Summary
Questo protocollo di dissociazione delle cellule neurali è destinato a campioni con una bassa quantità di materiale di partenza e produce una sospensione monocellulare altamente vitale per l'analisi a valle, con fasi opzionali di fissazione e colorazione.
Abstract
Questo protocollo di dissociazione neurale (un adattamento del protocollo che accompagna un kit di dissociazione cerebrale adulto commerciale) ottimizza l'elaborazione dei tessuti in preparazione di analisi dettagliate a valle come la citometria a flusso o il sequenziamento a singola cellula. La dissociazione neurale può essere condotta tramite dissociazione meccanica (come l'uso di filtri, tecniche di taglio o triturazione di pipette), digestione enzimatica o una combinazione di questi. La natura delicata delle cellule neuronali può complicare gli sforzi per ottenere la vera sospensione monocellulare altamente vitale con detriti cellulari minimi necessari per l'analisi a singola cellula. I dati dimostrano che questa combinazione di dissociazione meccanica automatizzata e digestione enzimatica produce costantemente una sospensione unicellulare altamente vitale (>90%), superando le difficoltà di cui sopra. Mentre alcuni dei passaggi richiedono destrezza manuale, questi passaggi riducono la gestione del campione e la potenziale perdita di cellule. Questo manoscritto descrive in dettaglio ogni fase del processo per dotare altri laboratori di dissociare con successo piccole quantità di tessuto neurale in preparazione per l'analisi a valle.
Introduction
L'ippocampo fu descritto per la prima volta da un anatomista bolognese, Giulio Cesare Aranzio, nel 15001. Nel nominare questa nuova struttura, Aranzio è stato probabilmente ispirato dalla sua strana somiglianza con il cavalluccio marino del genere Hippocampus1. L'ippocampo è coinvolto nelle risposte allo stress, ma è ampiamente noto per il suo ruolo nell'apprendimento e nella memoria. Più specificamente, l'ippocampo è responsabile della codifica e del recupero della memoria dichiarativa e spaziale1.
L'ippocampo, o ippocampo vero e proprio, è diviso nei sottocampi CA1 (cornu ammonis), CA2 e CA31. Rispetto al resto del sistema nervoso, l'ippocampo ha diverse caratteristiche distintive uniche, tra cui la sua plasticità e il potenziale per la neurogenesi in corso2. La neurogenesi è il processo di proliferazione e differenziazione delle cellule staminali neurali, seguito dalla loro integrazione nella rete neuronale preesistente. La neurogenesi è limitata alla zona subgranulare del giro dentato e alla zona subventricolare dei ventricoli laterali (e dei bulbi olfattivi)3. Mentre la neurogenesi è abbondante nell'embriogenesi, è un processo permanente 3,4. Come tale, questa discussione si concentrerà sulla neurogenesi adulta nell'ippocampo.
Le zone subventricolari e subgranulari sono nicchie neurogeniche contenenti cellule ependimali e vascolari, nonché lignaggi immaturi e maturi di cellule staminali neurali5. Le microglia contribuiscono a queste nicchie come cellule immunitarie per regolare la neurogenesi6. Le cellule progenitrici neurali sono progenie di cellule non staminali delle cellule staminali neurali7. Tre tipi di progenitori neurali sono presenti nella zona subventricolare: cellule radiali di tipo B simili a glia, progenitori di tipo C che amplificano il transito e neuroblasti di tipo A 3,8. Le cellule progenitrici neurali di tipo B che si dividono lentamente nella zona subventricolare possono differenziarsi in cellule di tipo C8 che si dividono rapidamente. Successivamente, le cellule di tipo C si differenziano in cellule di tipo A8. Questi neuroblasti migrano attraverso il flusso migratorio rostrale verso il bulbo olfattivo prima di differenziarsi in interneuroni o oligodendrociti9. Questi interneuroni a bulbo olfattivo sono fondamentali per la memoria olfattiva a breve termine e l'apprendimento associativo, mentre gli oligodendrociti mielinano gli assoni del corpo calloso9. La maggior parte della neurogenesi adulta si verifica nella zona subgranulare del giro dentato, dove si trovano progenitori neurali radiali di tipo 1 e non radiali di tipo 23. La maggior parte delle cellule progenitrici neurali sono destinate a diventare neuroni granulari dentati e astrociti10. Collegati da giunzioni gap, gli astrociti formano reti per modulare la plasticità, l'attività sinaptica e l'eccitabilità neuronale5. Come neurone eccitatorio primario del giro dentato, le cellule del granulo forniscono input dalla corteccia entorinale alla regione CA311.
Le popolazioni di cellule staminali neurali possono essere isolate utilizzando strategie di isolamento immunomagnetico o immunofluorescente12,13. Il tessuto neurale è particolarmente difficile da dissociare; gli sforzi per farlo spesso si traducono in campioni con scarsa vitalità cellulare e/ o non riescono a produrre la necessaria sospensione unicellulare per l'analisi a valle. La dissociazione neurale può essere condotta tramite dissociazione meccanica (come l'uso di filtri, tecniche di taglio o triturazione di pipette), digestione enzimatica o una combinazione di tecniche14,15. In uno studio che ha valutato i metodi di dissociazione neurale, sono state confrontate la vitalità e la qualità della dissociazione meccanica manuale mediante triturazione di pipette rispetto alle combinazioni di triturazione e digestione delle pipette con vari enzimi15. La qualità è stata classificata in base alla quantità di grumi cellulari e DNA o detriti subcellulari nella sospensione preparata15. Le sospensioni di tumori gliali sottoposti a dissociazione meccanica manuale da sole avevano una vitalità cellulare significativamente inferiore rispetto ai trattamenti con dispasi o una combinazione di DNasi, collagenasi e ialuronidasi15. Volovitz et al. hanno riconosciuto la variazione di vitalità e qualità tra i diversi metodi e hanno sottolineato che una dissociazione inadeguata può ridurre l'accuratezza dell'analisi a valle15.
In uno studio separato, gli autori hanno confrontato oltre 60 diversi metodi e combinazioni di dissociazione di cellule neuronali in coltura14. Questi metodi includevano otto diverse varianti di dissociazione meccanica manuale mediante triturazione a pipetta, un confronto dell'incubazione con cinque singoli enzimi a tre diversi intervalli e varie combinazioni di dissociazione meccanica con digestione enzimatica o la combinazione di due enzimi14. Nessuno dei metodi meccanici ha prodotto una sospensione a cella singola14. Quattro dei singoli trattamenti enzimatici, dieci dei trattamenti enzimatici combinati e quattro delle combinazioni di dissociazione meccanica con digestione enzimatica hanno prodotto una sospensione monocellulare14. Digestione enzimatica con TrypLE seguita da Campioni di Tripsina-EDTA più efficacemente dissociati14. Per inciso, i campioni trattati con TrypLE e/o Tripsina-EDTA tendevano a formare grumi gelatinosi14. Mentre questo studio è stato eseguito su cellule in coltura, parla delle carenze della triturazione della pipetta o della digestione enzimatica da sola.
Mancano confronti affiancati tra dissociazione meccanica manuale e automatica. Tuttavia, un gruppo ha eseguito la citometria a flusso per confrontare la dissociazione meccanica manuale e semi-automatizzata di interi cervelli di topo in combinazione con kit di dissociazione enzimatica commerciale di papaina o tripsina16. L'elaborazione con il dissociatore ha prodotto in modo più coerente cellule vitali16. A seguito della dissociazione, gli autori hanno anche isolato le cellule Prominin-1, le cellule precursori neuronali e la microglia16. Per due delle tre popolazioni cellulari isolate, la purezza delle cellule isolate era leggermente superiore quando i campioni venivano elaborati con il dissociatore, rispetto a16 manualmente. Reiß et al. hanno osservato che la variabilità da persona a persona nella tecnica di pipettaggio ostacola la riproducibilità della resa della popolazione cellulare vitale nella dissociazione dei tessuti16. Gli autori hanno concluso che la dissociazione meccanica automatizzata standardizza l'elaborazione dei campioni16.
Il metodo di dissociazione delineato in questo manoscritto è una combinazione di dissociazione meccanica completamente automatizzata e digestione enzimatica, utilizzando soluzioni che accompagnano un kit commerciale di dissociazione cerebrale per adulti17. A differenza dei protocolli standard, questo protocollo ottimizzato riduce la manipolazione del campione, produce una sospensione monocellulare altamente praticabile ed è destinato all'elaborazione di quantità minime di tessuto iniziale.
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Protocol
Gli esperimenti sono stati condotti in conformità con gli standard etici approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso l'UAMS. I topi selvatici C57Bl6 /J di 6 mesi di età sono stati acquistati e alloggiati in gruppo (4 topi per gabbia) in un ciclo di luce / buio costante di 12 ore.
1. Preparazione dei reagenti
- Preparare una soluzione madre fissabile per macchie vive/morte. Ricostituire la macchia fluorescente con 20 μL di dimetilsolfossido (DMSO).
- Avvolgere il flaconcino in un foglio, etichettarlo come "Ricostituito" e conservarlo a -20 °C per un massimo di sei mesi.
- Preparare una soluzione salina allo 0,9% con eparina. Diluire il contenuto di un flaconcino di eparina sodica (10.000 unità USP per 10 ml) in 1 L di acqua a doppia distillazione (ddH2O).
- Preparare abbastanza per circa 45 ml per animale e conservare a 4 °C per un massimo di una settimana.
- Produrre l'1% di paraformaldeide (PFA).
- In una cappa aspirante, riscaldare una piastra calda a 50 °C. In un forno a microonde, riscaldare 100 mL di ddH2O in un becher di vetro a circa 60 °C. Aggiungere una barra magnetica e trasferire sulla piastra calda.
- Nella cappa aspirante, pesare 1 g di PFA e aggiungere al becher di ddH2O. Aggiungere 0,1125 g di cristalli naOH e mescolare fino a quando non si scioglie (5-10 min).
- Aggiungere 0,4 g di NaPO4- monobasico e mescolare fino a quando non si scioglie (2-5 min). Filtrare a vuoto la soluzione e regolare il pH a 7,4 con HCl e NaOH.
- Raffreddare su ghiaccio o a 4°C per 30 minuti prima della conservazione.
NOTA: aliquote di 1,5 mL possono essere conservate a -20 °C per un anno. Evitare cicli di congelamento-scongelamento. Se, dopo lo scongelamento, la soluzione diventa torbida o si è formato un precipitato, la soluzione non deve essere utilizzata.
ATTENZIONE: Tossico, infiammabile. Lavorare sempre con PFA sotto un cappuccio ventilato indossando adeguati dispositivi di protezione individuale.
- Risospeso enzima liofilizzato A con 1 mL di tampone A. Non vortice la soluzione.
NOTA: L'enzima A e il tampone A e i tamponi A, Y e Z sono reagenti nel kit di dissociazione cerebrale adultocommerciale 17. - Dividere l'enzima P in aliquote di 50 μL e risospese l'enzima A in aliquote da 10 μL. Secondo le istruzioni del kit, conservare a -20 °C per un massimo di sei mesi. Evitare cicli di congelamento-scongelamento.
2. Giorno dell'esperimento
- Raffreddare la centrifuga da tavolo a 4 °C.
- Introdurre aliquote di PFA in frigorifero per uno scongelamento graduale.
- Posizionare la macchia viva/morta ricostituita al buio (ad esempio, un cassetto) per scongelare a temperatura ambiente.
- Preparare il tampone di albumina sierica bovina (BSA). Aggiungere 0,5 g di BSA a 100 mL di 1x soluzione tamponata con fosfato di Dulbecco senza calcio e magnesio (D-PBS), pH 7,2.
- Aggiungere una barra di agitazione e mescolare su un piatto per 30 minuti. Trasferire in tubi conici da 50 ml e conservare a 4 °C.
NOTA: utilizzare sempre un buffer BSA appena preparato. - Preparare la diluizione di lavoro delle macchie vive / morte. Aggiungere 1 μL della soluzione madre ricostituita per macchie vive/morte a 360 μL D-PBS e conservarla al buio (ad esempio, un cassetto o una scatola) a temperatura ambiente. Preparare 50 μL della diluizione di lavoro per campione.
3. Perfusione
- Posizionare la soluzione salina con eparina sul ghiaccio.
- Accendere l'ossigeno, impostare la sfera dell'indicatore del flussometro sul sistema di vaporizzatore per anestesia di piccoli animali su 1 L / min. Assicurarsi che ci sia un'adeguata pressione dell'ossigeno e isoflurano.
- Regolare la manopola del vaporizzatore al 3,5% (per induzione e manutenzione).
- Innescare le linee della pompa di perfusione con la soluzione salina/eparina. Impostare la velocità su 6 ml/min.
- Posizionare il mouse nella camera di induzione, accendere lo sfiato e attendere alcuni minuti fino a quando il mouse non risponde. Confermare una profondità sufficiente dell'anestesia attraverso l'assenza di ritiro del pedale al pizzico nocivo.
- Posizionare il mouse sulla schiena sul vassoio di dissezione con il naso nel cono del naso. Eseguire una conferma secondaria di anestesia completa attraverso l'assenza di prelievo del pedale al pizzico nocivo. Appuntare tutte e quattro le zampe al vassoio.
- Spruzzare l'addome dell'animale con il 20% di etanolo.
- Usando una pinza, pizzicare l'addome inferiore e sollevare la pelle. Usa le forbici per tagliare la pelliccia e la pelle sul fondo della gabbia toracica.
- Fai due incisioni diagonali da sotto la gabbia toracica verso ogni spalla.
- Resettare con attenzione il diaframma (evitando i polmoni e il cuore). Resecare la cassa toracica per esporre il cuore.
- Tagliare con cura qualsiasi tessuto connettivo intorno al cuore.
NOTA: i passaggi 3.10-3.11 sono critici; esibirsi con competenza e destrezza. - Usa le forbici per agganciare l'atrio destro (lobo scuro in alto a sinistra del cuore). Spegnere il flusso di isoflurano allo sfiato.
- Tieni il cuore fermo con una pinza. Con la smussatura dell'ago a farfalla rivolta verso l'alto, perforare il ventricolo sinistro mantenendo l'ago a livello e parallelo all'animale.
- Tenere l'ago in posizione, accendere la pompa e perfondere almeno 30 ml della soluzione salina/eparina fino a quando il fluido che esce dal cuore è opaco e il fegato e i polmoni di colore pallido.
NOTA: i passaggi 3.13-3.14 sono critici; esibirsi con competenza e destrezza. - Spegnere la pompa, rimuovere l'ago e trasferire il mouse nell'area di dissezione.
4. Dissezione
- Usando grandi forbici chirurgiche, decapitare la testa.
- Taglia la pelliccia dalla parte posteriore della testa fino agli occhi. Staccare la pelle per esporre il cranio.
- Taglia il cranio tra gli occhi. Fai due tagli nella parte posteriore del cranio, nelle posizioni 10 e 2, quindi fai un taglio lungo (tieni le punte per evitare di danneggiare il cervello) lungo la linea medio-gittale del cranio fino al taglio originale tra gli occhi.
- Usa una pinza per staccare le due metà del cranio ai lati. Utilizzare una spatola per rimuovere il cervello e posizionarlo in una capsula di Petri di vetro da 60 mm su ghiaccio riempito con D-PBS freddo (Figura 1).
- Usa un bisturi o un rasoio per separare ogni emisfero. Quindi rimuovere i bulbi olfattivi e il cervelletto.
- Utilizzare una pinza per rimuovere il mesencefalo fino a quando l'ippocampo è esposto.
- Proteggi il cervello con una pinza. Usando una seconda serie di pinze, stuzzicare delicatamente l'ippocampo da ciascun emisfero e trasferire entrambi gli ippocampi in un tubo etichettato da 1,5 ml contenente D-PBS freddo.
- Posizionare la provetta contenente i due ippocampi del topo sul ghiaccio.
5. Preparare la miscela di enzimi 1 e 2 per ciascun campione
NOTA: per volumi superiori a 2 ml, utilizzare una pipetta sierologica da 10 ml; per volumi, 200 μL-2 mL, utilizzare una pipetta da 1000 μL; per volumi, 21-199 μL, utilizzare una pipetta da 200 μL; per volumi, 2-20 μL, utilizzare una pipetta da 20 μL; per volumi inferiori a 2 μL, utilizzare una pipetta da 0-2 μL.
- Per ogni campione, scongelare un'aliquota ciascuno dell'enzima P e dell'enzima A a temperatura ambiente.
- Per la miscela enzimatica 1, combinare 50 μL di enzima P e 1900 μL di tampone Z in un tubo C etichettato (tabella dei materiali).
- Per la miscela enzimatica 2, aggiungere 20 μL di tampone Y all'aliquota scongelata di 10 μL dell'enzima A.
6. Protocollo di dissociazione cerebrale adulta17
NOTA: quando si lavora con campioni, i tubi devono essere collocati in un rack per tubi a temperatura ambiente mentre BSA e D-PBS rimangono sul ghiaccio, se non diversamente specificato.
- Accendere il dissociatore.
- Utilizzare una pinza per trasferire i pezzi di tessuto dell'ippocampo al tubo C.
- Trasferire 30 μL di miscela enzimatica 2 nel tubo C. Ruotare il cappuccio fino a quando la tensione non si fa sentire, quindi stringere fino a quando non scatta.
- Posizionare il tubo C capovolto in una posizione del dissociatore; al campione verrà assegnato lo stato Selezionato (Figura 2). Fissare il riscaldatore sul tubo C.
- Premere l'icona della cartella, selezionare la cartella Preferiti , scorrere fino e selezionare il programma 37C_ABDK_02 . Fare clic su OK per applicare il programma a tutti i tubi C selezionati, quindi toccare Start (Figura 2).
- Etichettare un tubo conico da 50 ml per campione.
- Posizionare un filtro cellulare da 70 μm su ogni tubo conico da 50 mL e bagnare con 2 mL di tampone BSA.
- Al termine del programma, rimuovere il riscaldatore e il tubo C dal dissociatore.
- Aggiungere 4 mL di tampone BSA al campione e applicare la miscela al filtro cellulare sul tubo conico da 50 mL.
- Aggiungere 10 ml di D-PBS al tubo C, chiuderlo e ruotare delicatamente la soluzione. Applicarlo al filtro cellulare sul tubo conico da 50 ml.
- Scartare il filtro cellulare e il tubo C. Centrifugare la sospensione a 300 x g per 10 min a 4 °C. Quindi, aspirare e scartare il surnatante.
7. Rimozione dei detriti
- Sospendere il pellet con 1550 μL di D-PBS freddo e trasferire la sospensione in un tubo conico da 15 mL etichettato.
- Aggiungere 450 μL di soluzione fredda per la rimozione dei detriti e pipettare su e giù (non vortice).
NOTA: Debris Removal Solution è un reagente del kit di dissociazione Brian per adulti17 commerciale. - Sovrapporre delicatamente 1 mL di D-PBS freddo sulla parte superiore della sospensione cellulare, mantenendo la punta contro la parete del tubo conico. Ripetere l'operazione fino a quando la sovrapposizione totale è di 2 ml.
NOTA: questo passaggio è fondamentale; esibirsi con competenza e destrezza. - Centrifuga a 3000 x g per 10 min a 4 °C con accelerazione completa e freno completo.
NOTA: se le fasi non sono chiaramente separate, ripetere i passaggi da 7.2 a 7.3. Centrifugare un'ultima volta a 1000 x g per 10 min a 4 °C. - La sospensione dovrebbe ora essere costituita da tre strati distinti (Figura 3). Aspirare lo strato più alto. Spazzare la punta della pipetta avanti e indietro per aspirare lo strato intermedio bianco. Rimuovere il più possibile lo strato intermedio senza disturbare lo strato più in basso.
NOTA: questo passaggio è fondamentale; esibirsi con competenza e destrezza. - Aggiungere 2 ml di D-PBS freddo e pipetta su e giù per mescolare.
- Centrifuga a 1000 x g per 10 min a 4 °C con accelerazione completa e freno completo. Aspirare e scartare il surnatante. Risospendare il pellet in 1 mL di tampone BSA.
NOTA: le celle possono essere risospese nel buffer appropriato, quindi etichettate magneticamente e isolate in preparazione per il sequenziamento a cella singola a questo punto.
8. Conteggio delle celle
- Eseguire il conteggio delle celle secondo il protocollo del produttore del contatore di celle disponibile (un'opzione è indicata nella Tabella dei materiali)
9. Macchia viva / morta
- Centrifugare i restanti 900 μL (da 7,7) a 1000 x g per 10 min a 4 °C con accelerazione completa e freno completo.
- Mentre il campione sta girando, etichettare un tubo di flusso per campione e avvolgerlo in un foglio per limitare l'esposizione alla luce.
- Aspirare e scartare il surnatante.
- Risospesare il pellet in 50 μL di macchia viva/morta diluita (precedentemente preparata).
NOTA: questo passaggio deve essere eseguito in condizioni di scarsa illuminazione. Spegni le luci della stanza sopraelevata per raggiungere questo obiettivo. - Trasferire ogni campione nel corrispondente tubo di flusso etichettato e incubare a temperatura ambiente per 8-10 minuti al buio (ad esempio, un cassetto o una scatola).
- Aggiungere 500 μL di tampone BSA e centrifugare a 1000 x g per 10 minuti a 4 °C con accelerazione completa e freno completo.
- Aspirare e scartare il surnatante.
NOTA: il pellet potrebbe non essere visibile; lasciare una piccola quantità di tampone in modo da non aspirare involontariamente il pellet. Le cellule possono essere risospese nel tampone appropriato, bloccate e colorate con anticorpi specifici della cellula a questo punto. Vedere File supplementare 1 per il protocollo di esempio18.
10. Fissazione (opzionale)
- Risospesare il pellet in 200 μL di PFA all'1% (precedentemente preparato). Incubare per 15 minuti a 4 °C.
- Lavare aggiungendo 500 μL di D-PBS e centrifugare a 300 x g per 10 min a 4 °C.
- Aspirare il surnatante.
NOTA: il pellet potrebbe non essere visibile; lasciare una piccola quantità di tampone in modo da non aspirare involontariamente il pellet. - Sospendere il pellet in 200 μL di D-PBS e conservare a 4 °C per un massimo di 3 giorni.
11. Citometria a flusso
- Etichettare i tappi del filtro sui nuovi tubi.
- Utilizzando una pipetta da 1 mL, pipettare ogni campione sul tappo del filtro.
- Centrifugare brevemente a 200 x g a 4 °C, consentendo alla centrifuga di raggiungere solo 200 x g prima di interrompere la corsa.
- Procedere al nucleo della citometria a flusso per l'analisi a valle.
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Representative Results
I campioni sono stati elaborati con un citometro a flusso in una struttura centrale e i dati risultanti sono stati valutati con un pacchetto software per l'analisi del flusso. In precedenza, venivano analizzati i controlli di compensazione: la macchia viva / morta e il controllo negativo. Se vengono utilizzati più fluorocromi, per ciascun anticorpo devono essere preparati controlli di fluorescenza meno uno (FMO) e controlli a singola macchia. La compensazione per la sovrapposizione spettrale per i campioni sperimentali è stata calcolata in base ai controlli analizzati. Per l'identificazione della popolazione cellulare, è stata utilizzata una strategia di gating gerarchica. Il gate primario escludeva i detriti nel grafico a dispersione diretta (dimensione della cella) rispetto allo scatter laterale (granularità)19,20. Successivamente, le cellule morte sono state escluse (Figura 4, Figura 5, Figura 6, Figura supplementare 1, Figura supplementare 2, Figura supplementare 3 e Figura supplementare 4). Il seguente gate ha escluso le cellule positive per la proteina di base della mielina (Figura supplementare 4). Delle cellule rimanenti, sono stati creati grafici di densità di cellule positive per ciascun fluorocromo (Figura supplementare 4). La frequenza di ogni popolazione di cellule neuronali è stata calcolata dalla terza porta (Figura supplementare 4). I campioni che sono stati elaborati con la dissociazione meccanica manuale21 e la digestione enzimatica hanno prodotto una popolazione sostanzialmente inferiore di cellule di interesse (File supplementare 221, Figura 4 e Figura supplementare 1). Al contrario, sia i campioni fissi che quelli freschi preparati tramite dissociazione meccanica automatizzata e digestione enzimatica hanno restituito una popolazione di cellule di interesse parecchie volte più grande (Figura 5, Figura 6, Figura supplementare 2 e Figura supplementare 3).
Figura 1: Cervello di topo. (A) Correttamente perfuso. (B) Non perfuso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Stato selezionato nel passaggio 6.4. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Sospensione a tre strati nel passaggio 7.5: Buffer (strato superiore), detriti cellulari, soluzione di rimozione dei detriti e celle (strato inferiore). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Analisi rappresentativa di campioni fissi elaborati mediante una combinazione di dissociazione manuale mediante triturazione a pipetta Pasteur e digestione enzimatica. Primo di due campioni elaborati contemporaneamente. (A) Percentuale di cellule che sono la popolazione cellulare di interesse. (B) Percentuale della popolazione di interesse che sono cellule vive. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Analisi rappresentativa di campioni freschi trattati utilizzando una combinazione di dissociazione meccanica automatizzata e digestione enzimatica. Primo di due campioni elaborati contemporaneamente. (A) Percentuale di cellule che sono la popolazione cellulare di interesse. (B) Percentuale della popolazione di interesse che sono cellule vive. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Analisi rappresentativa di campioni fissi trattati utilizzando una combinazione di dissociazione meccanica automatizzata e digestione enzimatica. Primo di due campioni elaborati contemporaneamente. (A) Percentuale di cellule che sono la popolazione cellulare di interesse. (B) Percentuale della popolazione di interesse che sono cellule vive. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare 1: Analisi rappresentativa di campioni fissi elaborati utilizzando una combinazione di dissociazione manuale della triturazione delle pipette Pasteur e digestione enzimatica. Secondo di due campioni elaborati contemporaneamente. (A) Percentuale di cellule che sono la popolazione cellulare di interesse. (B) Percentuale della popolazione di interesse che sono cellule vive. Fare clic qui per scaricare questo file.
Figura supplementare 2: Analisi rappresentativa di campioni freschi elaborati utilizzando una combinazione di dissociazione meccanica automatizzata e digestione enzimatica. Secondo di due campioni elaborati contemporaneamente. (A) Percentuale di cellule che sono la popolazione cellulare di interesse. (B) Percentuale della popolazione di interesse che sono cellule vive. Fare clic qui per scaricare questo file.
Figura supplementare 3: Analisi rappresentativa di campioni fissi elaborati utilizzando una combinazione di dissociazione meccanica automatizzata e digestione enzimatica. Secondo di due campioni elaborati contemporaneamente. (A) Percentuale di cellule che sono la popolazione cellulare di interesse. (B) Percentuale della popolazione di interesse che sono cellule vive. Fare clic qui per scaricare questo file.
Figura supplementare 4: Analisi rappresentativa di campioni colorati e fissi elaborati utilizzando una combinazione di dissociazione meccanica automatizzata e digestione enzimatica. (A) Percentuale di cellule che sono la popolazione cellulare di interesse. (B) Percentuale della popolazione di interesse che sono cellule vive. (C). MBP- Celle. (D). Cellule PSA-NCAM+ (Neuronal Precursor Cells). (E. Cellule ACSA2+ (Astrociti). (F). Cellule CD31+ (endoteliali). (G). Cellule CD11b+ (Microglia). Fare clic qui per scaricare questo file.
File supplementare 1: Protocollo di colorazione. Un protocollo di colorazione del campione per l'immunocolorazione dei marcatori della superficie cellulare. Fare clic qui per scaricare questo file.
File supplementare 2: Protocollo di dissociazione meccanica ed enzimatica manuale adattato. Questo metodo è adattato da un protocolloprecedentemente pubblicato 21. Fare clic qui per scaricare questo file.
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Discussion
Diversi passaggi in questo protocollo di dissociazione neurale richiedono una tecnica competente e destrezza: perfusione, aspirazione surnatante e rimozione della mielina. Durante tutto il processo di perfusione, gli organi interni devono rimanere intatti (oltre a rimuovere il diaframma e tagliare il cuore); questo include evitare le camere superiori del cuore con l'ago della farfalla. Mentre la quantità di soluzione salina con eparina necessaria varia, il fluido trasparente che scorre dal cuore indica che il processo è completo. Il cervello deve essere completamente e correttamente perfuso, a quel punto apparirà bianco sporco (Figura 1). Con la perfusione, la fase di rimozione dei globuli rossi diventa estranea, eliminando l'eccessiva manipolazione dei campioni che può causare la perdita di cellule. Successivamente, la fase di rimozione dei detriti richiede una mano ferma. Affinché la centrifugazione si traduca in strati chiaramente definiti seguendo la sovrapposizione D-PBS (Figura 3), gli strati non devono essere disturbati durante il transito o durante il pipettaggio. Inoltre, quando si aspirano i due strati superiori, è necessario rimuovere una sospensione sufficiente per eliminare i detriti cellulari eccessivi lasciando comunque un campione abbastanza grande dietro. Questo è un passo chiave in quanto le cellule morte hanno maggiori probabilità di legarsi in modo non specifico e diventare autofluorescenti22,23, sottolineando ulteriormente l'importanza di scegliere un metodo che si traduca costantemente in un'elevata vitalità cellulare. Infine, quando si aspira il surnatante, il pellet potrebbe non essere sempre visibile. Deve essere lasciata una piccola quantità di surnatante residuo per garantire che il campione non venga accidentalmente scartato.
Ci sono vantaggi e svantaggi nel fissare i campioni. Non tutti i marcatori anticorpali sono compatibili con la fissazione, limitando l'analisi a valle a seconda delle popolazioni cellulari di interesse. Inoltre, l'uso di PFA eccessivamente concentrato o il lasciare le cellule nel fissativo per un lungo periodo di tempo può provocare autofluorescenza e letture false positive, confondendo così i risultati24,25. Utilizzando una soluzione di PFA all'1% e riducendo al minimo l'esposizione delle cellule, la probabilità di letture false positive è notevolmente ridotta. Poiché questa procedura è dettagliata e ha molte variabili di temporizzazione, l'utilizzo di celle fresche pone i laboratori sotto stretti vincoli di tempo per garantire che le cellule rimangano vitali. La fissazione preserva la struttura cellulare per l'analisi del giorno successivo.
L'analisi a singola cellula può fornire informazioni chiave sull'efficacia del trattamento, sulla funzione cellulare e sui meccanismi d'azione della malattia o del trattamento. I metodi di esempio includono il sequenziamento del DNA edell'RNA a singola cellula 26,27, la citometria per tempo di volo 22,28, la citometria a flusso e l'immunoistochimica. Con il sequenziamento dell'mRNA a singola cellula, l'espressione genica al momento della raccolta del campione può fornire informazioni specifiche sul tipo di cellula26. Ad esempio, un gruppo di ricerca ha eseguito il sequenziamento dell'RNA a singola cellula sui recettori della dopamina D1 e D2 che esprimono sottotipi di neuroni spinosi medi dallo striato dorsomediale27. Il gruppo ha ridefinito il trascrittoma dei neuroni spinosi medi rilevando nuovi geni marcatori specifici del sottotipo e identificando geni che in precedenza e erroneamente erano stati segnalati per essere espressi in modo differenziale a causa della mancanza di risoluzione monocellulare27. Ho et al. hanno evidenziato il potenziale del sequenziamento dell'RNA a singola cellula nella scoperta di bersagli farmacologici specifici per tipo cellulare27. Con il sequenziamento del DNA a singola cellula, i cambiamenti nell'espressione genica possono essere descritti misurando le modifiche del DNA e degli istoni, l'accessibilità della cromatina e la conformazione della cromatina26. Nel misurare la metilazione del DNA a nucleo singolo, Liu et al. hanno costruito un atlante del metiloma del DNA a singola cellula di 45 regioni del cervello di topo e hanno identificato 161 tipi di cellule neuronali29. La preparazione dei campioni per il sequenziamento a singola cellula è più complessa, in particolare l'isolamento delle singole cellule e la rimozione dei detriti. Mattei et al. hanno esaminato l'effetto della dissociazione enzimatica e meccanica sulla profilazione trascrittomica e proteotipica, osservando che i metodi di dissociazione neurale introducono intrinsecamente un livello di bias30. Diversi gruppi hanno notato l'importanza di lavorare in modo efficiente, sezionando sul ghiaccio e utilizzando inibitori trascrizionali 26,30,31. Mattei et al. hanno anche identificato geni e proteine interessati per informare l'analisi30. Tuttavia, queste tecniche forniscono ancora informazioni dettagliate sugli elementi costitutivi cellulari che non hanno eguali nella trascrittomica dei tessuti di massa26,27.
La citometria a flusso è un potente strumento analitico in grado di identificare e misurare simultaneamente i parametri delle popolazioni monocellulari utilizzando sonde fluorescenti. Alcune applicazioni dei citometri a flusso includono l'analisi del ciclo cellulare, lo smistamento cellulare, la vitalità, la fenotipizzazione, la proliferazione cellulare e le analisi funzionali32,33. La maggior parte di queste applicazioni utilizza la colorazione superficiale a causa dell'accessibilità delle proteine della superficie cellulare. Queste proteine possono essere colorate per identificare specifiche popolazioni cellulari in base al lignaggio, allo stadio di sviluppo e alla funzione 19,32,33. Ad esempio, i campioni possono essere colorati in superficie per identificare popolazioni di astrociti, cellule endoteliali, cellule precursori neuronali e microglia34. Un vantaggio primario quando si colorano le proteine di superficie delle cellule vive è la possibilità di ordinare le cellule mantenendo la possibilità di condurre ulteriori analisi a valle34. Mentre le tecniche di colorazione superficiale sono abbastanza standard, la colorazione intracellulare è una procedura più delicata. Con la citometria a flusso intracellulare, le cellule devono essere fissate e permeabilizzate prima della colorazione per consentire all'anticorpo di attraversare la membrana cellulare 20,32,33,34. Idealmente, la morfologia cellulare rimarrà intatta; tuttavia, la permeabilizzazione rischia la denaturazione delle proteine, che avrebbe un impatto negativo sul rilevamento degli anticorpi22,34. Alcuni metodi di ulteriore analisi a valle non sono più un'opzione una volta che le celle sono fisse20. Mentre gli svantaggi della colorazione intracellulare sono più pronunciati della colorazione superficiale, il primo consente il rilevamento e l'analisi di molecole intracellulari che altrimenti non sarebbero plausibili. Inoltre, la superficie cellulare e le procedure di colorazione intracellulare possono essere accoppiate per identificare definitivamente determinati tipi di cellule o valutare parametri aggiuntivi contemporaneamente 20,28,34.
Esistono diversi metodi di dissociazione neurale che possono essere utilizzati per preparare la sospensione monocellulare necessaria per l'analisi cellulare, sebbene non siano ugualmente efficaci. Rispetto ai kit standardizzati e alle tecniche di cui sopra, questo particolare metodo di dissociazione neurale è destinato all'elaborazione di piccole quantità di tessuto, produce una sospensione unicellulare altamente praticabile (>90%) e semplifica l'esperimento. Con questo protocollo, altri laboratori sono attrezzati per eseguire la dissociazione neurale in modo affidabile e riproducibile.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Aimee Rogers per aver fornito formazione pratica e supporto continuo al prodotto. Ringraziamo la dott.ssa Amanda Burke per la risoluzione dei problemi in corso e le discussioni chiarificatrici. Ringraziamo Meredith Joheim e l'UAMS Science Communication Group per la modifica grammaticale e la formattazione di questo manoscritto. Questo studio è stato supportato da NIH R25GM083247 e NIH 1R01CA258673 (A.R.A).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 02-682-003 | Basix, assorted color |
| 15 mL Falcon Tubes | Becton Dickinson Labware Europe | 352009 | Polystyrene |
| 25 mL Serological Pipets | Fisher Scientific | 14-955-235 | |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Falcon | 352052 | |
| 500 mL Vacuum Filter/ Storage Bottle System | Corning | 431097 | |
| 70 μm cell strainer | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Adult Brain Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-107-677 | Contains Enzyme P, Buffer Z, Buffer Y, Enzyme A, Buffer A, Debris Removal Solution |
| Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-105 | |
| Anti-ACSA-2-PE-Vio770, mouse, clone REA969 | Miltenyi Biotec | 130-116-246 | |
| Anti-Myelin Basic Protein | Sigma-Aldrich | M3821-100UG | |
| Anti-PSA-NCAM-PE, human, mouse and rat, Clone 2-2B | Miltenyi Biotec | 130-117-394 | |
| BD LSRFortessa | BD | ||
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906-50G | |
| CD11b-VioBlue, mouse, Clone REA592 | Miltenyi Biotec | 130-113-810 | |
| CD31 Antibody | Miltenyi Biotec | 130-111-541 | |
| Ceramic Hot Plate Stirrer | Fisher Scientific | 11-100-100SH | |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Ethanol | Pharmco by Greenfield Global | 111000200 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Fine Scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | Perfusion |
| FlowJo | BD | (v10.7.0) | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Gibco DPBS (1X) | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| Glass Beaker | Fisher Scientific | 02-555-25A | |
| Heparin sodium | Fresenius Kabi | 504011 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher | L34965 | |
| Magnetic Stir Bar | Fisher Scientific | 14-513-51 | |
| Noyes Spring Scissors | Fine Science Tools | 15012-12 | Dissection |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 441244-3KG | Prilled, 95% |
| Pipette tips GP LTS 20 µL 960A/10 | Rainin | 30389270 | |
| Pipette Tips GP LTS 250 µL 960A/10 | Rainin | 30389277 | |
| Pipette tips RT LTS 1000 µL FL 768A/8 | Rainin | 30389213 | |
| Rainin Pipet-Lite XLS (2, 20, 200, 1000 μL) | Rainin | 30386597 | |
| RBXMO FITC XADS | Fisher Scientific | A16167 | |
| Round Ice Bucket with Lid | Fisher Scientific | 07-210-129 | |
| Round-Bottom Tubes with Cell Strainer Cap | Falcon | 100-0087 | |
| S1 Pipet Fillers | ThermoFisher Scientific | 9541 | |
| Spatula & Probe | Fine Science Tools | 10090-13 | Dissection & Perfusion |
| Surflo Winged Infusion Set 23 G x 3/4" | Termuno | SV-23BLK | Butterfly needle |
| Test Tube Rack | Fisher Scientific | 14-809-37 | |
| Thermo Scientific Legend XTR Centrifuge | ThermoFisher | discontinued | Or other standard table top centrifuge |
| Variable-Flow Peristaltic Pump | Fisher Scientific | 13-876-2 | Low-flow model |
| VetFlo Starter Kit for Mice | Kent Scientific | VetFlo-MSEKIT | Anesthesia mask, tubing, induction chamber, charcoal canisters |
| VetFlo Vaporizer Single Channel Anesthesia System | Kent Scientific | VetFlo-1210S | 0.2–4 LPM |
| Vi-CELL XR Cell Viability Analyzer | Beckman Coulter Life Sciences | 731196 | Cell Counting |
| Vi-CELL XR 4 Bags of Sample Vials | Beckman Coulter Life Sciences | 383721 | Cell Counting |
References
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