Summary
이 신경세포 해리 프로토콜은 출발 물질의 양이 적은 샘플을 대상으로 하며, 선택적 고정 및 염색 단계를 통해 다운스트림 분석을 위해 매우 실행 가능한 단일 세포 현탁액을 생성합니다.
Abstract
이 신경 해리 프로토콜 (상용 성인 뇌 해리 키트와 함께 제공되는 프로토콜의 적응)은 유세포 분석 또는 단일 세포 시퀀싱과 같은 상세한 하류 분석에 대비하여 조직 처리를 최적화합니다. 신경 해리는 기계적 해리 (예를 들어 필터, 베핑 기술 또는 피펫 분쇄 사용), 효소 소화 또는 이들의 조합을 통해 수행 될 수 있습니다. 신경 세포의 섬세한 특성은 단일 세포 분석에 필요한 최소한의 세포 파편으로 실행 가능하고 진정한 단일 세포 현탁액을 얻으려는 노력을 복잡하게 만들 수 있습니다. 이 데이터는 자동화 된 기계적 해리와 효소 소화의 이러한 조합이 일관되게 매우 실행 가능한 (>90 %)의 단일 세포 현탁액을 산출하여 앞서 언급 한 어려움을 극복한다는 것을 보여줍니다. 몇 가지 단계는 수동 손재주가 필요하지만 이러한 단계는 샘플 처리 및 잠재적 인 세포 손실을 줄입니다. 이 원고는 다운스트림 분석을 준비하기 위해 소량의 신경 조직을 성공적으로 해리시키기 위해 다른 실험실을 갖추는 과정의 각 단계를 자세히 설명합니다.
Introduction
해마는 볼로냐 해부학자 줄리오 체사레 아란지오(Giulio Cesare Aranzio)에 의해 1500년대1년에 처음 기술되었다. 이 새로 발견 된 구조물의 이름을 지을 때, Aranzio는 해 마1 속의 해마와 닮은 기묘한 유사성에서 영감을 얻었을 것입니다. 해마는 스트레스 반응에 관여하지만 학습과 기억에서의 역할로 널리 알려져 있습니다. 보다 구체적으로, 해마는 선언적 및 공간 기억(1)의 인코딩 및 검색을 담당한다.
해마 또는 해마는 CA1 (cornu ammonis), CA2 및 CA3 서브 필드1로 나뉩니다. 신경계의 나머지 부분과 비교할 때, 해마는 가소성과 진행중인 신경 발생의 잠재력을 포함하여 몇 가지 독특한 정의 특성을 가지고 있습니다2. 신경 발생은 신경 줄기 세포의 증식 및 분화의 과정이며, 그 다음에 기존의 신경 네트워크로의 통합이 뒤 따른다. 신경 발생은 치과 자이러스의 하위 과립 영역과 측심실 (및 후각 전구)의 심실 하부 영역으로 제한됩니다3. 신경 발생은 배아 발생에 풍부하지만, 평생 과정 3,4입니다. 따라서이 토론은 해마의 성인 신경 발생에 초점을 맞출 것입니다.
심실 하부 및 하위 과립 영역은 상피 및 혈관 세포뿐만 아니라 신경 줄기 세포의 미성숙하고 성숙한 혈통을 포함하는 신경 인성 틈새 시장입니다5. Microglia는 신경 생성을 조절하는 면역 세포로서 이러한 틈새 시장에 기여합니다6. 신경전구세포는 신경줄기세포의 비줄기세포 자손(7)이다. 세 가지 유형의 신경 선조가 심실 하부 영역에 존재합니다 : 방사형 신경교세포 유사 B 세포, C 형 전이 증폭 전구 인자 및 A 형 신경 세포 3,8. 심실 하부 영역에서 천천히 분열하는 B형 신경 전구 세포는 빠르게 분열하는 C형 세포(8)로 분화할 수 있다. 이어서, C형 세포는 A형 세포8로 분화한다. 이들 신경세포는 로스트랄 철새 스트림을 통해 후각 전구로 이동한 후 인터뉴런 또는 희소돌기아교세포(9)로 분화된다. 이러한 후각 전구 인터뉴런은 후각 단기 기억 및 연관 학습의 핵심인 반면, 올리고덴드로사이트는 코퍼스 캘로섬9의 축삭돌기를 수초로 한다. 성인 신경 발생의 대부분은 치과 자이러스의 하위 과립 영역에서 발생하며, 방사형 유형 1 및 비 방사형 유형 2 신경 선조가 발견됩니다3. 대부분의 신경 전구 세포는 상아질 과립 뉴런 및 성상세포(10)가 될 운명이다. 갭 접합에 의해 연결되어, 성상세포는 가소성, 시냅스 활성 및 신경 흥분성을 조절하기 위해 네트워크를 형성한다5. 치아질 자이러스의 일차 흥분성 뉴런으로서, 과립 세포는 엔토리날 피질로부터 CA3 영역(11)으로의 입력을 제공한다.
신경줄기세포 집단은 면역자기 또는 면역형광 분리 전략(12,13)을 사용하여 단리될 수 있다. 신경 조직은 특히 해리하기가 어렵습니다. 그렇게 하려는 노력은 종종 불량한 세포 생존율을 갖는 샘플을 초래하고/하거나 다운스트림 분석에 필요한 단일 세포 현탁액을 생성하는데 실패한다. 신경 해리는 기계적 해리 (예를 들어 필터, 베핑 기술 또는 피펫 분쇄 사용), 효소 소화 또는 기술14,15의 조합을 통해 수행 될 수 있습니다. 신경 해리 방법을 평가하는 연구에서, 피펫 분쇄에 의한 수동 기계적 해리의 생존 가능성과 품질을 피펫 분쇄 및 다양한 효소와의 소화의 조합과 비교하여15. 품질은 제조된 현탁액(15) 내의 세포 덩어리 및 DNA 또는 세포내 파편의 양에 기초하여 등급화되었다. 수동 기계적 해리를 단독으로 실시한 신경교암 종양의 현탁액은 디스파아제 또는 DNase, 콜라게나제 및 히알루로니다제15의 조합을 사용한 치료보다 현저히 낮은 세포 생존율을 가졌다. Volovitz 등은 상이한 방법들 사이의 생존력과 질의 변화를 인정하고, 부적절한 해리가 다운스트림 분석(15)의 정확성을 감소시킬 수 있다고 강조했다.
별도의 연구에서, 저자들은 배양 된 신경 세포의 해리의 60 가지 이상의 다른 방법과 조합을 비교했다14. 이들 방법에는 피펫 분쇄에 의한 수동 기계적 해리의 여덟 가지 변형, 세 가지 상이한 간격으로 다섯 개의 개별 효소와의 인큐베이션 비교, 효소 소화와의 기계적 해리의 다양한 조합 또는 두 효소의 조합14가 포함되었다. 기계적 방법 중 어느 것도 단일 세포 현탁액(14)을 산출하지 않았다. 단일 효소 처리 중 네 개, 열 개의 조합 효소 처리, 및 효소적 소화를 통한 기계적 해리의 조합 중 네 개는 단일 세포 현탁액14를 산출하였다. 트립LE를 사용한 효소적 소화에 이어 트립신-EDTA가 가장 효과적으로 해리된 샘플14. 덧붙이자면, 트립LE 및/또는 트립신-EDTA로 처리된 샘플은 젤라틴 덩어리(14)를 형성하는 경향이 있었다. 이 연구는 배양 된 세포에 대해 수행되었지만 피펫 분쇄 또는 효소 소화 단독의 단점을 말해줍니다.
수동 및 자동 기계적 해리의 나란히 비교는 부족합니다. 그러나, 한 그룹은 상업적 파파인 또는 트립신 효소적 해리 키트(16)와 함께 전체 마우스 뇌의 수동 및 반자동화된 기계적 해리를 비교하기 위해 유세포 분석기를 실행하였다. 해리제를 사용한 처리는 보다 일관되게 생존가능한 세포(16)를 산출하였다. 해리 후, 저자들은 또한 Prominin-1 세포, 신경 전구체 세포 및 microglia16을 분리했습니다. 세 개의 분리된 세포 집단 중 두 개의 경우, 샘플이 해리기로 처리되었을 때 분리된 세포의 순도는 수동16과 비교하여 약간 더 높았다. Reiß et al.은 피펫팅 기술의 사람 대 사람 변동성이 조직 해리16에서 실행 가능한 세포 집단 수율의 재현성을 방해한다고 지적했다. 저자들은 자동화된 기계적 해리가 샘플 처리(16)를 표준화한다고 결론지었다.
이 원고에 요약된 해리 방법은 상업적 성인 뇌 해리 키트(17)와 함께 제공되는 용액을 사용하여 완전 자동화된 기계적 해리 및 효소적 소화의 조합이다. 표준 프로토콜과 달리, 이 최적화된 프로토콜은 샘플 조작을 줄이고, 매우 실행 가능한 단일 세포 현탁액을 생성하며, 최소한의 시작 조직을 처리하기 위한 것입니다.
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Protocol
실험은 UAMS의 기관 동물 관리 및 사용위원회에서 승인 한 윤리적 기준에 따라 수행되었습니다. 6 개월 된 암컷 C57Bl6 / J 야생형 마우스를 구입하고 일정한 12 시간 빛 / 어둠주기하에 그룹 하우스 (케이지 당 4 마리의 마우스)를 구입했습니다.
1. 시약의 제조
- 고정 가능한 살아있는 / 죽은 얼룩 원액을 준비하십시오. 형광 염색을 20 μL의 디메틸설폭사이드(DMSO)로 재구성한다.
- 바이알을 호일에 싸서 "재구성 된"것으로 표시 한 다음 최대 6 개월 동안 -20 ° C에 보관하십시오.
- 헤파린으로 0.9 % 식염수 용액을 준비하십시오. 헤파린 나트륨 (10 mL 당 10,000 USP 단위)의 1 바이알의 내용물을 이중 증류수 (ddH2O) 1 L에 희석하십시오.
- 동물당 약 45mL를 충분히 준비하고 4°C에서 최대 일주일 동안 보관한다.
- 1 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 만드십시오.
- 흄 후드에서, 핫플레이트를 50°C로 가열한다. 마이크로파에서, 유리 비이커에서 100 mL의ddH2O를 대략 60°C로 가열한다. 마그네틱 교반 바를 추가하고 핫 플레이트로 옮깁니다.
- 흄 후드에서 PFA 1g의 무게를 측정하고ddH2O. 0.1125g의 NaOH 결정을 넣고 용해 될 때까지 혼합하십시오 (5-10 분).
- 0.4 g의 NaPO4-일염기성을 첨가하고 용해 될 때까지 혼합하십시오 (2-5 분). 용액을 진공 여과하고 HCl 및 NaOH로 pH를 7.4로 조정한다.
- 보관하기 전에 얼음 위에서 또는 4°C에서 30분 동안 식히십시오.
참고: 1.5mL의 분취량은 -20°C에서 1년 동안 보관할 수 있습니다. 동결-해동 사이클을 피하십시오. 해동 후 용액이 흐려지거나 침전물이 형성되면 용액을 사용해서는 안됩니다.
주의: 독성, 가연성. 항상 적절한 개인 보호 장비를 착용하고 통풍이 잘되는 후드 아래에서 PFA와 함께 작업하십시오.
- 동결건조된 효소 A를 1 mL의 완충액 A와 함께 재현탁시킨다. 용액을 와류하지 마십시오.
참고: 효소 A와 버퍼 A, 버퍼 A, Y, Z는 상용 성인 뇌 해리 키트17의 시약입니다. - 효소 P를 50μL의 분취량으로 나누고 효소 A를 10μL 분취량으로 재현탁시킨다. 키트 지침에 따라 -20°C에서 최대 6개월 동안 보관하십시오. 동결-해동 사이클을 피하십시오.
2. 실험일
- 탁상용 원심분리기를 4°C로 냉각시킨다.
- PFA의 분취량을 냉장고에 넣어 점진적으로 해동하십시오.
- 재구성 된 생사 얼룩을 어둠 (예 : 서랍)에 놓아 실온에서 해동하십시오.
- 소 혈청 알부민(BSA) 완충액을 준비한다. 칼슘 및 마그네슘(D-PBS), pH 7.2가 없는 1x 둘베코의 인산염 완충 용액 100 mL에 BSA 0.5g을 첨가한다.
- 교반 막대를 추가하고 30 분 동안 교반 접시에 섞는다. 50 mL 코니컬 튜브로 옮기고 4°C에서 보관한다.
참고: 항상 새로 준비된 BSA 버퍼를 사용하십시오. - 살아있는 / 죽은 얼룩 작업 희석을 준비하십시오. 재구성된 생/사형 얼룩 원액 1μL를 360μL D-PBS에 첨가하고 실온에서 어둠(예: 서랍 또는 상자)에 보관합니다. 샘플 당 50 μL의 작업 희석액을 준비한다.
3. 관류
- 헤파린이있는 식염수 용액을 얼음 위에 놓습니다.
- 산소를 켜고 작은 동물 마취 기화기 시스템의 유량계 표시기 볼을 1L / min으로 설정하십시오. 적절한 산소 압력과 이소플루란이 있는지 확인하십시오.
- 기화기 다이얼을 3.5 %로 조정하십시오 (유도 및 유지 보수를 위해).
- 식염수 / 헤파린 용액으로 관류 펌프 라인을 프라임. 속도를 6mL/분으로 설정합니다.
- 마우스를 유도 챔버에 놓고 브리더를 켜고 마우스가 응답하지 않을 때까지 몇 분 정도 기다립니다. 유해한 핀치에 페달 철수가없는 것을 통해 충분한 마취 깊이를 확인하십시오.
- 마우스를 코 콘에 코가있는 해부 트레이 위에 뒤쪽에 놓습니다. 유해한 핀치에 페달 철수의 부재를 통해 완전한 마취의 이차 확인을 수행하십시오. 네 발을 모두 트레이에 고정합니다.
- 동물의 복부에 20 % 에탄올을 뿌리십시오.
- 포셉을 사용하여 하복부를 꼬집고 피부를 들어 올립니다. 가위를 사용하여 모피와 피부를 흉곽 바닥으로 자릅니다.
- 흉곽 아래에서 각 어깨를 향해 두 개의 대각선 절개를 만듭니다.
- 횡격막을 조심스럽게 절제하십시오 (폐와 심장을 피하십시오). 흉곽을 절제하여 심장을 노출시킵니다.
- 심장 주위의 결합 조직을 조심스럽게 절단하십시오.
참고: 3.10-3.11단계는 매우 중요합니다. 숙련도와 손재주로 수행하십시오. - 가위를 사용하여 오른쪽 심방 (심장의 왼쪽 상단에있는 어두운 엽)을 클립하십시오. 호흡기에 이소플루란의 흐름을 끄십시오.
- 포셉으로 심장을 일정하게 잡으십시오. 나비 바늘의 경사가 위를 향하게하여 바늘 수준을 유지하고 동물과 평행하게 유지하면서 좌심실을 관통하십시오.
- 바늘을 제자리에 고정하고 펌프를 켜고 심장을 떠나는 액체가 불투명하고 간과 폐가 옅어질 때까지 적어도 30mL의 식염수/헤파린 용액을 정독하십시오.
참고: 단계 3.13-3.14는 매우 중요합니다. 숙련도와 손재주로 수행하십시오. - 펌프를 끄고 바늘을 제거한 다음 마우스를 해부 영역으로 옮깁니다.
4. 해부
- 큰 외과 용 가위를 사용하여 머리를 무력화시킵니다.
- 머리 뒤쪽에서 눈까지 모피를 자릅니다. 두개골을 노출시키기 위해 피부를 다시 벗겨냅니다.
- 눈 사이에 두개골을 클립하십시오. 두개골 뒤쪽의 10시와 2시 위치에서 두 번 자른 다음 두개골의 중간 시상 선을 따라 눈 사이의 원래 절단까지 하나의 긴 컷 (뇌를 손상시키지 않도록 팁을 유지하십시오)을 만듭니다.
- 포셉을 사용하여 두개골의 두 반쪽을 옆으로 떼어냅니다. 주걱을 사용하여 뇌를 제거하고 차가운 D-PBS로 채워진 얼음 위에 60mm 유리 페트리 접시에 넣습니다(그림 1).
- 메스 또는 면도기를 사용하여 각 반구를 분리하십시오. 그런 다음 후각 전구와 소뇌를 제거하십시오.
- 해마가 노출 될 때까지 포셉을 사용하여 중뇌를 제거하십시오.
- 포셉으로 뇌를 고정시킵니다. 두 번째 포셉 세트를 사용하여, 각 반구에서 해마를 부드럽게 놀리고, 두 해마를 차가운 D-PBS를 함유하는 표지된 1.5 mL 튜브로 옮긴다.
- 마우스로부터 두 개의 해마가 들어있는 샘플 튜브를 얼음 위에 놓는다.
5. 각 시료에 대해 효소 믹스 1과 2 준비
참고: 부피가 2mL보다 큰 경우 10mL 혈청 피펫을 사용하십시오. 부피의 경우, 200 μL-2 mL, 1000 μL 피펫을 사용하십시오. 부피의 경우, 21-199 μL, 200 μL 피펫을 사용하십시오. 부피의 경우, 2-20 μL, 20 μL 피펫을 사용하십시오. 2 μL 미만의 부피의 경우 0-2 μL 피펫을 사용하십시오.
- 각 샘플에 대해, 실온에서 각각의 효소 P 및 효소 A의 하나의 분취량을 해동시킨다.
- 효소 믹스 1의 경우, 50 μL의 효소 P와 1900 μL의 버퍼 Z를 표지된 C 튜브에 결합한다(표 of Materials).
- 효소 믹스 2의 경우, 20 μL의 완충액 Y를 효소 A의 해동된 10 μL 분취량에 첨가한다.
6. 성인 뇌 해리 프로토콜17
참고: 샘플로 작업할 때는 튜브를 실온에서 튜브 랙에 놓아야 하며, BSA 및 D-PBS는 달리 명시되지 않는 한 얼음 위에 남아 있어야 합니다.
- 해리기를 켭니다.
- 포셉을 사용하여 해마 조직 조각을 C 튜브로 옮깁니다.
- 30 μL의 효소 믹스 2를 C 튜브 내로 옮긴다. 장력이 느껴질 때까지 뚜껑을 비틀고 딸깍 소리가 날 때까지 조이십시오.
- C 튜브를 해리기의 위치에 거꾸로 놓습니다. 샘플에 선택됨 상태가 할당됩니다(그림 2). 히터를 C 튜브 위에 고정하십시오.
- 폴더 아이콘을 누르고 즐겨찾기 폴더를 선택한 다음 스크롤하여 37C_ABDK_02 프로그램을 선택하십시오. 확인을 클릭하여 선택한 모든 C 튜브에 프로그램을 적용한 다음 시작 을 누릅니다(그림 2).
- 샘플 당 하나의 50mL 원뿔형 튜브에 라벨을 붙입니다.
- 70 μm 세포 스트레이너를 각 50 mL 원뿔형 튜브에 놓고 2 mL의 BSA 완충액으로 습윤시킨다.
- 프로그램이 완료되면 해리기에서 히터와 C 튜브를 제거하십시오.
- BSA 버퍼 4 mL를 샘플에 첨가하고, 혼합물을 50 mL 원뿔형 튜브 상의 세포 스트레이너에 적용한다.
- 10 mL의 D-PBS를 C 튜브에 첨가하고, 그것을 닫고, 용액을 부드럽게 소용돌이친다. 50 mL 원뿔형 튜브의 세포 스트레이너에 바르십시오.
- 세포 스트레이너와 C 튜브를 버리십시오. 현탁액을 4°C에서 10분 동안 300 x g 에서 원심분리한다. 그런 다음 상청액을 흡인하고 버리십시오.
7. 이물질 제거
- 펠렛을 1550 μL의 차가운 D-PBS로 재현탁시키고, 현탁액을 표지된 15 mL 원뿔형 튜브로 옮긴다.
- 450 μL의 차가운 이물질 제거 용액과 피펫을 위아래로 첨가하십시오 (볼텍스 방지).
참고: 이물질 제거 솔루션은 상업용 성인 브라이언 해리 키트17의 시약입니다. - 차가운 D-PBS 1 mL를 세포 현탁액의 상부에 부드럽게 오버레이하고, 팁을 원뿔형 튜브의 벽에 대고 유지한다. 총 오버레이가 2mL가 될 때까지 반복하십시오.
참고: 이 단계는 매우 중요합니다. 숙련도와 손재주로 수행하십시오. - 3000 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리하여 완전 가속 및 완전 브레이크를 사용합니다.
참고: 단계가 명확하게 구분되지 않으면 7.2-7.3단계를 반복합니다. 4°C에서 10분 동안 1000 x g 에서 최종 시간 동안 원심분리한다. - 서스펜션은 이제 세 개의 별개의 레이어로 구성되어야 합니다(그림 3). 맨 위 레이어를 흡인하십시오. 피펫 끝을 앞뒤로 쓸어 흰색 중간 층을 흡인시킵니다. 가장 아래쪽 레이어를 방해하지 않고 가능한 한 많은 중간 레이어를 제거하십시오.
참고: 이 단계는 매우 중요합니다. 숙련도와 손재주로 수행하십시오. - 차가운 D-PBS 2mL와 피펫을 위아래로 섞어 줍니다.
- 1000 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리하여 완전 가속 및 완전 브레이크를 사용합니다. 상층액을 흡인하고 버립니다. 펠렛을 1 mL의 BSA 완충액에 재현탁시킨다.
참고: 세포는 적절한 완충액에 재현탁된 다음, 이 시점에서 단일 세포 시퀀싱을 준비하기 위해 자기적으로 표지되고 단리될 수 있다.
8. 세포 수
- 사용 가능한 셀 카운터에 대한 제조업체의 프로토콜에 따라 셀 카운팅을 수행합니다 (한 가지 옵션은 재료 표에 나와 있음)
9. 생사/죽은 얼룩
- 나머지 900 μL (7.7로부터)를 1000 x g 에서 4°C에서 10분 동안 완전 가속 및 완전 브레이크로 원심분리한다.
- 샘플이 회전하는 동안 샘플당 하나의 유동 튜브에 라벨을 붙이고 호일에 싸서 빛 노출을 제한합니다.
- 상층액을 흡인하고 버립니다.
- 펠렛을 희석된 생/사 얼룩 50 μL(이전에 제조됨)에 재현탁시킨다.
참고: 이 단계는 저조도 설정에서 수행해야 합니다. 이를 위해 오버 헤드 룸 조명을 끄십시오. - 각각의 샘플을 상응하는 라벨링된 유동 튜브로 옮기고, 어둠 속에서 8-10분 동안 실온에서 인큐베이션한다(예를 들어, 서랍 또는 박스).
- 500 μL의 BSA 버퍼를 첨가하고 1000 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리하여 완전 가속 및 완전 브레이크를 사용합니다.
- 상층액을 흡인하고 버립니다.
참고: 펠릿이 보이지 않을 수 있습니다. 의도하지 않게 펠릿을 흡인하지 않도록 소량의 버퍼를 남겨 두십시오. 세포는 적절한 완충액에 재현탁되고, 차단되고, 이 시점에서 세포 특이적 항체로 염색될 수 있다. 샘플 프로토콜18에 대해서는 보충 파일 1을 참조하십시오.
10. 고정 (선택 사항)
- 펠렛을 1% PFA의 200 μL에 재현탁시켰다 (이전에 제조됨). 4°C에서 15분 동안 인큐베이션한다.
- 500 μL의 D-PBS를 첨가하고 4°C에서 10분 동안 300 x g 에서 원심분리하여 세척한다.
- 상층액을 흡인하십시오.
참고: 펠릿이 보이지 않을 수 있습니다. 의도하지 않게 펠릿을 흡인하지 않도록 소량의 버퍼를 남겨 두십시오. - 펠렛을 200 μL의 D-PBS에 재현탁시키고 최대 3일 동안 4°C에서 보관한다.
11. 유세포 측정
- 새 튜브에 필터 캡에 레이블을 지정합니다.
- 1 mL 피펫을 사용하여, 각 샘플을 필터 캡 상에 피펫한다.
- 원심분리기는 4°C에서 200 x g에서 간략하게 진행하고, 단지 원심분리기가 실행을 중단하기 전에 200 x g에 도달하도록 허용하였다.
- 하류 분석을 위해 유세포 분석기 코어로 진행한다.
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Representative Results
샘플은 핵심 시설에서 유세포 분석기로 처리되었고, 결과 데이터는 유동 분석을 위한 소프트웨어 패키지로 평가되었다. 이전에는 보상 대조군 (생사 얼룩 및 음성 대조군)을 분석했습니다. 여러 개의 형광이 사용되는 경우, 형광 마이너스 하나 (FMO) 대조군 및 단일 염색 대조군이 각 항체에 대해 준비되어야 한다. 실험 샘플에 대한 스펙트럼 중첩에 대한 보상은 분석된 대조군에 기초하여 계산되었다. 세포 집단 식별을 위해, 계층적 게이팅 전략이 사용되었다. 일차 게이트는 전방 산란(셀 크기) 대 측면 산란(세분성) 플롯19,20에서 파편을 제외시켰다. 이어서, 죽은 세포를 배제하였다(도 4, 도 5, 도 6, 보충 도 1, 보충 도 2, 보충 도 3, 및 보충 도 4). 다음 게이트는 미엘린 베이직 단백질에 대해 양성인 세포를 배제하였다(보충 도 4). 나머지 세포 중에서, 각각의 형광색에 대해 양성인 세포의 밀도 플롯이 생성되었다(보충 그림 4). 각 신경세포 집단의 빈도는 세 번째 게이트로부터 계산되었다(보충 그림 4). 수동 기계적 해리21 및 효소 소화로 처리된 샘플은 실질적으로 더 낮은 관심 세포 집단을 산출하였다(보충 파일 2 21, 도 4 및 보충 도 1). 반대로, 자동화된 기계적 해리 및 효소 소화를 통해 제조된 고정 및 신선 샘플 모두 몇 배 더 큰 관심 세포 집단을 반환했습니다 (그림 5, 그림 6, 보충 그림 2 및 보충 그림 3).
그림 1: 마우스 뇌 . (A) 적절하게 관류됨. (B) 비관류. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 6.4단계에서 선택한 상태. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 단계 7.5의 삼층 현탁액: 버퍼(상위 레이어), 셀 파편, 이물질 제거 용액 및 셀(하단 레이어). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 파스퇴르 피펫 분쇄 및 효소 소화에 의한 수동 해리의 조합을 사용하여 처리된 고정 샘플의 대표적인 분석. 동시에 처리된 두 샘플 중 첫 번째입니다. (A) 관심있는 세포 집단 인 세포의 비율. (B) 살아있는 세포인 관심 집단의 백분율. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 자동화된 기계적 해리와 효소적 소화의 조합을 사용하여 처리된 신선한 샘플의 대표적인 분석. 동시에 처리된 두 샘플 중 첫 번째입니다. (A) 관심있는 세포 집단 인 세포의 비율. (B) 살아있는 세포인 관심 집단의 백분율. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 6: 자동화된 기계적 해리와 효소적 소화의 조합을 사용하여 처리된 고정된 샘플의 대표적인 분석. 동시에 처리된 두 샘플 중 첫 번째입니다. (A) 관심있는 세포 집단 인 세포의 비율. (B) 살아있는 세포인 관심 집단의 백분율. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1: 수동 파스퇴르 피펫 분쇄 해리 및 효소 소화의 조합을 사용하여 처리된 고정 샘플의 대표적인 분석. 두 샘플 중 두 번째는 동시에 처리됩니다. (A) 관심있는 세포 집단 인 세포의 비율. (B) 살아있는 세포인 관심 집단의 백분율. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 2 : 자동화 된 기계적 해리와 효소 소화의 조합을 사용하여 처리 된 신선한 샘플의 대표적인 분석. 두 샘플 중 두 번째는 동시에 처리됩니다. (A) 관심있는 세포 집단 인 세포의 비율. (B) 살아있는 세포인 관심 집단의 백분율. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 3 : 자동화 된 기계적 해리와 효소 소화의 조합을 사용하여 처리 된 고정 샘플의 대표적인 분석. 두 샘플 중 두 번째는 동시에 처리됩니다. (A) 관심있는 세포 집단 인 세포의 비율. (B) 살아있는 세포인 관심 집단의 백분율. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 4: 자동화된 기계적 해리 및 효소 소화의 조합을 사용하여 처리된 염색 및 고정 샘플의 대표적인 분석. (A) 관심있는 세포 집단 인 세포의 비율. (B) 살아있는 세포인 관심 집단의 백분율. (C). MBP- 세포. (D). PSA-NCAM+ 세포 (뉴런 전구체 세포). (E). ACSA2+ 세포 (성상세포). (F). CD31+ 세포 (내피). (G). CD11b+ 세포 (미세아교세포). 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1 : 염색 프로토콜. 세포 표면 마커의 면역염색을 위한 샘플 염색 프로토콜. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 2 : 적응 된 수동 기계적 및 효소 해리 프로토콜. 이 방법은 이전에 공개된 프로토콜(21)로부터 적응된다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 신경 해리 프로토콜의 몇 가지 단계는 능숙한 기술과 손재주 - 관류, 상청 흡인 및 미엘린 제거가 필요합니다. 관류 과정 전반에 걸쳐 내부 장기는 손상되지 않아야합니다 (횡격막을 제거하고 심장을 자르는 것 외에); 이것은 나비 바늘로 심장의 상부 챔버를 피하는 것을 포함합니다. 필요한 헤파린을 함유 한 식염수의 양은 다양하지만 심장에서 흐르는 투명한 유체는 과정이 완료되었음을 나타냅니다. 뇌는 완전하고 적절하게 관류되어야 하며, 이 때 뇌는 흰색이 아닌 것처럼 보입니다(그림 1). 관류와 함께, 적혈구 제거 단계는 외래 적이 되어, 세포 손실을 초래할 수 있는 샘플의 과도한 조작을 제거한다. 이어서, 이물질 제거 단계는 꾸준한 손을 필요로 한다. 원심분리가 D-PBS 오버레이에 따라 명확하게 정의된 층들을 초래하기 위해서는(그림 3), 층들이 수송 중에 또는 피펫팅하는 동안 방해받지 않아야 한다. 또한, 상위 두 층을 흡인 할 때, 충분한 현탁액을 제거하여 과도한 세포 파편을 제거하면서 충분히 큰 샘플을 남겨 두어야합니다. 이것은 죽은 세포가 비특이적으로 결합하고 자가 형광22,23이 될 가능성이 높기 때문에 중요한 단계이며, 지속적으로 높은 세포 생존력을 초래하는 방법을 선택하는 것이 중요하다는 것을 강조합니다. 마지막으로, 상청액을 흡인 할 때, 펠릿이 항상 보이지 않을 수 있습니다. 샘플이 실수로 버려지지 않도록 소량의 잔류 상청액을 남겨 두어야합니다.
샘플을 고정하는 데는 장단점이 있습니다. 모든 항체 마커가 고정과 양립할 수 있는 것은 아니며, 관심있는 세포 집단에 따라 하류 분석을 제한한다. 또한, 과도하게 농축된 PFA를 사용하거나 세포를 장기간 동안 고정제로 남겨두면 자가형광 및 위양성 판독이 발생할 수 있고, 이로 인해 결과24,25가 교란될 수 있다. 1% PFA 용액을 사용하고 세포의 노출을 최소화함으로써, 위양성 판독의 가능성이 크게 감소된다. 이 절차는 상세하고 많은 타이밍 변수를 가지고 있기 때문에 신선한 셀을 사용하면 실험실을 엄격한 시간 제약 조건 하에서 배치하여 셀이 실행 가능한 상태를 유지할 수 있도록합니다. 고정은 다음날 분석을 위해 세포 구조를 보존합니다.
단일 세포 분석은 치료 효능, 세포 기능 및 질병 또는 치료 작용 메커니즘에 대한 주요 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 예시적인 방법은 단일 세포 DNA 및 RNA 시퀀싱26,27, 비행시간 22,28에 의한 세포측정, 유세포 측정, 및 면역조직화학을 포함한다. 단일 세포 mRNA 시퀀싱을 통해, 샘플 수집시의 유전자 발현은 세포 유형-특이적 인사이트(26)를 제공할 수 있다. 예를 들어, 연구 그룹은 등쪽 선조체 27에서 배지 스파이니 뉴런 서브타입을 발현하는 D1 및D2 도파민 수용체에 대해 단일 세포 RNA 시퀀싱을 수행했다. 이 그룹은 새로운 아형-특이적 마커 유전자를 검출하고, 단세포 분해능27의 부족으로 인해 차등적으로 발현되는 것으로 이전에 그리고 부정확하게 보고되었던 유전자들을 확인함으로써 배지 스파이니 뉴런의 전사체를 재정의하였다. Ho et al.은 세포 유형 특이적 약물 표적을 발견하는 데있어 단일 세포 RNA 시퀀싱의 잠재력을 강조했다27. 단일 세포 DNA 시퀀싱을 통해, 유전자 발현의 변화는 DNA 및 히스톤 변형, 크로마틴 접근성 및 크로마틴 입체 형태26을 측정함으로써 설명될 수 있다. 단일 핵 DNA 메틸화를 측정함에 있어서, Liu et al.은 45개의 마우스 뇌 영역의 단일 세포 DNA 메틸롬 아틀라스를 구축하고, 161개의 뉴런 세포 유형29를 확인했다. 단일 세포 시퀀싱을 위한 샘플 준비는 더욱 복잡하며, 특히 단일 세포의 분리 및 파편 제거가 더 복잡합니다. Mattei et al.은 전사체 및 프로테오타입 프로파일링에 대한 효소적 및 기계적 해리의 효과를 조사하면서, 신경 해리 방법이 본질적으로 바이어스30 수준을 도입한다고 지적했다. 몇몇 그룹은 효율적으로 일하고, 얼음 위에서 해부하고, 전사 억제제26,30,31을 사용하는 것이 중요하다는 점에 주목했습니다. Mattei et al. 또한 분석30을 알리기 위해 영향을받는 유전자와 단백질을 확인했습니다. 그러나, 이들 기술은 여전히 벌크 조직 전사체학(bulk-tissue transcriptomics)(26,27)에 의해 타의 추종을 불허하는 세포 빌딩 블록에 대한 상세한 통찰력을 제공한다.
유세포 분석기는 형광 프로브를 사용하여 단일 세포 집단의 매개 변수를 동시에 식별하고 측정 할 수있는 강력한 분석 도구입니다. 유세포 분석기의 일부 응용 분야에는 세포 주기 분석, 세포 분류, 생존력, 표현형, 세포 증식 및 기능 분석(32,33)이 포함된다. 이러한 응용 프로그램의 대부분은 세포 표면 단백질의 접근성으로 인해 표면 염색을 사용합니다. 이들 단백질은 혈통, 발달 단계 및 기능 19,32,33에 기초하여 특정 세포 집단을 확인하기 위해 염색될 수 있다. 예를 들어, 샘플은 성상세포, 내피 세포, 뉴런 전구체 세포, 및 미세아교세포(34)의 집단을 확인하기 위해 표면 염색될 수 있다. 살아있는 세포의 표면 단백질을 염색할 때 가장 큰 이점은 추가적인 하류 분석(34)을 수행하기 위한 옵션을 유지하면서 세포를 분류할 수 있다는 것이다. 표면 염색 기술은 상당히 표준이지만 세포 내 염색은보다 섬세한 절차입니다. 세포내 유세포 분석기를 이용하면, 항체가 세포막(20,32,33,34)을 가로지를 수 있도록 염색 전에 세포를 고정시키고 투과시켜야 한다. 이상적으로는, 세포 형태학은 온전하게 남아있을 것이다; 그러나, 투과화는 단백질 변성을 위험에 빠뜨리며, 이는 항체 검출22,34에 부정적인 영향을 미칠 것이다. 추가적인 하류 분석의 일부 방법은 일단 세포가 고정되면(20) 더 이상 옵션이 아니다. 세포 내 염색의 단점은 표면 염색보다 더 뚜렷하지만, 전자는 그렇지 않으면 그럴듯하지 않은 세포 내 분자의 검출 및 분석을 허용합니다. 추가적으로, 세포 표면 및 세포내 염색 절차는 특정 세포 유형을 결정적으로 식별하거나 추가적인 파라미터를 동시에 평가하기 위해 결합될 수 있다(20,28,34).
세포 분석에 필요한 단일 세포 현탁액을 준비하는 데 사용할 수있는 몇 가지 신경 해리 방법이 있지만 똑같이 효과적이지는 않습니다. 표준화 된 키트 및 전술 한 기술과 비교할 때,이 특정 신경 해리 방법은 소량의 조직을 처리하기위한 것이며, 매우 실행 가능한 단일 세포 현탁액 (>90 %)을 산출하고 실험을 간소화합니다. 이 프로토콜을 통해 다른 실험실은 신뢰할 수 있고 재현 가능한 방식으로 신경 해리를 수행 할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
실습 교육과 지속적인 제품 지원을 제공해 주신 Aimee Rogers에게 감사드립니다. 지속적인 문제 해결과 명확한 토론에 대해 Amanda Burke 박사님께 감사드립니다. 이 원고의 문법적 편집 및 서식에 대해 Meredith Joheim과 UAMS Science Communication Group에 감사드립니다. 본 연구는 NIH R25GM083247 및 NIH 1R01CA258673 (ARA)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 02-682-003 | Basix, assorted color |
| 15 mL Falcon Tubes | Becton Dickinson Labware Europe | 352009 | Polystyrene |
| 25 mL Serological Pipets | Fisher Scientific | 14-955-235 | |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Falcon | 352052 | |
| 500 mL Vacuum Filter/ Storage Bottle System | Corning | 431097 | |
| 70 μm cell strainer | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Adult Brain Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-107-677 | Contains Enzyme P, Buffer Z, Buffer Y, Enzyme A, Buffer A, Debris Removal Solution |
| Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-105 | |
| Anti-ACSA-2-PE-Vio770, mouse, clone REA969 | Miltenyi Biotec | 130-116-246 | |
| Anti-Myelin Basic Protein | Sigma-Aldrich | M3821-100UG | |
| Anti-PSA-NCAM-PE, human, mouse and rat, Clone 2-2B | Miltenyi Biotec | 130-117-394 | |
| BD LSRFortessa | BD | ||
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906-50G | |
| CD11b-VioBlue, mouse, Clone REA592 | Miltenyi Biotec | 130-113-810 | |
| CD31 Antibody | Miltenyi Biotec | 130-111-541 | |
| Ceramic Hot Plate Stirrer | Fisher Scientific | 11-100-100SH | |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Ethanol | Pharmco by Greenfield Global | 111000200 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Fine Scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | Perfusion |
| FlowJo | BD | (v10.7.0) | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Gibco DPBS (1X) | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| Glass Beaker | Fisher Scientific | 02-555-25A | |
| Heparin sodium | Fresenius Kabi | 504011 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher | L34965 | |
| Magnetic Stir Bar | Fisher Scientific | 14-513-51 | |
| Noyes Spring Scissors | Fine Science Tools | 15012-12 | Dissection |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 441244-3KG | Prilled, 95% |
| Pipette tips GP LTS 20 µL 960A/10 | Rainin | 30389270 | |
| Pipette Tips GP LTS 250 µL 960A/10 | Rainin | 30389277 | |
| Pipette tips RT LTS 1000 µL FL 768A/8 | Rainin | 30389213 | |
| Rainin Pipet-Lite XLS (2, 20, 200, 1000 μL) | Rainin | 30386597 | |
| RBXMO FITC XADS | Fisher Scientific | A16167 | |
| Round Ice Bucket with Lid | Fisher Scientific | 07-210-129 | |
| Round-Bottom Tubes with Cell Strainer Cap | Falcon | 100-0087 | |
| S1 Pipet Fillers | ThermoFisher Scientific | 9541 | |
| Spatula & Probe | Fine Science Tools | 10090-13 | Dissection & Perfusion |
| Surflo Winged Infusion Set 23 G x 3/4" | Termuno | SV-23BLK | Butterfly needle |
| Test Tube Rack | Fisher Scientific | 14-809-37 | |
| Thermo Scientific Legend XTR Centrifuge | ThermoFisher | discontinued | Or other standard table top centrifuge |
| Variable-Flow Peristaltic Pump | Fisher Scientific | 13-876-2 | Low-flow model |
| VetFlo Starter Kit for Mice | Kent Scientific | VetFlo-MSEKIT | Anesthesia mask, tubing, induction chamber, charcoal canisters |
| VetFlo Vaporizer Single Channel Anesthesia System | Kent Scientific | VetFlo-1210S | 0.2–4 LPM |
| Vi-CELL XR Cell Viability Analyzer | Beckman Coulter Life Sciences | 731196 | Cell Counting |
| Vi-CELL XR 4 Bags of Sample Vials | Beckman Coulter Life Sciences | 383721 | Cell Counting |
References
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