Summary
この神経細胞解離プロトコルは、出発物質の量が少ないサンプルを対象としており、オプションの固定および染色ステップで、下流分析用の生存率の高い単一細胞懸濁液を生成します。
Abstract
この神経解離プロトコル(市販の成人脳解離キットに付随するプロトコルの適応)は、フローサイトメトリーや単一細胞シーケンシングなどの詳細な下流分析の準備として組織処理を最適化します。神経解離は、機械的解離(フィルター、チョッピング技術、またはピペット粉砕の使用など)、酵素消化、またはそれらの組み合わせを介して行うことができる。神経細胞の繊細な性質は、単一細胞分析に必要な最小限の細胞破片で、生存率の高い真の単一細胞懸濁液を得るための努力を複雑にする可能性があります。このデータは、自動化された機械的解離と酵素消化のこの組み合わせが、前述の困難を克服し、常に生存率の高い(>90%)単一細胞懸濁液を生成することを実証する。いくつかのステップでは手作業による器用さが必要ですが、これらのステップはサンプルの取り扱いと潜在的な細胞損失を軽減します。この原稿では、下流の分析に備えて少量の神経組織を首尾よく解離させるために他の研究室を装備するためのプロセスの各ステップを詳述しています。
Introduction
海馬は、1500年代にボローニャの解剖学者ジュリオ・チェーザレ・アランツィオによって最初に記述されました。この新しく発見された構造に名前を付ける際に、アランツィオはおそらく 海馬1属のタツノオトシゴとの奇妙な類似性に触発されました。海馬はストレス反応に関与していますが、学習と記憶におけるその役割で広く知られています。より具体的には、海馬は、宣言的および空間的記憶1の符号化および検索を担当する。
海馬、または適切な海馬は、CA1(cornu ammonis)、CA2、およびCA3サブフィールド1に分けられます。神経系の他の部分と比較して、海馬は、その可塑性および進行中の神経新生の可能性を含むいくつかのユニークな定義的特徴を有する2。神経新生は、神経幹細胞の増殖および分化のプロセスであり、続いて既存のニューロンネットワークへの統合が続く。神経新生は、歯状回および側脳室(および嗅球)の脳室下帯の顆粒下帯に限定される3。神経新生は胚発生に豊富ですが、それは生涯にわたるプロセスです3,4。したがって、この議論は海馬における成体の神経新生に焦点を当てる。
脳室下および顆粒下帯は、上衣細胞および血管細胞、ならびに神経幹細胞5の未熟および成熟系統を含む神経原性ニッチである。ミクログリアは、神経新生を調節する免疫細胞としてこれらのニッチに寄与する6。神経前駆細胞は、神経幹細胞7の非幹細胞後代である。脳室下帯には3種類の神経前駆細胞が存在する:放射状グリア様B型細胞、C型トランジット増幅前駆細胞、およびA型神経芽細胞3、8。脳室下帯でゆっくりと分裂するB型神経前駆細胞は、急速に分裂するC型細胞8に分化することができる。続いて、C型細胞はA型細胞8に分化する。これらの神経芽細胞は、吻側移動流を通って嗅球に移動し、その後、介在ニューロンまたは希突起膠細胞に分化する9。これらの嗅球介在ニューロンは、嗅覚短期記憶、および連想学習の鍵であり、一方、希突起膠細胞は脳梁9の軸索を髄鞘化する。成体神経新生の大部分は、歯状回亜顆粒帯で起こり、そこでは放射状タイプ1および非放射状タイプ2の神経前駆細胞が見出される3。ほとんどの神経前駆細胞は、歯状顆粒ニューロンおよびアストロサイト10になる運命にある。ギャップ接合部によって接続されたアストロサイトは、可塑性、シナプス活性、およびニューロン興奮性を調節するためにネットワークを形成する5。歯状回の主要な興奮性ニューロンとして、顆粒細胞は嗅内皮質からCA3領域11への入力を提供する。
神経幹細胞集団は、免疫磁気または免疫蛍光単離戦略を用いて単離することができる12、13。神経組織は解離することが特に困難です。そのための努力は、しばしば、細胞生存率の低いサンプルおよび/または下流分析に必要な単一細胞懸濁液の製造に失敗する結果となる。神経解離は、機械的解離(フィルター、チョッピング技術、またはピペット粉砕の使用など)、酵素消化、または技術の組み合わせを介して行うことができる14、15。神経解離法を評価する研究では、ピペット粉砕による手動機械的解離の生存率および品質を、ピペット粉砕および様々な酵素による消化の組み合わせと比較した15。品質は、調製した懸濁液15中の細胞凝集塊およびDNAまたは細胞内破片の量に基づいて等級付けした。単独で手動機械的解離を行ったグリア腫瘍の懸濁液は、ディスパーゼまたはDNase、コラゲナーゼ、およびヒアルロニダーゼの組み合わせによる処理よりも有意に低い細胞生存率を有していた15。Volovitzらは、異なる方法間の生存率および品質のばらつきを認め、不十分な解離が下流分析の精度を低下させる可能性があることを強調した15。
別の研究では、著者らは培養神経細胞の解離の60以上の異なる方法と組み合わせを比較した14。これらの方法には、ピペット粉砕による手動機械的解離の8つの異なるバリエーション、3つの異なる間隔での5つの個々の酵素とのインキュベーションの比較、および酵素消化による機械的解離の様々な組み合わせ、または2つの酵素の組み合わせ14が含まれていた。いずれの機械的方法も、単一細胞懸濁液14を生じた。4つの単一酵素処理、10の組合せ酵素処理、および4つの組合せの機械的解離と酵素消化は、単一細胞懸濁液14を得た。TrypLEによる酵素消化に続いてトリプシン−EDTAが最も効果的に解離したサンプル14。なお、TrypLEおよび/またはトリプシン-EDTAで処理した試料は、ゼラチン状凝集塊14を形成する傾向があった。この研究は培養細胞に対して実施されましたが、ピペットの粉砕または酵素消化のみの欠点を物語っています。
手動解離と自動機械的解離の並列比較は欠けている。しかしながら、1つのグループはフローサイトメトリーを実行して、市販のパパインまたはトリプシン酵素解離キット16と組み合わせてマウス脳全体の手動および半自動機械的解離を比較した。解離器による処理により、より一貫して生細胞16を得た。解離後、著者らはまた、プロミニン-1細胞、ニューロン前駆細胞、およびミクログリア16を単離した。3つの単離された細胞集団のうちの2つについて、単離された細胞の純度は、サンプルを解離剤で処理したとき、手動の16と比較してわずかに高かった。Reißらは、ピペッティング技術における人的変動が、組織解離における生細胞集団収量の再現性を妨げることを指摘した16。著者らは、自動化された機械的解離がサンプル処理16を標準化すると結論付けた。
この原稿に概説されている解離の方法は、市販の成人脳解離キット17に付随する溶液を使用する、完全に自動化された機械的解離および酵素的消化の組み合わせである。標準的なプロトコルとは異なり、この最適化されたプロトコルは、サンプル操作を減らし、生存率の高い単一細胞懸濁液を生成し、最小限の開始組織を処理することを目的としています。
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Protocol
実験は、UAMSの施設動物ケアおよび使用委員会によって承認された倫理基準に従って実施された。生後6ヶ月の雌性C57Bl6/J野生型マウスを購入し、一定の12時間の明暗サイクル下で集団飼育(ケージあたり4匹)した。
1. 試薬の調製
- 修正可能な生/死汚れストック溶液を準備します。蛍光染色液を20μLのジメチルスルホキシド(DMSO)で再構成する。
- バイアルをホイルで包み、「再構成済み」とラベルを付け、-20°Cで最大6ヶ月間保存します。
- ヘパリンを含む0.9%生理食塩水を調製する。1バイアルのヘパリンナトリウム(10mLあたり10,000USP単位)の内容物を1Lの二重蒸留水(ddH2O)で希釈する。
- 1匹あたり約45mLに十分な量を用意し、4°Cで最大1週間保存してください。
- 1%パラホルムアルデヒド(PFA)を作る。
- ヒュームフード内で、ホットプレートを50°Cに加熱する。 電子レンジで、ガラスビーカー中のddH2O100mLを約60°Cに加熱する。 マグネチックスターバーを加え、ホットプレートに移す。
- ヒュームフード内で、1gのPFAを計量し、ddH2Oのビーカーに加え、0.1125gのNaOH結晶を加え、溶解するまで混合する(5〜10分)。
- 0.4gのNaPO4- 一塩基を添加し、溶解するまで混合する(2〜5分間)。溶液を真空ろ過し、HClおよびNaOHでpHを7.4に調整する。
- 氷の上または4°Cで30分間冷やしてから保管してください。
注:1.5mLのアリコートは、-20°Cで1年間保存することができます。凍結融解サイクルは避けてください。解凍後に溶液が白濁したり、沈殿物が形成されたりした場合は、溶液を使用しないでください。
警告: 有毒で可燃性です。適切な個人用保護具を着用した換気フードの下でPFAを常に使用してください。
- 凍結乾燥酵素Aを1mLのバッファーAで再懸濁する。溶液を渦巻き込まないでください。
注:酵素Aおよび緩衝液Aならびに緩衝液A、Y、およびZは、市販の成人脳解離キット17の試薬である。 - 酵素Pを50 μLのアリコートに分割し、エンザイムAを10 μLのアリコートに再懸濁する。キットの説明書に従って、-20 °C で最大 6 か月間保管してください。凍結融解サイクルは避けてください。
2. 実験日
- 卓上遠心分離機を4°Cに冷却する。
- PFAのアリコートを冷蔵庫に入れ、徐々に解凍します。
- 再構成された生/死んだ汚れを暗所(引き出しなど)に置き、室温で解凍します。
- ウシ血清アルブミン(BSA)バッファーを調製する。カルシウムとマグネシウムを含まない1x Dulbeccoのリン酸緩衝溶液(D-PBS)100 mLに0.5 gのBSAを加えます(pH 7.2)。
- 攪拌子を加え、攪拌板上で30分間混合する。50mLの円錐管に移し、4°Cで保存する。
メモ:常に新しく調製したBSAバッファーを使用してください。 - 生きた/死んだ汚れ作業希釈液を準備します。再構成された生/死汚れストック溶液1 μLを360 μL D-PBSに加え、室温で暗所(引き出しや箱など)に保管します。サンプルあたり50 μLの作業希釈液を調製する。
3. 灌流
- ヘパリンを含む生理食塩水を氷の上に置きます。
- 酸素をオンにし、小動物麻酔気化器システムの流量計インジケータボールを1 L /分に設定します。適切な酸素圧力とイソフルランがあることを確認してください。
- 気化器ダイヤルを3.5%に調整します(誘導とメンテナンス用)。
- 灌流ポンプラインを生理食塩水/ヘパリン溶液でプライムします。速度を 6 mL/分に設定します。
- マウスを誘導チャンバーに入れ、ブリーザーをオンにして、マウスが反応しなくなるまで数分待ちます。有害なピンチへのペダルの引き抜きがないことを通して麻酔の十分な深さを確認してください。
- マウスを背中に乗せて解剖トレイの上に置き、鼻をノーズコーンに入れます。有害なピンチへのペダル離脱の不在による完全な麻酔の二次確認を行う。4本の足をトレイに固定します。
- 動物の腹部に20%エタノールをスプレーする。
- 鉗子を使用して、下腹部をつまみ、皮膚を持ち上げます。はさみを使用して、毛皮や皮膚を胸郭の底まで切り取ります。
- 胸郭の下から各肩に向かって2つの斜めの切開を行います。
- 横隔膜を慎重に切除する(肺と心臓を避ける)。胸郭を切除して心臓を露出させます。
- 心臓の周りの結合組織を慎重に切断します。
注: ステップ 3.10-3.11 は重要です;熟練度と器用さで演奏する。 - はさみを使って右心房(心臓の左上にある暗い葉)をクリップします。ブリーザーへのイソフルランの流れをオフにします。
- 鉗子で心臓をしっかりと保持します。蝶の針の斜めを上に向けて、針を水平に保ちながら左心室を突き刺し、動物と平行にします。
- 針を所定の位置に保持し、ポンプをオンにし、心臓を離れる液体が不透明になり、肝臓と肺の色が薄くなるまで、少なくとも30mLの生理食塩水/ヘパリン溶液を灌流します。
注: ステップ 3.13-3.14 は重要です;熟練度と器用さで演奏する。 - ポンプの電源を切り、針を外し、マウスを解剖領域に移します。
4. 解剖
- 大きな外科用はさみを使用して、頭を斬首します。
- 毛皮を頭の後ろから目まで切ります。頭蓋骨を露出させるために皮膚を剥がします。
- 頭蓋骨を目の間にクリップで留めます。頭蓋骨の後ろ、10時と2時の位置で2つの切り傷を作り、頭蓋骨の矢状線に沿って目の間の元の切り傷まで1つの長い切り傷(脳を傷つけないように先端を上に保ちます)。
- 鉗子を使用して、頭蓋骨の2つの半分を側面に剥がします。ヘラを使って脳を摘出し、冷たいD-PBSで満たされた氷の上の60mmガラスのペトリ皿に入れます(図1)。
- メスまたはカミソリを使用して各半球を分離します。その後、嗅球と小脳を取り除きます。
- 鉗子を使用して、海馬が露出するまで中脳を除去します。
- 鉗子で脳を固定します。第2の鉗子セットを用いて、各半球から海馬を優しくからかい、両方の海馬を冷たいD-PBSを含む標識された1.5mLチューブに移す。
- マウス由来の2匹の海馬を入れたサンプルチューブを氷の上に置く。
5.各サンプルの酵素ミックス1と2を準備する
注: 2 mL を超える容量の場合は、10 mL の血清学的ピペットを使用してください。容量については、200 μL-2 mL、1000 μLピペットを使用する。容量21~199 μLの場合は、200 μLのピペットを使用します。容量の場合は、2-20 μL、20 μLのピペットを使用します。2 μL 未満の容量の場合は、0 ~ 2 μL のピペットを使用してください。
- 各サンプルについて、酵素Pおよび酵素Aのそれぞれ1つのアリコートを室温で解凍する。
- 酵素ミックス1の場合、標識Cチューブに50 μLの酵素Pと1900 μLのバッファーZを混ぜ合わせます(材料表)。
- 酵素ミックス2の場合、解凍した10 μLの酵素Aアリコートに20 μLのバッファーYを加えます。
成人脳解離プロトコル17
メモ: サンプルを扱う場合、特に断りのない限り、BSA および D-PBS が氷上に残っている間、チューブは室温でチューブラックに入れる必要があります。
- 解離器のスイッチを入れます。
- 鉗子を使用して海馬組織片をCチューブに移す。
- 30 μL の酵素ミックス 2 を C チューブに移します。張力が感じられるまでキャップをひねり、カチッと音がするまで締めます。
- Cチューブを逆さまにして解離器の位置に置きます。サンプルには [選択済み] ステータスが割り当てられます (図 2)。ヒーターをCチューブの上に固定します。
- フォルダアイコンを押し、 お気に入り フォルダを選択し、スクロールして 37C_ABDK_02 プログラムを選択します。[ OK] をクリックして、選択したすべてのCチューブにプログラムを適用し、[ スタート ]をタップします(図2)。
- サンプルごとに 1 本の 50 mL 円錐形チューブにラベルを付けます。
- 各50 mL円錐管に70 μmのセルストレーナーを置き、2 mLのBSAバッファーで濡らします。
- プログラムが完了したら、解離器からヒーターとCチューブを取り外します。
- サンプルに4 mLのBSAバッファーを加え、混合物を50 mL円錐形チューブ上のセルストレーナーに塗布します。
- 10mLのD-PBSをCチューブに加え、それを閉じ、溶液を穏やかに旋回させる。50mLの円錐管のセルストレーナーに塗布します。
- セルストレーナーとCチューブを捨てます。懸濁液を300 x g で4°Cで10分間遠心分離する。 その後、上澄み液を吸引して廃棄する。
7. がれきの除去
- ペレットを1550μLの冷たいD-PBSで再懸濁し、懸濁液を標識された15mL円錐管に移す。
- 450 μLの冷たい破片除去溶液とピペットを上下に加えます(渦を巻かないでください)。
注:破片除去溶液は、市販の成人ブライアン解離キット17の試薬である。 - 細胞懸濁液の上に1mLの冷たいD-PBSを静かに重ね合わせ、先端を円錐管の壁に保つ。オーバーレイの合計が 2 mL になるまで繰り返します。
メモ: この手順は非常に重要です。熟練度と器用さで演奏する。 - 3000 x g で4°Cで10分間遠心分離機をフル加速とフルブレーキで行います。
メモ: フェーズが明確に分離されていない場合は、手順 7.2 ~ 7.3 を繰り返します。1000 x g で最終時間を4°Cで10分間遠心分離する。 - サスペンションは3つの異なるレイヤーで構成されるようになります(図3)。最上層を吸引します。ピペットチップを前後に掃引して、白い中間層を吸引します。最下層の層を乱すことなく、中間層をできるだけ多く取り除きます。
メモ: この手順は非常に重要です。熟練度と器用さで演奏する。 - 2 mL の冷たい D-PBS とピペットを上下に追加して混合します。
- 1000 x g で4°Cで10分間遠心分離し、フル加速とフルブレーキをかけます。上清を吸引して捨てる。ペレットを1mLのBSA緩衝液に再懸濁する。
注:細胞を適切なバッファーに再懸濁し、磁気標識して単離し、この時点で単一細胞シーケンシングに備えます。
8. セル数
- 利用可能なセルカウンタの製造元のプロトコルに従ってセルカウントを実行します(1つのオプションは 材料表に記載されています)
9. 生きた/死んだ汚れ
- 残りの 900 μL (7.7 から) を 1000 x g で 4 °C で 10 分間遠心分離し、フル加速とフルブレーキを行います。
- サンプルが回転している間は、サンプルごとに1本のフローチューブにラベルを付け、ホイルで包んで光の露出を制限します。
- 上清を吸引して捨てる。
- ペレットを50 μLの希釈生/死染み(以前に調製済み)に再懸濁する。
メモ: この手順は、暗い場所で実行する必要があります。これを実現するには、頭上の部屋の照明を消してください。 - 各サンプルを対応する標識フローチューブに移し、室温で暗所で8〜10分間インキュベートする(例えば、引き出しまたは箱)。
- 500 μL の BSA バッファーを加え、1000 x g で 4 °C で 10 分間遠心分離し、フル加速とフルブレーキを行います。
- 上清を吸引して捨てる。
注:ペレットが見えない場合があります。ペレットを意図せずに吸引しないように、少量のバッファーを残します。細胞を適切な緩衝液に再懸濁し、ブロックし、この時点で細胞特異的抗体で染色することができる。サンプル・プロトコル18 については、補足ファイル 1 を参照してください。
10. 固定(オプション)
- ペレットを200μLの1%PFA(予め調製済み)に再懸濁する。4°Cで15分間インキュベートする。
- 500 μLのD-PBSを加え、300 x g で遠心分離機で4°Cで10分間洗浄します。
- 上清を吸引する。
注:ペレットが見えない場合があります。ペレットを意図せずに吸引しないように、少量のバッファーを残します。 - ペレットを200 μLのD-PBSに再懸濁し、4°Cで最大3日間保存する。
11. フローサイトメトリー
- 新しいチューブのフィルターキャップにラベルを付けます。
- 1mLピペットを用いて、各サンプルをフィルターキャップ上にピペットする。
- 4 °C で 200 x g で短時間遠心分離し、運転を停止する前に遠心分離機が 200 x g に達するまでだけ許可します。
- 下流分析のためにフローサイトメトリーコアに進みます。
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Representative Results
サンプルをコア施設でフローサイトメーターで処理し、得られたデータをフロー分析用のソフトウェアパッケージで評価しました。以前は、補正コントロール(ライブ/デッドシミとネガティブコントロール)が分析されていました。複数の蛍光色素を使用する場合は、蛍光マイナス1(FMO)コントロールとシングル染色コントロールを抗体ごとに調製する必要があります。実験サンプルについてのスペクトルオーバーラップの補償は、分析された対照に基づいて計算した。細胞集団の同定のために、階層的ゲーティング戦略が使用された。一次ゲートは、前方散乱(セルサイズ)対側散乱(粒度)プロット19、20において破片を除外した。続いて、死細胞を除外した(図4、図5、図6、補足図1、補足図2、補足図3、および補足図4)。以下のゲートは、ミエリン塩基性タンパク質に対して陽性の細胞を除外した(補足図4)。残りの細胞のうち、各蛍光色素について陽性の細胞の密度プロットが作成された(補足図4)。各神経細胞集団の頻度を第3ゲート外で計算した(補足図4)。手動機械的解離21および酵素消化で処理されたサンプルは、関心のある細胞の実質的に低い集団を生じた(補足ファイル221、図4、および補足図1)。 逆に、自動機械的解離および酵素消化を介して調製された固定および新鮮なサンプルの両方が、数倍大きい関心のある細胞集団を戻した(図5、図6、補足図2、および補足図3)。
図1:マウスの脳。 (A)適切に灌流されている。(B) 非灌流。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: 手順 6.4 で選択したステータス。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: ステップ 7.5 の 3 層懸濁液: バッファー (最上層)、細胞破片、破片除去溶液、および細胞 (最下層)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:パスツールピペット粉砕による手動解離と酵素消化の組み合わせを用いて処理された固定サンプルの代表的な分析。 2つのサンプルのうち最初のサンプルを同時に処理する。(A)対象とする細胞集団である細胞の割合。(B)生細胞である対象集団の割合。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:自動機械的解離と酵素消化の組み合わせを使用して処理された新鮮なサンプルの代表的な分析。 2つのサンプルのうち最初のサンプルを同時に処理する。(A)対象とする細胞集団である細胞の割合。(B)生細胞である対象集団の割合。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:自動機械的解離と酵素消化の組み合わせを使用して処理された固定サンプルの代表的な分析。 2つのサンプルのうち最初のサンプルを同時に処理する。(A)対象とする細胞集団である細胞の割合。(B)生細胞である対象集団の割合。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足図1:手動パスツールピペット摩砕解離および酵素消化の組み合わせを用いて処理された固定サンプルの代表的分析。2 つのサンプルの 2 番目が同時に処理されます。(A)対象とする細胞集団である細胞の割合。(B)生細胞である対象集団の割合。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図2:自動機械的解離と酵素消化の組み合わせを使用して処理された新鮮なサンプルの代表的な分析。 2 つのサンプルの 2 番目が同時に処理されます。(A)対象とする細胞集団である細胞の割合。(B)生細胞である対象集団の割合。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図3:自動機械的解離と酵素消化の組み合わせを使用して処理された固定サンプルの代表的な分析。2 つのサンプルの 2 番目が同時に処理されます。(A)対象とする細胞集団である細胞の割合。(B)生細胞である対象集団の割合。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図4:自動機械的解離および酵素消化の組み合わせを使用して処理された染色および固定サンプルの代表的な分析。(A)対象とする細胞集団である細胞の割合。(B)生細胞である対象集団の割合。MBP細胞。PSA-NCAM+細胞(ニューロン前駆細胞)。ACSA2+細胞(アストロサイト)。CD31+細胞(内皮)。CD11b+細胞(ミクログリア)。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル1:染色プロトコル。細胞表面マーカーの免疫染色のためのサンプル染色プロトコール。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル2:適合した手動機械的および酵素的解離プロトコル。 この方法は、以前に公開されたプロトコル21から適合される。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
この神経解離プロトコルのいくつかのステップは、熟練した技術と器用さ - 灌流、上清吸引、およびミエリン除去を必要とする。灌流プロセスを通して、内臓は無傷のままでいなければなりません(横隔膜を取り除き、心臓をクリッピングすることを除いて)。これには、蝶の針で心臓の上部室を避けることが含まれます。必要なヘパリンを含む生理食塩水の量はさまざまですが、心臓から流れる透明な液体はプロセスが完了したことを示します。脳は完全かつ適切に灌流されなければならず、その時点で脳は白く見えます(図1)。灌流では、赤血球除去ステップは余計なものになり、細胞損失をもたらす可能性のあるサンプルの過剰な操作を排除します。続いて、破片除去工程は、安定した手を必要とする。遠心分離の結果、D-PBSオーバーレイ(図3)の後に明確に定義された層を得るためには、輸送中またはピペッティング中に層が乱されてはなりません。さらに、上の2つの層を吸引するときは、十分な大きさのサンプルを残したまま、過剰な細胞破片を除去するのに十分な懸濁液を除去する必要があります。死細胞は非特異的に結合して自己蛍光になる可能性が高くなるため、これは重要なステップであり22,23、一貫して高い細胞生存率をもたらす方法を選択することの重要性をさらに強調する。最後に、上清を吸引するとき、ペレットは必ずしも見えるとは限らない。サンプルが誤って廃棄されないように、少量の残留上清を放置する必要があります。
サンプルを固定することには長所と短所があります。すべての抗体マーカーが固定と互換性があるわけではなく、目的の細胞集団に応じて下流分析が制限されます。また、過度に濃縮されたPFAを使用するか、または細胞を固定液中に長期間放置すると、自己蛍光および偽陽性の読み取り値をもたらし、それによって結果24、25を混乱させる可能性がある。1%PFA溶液を使用し、細胞の曝露を最小限に抑えることにより、偽陽性の測定値の可能性が大幅に低減されます。この手順は詳細で、多くのタイミング変数があるため、新しいセルを使用すると、ラボは細胞が生存可能なままであることを保証するために厳しい時間制約下に置かれます。固定は、翌日の分析のために細胞構造を保持する。
単一細胞分析は、治療の有効性、細胞機能、および疾患または治療作用機序に関する重要な洞察を提供することができる。例としては、単一細胞DNAおよびRNAシーケンシング26、27、飛行時間22、28によるサイトメトリー、フローサイトメトリー、および免疫組織化学が挙げられる。単一細胞mRNAシーケンシングにより、サンプル採取時の遺伝子発現は、細胞型特異的な洞察を提供することができる26。例えば、ある研究グループは、背内側線条体から中程度の棘状ニューロンサブタイプを発現するD1およびD2ドーパミン受容体について単一細胞RNAシーケンシングを行った27。研究グループは、新規なサブタイプ特異的マーカー遺伝子を検出し、単一細胞分解能の欠如のために差次的に発現していると以前に誤って報告された遺伝子を同定することによって、培地の棘状ニューロンのトランスクリプトームを再定義した27。Hoらは、細胞型特異的薬物標的の発見における単一細胞RNAシーケンシングの可能性を強調した27。単一細胞DNAシーケンシングでは、DNAおよびヒストン修飾、クロマチンアクセシビリティ、およびクロマチン立体構造を測定することによって、遺伝子発現の変化を記述することができる26。単一核DNAメチル化の測定において、Liuらは45のマウス脳領域の単一細胞DNAメチロームアトラスを構築し、161のニューロン細胞型を同定した29。単一細胞シーケンシングのためのサンプル調製は、特に単一細胞の単離および破片除去において、より複雑である。Matteiらは、トランスクリプトームおよびプロテオタイププロファイリングに対する酵素的および機械的解離の影響を調べ、神経解離法が本質的に一定のバイアス30を導入することに留意した。いくつかのグループは、効率的に作業し、氷上で解剖し、転写阻害剤を使用することの重要性を指摘している26,30,31。Matteiらはまた、解析に情報を提供するために、罹患した遺伝子およびタンパク質を同定した30。しかしながら、これらの技術は、バルク組織トランスクリプトミクスでは比類のない細胞ビルディングブロックに関する詳細な洞察を依然として提供している26,27。
フローサイトメトリーは、蛍光プローブを使用して単一細胞集団のパラメータを同時に同定および測定できる強力な分析ツールです。フローサイトメーターのいくつかの用途には、細胞周期分析、細胞選別、生存率、表現型決定、細胞増殖、および機能分析が含まれる32,33。これらのアプリケーションのほとんどは、細胞表面タンパク質のアクセシビリティのために表面染色を利用しています。これらのタンパク質を染色して、系統、発生段階、および機能に基づいて特定の細胞集団を同定することができる19、32、33。例えば、サンプルを表面染色して、アストロサイト、内皮細胞、ニューロン前駆細胞、およびミクログリア34の集団を同定することができる。生細胞の表面タンパク質を染色する際の主な利点は、さらに下流の分析を行うオプションを保持しながら細胞を選別できることである34。表面染色技術はかなり標準的ですが、細胞内染色はより繊細な手順です。細胞内フローサイトメトリーでは、抗体が細胞膜20、32、33、34を通過することを可能にするために、染色前に細胞を固定し、透過処理しなければならない。理想的には、細胞形態は無傷のままである。しかし、透過処理はタンパク質の変性を危険にさらし、抗体検出に悪影響を及ぼすだろう22,34。さらなる下流分析のいくつかの方法は、細胞が固定されるともはや選択肢ではない20。細胞内染色の欠点は表面染色よりも顕著であるが、前者は、そうでなければ妥当ではないであろう細胞内分子の検出および分析を可能にする。さらに、細胞表面および細胞内染色手順は、特定の細胞型を決定的に同定するか、または追加のパラメータを同時に評価するために結合され得る20、28、34。
細胞分析に必要な単一細胞懸濁液を調製するために使用できる神経解離のいくつかの方法があるが、それらは同様に効果的ではない。標準化されたキットおよび前述の技術と比較して、この特定の神経解離方法は、少量の組織を処理することを意図しており、生存率の高い単一細胞懸濁液(>90%)を生じ、実験を合理化する。このプロトコルにより、他のラボは信頼性が高く再現可能な方法で神経解離を実行することができます。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もありません。
Acknowledgments
Aimee Rogersが実践的なトレーニングと継続的な製品サポートを提供してくれたことに感謝します。アマンダ・バーク博士の継続的なトラブルシューティングと議論の明確化に感謝します。メレディス・ヨハイムとUAMSサイエンス・コミュニケーション・グループに対し、この原稿の文法的な編集とフォーマットに感謝します。この研究は、NIH R25GM083247およびNIH 1R01CA258673(A.R.A)によって支持された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 02-682-003 | Basix, assorted color |
| 15 mL Falcon Tubes | Becton Dickinson Labware Europe | 352009 | Polystyrene |
| 25 mL Serological Pipets | Fisher Scientific | 14-955-235 | |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Falcon | 352052 | |
| 500 mL Vacuum Filter/ Storage Bottle System | Corning | 431097 | |
| 70 μm cell strainer | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Adult Brain Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-107-677 | Contains Enzyme P, Buffer Z, Buffer Y, Enzyme A, Buffer A, Debris Removal Solution |
| Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-105 | |
| Anti-ACSA-2-PE-Vio770, mouse, clone REA969 | Miltenyi Biotec | 130-116-246 | |
| Anti-Myelin Basic Protein | Sigma-Aldrich | M3821-100UG | |
| Anti-PSA-NCAM-PE, human, mouse and rat, Clone 2-2B | Miltenyi Biotec | 130-117-394 | |
| BD LSRFortessa | BD | ||
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906-50G | |
| CD11b-VioBlue, mouse, Clone REA592 | Miltenyi Biotec | 130-113-810 | |
| CD31 Antibody | Miltenyi Biotec | 130-111-541 | |
| Ceramic Hot Plate Stirrer | Fisher Scientific | 11-100-100SH | |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Ethanol | Pharmco by Greenfield Global | 111000200 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Fine Scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | Perfusion |
| FlowJo | BD | (v10.7.0) | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Gibco DPBS (1X) | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| Glass Beaker | Fisher Scientific | 02-555-25A | |
| Heparin sodium | Fresenius Kabi | 504011 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher | L34965 | |
| Magnetic Stir Bar | Fisher Scientific | 14-513-51 | |
| Noyes Spring Scissors | Fine Science Tools | 15012-12 | Dissection |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 441244-3KG | Prilled, 95% |
| Pipette tips GP LTS 20 µL 960A/10 | Rainin | 30389270 | |
| Pipette Tips GP LTS 250 µL 960A/10 | Rainin | 30389277 | |
| Pipette tips RT LTS 1000 µL FL 768A/8 | Rainin | 30389213 | |
| Rainin Pipet-Lite XLS (2, 20, 200, 1000 μL) | Rainin | 30386597 | |
| RBXMO FITC XADS | Fisher Scientific | A16167 | |
| Round Ice Bucket with Lid | Fisher Scientific | 07-210-129 | |
| Round-Bottom Tubes with Cell Strainer Cap | Falcon | 100-0087 | |
| S1 Pipet Fillers | ThermoFisher Scientific | 9541 | |
| Spatula & Probe | Fine Science Tools | 10090-13 | Dissection & Perfusion |
| Surflo Winged Infusion Set 23 G x 3/4" | Termuno | SV-23BLK | Butterfly needle |
| Test Tube Rack | Fisher Scientific | 14-809-37 | |
| Thermo Scientific Legend XTR Centrifuge | ThermoFisher | discontinued | Or other standard table top centrifuge |
| Variable-Flow Peristaltic Pump | Fisher Scientific | 13-876-2 | Low-flow model |
| VetFlo Starter Kit for Mice | Kent Scientific | VetFlo-MSEKIT | Anesthesia mask, tubing, induction chamber, charcoal canisters |
| VetFlo Vaporizer Single Channel Anesthesia System | Kent Scientific | VetFlo-1210S | 0.2–4 LPM |
| Vi-CELL XR Cell Viability Analyzer | Beckman Coulter Life Sciences | 731196 | Cell Counting |
| Vi-CELL XR 4 Bags of Sample Vials | Beckman Coulter Life Sciences | 383721 | Cell Counting |
References
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