Summary
Dieses neuronale Zelldissoziationsprotokoll ist für Proben mit einer geringen Menge an Ausgangsmaterial vorgesehen und liefert eine hochgradig lebensfähige Einzelzellsuspension für die nachgelagerte Analyse mit optionalen Fixations- und Färbeschritten.
Abstract
Dieses neuronale Dissoziationsprotokoll (eine Anpassung des Protokolls, das ein kommerzielles Dissoziationskit für Erwachsene begleitet) optimiert die Gewebeverarbeitung in Vorbereitung auf detaillierte nachgelagerte Analysen wie Durchflusszytometrie oder Einzelzellsequenzierung. Die neuronale Dissoziation kann durch mechanische Dissoziation (z. B. unter Verwendung von Filtern, Hacktechniken oder Pipettenverreibung), enzymatischer Verdauung oder einer Kombination davon durchgeführt werden. Die heikle Natur neuronaler Zellen kann die Bemühungen erschweren, die hochgradig lebensfähige, echte Einzelzellsuspension mit minimalen Zelltrümmern zu erhalten, die für die Einzelzellanalyse erforderlich ist. Die Daten zeigen, dass diese Kombination aus automatisierter mechanischer Dissoziation und enzymatischem Aufschluss durchweg zu einer hochgradig lebensfähigen (>90%) Einzelzellsuspension führt, die die oben genannten Schwierigkeiten überwindet. Während einige der Schritte manuelle Geschicklichkeit erfordern, verringern diese Schritte die Probenhandhabung und den potenziellen Zellverlust. Dieses Manuskript beschreibt jeden Schritt des Prozesses, um andere Labors in die Lage zu versetzen, kleine Mengen neuronalen Gewebes in Vorbereitung auf die nachgelagerte Analyse erfolgreich zu dissoziieren.
Introduction
Der Hippocampus wurde erstmals von einem bolognesischen Anatomen, Giulio Cesare Aranzio, in den 1500er Jahren beschrieben1. Bei der Benennung dieser neu entdeckten Struktur wurde Aranzio wahrscheinlich von seiner unheimlichen Ähnlichkeit mit dem Seepferdchen der Gattung Hippocampus1 inspiriert. Der Hippocampus ist an Stressreaktionen beteiligt, ist aber weithin für seine Rolle beim Lernen und Gedächtnis bekannt. Genauer gesagt ist der Hippocampus für die Kodierung und den Abruf des deklarativen und räumlichen Gedächtnissesverantwortlich 1.
Der Hippocampus oder Hippocampus selbst ist in dieUnterfelder CA1 (Cornu Ammonis), CA2 und CA3 1 unterteilt. Im Vergleich zum Rest des Nervensystems weist der Hippocampus mehrere einzigartige definierende Merkmale auf, darunter seine Plastizität und sein Potenzial für die laufende Neurogenese2. Neurogenese ist der Prozess der Proliferation und Differenzierung neuronaler Stammzellen, gefolgt von ihrer Integration in das bereits bestehende neuronale Netzwerk. Die Neurogenese ist auf die subgranulare Zone des Gyrus dentatus und die subventrikuläre Zone der lateralen Ventrikel (und der Riechkolben) beschränkt3. Während die Neurogenese in der Embryogenese reichlich vorhanden ist, ist es ein lebenslanger Prozess 3,4. Daher wird sich diese Diskussion auf die adulte Neurogenese im Hippocampus konzentrieren.
Die subventrikulären und subgranularen Zonen sind neurogene Nischen, die ependymale und vaskuläre Zellen sowie unreife und reife Linien neuronaler Stammzellen enthalten5. Mikroglia tragen als Immunzellen zu diesen Nischen bei, um die Neurogenese zu regulieren6. Neurale Vorläuferzellen sind Nichtstammzell-Nachkommen von neuralen Stammzellen7. Drei Arten von neuronalen Vorläufern sind in der subventrikulären Zone vorhanden: radiale gliaartige Typ-B-Zellen, Typ-C-transitverstärkende Vorläufer und Typ-A-Neuroblasten 3,8. Die sich langsam teilenden neuralen Vorläuferzellen vom Typ B in der subventrikulären Zone können sich in sich schnell teilende Typ-C-Zellen8 differenzieren. Anschließend differenzieren sich Typ-C-Zellen in Typ-A-Zellen8. Diese Neuroblasten wandern durch den rostralen Migrationsstrom zum Riechkolben, bevor sie sich in Interneuronen oder Oligodendrozyten9 differenzieren. Diese Riechkolben-Interneurone sind der Schlüssel zum olfaktorischen Kurzzeitgedächtnis und zum assoziativen Lernen, während die Oligodendrozyten Axone des Corpus callosum9 myelinieren. Der Großteil der adulten Neurogenese findet in der subgranularen Zone des Gyrus dentatus statt, wo radiale neurale Vorläufer vom Typ 1 und nichtradialen Typ 2gefunden werden 3. Die meisten neuralen Vorläuferzellen sind dazu bestimmt, zu dentalen Granulatneuronen und Astrozyten10 zu werden. Durch Gap Junctions verbunden, bilden Astrozyten Netzwerke, um Plastizität, synaptische Aktivität und neuronale Erregbarkeitzu modulieren 5. Als primäres exzitatorisches Neuron des Gyrus dentatus liefern Körnerzellen Input vom entorhinalen Kortex in die CA3-Region11.
Neuronale Stammzellpopulationen können mit Hilfe von immunmagnetischen oder immunfluoreszierenden Isolationsstrategienisoliert werden 12,13. Neuralgewebe ist besonders schwer zu dissoziieren; Bemühungen, dies zu tun, führen oft zu Proben mit schlechter Zelllebensfähigkeit und / oder nicht zur Herstellung der notwendigen Einzelzellsuspension für die nachgelagerte Analyse. Die neuronale Dissoziation kann durch mechanische Dissoziation (z. B. unter Verwendung von Filtern, Hacktechniken oder Pipettenverreibung), enzymatischer Verdauung oder einer Kombination von Technikendurchgeführt werden 14,15. In einer Studie zur Bewertung neuronaler Dissoziationsmethoden wurden die Lebensfähigkeit und Qualität der manuellen mechanischen Dissoziation durch Pipettenverreibung im Vergleich zu Kombinationen von Pipettenverreibung und Verdauung mit verschiedenen Enzymenverglichen 15. Die Qualität wurde basierend auf der Menge an Zellklumpen und DNA oder subzellulären Ablagerungen in der vorbereiteten Suspension15 bewertet. Suspensionen von Gliatumoren, die allein einer manuellen mechanischen Dissoziation unterzogen wurden, hatten eine signifikant geringere Zelllebensfähigkeit als Behandlungen mit Dispase oder einer Kombination aus DNase, Kollagenase und Hyaluronidase15. Volovitz et al. erkannten die Unterschiede in der Lebensfähigkeit und Qualität zwischen den verschiedenen Methoden an und betonten, dass eine unzureichende Dissoziation die Genauigkeit der nachgelagerten Analyse verringernkann 15.
In einer separaten Studie verglichen die Autoren über 60 verschiedene Methoden und Kombinationen der Dissoziation von kultivierten neuronalen Zellen14. Diese Methoden umfassten acht verschiedene Variationen der manuellen mechanischen Dissoziation durch Pipettenverreibung, einen Vergleich der Inkubation mit fünf einzelnen Enzymen in drei verschiedenen Intervallen und verschiedene Kombinationen der mechanischen Dissoziation mit enzymatischer Verdauung oder die Kombination von zwei Enzymen14. Keine der mechanischen Methoden ergab eine Einzelzellsuspension14. Vier der Einzelenzymbehandlungen, zehn der enzymatischen Kombinationsbehandlungen und vier der Kombinationen von mechanischer Dissoziation mit enzymatischer Verdauung ergaben eine Einzelzellsuspension14. Enzymatischer Aufschluss mit TrypLE, gefolgt von Trypsin-EDTA, dissoziierte Proben am effektivsten14. Proben, die mit TrypLE und/oder Trypsin-EDTA behandelt wurden, neigten übrigens dazu, gallertartige Klumpenzu bilden 14. Während diese Studie an kultivierten Zellen durchgeführt wurde, spricht sie für die Mängel der Pipettenverreibung oder der enzymatischen Verdauung allein.
Parallele Vergleiche von manueller und automatisierter mechanischer Dissoziation fehlen. Eine Gruppe führte jedoch Durchflusszytometrie durch, um die manuelle und halbautomatische mechanische Dissoziation ganzer Mausgehirne in Verbindung mit kommerziellen Papain- oder Trypsin-Enzymdissoziationskitszu vergleichen 16. Die Verarbeitung mit dem Dissoziator ergab konsistenter lebensfähige Zellen16. Nach der Dissoziation isolierten die Autoren auch Prominin-1-Zellen, neuronale Vorläuferzellen und Mikroglia16. Für zwei der drei isolierten Zellpopulationen war die Reinheit der isolierten Zellen etwas höher, wenn Proben mit dem Dissoziator verarbeitet wurden, verglichen mitmanuell 16. Reiß et al. stellten fest, dass die Variabilität von Mensch zu Mensch in der Pipettiertechnik die Reproduzierbarkeit der lebensfähigen Zellpopulationsausbeute bei der Gewebedissoziation behindert16. Die Autoren folgerten, dass die automatisierte mechanische Dissoziation die Probenverarbeitungstandardisiert 16.
Die in diesem Manuskript beschriebene Methode der Dissoziation ist eine Kombination aus vollautomatischer mechanischer Dissoziation und enzymatischer Verdauung unter Verwendung von Lösungen, die ein kommerzielles Dissoziationskit für Erwachsene17 begleiten. Im Gegensatz zu Standardprotokollen reduziert dieses optimierte Protokoll die Probenmanipulation, ergibt eine hochgradig lebensfähige Einzelzellsuspension und ist für die Verarbeitung minimaler Mengen an Ausgangsgewebe vorgesehen.
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Protocol
Die Experimente wurden in Übereinstimmung mit den ethischen Standards durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee der UAMS genehmigt wurden. 6 Monate alte weibliche C57Bl6/J-Wildtyp-Mäuse wurden gekauft und in Gruppen (4 Mäuse pro Käfig) unter einem konstanten Hell/Dunkel-Zyklus von 12 h untergebracht.
1. Herstellung von Reagenzien
- Bereiten Sie eine reparierbare Lebend-/Totflecken-Lagerlösung vor. Rekonstituieren Sie die fluoreszierende Färbung mit 20 μL Dimethylsulfoxid (DMSO).
- Wickeln Sie die Durchstechflasche in Folie ein, kennzeichnen Sie sie als "Rekonstituiert" und lagern Sie sie bis zu sechs Monate bei -20 °C.
- Bereiten Sie eine 0,9% ige Salzlösung mit Heparin vor. Verdünnen Sie den Inhalt einer Durchstechflasche Heparinnatrium (10.000 USP-Einheiten pro 10 ml) in 1 l doppelt destilliertem Wasser (ddH2O).
- Bereiten Sie genug für ca. 45 ml pro Tier vor und lagern Sie es bei 4 ° C für bis zu einer Woche.
- Machen Sie 1% Paraformaldehyd (PFA).
- In einem Abzug eine Kochplatte auf 50 °C erhitzen. In einer Mikrowelle 100 ml ddH2O in einem Glasbecherglas auf ca. 60 °C erhitzen. Fügen Sie eine magnetische Rührstange hinzu und geben Sie sie auf die Heizplatte.
- Im Abzug 1 g PFA abwägen und in das Becherglas von ddH2O geben. 0,1125 g NaOH-Kristalle hinzufügen und mischen, bis sie sich aufgelöst haben (5-10 min).
- 0,4 g NaPO4- monobasic zugeben und bis zur Auflösung (2-5 min) mischen. Vakuumfiltern Sie die Lösung und stellen Sie den pH-Wert mit HCl und NaOH auf 7,4 ein.
- Vor der Lagerung 30 min auf Eis oder bei 4°C abkühlen lassen.
HINWEIS: Aliquots von 1,5 ml können ein Jahr lang bei -20 °C gelagert werden. Vermeiden Sie Frost-Tau-Zyklen. Wenn die Lösung nach dem Auftauen trüb wird oder sich ein Niederschlag gebildet hat, sollte die Lösung nicht verwendet werden.
VORSICHT: Giftig, brennbar. Arbeiten Sie immer mit PFA unter einer belüfteten Kapuze und tragen Sie die richtige persönliche Schutzausrüstung.
- Resuspendiert das lyophilisierte Enzym A mit 1 ml Puffer A. Wirbeln Sie die Lösung nicht ein.
HINWEIS: Enzym A und Puffer A sowie die Puffer A, Y und Z sind Reagenzien im kommerziellen Adult Brain Dissociation Kit17. - Teilen Sie Enzym P in Aliquote von 50 μL und resuspendieren Sie Enzym A in 10 μL Aliquote. Gemäß den Anweisungen des Kits bis zu sechs Monate bei -20 °C lagern. Vermeiden Sie Frost-Tau-Zyklen.
2. Tag des Experiments
- Die Tischzentrifuge wird auf 4 °C abgekühlt.
- Legen Sie Aliquot(s) von PFA in den Kühlschrank, um es allmählich aufzutauen.
- Legen Sie den rekonstituierten lebenden/toten Fleck ins Dunkel (z. B. eine Schublade), um ihn bei Raumtemperatur aufzutauen.
- Bereiten Sie den Puffer für Rinderserumalbumin (BSA) vor. 0,5 g BSA zu 100 ml 1x Dulbeccos phosphatgepufferter Lösung ohne Kalzium und Magnesium (D-PBS), pH 7,2, zugeben.
- Fügen Sie einen Rührstab hinzu und mischen Sie ihn 30 min auf einer Rührplatte. Auf 50 ml konische Rohre umfüllen und bei 4 °C lagern.
HINWEIS: Verwenden Sie immer frisch zubereiteten BSA-Puffer. - Bereiten Sie die Verdünnung der Lebend-/Totfleckenarbeit vor. 1 μL der rekonstituierten Lebend-/Totflecken-Stammlösung in 360 μL D-PBS geben und bei Raumtemperatur im Dunkeln lagern (z. B. eine Schublade oder Box). Bereiten Sie 50 μL der Arbeitsverdünnung pro Probe vor.
3. Perfusion
- Die Salzlösung mit Heparin auf Eis legen.
- Schalten Sie den Sauerstoff ein und stellen Sie die Durchflussmesseranzeige am Kleintier-Anästhesie-Verdampfersystem auf 1 L / min ein. Stellen Sie sicher, dass der Sauerstoffdruck und das Isofluran ausreichend vorhanden sind.
- Stellen Sie das Vaporizer-Zifferblatt auf 3,5% ein (für Induktion und Wartung).
- Grundieren Sie die Perfusionspumpenleitungen mit der Kochsalzlösung/Heparin-Lösung. Stellen Sie die Geschwindigkeit auf 6 ml/min ein.
- Legen Sie die Maus in die Induktionskammer, schalten Sie die Entlüftung ein und warten Sie einige Minuten, bis die Maus nicht mehr reagiert. Bestätigen Sie eine ausreichende Tiefe der Anästhesie durch das Fehlen eines Pedalentzugs bis hin zu schädlicher Prise.
- Legen Sie die Maus auf den Rücken auf das Dissektionstablett mit der Nase im Nasenkonus. Führen Sie eine sekundäre Bestätigung der Vollnarkose durch das Fehlen eines Pedalentzugs zu schädlicher Prise durch. Heften Sie alle vier Pfoten an das Tablett an.
- Besprühen Sie den Bauch des Tieres mit 20% Ethanol.
- Kneifen Sie mit einer Pinzette den Unterbauch ein und heben Sie die Haut an. Verwenden Sie eine Schere, um Fell und Haut bis zum Boden des Brustkorbs zu durchschneiden.
- Machen Sie zwei diagonale Schnitte von unterhalb des Brustkorbs zu jeder Schulter.
- Sezieren Sie vorsichtig das Zwerchfell (vermeiden Sie die Lunge und das Herz). Sezieren Sie den Brustkorb, um das Herz freizulegen.
- Durchtrennen Sie vorsichtig das Bindegewebe um das Herz.
HINWEIS: Die Schritte 3.10-3.11 sind kritisch. Führen Sie mit Können und Geschicklichkeit durch. - Verwenden Sie die Schere, um den rechten Vorhof (dunkler Lappen oben links im Herzen) zu beschneiden. Schalten Sie den Fluss von Isofluran zum Entlüfter aus.
- Halten Sie das Herz mit einer Pinzette stabil. Durchbohren Sie mit der Fase der Schmetterlingsnadel nach oben den linken Ventrikel, während Sie die Nadel auf gleicher und parallel zum Tier halten.
- Halten Sie die Nadel an Ort und Stelle, schalten Sie die Pumpe ein und durchbluten Sie mindestens 30 ml der Kochsalzlösung / Heparinlösung, bis die Flüssigkeit, die das Herz verlässt, undurchsichtig ist und Leber und Lunge blass sind.
HINWEIS: Die Schritte 3.13-3.14 sind kritisch. Führen Sie mit Können und Geschicklichkeit durch. - Schalten Sie die Pumpe aus, entfernen Sie die Nadel und bringen Sie die Maus in den Dissektionsbereich.
4. Sezieren
- Enthaupten Sie den Kopf mit einer großen chirurgischen Schere.
- Schneiden Sie das Fell vom Hinterkopf bis zu den Augen. Schälen Sie die Haut zurück, um den Schädel freizulegen.
- Befestigen Sie den Schädel zwischen den Augen. Machen Sie zwei Schnitte an der Rückseite des Schädels, an der 10- und 2-Uhr-Position, dann machen Sie einen langen Schnitt (halten Sie die Spitzen hoch, um das Gehirn nicht zu schädigen) entlang der mittleren Linie des Schädels bis zum ursprünglichen Schnitt zwischen den Augen.
- Verwenden Sie eine Pinzette, um die beiden Schädelhälften an den Seiten abzuschälen. Verwenden Sie einen Spatel, um das Gehirn zu entfernen, und legen Sie es in eine 60 mm große Petrischale aus Glas auf Eis, das mit kaltem D-PBS gefüllt ist (Abbildung 1).
- Verwenden Sie ein Skalpell oder Rasiermesser, um jede Hemisphäre zu trennen. Entfernen Sie dann die Riechkolben und das Kleinhirn.
- Verwenden Sie eine Pinzette, um das Mittelhirn zu entfernen, bis der Hippocampus freigelegt ist.
- Sichern Sie das Gehirn mit einer Pinzette. Mit einer zweiten Pinzette den Hippocampus vorsichtig aus jeder Hemisphäre herauskitzeln und beide Hippocampi auf eine markierte 1,5-ml-Röhre mit kaltem D-PBS übertragen.
- Legen Sie das Probenröhrchen mit den beiden Hippocampi der Maus auf Eis.
5. Bereiten Sie Enzymmischung 1 und 2 für jede Probe vor
HINWEIS: Für Volumina größer als 2 ml verwenden Sie eine serologische Pipette von 10 ml. Für Volumina von 200 μL-2 ml verwenden Sie eine 1000 μL-Pipette; Für Volumina von 21-199 μL verwenden Sie eine 200 μL Pipette; Für Volumina von 2-20 μL verwenden Sie eine 20 μL Pipette; Für Volumina unter 2 μL verwenden Sie eine Pipette von 0-2 μL.
- Für jede Probe tauen Sie je ein Aliquot von Enzym P und Enzym A bei Raumtemperatur auf.
- Für Enzymmischung 1 kombinieren Sie 50 μL Enzym P und 1900 μL Puffer Z in einem markierten C-Rohr (Tabelle der Materialien).
- Für Enzymmischung 2 fügen Sie 20 μL Puffer Y zu dem aufgetauten 10 μL Aliquot von Enzym A hinzu.
6. Dissoziationsprotokoll des Gehirns bei Erwachsenen17
HINWEIS: Bei der Arbeit mit Proben sollten die Röhrchen bei Raumtemperatur in ein Röhrchenrack gelegt werden, während BSA und D-PBS auf Eis bleiben, sofern nicht anders angegeben.
- Schalten Sie den Dissoziator ein.
- Verwenden Sie eine Pinzette, um die Hippocampi-Gewebestücke in die C-Röhre zu übertragen.
- Übertragen Sie 30 μL Enzymmischung 2 in die C-Röhre. Drehen Sie die Kappe, bis die Spannung spürbar ist, und ziehen Sie sie dann fest, bis sie klickt.
- Stellen Sie die C-Röhre kopfüber in eine Position des Dissoziators; Dem Beispiel wird der Status Ausgewählt zugewiesen (Abbildung 2). Befestigen Sie die Heizung über dem C-Rohr.
- Drücken Sie das Ordnersymbol, wählen Sie Favoritenordner, scrollen Sie zum 37C_ABDK_02 Programm und wählen Sie es aus. Klicken Sie auf OK, um das Programm auf alle ausgewählten C-Röhren anzuwenden, und tippen Sie dann auf Start (Abbildung 2).
- Beschriften Sie ein konisches 50-ml-Röhrchen pro Probe.
- Legen Sie ein 70 μm Zellsieb auf jedes 50 ml konische Rohr und befeuchten Sie es mit 2 ml BSA-Puffer.
- Entfernen Sie nach Abschluss des Programms die Heizung und den C-Schlauch aus dem Dissoziator.
- Geben Sie 4 ml BSA-Puffer in die Probe und tragen Sie die Mischung auf das Zellsieb auf dem 50 ml konischen Röhrchen auf.
- Fügen Sie 10 ml D-PBS zum C-Rohr hinzu, schließen Sie es und schwenken Sie die Lösung vorsichtig. Tragen Sie es auf das Zellsieb auf dem 50 ml konischen Schlauch auf.
- Entsorgen Sie das Zellsieb und die C-Röhre. Zentrifen Sie die Suspension bei 300 x g für 10 min bei 4 °C. Dann aspirieren und verwerfen Sie den Überstand.
7. Entfernung von Ablagerungen
- Resuspendiert das Pellet mit 1550 μL kaltem D-PBS und überträgt die Suspension auf ein beschriftetes 15 mL konisches Röhrchen.
- Fügen Sie 450 μL kalte Schmutzentfernungslösung hinzu und pipettieren Sie sie auf und ab (nicht vorwirbeln).
HINWEIS: Debris Removal Solution ist ein Reagenz im kommerziellen Adult Brian Dissociation Kit17. - Überlagern Sie vorsichtig 1 ml kaltes D-PBS auf die Zellsuspension und halten Sie die Spitze an der Wand des konischen Rohrs. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die Gesamtüberlagerung 2 ml beträgt.
HINWEIS: Dieser Schritt ist von entscheidender Bedeutung. Führen Sie mit Können und Geschicklichkeit durch. - Zentrifuge bei 3000 x g für 10 min bei 4 °C mit voller Beschleunigung und voller Bremse.
HINWEIS: Wenn die Phasen nicht klar voneinander getrennt sind, wiederholen Sie die Schritte 7.2-7.3. Zentrifugieren Sie ein letztes Mal bei 1000 x g für 10 min bei 4 °C. - Die Aufhängung sollte nun aus drei verschiedenen Schichten bestehen (Abbildung 3). Saugen Sie die oberste Schicht ab. Streichen Sie die Pipettenspitze hin und her, um die weiße Mittelschicht abzusaugen. Entfernen Sie so viel wie möglich von der mittleren Schicht, ohne die unterste Schicht zu stören.
HINWEIS: Dieser Schritt ist von entscheidender Bedeutung. Führen Sie mit Können und Geschicklichkeit durch. - Fügen Sie 2 ml kaltes D-PBS hinzu und pipettieren Sie es auf und ab, um zu mischen.
- Zentrifuge bei 1000 x g für 10 min bei 4 °C mit voller Beschleunigung und voller Bremse. Saugen Sie den Überstand auf und verwerfen Sie ihn. Resuspendiert das Pellet in 1 ml BSA-Puffer.
HINWEIS: Zellen können im entsprechenden Puffer resuspendiert und dann magnetisch markiert und isoliert werden, um sich auf die Einzelzellsequenzierung vorzubereiten.
8. Anzahl der Zellen
- Führen Sie die Zellzählung gemäß dem Protokoll des Herstellers des verfügbaren Zellzählers durch (eine Option ist in der Materialtabelle angegeben)
9. Lebender/toter Fleck
- Die restlichen 900 μL (ab 7,7) bei 1000 x g zentrifugieren für 10 min bei 4 °C mit voller Beschleunigung und voller Bremse.
- Während sich die Probe dreht, beschriften Sie ein Durchflussröhrchen pro Probe und wickeln Sie es in Folie, um die Lichteinwirkung zu begrenzen.
- Saugen Sie den Überstand auf und verwerfen Sie ihn.
- Resuspendiert das Pellet in 50 μL verdünnter lebender/toter Flecken (zuvor zubereitet).
HINWEIS: Dieser Schritt sollte bei schlechten Lichtverhältnissen ausgeführt werden. Schalten Sie die Oberlichter aus, um dies zu erreichen. - Geben Sie jede Probe in das entsprechende markierte Durchflussröhrchen und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 8-10 min im Dunkeln (z. B. eine Schublade oder eine Box).
- Zugabe von 500 μL BSA-Puffer und Zentrifuge bei 1000 x g für 10 min bei 4 °C bei voller Beschleunigung und voller Bremse.
- Saugen Sie den Überstand auf und verwerfen Sie ihn.
HINWEIS: Das Pellet ist möglicherweise nicht sichtbar; Lassen Sie eine kleine Menge Puffer zurück, um das Pellet nicht unbeabsichtigt abzusaugen. Zellen können im entsprechenden Puffer resuspendiert, blockiert und an dieser Stelle mit zellspezifischen Antikörpern angefärbt werden. Siehe Ergänzende Datei 1 für Beispielprotokoll18.
10. Fixierung (optional)
- Resuspendiert das Pellet in 200 μL von 1% PFA (zuvor zubereitet). 15 min bei 4 °C inkubieren.
- Waschen durch Zugabe von 500 μL D-PBS und Zentrifuge bei 300 x g für 10 min bei 4 °C.
- Aspirieren Sie den Überstand.
HINWEIS: Das Pellet ist möglicherweise nicht sichtbar; Lassen Sie eine kleine Menge Puffer zurück, um das Pellet nicht unbeabsichtigt abzusaugen. - Resuspendiert das Pellet in 200 μL D-PBS und lagert es bei 4 °C für bis zu 3 Tage.
11. Durchflusszytometrie
- Beschriften Sie die Filterkappen auf den neuen Röhrchen.
- Mit einer 1-ml-Pipette pipettieren Sie jede Probe auf die Filterkappe.
- Zentrifugieren Sie kurz bei 200 x g bei 4 °C, so dass die Zentrifuge nur 200 x g erreichen kann, bevor der Lauf gestoppt wird.
- Fahren Sie mit dem Durchflusszytometriekern für die nachgelagerte Analyse fort.
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Representative Results
Die Proben wurden mit einem Durchflusszytometer in einer Kernanlage verarbeitet und die resultierenden Daten wurden mit einem Softwarepaket für die Durchflussanalyse ausgewertet. Zuvor wurden Kompensationskontrollen analysiert - der lebende / tote Fleck und die Negativkontrolle. Wenn mehrere Fluorochrome verwendet werden, sollten für jeden Antikörper Fluoreszenz-Minus-Eins-Kontrollen (FMO) und Einzelfleckenkontrollen vorbereitet werden. Die Kompensation der spektralen Überlappung für die experimentellen Proben wurde auf der Grundlage der analysierten Kontrollen berechnet. Für die Identifizierung der Zellpopulation wurde eine hierarchische Gating-Strategie verwendet. Das primäre Gate schloss Ablagerungen im Vorwärtsstreudiagramm (Zellgröße) gegenüber der Seitenstreuung (Granularität)19,20 aus. Anschließend wurden die toten Zellen ausgeschlossen (Abbildung 4, Abbildung 5, Abbildung 6, Ergänzende Abbildung 1, Ergänzende Abbildung 2, Ergänzende Abbildung 3 und Ergänzende Abbildung 4). Das folgende Gate schloss Zellen aus, die positiv auf das Myelin-Basisprotein waren (Ergänzende Abbildung 4). Von den verbleibenden Zellen wurden Dichtediagramme von Zellen erstellt, die für jedes Fluorochrom positiv waren (Ergänzende Abbildung 4). Die Häufigkeit jeder neuronalen Zellpopulation wurde aus dem dritten Tor heraus berechnet (Ergänzende Abbildung 4). Proben, die mit manueller mechanischer Dissoziation 21 und enzymatischem Aufschluss verarbeitet wurden, ergaben eine wesentlich geringere Population interessanter Zellen (Supplemental File 221, Figure 4, and Supplemental Figure 1). Umgekehrt ergaben sowohl feste als auch frische Proben, die durch automatisierte mechanische Dissoziation und enzymatischen Aufschluss hergestellt wurden, eine Population von Zellen von Interesse, die um ein Vielfaches größer waren (Abbildung 5, Abbildung 6, Ergänzende Abbildung 2 und Ergänzende Abbildung 3).
Abbildung 1: Gehirn der Maus . (A) Richtig durchblutet. (B) Nicht durchblutet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Ausgewählter Status in Schritt 6.4. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Dreischichtige Suspension in Schritt 7.5: Puffer (obere Schicht), Zellablagerungen, Lösung zur Entfernung von Ablagerungen und Zellen (untere Schicht). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Repräsentative Analyse festsitzender Proben, die unter Verwendung einer Kombination aus manueller Dissoziation durch Pasteur-Pipettenverreibung und enzymatischem Aufschluss verarbeitet wurden. Erste von zwei gleichzeitig verarbeiteten Proben. (A) Prozentsatz der Zellen, die die Zellpopulation von Interesse sind. (B) Prozentsatz der interessierenden Grundgesamtheit, bei denen es sich um lebende Zellen handelt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Repräsentative Analyse von frischen Proben, die mit einer Kombination aus automatisierter mechanischer Dissoziation und enzymatischem Aufschluss verarbeitet werden. Erste von zwei gleichzeitig verarbeiteten Proben. (A) Prozentsatz der Zellen, die die Zellpopulation von Interesse sind. (B) Prozentsatz der interessierenden Grundgesamtheit, bei denen es sich um lebende Zellen handelt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Repräsentative Analyse festsitzender Proben, die mit einer Kombination aus automatisierter mechanischer Dissoziation und enzymatischem Aufschluss verarbeitet wurden. Erste von zwei gleichzeitig verarbeiteten Proben. (A) Prozentsatz der Zellen, die die Zellpopulation von Interesse sind. (B) Prozentsatz der interessierenden Grundgesamtheit, bei denen es sich um lebende Zellen handelt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ergänzende Abbildung 1: Repräsentative Analyse festsitzender Proben, die mit einer Kombination aus manueller Pasteur-Pipettenverreibungsdissoziation und enzymatischem Aufschluss verarbeitet wurden. Zweite von zwei gleichzeitig verarbeiteten Proben. (A) Prozentsatz der Zellen, die die Zellpopulation von Interesse sind. (B) Prozentsatz der interessierenden Grundgesamtheit, bei denen es sich um lebende Zellen handelt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 2: Repräsentative Analyse von frischen Proben, die unter Verwendung einer Kombination aus automatisierter mechanischer Dissoziation und enzymatischem Aufschluss verarbeitet werden. Zweite von zwei gleichzeitig verarbeiteten Proben. (A) Prozentsatz der Zellen, die die Zellpopulation von Interesse sind. (B) Prozentsatz der interessierenden Grundgesamtheit, bei denen es sich um lebende Zellen handelt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 3: Repräsentative Analyse fester Proben, die unter Verwendung einer Kombination aus automatisierter mechanischer Dissoziation und enzymatischem Aufschluss verarbeitet werden. Zweite von zwei gleichzeitig verarbeiteten Proben. (A) Prozentsatz der Zellen, die die Zellpopulation von Interesse sind. (B) Prozentsatz der interessierenden Grundgesamtheit, bei denen es sich um lebende Zellen handelt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 4: Repräsentative Analyse von gefärbten und fixierten Proben, die unter Verwendung einer Kombination aus automatisierter mechanischer Dissoziation und enzymatischem Aufschluss verarbeitet werden. (A) Prozentsatz der Zellen, die die Zellpopulation von Interesse sind. (B) Prozentsatz der interessierenden Grundgesamtheit, bei denen es sich um lebende Zellen handelt. (C). MBP- Zellen. (D). PSA-NCAM+-Zellen (Neuronale Vorläuferzellen). (E). ACSA2+ Zellen (Astrozyten). (F). CD31+-Zellen (Endothel). (G). CD11b+-Zellen (Mikroglia). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Datei 1: Färbeprotokoll. Ein Probenfärbungsprotokoll zur Immunfärbung von Zelloberflächenmarkern. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Supplemental File 2: Angepasstes manuelles mechanisches und enzymatisches Dissoziationsprotokoll. Diese Methode ist an ein bereits veröffentlichtes Protokoll21 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Mehrere Schritte in diesem neuronalen Dissoziationsprotokoll erfordern eine kompetente Technik und Geschicklichkeit - Perfusion, Überstandsaspiration und Myelinentfernung. Während des gesamten Perfusionsprozesses müssen die inneren Organe intakt bleiben (abgesehen vom Entfernen des Zwerchfells und dem Abschneiden des Herzens); Dazu gehört, die oberen Kammern des Herzens mit der Schmetterlingsnadel zu vermeiden. Während die Menge an Kochsalzlösung, die mit Heparin benötigt wird, variiert, zeigt transparente Flüssigkeit, die aus dem Herzen fließt, an, dass der Prozess abgeschlossen ist. Das Gehirn muss vollständig und richtig durchblutet sein, woraufhin es cremefarben erscheint (Abbildung 1). Mit der Perfusion wird der Schritt zur Entfernung der roten Blutkörperchen irrelevant und eliminiert eine übermäßige Manipulation der Proben, die zu Zellverlust führen kann. Anschließend erfordert der Schritt der Schmutzentfernung eine ruhige Hand. Damit die Zentrifugation nach dem D-PBS-Overlay zu klar definierten Schichten führt (Abbildung 3), dürfen die Schichten während des Transports oder beim Pipettieren nicht gestört werden. Darüber hinaus muss beim Absaugen der oberen beiden Schichten genügend Suspension entfernt werden, um übermäßige Zelltrümmer zu beseitigen, während immer noch eine ausreichend große Probe zurückbleibt. Dies ist ein wichtiger Schritt, da tote Zellen eher unspezifisch binden und autofluoreszierendwerden 22,23, was die Bedeutung der Wahl einer Methode, die konsistent zu einer hohen Zelllebensfähigkeit führt, weiter unterstreicht. Schließlich ist das Pellet beim Absaugen des Überstands möglicherweise nicht immer sichtbar. Eine kleine Menge Restüberstand muss übrig bleiben, um sicherzustellen, dass die Probe nicht versehentlich verworfen wird.
Es gibt Vor- und Nachteile bei der Fixierung der Proben. Nicht alle Antikörpermarker sind mit der Fixierung kompatibel, was die nachgelagerte Analyse in Abhängigkeit von den interessierenden Zellpopulationen einschränkt. Auch die Verwendung von übermäßig konzentriertem PFA oder das Belassen der Zellen im Fixiermittel für einen längeren Zeitraum kann zu Autofluoreszenz und falsch-positiven Messwerten führen, wodurch die Ergebnisse verwirrtwerden 24,25. Durch die Verwendung einer 1% igen PFA-Lösung und die Minimierung der Exposition der Zellen wird die Wahrscheinlichkeit falsch-positiver Messwerte stark reduziert. Da dieses Verfahren detailliert ist und viele Timing-Variablen aufweist, setzt die Verwendung von Frischzellen die Labore unter strenge Zeitbeschränkungen, um sicherzustellen, dass die Zellen lebensfähig bleiben. Die Fixierung bewahrt die Zellstruktur für die Analyse am nächsten Tag.
Die Einzelzellanalyse kann wichtige Erkenntnisse über die Wirksamkeit der Behandlung, die Zellfunktion und die Wirkmechanismen von Krankheiten oder Behandlungen liefern. Beispielmethoden umfassen Einzelzell-DNA- und RNA-Sequenzierung 26,27, Zytometrie nach Flugzeit22,28, Durchflusszytometrie und Immunhistochemie. Mit der Einzelzell-mRNA-Sequenzierung kann die Genexpression zum Zeitpunkt der Probenentnahme zelltypspezifische Erkenntnisse liefern26. Zum Beispiel führte eine Forschungsgruppe eine Einzelzell-RNA-Sequenzierung an D1- und D2-Dopaminrezeptoren durch, die mittlere spiny Neuron-Subtypen aus dorsomedialem Striatum27 exprimierten. Die Gruppe definierte das Transkriptom von mittelstacheligen Neuronen neu, indem sie neuartige subtypspezifische Markergene entdeckte und Gene identifizierte, von denen zuvor fälschlicherweise berichtet wurde, dass sie aufgrund fehlender Einzelzellauflösung differentiell exprimiert wurden27. Ho et al. hoben das Potenzial der Einzelzell-RNA-Sequenzierung bei der Entdeckung zelltypspezifischer Wirkstoffzielehervor 27. Mit der Einzelzell-DNA-Sequenzierung können Veränderungen der Genexpression durch Messung von DNA- und Histonmodifikationen, Chromatinzugänglichkeit und Chromatinkonformation beschriebenwerden 26. Bei der Messung der DNA-Methylierung einzelner Kerne konstruierten Liu et al. einen einzelligen DNA-Methylomatlas von 45 Hirnregionen der Maus und identifizierten 161 neuronale Zelltypen29. Die Probenvorbereitung für die Einzelzellsequenzierung ist komplizierter, insbesondere die Isolierung von Einzelzellen und die Entfernung von Ablagerungen. Mattei et al. untersuchten die Wirkung der enzymatischen und mechanischen Dissoziation auf das transkriptomische und Proteotyp-Profiling und stellten fest, dass neuronale Dissoziationsmethoden von Natur aus ein gewisses Maß an Bias30 einführen. Mehrere Gruppen haben festgestellt, wie wichtig es ist, effizient zu arbeiten, auf Eis zu sezieren und transkriptionelle Inhibitoren zu verwenden 26,30,31. Mattei et al. identifizierten auch betroffene Gene und Proteine, um die Analysezu informieren 30. Diese Techniken liefern jedoch immer noch detaillierte Einblicke in zelluläre Bausteine, die von der Transkriptomik des Massengewebes nicht erreicht werden26,27.
Die Durchflusszytometrie ist ein leistungsfähiges Analysewerkzeug, das gleichzeitig Parameter von Einzelzellpopulationen mithilfe von Fluoreszenzsonden identifizieren und messen kann. Einige Anwendungen von Durchflusszytometern umfassen Zellzyklusanalyse, Zellsortierung, Lebensfähigkeit, Phänotypisierung, Zellproliferation undFunktionsanalysen 32,33. Die meisten dieser Anwendungen nutzen die Oberflächenfärbung aufgrund der Zugänglichkeit von Zelloberflächenproteinen. Diese Proteine können gefärbt werden, um spezifische Zellpopulationen basierend auf Abstammung, Entwicklungsstadium und Funktion zu identifizieren 19,32,33. Zum Beispiel können Proben oberflächengefärbt werden, um Populationen von Astrozyten, Endothelzellen, neuronalen Vorläuferzellen und Mikroglia34 zu identifizieren. Ein Hauptvorteil bei der Färbung von Oberflächenproteinen lebender Zellen besteht darin, die Zellen sortieren zu können und gleichzeitig die Möglichkeit zu behalten, weitere nachgelagerte Analysendurchzuführen 34. Während Oberflächenfärbungstechniken ziemlich Standard sind, ist die intrazelluläre Färbung ein empfindlicheres Verfahren. Bei der intrazellulären Durchflusszytometrie müssen die Zellen vor der Färbung fixiert und permeabilisiert werden, damit der Antikörper die Zellmembranpassieren kann 20,32,33,34. Im Idealfall bleibt die Zellmorphologie intakt; Die Permeabilisierung birgt jedoch das Risiko einer Proteindenaturierung, die sich negativ auf den Antikörpernachweis auswirkenwürde 22,34. Einige Methoden der weiteren nachgelagerten Analyse sind keine Option mehr, sobald die Zellen fixiert sind20. Während die Nachteile der intrazellulären Färbung ausgeprägter sind als bei der Oberflächenfärbung, ermöglicht erstere den Nachweis und die Analyse intrazellulärer Moleküle, die sonst nicht plausibel wären. Darüber hinaus können Zelloberflächen- und intrazelluläre Färbeverfahren gekoppelt werden, um bestimmte Zelltypen definitiv zu identifizieren oder zusätzliche Parameter gleichzeitig zu bewerten20,28,34.
Es gibt mehrere Methoden der neuronalen Dissoziation, die verwendet werden können, um die für die Zellanalyse erforderliche Einzelzellsuspension vorzubereiten, obwohl sie nicht gleich wirksam sind. Im Vergleich zu standardisierten Kits und den oben genannten Techniken ist diese spezielle Methode der neuronalen Dissoziation für die Verarbeitung kleiner Gewebemengen gedacht, ergibt eine hochgradig lebensfähige Einzelzellsuspension (>90%) und rationalisiert das Experiment. Mit diesem Protokoll sind andere Labore in der Lage, neuronale Dissoziation zuverlässig und reproduzierbar durchzuführen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Wir danken Aimee Rogers für die praktische Schulung und den kontinuierlichen Produktsupport. Wir danken Dr. Amanda Burke für die kontinuierliche Fehlerbehebung und klärende Diskussionen. Wir danken Meredith Joheim und der UAMS Science Communication Group für die grammatikalische Bearbeitung und Formatierung dieses Manuskripts. Diese Studie wurde von NIH R25GM083247 und NIH 1R01CA258673 (A.R.A.) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 02-682-003 | Basix, assorted color |
| 15 mL Falcon Tubes | Becton Dickinson Labware Europe | 352009 | Polystyrene |
| 25 mL Serological Pipets | Fisher Scientific | 14-955-235 | |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Falcon | 352052 | |
| 500 mL Vacuum Filter/ Storage Bottle System | Corning | 431097 | |
| 70 μm cell strainer | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Adult Brain Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-107-677 | Contains Enzyme P, Buffer Z, Buffer Y, Enzyme A, Buffer A, Debris Removal Solution |
| Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-105 | |
| Anti-ACSA-2-PE-Vio770, mouse, clone REA969 | Miltenyi Biotec | 130-116-246 | |
| Anti-Myelin Basic Protein | Sigma-Aldrich | M3821-100UG | |
| Anti-PSA-NCAM-PE, human, mouse and rat, Clone 2-2B | Miltenyi Biotec | 130-117-394 | |
| BD LSRFortessa | BD | ||
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906-50G | |
| CD11b-VioBlue, mouse, Clone REA592 | Miltenyi Biotec | 130-113-810 | |
| CD31 Antibody | Miltenyi Biotec | 130-111-541 | |
| Ceramic Hot Plate Stirrer | Fisher Scientific | 11-100-100SH | |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Ethanol | Pharmco by Greenfield Global | 111000200 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Fine Scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | Perfusion |
| FlowJo | BD | (v10.7.0) | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Gibco DPBS (1X) | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| Glass Beaker | Fisher Scientific | 02-555-25A | |
| Heparin sodium | Fresenius Kabi | 504011 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher | L34965 | |
| Magnetic Stir Bar | Fisher Scientific | 14-513-51 | |
| Noyes Spring Scissors | Fine Science Tools | 15012-12 | Dissection |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 441244-3KG | Prilled, 95% |
| Pipette tips GP LTS 20 µL 960A/10 | Rainin | 30389270 | |
| Pipette Tips GP LTS 250 µL 960A/10 | Rainin | 30389277 | |
| Pipette tips RT LTS 1000 µL FL 768A/8 | Rainin | 30389213 | |
| Rainin Pipet-Lite XLS (2, 20, 200, 1000 μL) | Rainin | 30386597 | |
| RBXMO FITC XADS | Fisher Scientific | A16167 | |
| Round Ice Bucket with Lid | Fisher Scientific | 07-210-129 | |
| Round-Bottom Tubes with Cell Strainer Cap | Falcon | 100-0087 | |
| S1 Pipet Fillers | ThermoFisher Scientific | 9541 | |
| Spatula & Probe | Fine Science Tools | 10090-13 | Dissection & Perfusion |
| Surflo Winged Infusion Set 23 G x 3/4" | Termuno | SV-23BLK | Butterfly needle |
| Test Tube Rack | Fisher Scientific | 14-809-37 | |
| Thermo Scientific Legend XTR Centrifuge | ThermoFisher | discontinued | Or other standard table top centrifuge |
| Variable-Flow Peristaltic Pump | Fisher Scientific | 13-876-2 | Low-flow model |
| VetFlo Starter Kit for Mice | Kent Scientific | VetFlo-MSEKIT | Anesthesia mask, tubing, induction chamber, charcoal canisters |
| VetFlo Vaporizer Single Channel Anesthesia System | Kent Scientific | VetFlo-1210S | 0.2–4 LPM |
| Vi-CELL XR Cell Viability Analyzer | Beckman Coulter Life Sciences | 731196 | Cell Counting |
| Vi-CELL XR 4 Bags of Sample Vials | Beckman Coulter Life Sciences | 383721 | Cell Counting |
References
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