaliserte protokoller gir ofte lav effektivitet av totale celler i kulturen. 20% -25% av transfeksjonseffektivitet oppnås vanligvis i våre nevronkulturer, uten tegn på transfeksjonsindusert toksisitet. Mens ganske konsistente uttrykk ses på tvers av celler som inneholder GCaMP, vurderes subtilt forskjellige nivåer av sondeuttrykk i individuelle celler basert på metoden for individuell region kvantifisering av endring i baseline fluorescens sammenlignet med den baseline. Men med denne relativt lave effektiviteten, ved hjelp av transfeksjonsbaserte metoder for å introdusere GCaMP-reporteren, er det ikke tilstrekkelig robusthet for store biologiske repliker for screeningstudier med høy gjennomstrømning. For å overvinne dette er flere variantkonstruksjoner kommersielt tilgjengelige for lentiviral eller adenoviral emballasje eller cellelinje spesifikt uttrykk, noe som vil tillate høyere transduksjonseffektivitet. En primær modifikasjon som kan være ønsket ved bruk av disse protokollene er å bruke optogenetisk stimulering av nevroner i stedet for badeapplikasjon av KCl62. Transduksjon med lentivirale konstruksjoner designet for å uttrykke en av familiene til nå tilgjengelige kanalrhodopsiner, etterfulgt av aktivering med spesifikke bølgelengder av lys, muliggjør romlig kontroll for depolarisering av undergrupper av nevroner og også for evaluering av effekten av tog av virkningspotensialer på repeterende kalsiumtilstrømningsnivåer og uttømming av synaptiske vesicle-butikker63 . Det er imidlertid viktig å huske på at bruken av denne metoden for tiden er noe begrenset, da brukeren må sørge for at deres optogenetiske reporter, synaptiske reporter og ytterligere eksogent introduserte proteiner ikke har spektral overlapping mellom brukte fluoroforer. Et vanlig feilsøkingsproblem ved bruk av styrylfargestoffet er passiv intensitetsreduksjon i løpet av baseline-opptaksperioden. Før eksperimentelle studier er det viktig å optimalisere laserintensitet og fotoopptaksintervaller for å minimere fotobleaching-effekter. For eksperimenter som skal vurderes, er stabilisering av intensitet i minst de siste 30 s av baselineperioden nødvendig. Se tabell 2 og tabell 3 for vanlige problemer og deres løsninger for henholdsvis styrylfargestoff og kalsium forbigående eksperimenter.

Hovedbegrensningen i disse to metodene er at kulturer bare kan stimuleres og undersøkes i ett enkelt tilfelle. Ettersom badeapplikasjon brukes til å introdusere depolariseringsmiddelet KCl, må alle nevroner som skal undersøkes fra den tilstanden i den parabolen være innenfor det opprinnelige synsfeltet til mikroskopmålet. Hvis funksjonalitet over tid er av interesse, kreves det sammenkoblede kulturer. Imidlertid vil den optogenetiske metoden nevnt ovenfor tillate kalsiumdynamikk å bli observert over tid om ønskelig. I tillegg, hvis nevroner har en defekt i resirkulering av synaptiske vesicles, vil den første belastningen av styrylfargen bli svekket. Mens intern intensitetsnormalisering tillater sammenligning på tvers av forhold, kan det være vanskelig å oppdage små forskjeller i størrelsen på svarene. Til slutt har nye iterasjoner av disse reporterne raskt blitt tilgjengelige og kan byttes ut for raskere deteksjonstider eller mer robuste resultater. For eksempel anses GCaMP6m ikke lenger som den raskeste reporteren av kalsiumtransienter ved synaptiske terminaler. I stedet kan man bruke den nyeste generasjonen jGCaMP864.

Metodene beskrevet her er en rask og pålitelig måte å avgjøre om genetisk eller farmakologisk manipulering av nevroner perturber funksjonell synaptisk signalering og frigjøring. De detaljerte eksperimentene er mindre teknisk utfordrende og mindre kostbare enn tradisjonell spenning/strømklemme elektrofysiologi og elektronmikroskopi. I tillegg, mens elektrofysiologi er av natur lav gjennomstrømning og på det enkelte cellenivå, protokollene her beskrevet er høyere gjennomstrømning og rask, slik at flere nevroner kan avbildes samtidig og mange iterasjoner som skal utføres i en enkelt bildeøkt. Det foreslås at disse kalsiumdynamikk og synaptiske frigjøringsparadigmer brukes som den første indikatoren for synaptiske overføringsendringer i ALS-modeller og studiet av andre former for nevronal degenerasjon. Selv om konklusjonene fra Gcamp6m og styrylfargeavbildning ikke nøyaktig kan erte ut en bestemt mekanisme for synaptisk dysfunksjon, basert på slike funn, kan forskere deretter gjennomføre målrettede, evidensbaserte komplementære studier ved hjelp av tradisjonelle metoder for å bestemme kanaler involvert, synaptisk vesiclenummer eller quantalt innhold.

Verktøyet i disse protokollene er den raske og enkle vurderingen av endringer i riktig depolariseringsmediert kalsiumtilstrømning og / eller synaptisk vesiclefusjon i spesifikke ALS-modeller. Vi har nylig demonstrert dette i en publikasjon som viser økt kalsiumtilstrømning og abrogasjon av synaptisk lossing i kortikale nevroner som uttrykker dipeptidproteinet (glycin-alanin)50 som følge av C9ORF72 heksacnukleotid gjentatt ekspansjon43. Som vist i vårt publiserte arbeid, kan disse metodene enkelt utføres i takt med co-transfeksjon av mutante RNAer eller proteiner av interesse eller i celler dyrket direkte fra transgene dyremodeller43. I tillegg har påliteligheten og robustheten til disse protokollene vellykket testet i nevronalt differensierte menneskeskapte pluripotente stamceller45, slik at fremtidige studier kan gjøres direkte i pasientavledede sykdomsrelevante celler. I et annet nylig manuskript gir vi bevis på at motoriske nevroner av vill type gjennomgår høy kalsiumtilstrømning etter stimulering når de er i nærvær av en løselig faktor frigjort fra mutant FUS som uttrykker astrocytter44. Astrocytiske kalsiumsignaleringshendelser er også dypt sammenflettet med synaptisk overføring i nærliggende nevroner65. Kalsiumdynamikkprotokoll har blitt brukt til å undersøke helcellede kalsiumtransienter i modeller av astrocytisk kultur, som har vist seg effektive i både gnagere primære og menneskelige IPS-avledede celler. Videre forståelse av astrocytisk kalsiumdynamikk og signalering i ALS-modeller vil gi verdifull innsikt i hvordan synaptisk overføring kanskje påvirkes. Til syvende og sist vil bruk av celle-type-spesifikke GCaMP-reportere også være et kraftig verktøy for å undersøke nevronal og astrocytisk kalsiumdynamikk i blandede samkulturinnstillinger og spesifikt evaluere ikke-celle-autonome effekter som stammer fra hver cellepopulasjon.

Til slutt strekker den potensielle bruken av disse metodene seg ikke bare utover studiet av ALS, men også til de bredere feltene nevrodegenerativ og til og med utviklingsmessig nevrovitenskap. Detaljert informasjon om de spesifikke plasmidene som brukes til å generere de representative resultatene, er gitt og vellykket ved transfecting plasmider som inneholder mange forskjellige genetiske varianter av FUS, SOD1 og C9ORF72 hexanucleotide repetisjoner og dipeptider43,44,66,67,68. Forutsatt at plasmider inneholder en promotor som brukes i nevroner, er det ingen begrensning på hvilke modeller av ALS eller degenerativ sykdom som kan studeres ved hjelp av disse metodene. Videre er transfeksjon for å uttrykke mutantproteiner et helt valgfritt trinn. Kulturer generert fra transgene dyr eller menneskelige pasientavledede celler eliminerer behovet for å identifisere celler som inneholder det mutante proteinet av interesse. For tiden er disse systemene begrenset på den måten at hvis styrylfarge vil bli brukt, er TRITC-kanalen opptatt, og hvis GcaMP6 brukes, er FITC-kanalen opptatt. Teknikker som muliggjør undersøkelse av nevronal og astrocytisk aktivitet i sanntid utvider mulighetene for å forstå tidsforløpanalyse for synaptisk modning / degenerasjon, samt raske tester for effekten av farmakologiske forbindelser for å fremme eller undertrykke nevronal kommunikasjon. Disse to metodene er egnet til høy gjennomstrømningsskalering for screening. I stedet for å plate nevroner i individuelle 35 mm retter, kan bildeparametrene til disse to protokollene brukes på en automatisert måte over 96-brønnsplater. Ved hjelp av en slik plattform kan sammensatte biblioteker raskt testes for terapeutiske behandlinger, som modulerer kalsiuminngang eller forbedrer synaptisk frigjøring ved hjelp av en genetisk sykdomsmodell eller til og med celler avledet direkte fra pasienter. Denne metoden kan raskt spore muligheten for undergruppespesifikk eller til og med personlig terapeutisk ved raskt å identifisere kandidatmolekyler for videre undersøkelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi vil gjerne anerkjenne nåværende og tidligere medlemmer av Jefferson Weinberg ALS Center for kritiske tilbakemeldinger og forslag til optimalisering av disse teknikkene og deres analyser. Dette arbeidet ble støttet av finansiering fra NIH (RF1-AG057882-01 og R21-NS0103118 til D.T), NINDS (R56-NS092572 og R01-NS109150 til P.P), Muscular Dystrophy Association (D.T.), Robert Packard Center for ALS Research (D.T.), Family Strong 4 ALS foundation og Farber Family Foundation (B.K.J., K.K, og P.P).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20x air objective Nikon For imaging
40x oil immersion objective Nikon For imaging
B27 supplement Thermo Scientific 17504044 Neuronal growth supplement
BD Syringes without Needle, 50 mL Thermo Scientific 13-689-8 Part of gravity perfusion assembly
Biosafety cell culture hood Baker SterilGARD III SG403A Asceptic cell culturing, transfection, and dye loading
b-Mercaptoethanol Millipore Sigma M3148 For culturing and maintenance of neuronal cultures
Bovine Serum Albumin Millipore Sigma A9418 For preparing neuronal cultures
Calcium chloride dihydrate Millipore Sigma 223506 Component of aCSF solutions
Cell culture CO2 incubator Thermo Scientific 13-998-123 For culturing and maintenance of neurons
Centrifuge Eppendorf 5810R For neuronal culture preparation
Confocal microscope Nikon Eclipse Ti +A1R core For fluorescence imaging
CoolSNAP ES2  CCD camera Photometrics For image acquisition
D-Glucose Millipore Sigma G8270 Component of aCSF solutions
DNase Millipore Sigma D5025 For neuronal culture preparation
Female, timed-pregnancy Sprague Dawley rats Charles river 400SASSD For preparing embryonic cortical and spinal motor neuron cultures
FITC Filter cube Nikon 77032509 For imaging Gcamp calcium transients
FM4-64 styryl dye Invitrogen T13320 For imaging synaptic vesicle release
Glass bottom petri dishes (Thickness #1.5) CellVis D35-10-1.5-N For growth of neurons on imaging-compatible culture dish
Glass Pasteur pipette Grainger 52NK56 For preparing neuronal cultures
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Millipore Sigma H6648 For preparing neuronal cultures
HEPES Millipore Sigma H3375 Component of aCSF solutions
High KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF) For imaging. Please see recipes*
horse serum Millipore Sigma H1138 For culturing and maintenance of neurons
Laminar flow dissection hood NUAIRE NU-301-630 For preparing neuronal cultures
Laminin Thermo Scientific 23017015 For preparing neuronal cultures
Leibovitz's L-15 Medium Thermo Scientific 11415064 For preparing neuronal cultures
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red Thermo Scientific 21083027 For preparing neuronal cultures
L-Glutamine (200 mM) Thermo Scientific 25030149 Neuronal culture supplement
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Scientific 11668019 For neuronal transfections
Low KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF) For imaging. Please see recipes*
Magnesium chloride Millipore Sigma 208337 Component of aCSF solutions
Microsoft Excel Microsoft Software for data analysis/normalization
Nalgene  Filter Units, 0.2 µm PES Thermo Scientific 565-0020 Filter unit for aCSF solution
Neurobasal medium Thermo Scientific 21103049 For culturing and maintenance of neuronal cultures
NIS-Elements Advanced Research Nikon Software for image capture and analysis
Nunc 15 mL Conical tubes Thermo Scientific 339650 For preparing neuronal culture and buffer solutions
Nunc 50 mL conical tubes Thermo Scientific 339652 For preparing neuronal culture and buffer solutions
Optiprep Millipore Sigma D1556 For preparing neuronal cultures
Papain Millipore Sigma P4762 For preparing neuronal cultures
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Scientific 15140122 To prevent bacterial contamination of neuronal cultures
Perfusion system Warner Instruments SF-77B For exchange of aCSF
Perfusion tubing Cole-Parmer UX-30526-14 Part of gravity perfusion assembly
pGP-CMV-Gcamp6m plasmid Addgene 40754 For imaging calcium transients
Poly-D-lysine hydrobromide Millipore Sigma P7886 Coating agent for glass bottom petri dishes
Potassium chloride Millipore Sigma P3911 Component of aCSF solutions
Sodium bicarbonate Millipore Sigma S5761 Component of aCSF solutions
Sodium Chloride Millipore Sigma S9888 Component of aCSF solutions
Stage Top Incubator Tokai Hit For incubation of live neurons during imaging period
TRITC Filter cube Nikon 77032809 For imaging FM4-64
Trypsin Inhibitor Millipore Sigma T6414 For preparing neuronal cultures
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Thermo Scientific 25200056 For preparing neuronal cultures
Vibration Isolation table New Port VIP320X2430-135520 Table/stand for microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gibson, S. B., et al. The evolving genetic risk for sporadic ALS. Neurology. 89 (3), 226-233 (2017).
  2. Kim, G., Gautier, O., Tassoni-Tsuchida, E., Ma, X. R., Gitler, A. D. ALS genetics: Gains, losses, and implications for future therapies. Neuron. 108 (5), 822-842 (2020).
  3. Nijssen, J., Comley, L. H., Hedlund, E. Motor neuron vulnerability and resistance in amyotrophic lateral sclerosis. Acta Neuropathologica. 133 (6), 863-885 (2017).
  4. Marttinen, M., Kurkinen, K. M., Soininen, H., Haapasalo, A., Hiltunen, M. Synaptic dysfunction and septin protein family members in neurodegenerative diseases. Molecular Neurodegeneration. 10, 16 (2015).
  5. Bae, J. S., Simon, N. G., Menon, P., Vucic, S., Kiernan, M. C. The puzzling case of hyperexcitability in amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Clinical Neurology. 9 (2), 65-74 (2013).
  6. Kiernan, M. C. Hyperexcitability, persistent Na+ conductances and neurodegeneration in amyotrophic lateral sclerosis. Experimental Neurology. 218 (1), 1-4 (2009).
  7. Krarup, C. Lower motor neuron involvement examined by quantitative electromyography in amyotrophic lateral sclerosis. Clinical Neurophysiology. 122 (2), 414-422 (2011).
  8. Vucic, S., Nicholson, G. A., Kiernan, M. C. Cortical hyperexcitability may precede the onset of familial amyotrophic lateral sclerosis. Brain. 131, Pt 6 1540-1550 (2008).
  9. Marchand-Pauvert, V., et al. Absence of hyperexcitability of spinal motoneurons in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Physiology. 597 (22), 5445-5467 (2019).
  10. Fischer, L. R., et al. Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: evidence in mice and man. Experimental Neurology. 185 (2), 232-240 (2004).
  11. Markert, S. M., et al. Overexpression of an ALS-associated FUS mutation in C. elegans disrupts NMJ morphology and leads to defective neuromuscular transmission. Biology Open. 9 (12), (2020).
  12. Shahidullah, M., et al. Defects in synapse structure and function precede motor neuron degeneration in Drosophila models of FUS-related ALS. Journal of Neuroscience. 33 (50), 19590-19598 (2013).
  13. Liu, Y., et al. C9orf72 BAC Mouse Model with Motor Deficits and Neurodegenerative Features of ALS/FTD. Neuron. 90 (3), 521-534 (2016).
  14. Freibaum, B. D., et al. GGGGCC repeat expansion in C9orf72 compromises nucleocytoplasmic transport. Nature. 525 (7567), 129-133 (2015).
  15. Zhang, K., et al. The C9orf72 repeat expansion disrupts nucleocytoplasmic transport. Nature. 525 (7567), 56-61 (2015).
  16. Perry, S., Han, Y., Das, A., Dickman, D. Homeostatic plasticity can be induced and expressed to restore synaptic strength at neuromuscular junctions undergoing ALS-related degeneration. Human Molecular Genetics. 26 (21), 4153-4167 (2017).
  17. Romano, G., et al. Chronological requirements of TDP-43 function in synaptic organization and locomotive control. Neurobiology of Disease. 71, 95-109 (2014).
  18. Armstrong, G. A., Drapeau, P. Calcium channel agonists protect against neuromuscular dysfunction in a genetic model of TDP-43 mutation in ALS. Journal of Neuroscience. 33 (4), 1741-1752 (2013).
  19. Diaper, D. C., et al. Loss and gain of Drosophila TDP-43 impair synaptic efficacy and motor control leading to age-related neurodegeneration by loss-of-function phenotypes. Human Molecular Genetics. 22 (8), 1539-1557 (2013).
  20. Schwiening, C. J. A brief historical perspective: Hodgkin and Huxley. Journal of Physiology. 590 (11), 2571-2575 (2012).
  21. Dong, H., et al. Curcumin abolishes mutant TDP-43 induced excitability in a motoneuron-like cellular model of ALS. Neuroscience. 272, 141-153 (2014).
  22. Chand, K. K., et al. Defects in synaptic transmission at the neuromuscular junction precede motor deficits in a TDP-43(Q331K) transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 32 (5), 2676-2689 (2018).
  23. Perkins, E. M., et al. Altered network properties in C9ORF72 repeat expansion cortical neurons are due to synaptic dysfunction. Molecular Neurodegeneration. 16 (1), 13 (2021).
  24. Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P. Vesicle hypothesis of the release of quanta of acetylcholine. Physiological Reviews. 60 (2), 396-441 (1980).
  25. Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
  26. Ryan, J., Gerhold, A. R., Boudreau, V., Smith, L., Maddox, P. S. Introduction to Modern Methods in Light Microscopy. Methods in Molecular Biology. 1563, 1-15 (2017).
  27. Wang, L., Frei, M. S., Salim, A., Johnsson, K. Small-molecule fluorescent probes for live-cell super-resolution microscopy. Journal of the American Chemical Society. 141 (7), 2770-2781 (2019).
  28. Neher, E. Vesicle pools and Ca2+ microdomains: new tools for understanding their roles in neurotransmitter release. Neuron. 20 (3), 389-399 (1998).
  29. Dolphin, A. C., Lee, A. Presynaptic calcium channels: specialized control of synaptic neurotransmitter release. Nature Reviews Neuroscience. 21 (4), 213-229 (2020).
  30. Tsien, R. Y., Rink, T. J., Poenie, M. Measurement of cytosolic free Ca2+ in individual small cells using fluorescence microscopy with dual excitation wavelengths. Cell Calcium. 6 (1-2), 145-157 (1985).
  31. Takahashi, N., et al. Cytosolic Ca2+ dynamics in hamster ascending thin limb of Henle's loop. American Journal of Physiology. 268 (6), Pt 2 1148-1153 (1995).
  32. Cleemann, L., DiMassa, G., Morad, M. Ca2+ sparks within 200 nm of the sarcolemma of rat ventricular cells: evidence from total internal reflection fluorescence microscopy. Advances in Experimental Medicine and Biology. 430, 57-65 (1997).
  33. Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B. Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium. Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).
  34. Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).
  35. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  36. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
  37. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  38. Horikawa, K. Recent progress in the development of genetically encoded Ca2+ indicators. Journal of Medical Investigation. 62 (1-2), 24-28 (2015).
  39. Bohme, M. A., Grasskamp, A. T., Walter, A. M. Regulation of synaptic release-site Ca(2+) channel coupling as a mechanism to control release probability and short-term plasticity. Federation of European Biochemical Society Letters. 592 (21), 3516-3531 (2018).
  40. Li, Y. C., Kavalali, E. T. Synaptic vesicle-recycling machinery components as potential therapeutic targets. Pharmacological Reviews. 69 (2), 141-160 (2017).
  41. Gaffield, M. A., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle exocytosis and endocytosis with FM dyes. Nature Protocols. 1 (6), 2916-2921 (2006).
  42. Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the Drosophila neuromuscular junction. Methods in Molecular Biology. 440, 349-369 (2008).
  43. Jensen, B. K., et al. Synaptic dysfunction induced by glycine-alanine dipeptides in C9orf72-ALS/FTD is rescued by SV2 replenishment. European Molecular Biology Organization Molecular Medicine. 12 (5), 10722 (2020).
  44. Kia, A., McAvoy, K., Krishnamurthy, K., Trotti, D., Pasinelli, P. Astrocytes expressing ALS-linked mutant FUS induce motor neuron death through release of tumor necrosis factor-alpha. Glia. 66 (5), 1016-1033 (2018).
  45. Fernandopulle, M. S., et al. Transcription Factor-Mediated Differentiation of Human iPSCs into Neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 51 (2018).
  46. Ye, L., Haroon, M. A., Salinas, A., Paukert, M. Comparison of GCaMP3 and GCaMP6f for studying astrocyte Ca2+ dynamics in the awake mouse brain. Public Library of Science One. 12 (7), 0181113 (2017).
  47. Angleson, J. K., Betz, W. J. Monitoring secretion in real time: capacitance, amperometry and fluorescence compared. Trends in Neuroscience. 20 (7), 281-287 (1997).
  48. Ryan, T. A., et al. The kinetics of synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic boutons. Neuron. 11 (4), 713-724 (1993).
  49. Kraszewski, K., et al. Synaptic vesicle dynamics in living cultured hippocampal neurons visualized with CY3-conjugated antibodies directed against the lumenal domain of synaptotagmin. Journal of Neuroscience. 15 (6), 4328-4342 (1995).
  50. Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. Journal of Neuroscience. 12 (2), 363-375 (1992).
  51. Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255 (5041), 200-203 (1992).
  52. Ryan, T. A., Smith, S. J. Vesicle pool mobilization during action potential firing at hippocampal synapses. Neuron. 14 (5), 983-989 (1995).
  53. Betz, W. J., Ridge, R. M., Bewick, G. S. Comparison of FM1-43 staining patterns and electrophysiological measures of transmitter release at the frog neuromuscular junction. Journal of Physiology-Paris. 87 (3), 193-202 (1993).
  54. Wu, L. G., Betz, W. J. Nerve activity but not intracellular calcium determines the time course of endocytosis at the frog neuromuscular junction. Neuron. 17 (4), 769-779 (1996).
  55. Ryan, T. A., Smith, S. J., Reuter, H. The timing of synaptic vesicle endocytosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (11), 5567-5571 (1996).
  56. Ramaswami, M., Krishnan, K. S., Kelly, R. B. Intermediates in synaptic vesicle recycling revealed by optical imaging of Drosophila neuromuscular junctions. Neuron. 13 (2), 363-375 (1994).
  57. Kayser, M. S., McClelland, A. C., Hughes, E. G., Dalva, M. B. Intracellular and trans-synaptic regulation of glutamatergic synaptogenesis by EphB receptors. Journal of Neuroscience. 26 (47), 12152-12164 (2006).
  58. Washburn, H. R., Xia, N. L., Zhou, W., Mao, Y. T., Dalva, M. B. Positive surface charge of GluN1 N-terminus mediates the direct interaction with EphB2 and NMDAR mobility. Nature Communications. 11 (1), 570 (2020).
  59. Magrane, J., Sahawneh, M. A., Przedborski, S., Estevez, A. G., Manfredi, G. Mitochondrial dynamics and bioenergetic dysfunction is associated with synaptic alterations in mutant SOD1 motor neurons. Journal of Neuroscience. 32 (1), 229-242 (2012).
  60. Casci, I., et al. Muscleblind acts as a modifier of FUS toxicity by modulating stress granule dynamics and SMN localization. Nature Communications. 10 (1), 5583 (2019).
  61. Hruska, M., Henderson, N., Le Marchand, S. J., Jafri, H., Dalva, M. B. Synaptic nanomodules underlie the organization and plasticity of spine synapses. Nature Neuroscience. 21 (5), 671-682 (2018).
  62. Rein, M. L., Deussing, J. M. The optogenetic (r)evolution. Molecular Genetics and Genomics. 287 (2), 95-109 (2012).
  63. Bertucci, C., Koppes, R., Dumont, C., Koppes, A. Neural responses to electrical stimulation in 2D and 3D in vitro environments. Brain Research Bulletin. 152, 265-284 (2019).
  64. Zhang, Y., et al. jGCaMP8 Fast genetically encoded calcium indicators. Janelia Research Campus. , (2020).
  65. Guerra-Gomes, S., Sousa, N., Pinto, L., Oliveira, J. F. Functional roles of astrocyte calcium elevations: From synapses to behavior. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 427 (2017).
  66. Westergard, T., et al. Cell-to-cell transmission of dipeptide repeat proteins linked to C9orf72-ALS/FTD. Cell Reports. 17 (3), 645-652 (2016).
  67. Wen, X., et al. Antisense proline-arginine RAN dipeptides linked to C9ORF72-ALS/FTD form toxic nuclear aggregates that initiate in vitro and in vivo neuronal death. Neuron. 84 (6), 1213-1225 (2014).
  68. Daigle, J. G., et al. Pur-alpha regulates cytoplasmic stress granule dynamics and ameliorates FUS toxicity. Acta Neuropathologica. 131 (4), 605-620 (2016).

Tags

Nevrovitenskap utgave 173
Sanntids fluorescerende måling av synaptiske funksjoner i modeller av amyotrofisk lateral sklerose
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Krishnamurthy, K., Trotti, D.,… More

Krishnamurthy, K., Trotti, D., Pasinelli, P., Jensen, B. Real-Time Fluorescent Measurement of Synaptic Functions in Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis. J. Vis. Exp. (173), e62813, doi:10.3791/62813 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter