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Neuroscience

माउस मस्तिष्क हिप्पोकैम्पस ऊतक के संयुक्त यांत्रिक और एंजाइमेटिक पृथक्करण

Published: October 21, 2021 doi: 10.3791/63007
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2, 1,2,3, 1,2,3
1Division of Radiation Health, University of Arkansas for Medical Sciences, 2Department of Pharmaceutical Sciences, University of Arkansas for Medical Sciences, 3Neurobiology & Developmental Sciences, University of Arkansas for Medical Sciences

Summary

यह तंत्रिका कोशिका पृथक्करण प्रोटोकॉल शुरुआती सामग्री की कम मात्रा के साथ नमूनों के लिए अभिप्रेत है और वैकल्पिक निर्धारण और धुंधला चरणों के साथ डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए एक अत्यधिक व्यवहार्य एकल-सेल निलंबन उत्पन्न करता है।

Abstract

यह तंत्रिका पृथक्करण प्रोटोकॉल (एक वाणिज्यिक वयस्क मस्तिष्क पृथक्करण किट के साथ प्रोटोकॉल का एक अनुकूलन) प्रवाह साइटोमेट्री या एकल-सेल अनुक्रमण जैसे विस्तृत डाउनस्ट्रीम विश्लेषण की तैयारी में ऊतक प्रसंस्करण को अनुकूलित करता है। तंत्रिका पृथक्करण को यांत्रिक पृथक्करण के माध्यम से आयोजित किया जा सकता है (जैसे कि फिल्टर, चॉपिंग तकनीक, या पिपेट ट्रिचुरेशन का उपयोग करना), एंजाइमेटिक पाचन, या उसके संयोजन। न्यूरोनल कोशिकाओं की नाजुक प्रकृति न्यूनतम सेलुलर मलबे के साथ अत्यधिक व्यवहार्य, सच्चे एकल-सेल निलंबन को प्राप्त करने के प्रयासों को जटिल कर सकती है जो एकल-सेल विश्लेषण के लिए आवश्यक है। डेटा से पता चलता है कि स्वचालित यांत्रिक पृथक्करण और एंजाइमेटिक पाचन का यह संयोजन लगातार एक अत्यधिक व्यवहार्य (>90%) एकल-सेल निलंबन उत्पन्न करता है, जो उपर्युक्त कठिनाइयों पर काबू पाता है। जबकि कुछ चरणों को मैन्युअल निपुणता की आवश्यकता होती है, ये चरण नमूना हैंडलिंग और संभावित सेल हानि को कम करते हैं। यह पांडुलिपि अन्य प्रयोगशालाओं को डाउनस्ट्रीम विश्लेषण की तैयारी में तंत्रिका ऊतक की छोटी मात्रा को सफलतापूर्वक अलग करने के लिए सुसज्जित करने के लिए प्रक्रिया के प्रत्येक चरण का विवरण देती है।

Introduction

हिप्पोकैम्पस को पहली बार एक बोलोग्नीज एनाटॉमिस्ट, Giulio Cesare Aranzio द्वारा 1500 के दशक में वर्णित किया गयाथा। इस नई संरचना के नामकरण में, Aranzio संभवतः जीनस हिप्पोकैम्पस1 के seahorse के लिए अपनी अलौकिक समानता से प्रेरित था। हिप्पोकैम्पस तनाव प्रतिक्रियाओं में शामिल है, लेकिन व्यापक रूप से सीखने और स्मृति में अपनी भूमिका के लिए जाना जाता है। अधिक विशेष रूप से, हिप्पोकैम्पस घोषणात्मक और स्थानिक स्मृति1 के एन्कोडिंग और पुनर्प्राप्ति के लिए जिम्मेदार है।

हिप्पोकैम्पस, या हिप्पोकैम्पस उचित, CA1 (cornu ammonis), CA2, और CA3 subfields1 में विभाजित है। तंत्रिका तंत्र के बाकी हिस्सों की तुलना में, हिप्पोकैम्पस में कई अद्वितीय परिभाषित विशेषताएं हैं, जिनमें इसकी प्लास्टिसिटी और चल रहे न्यूरोजेनेसिस 2 के लिए क्षमता शामिलहै। न्यूरोजेनेसिस तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के प्रसार और भेदभाव की प्रक्रिया है, जिसके बाद पहले से मौजूद न्यूरोनल नेटवर्क में उनका एकीकरण होता है। न्यूरोजेनेसिस डेंटेट गाइरस और पार्श्व वेंट्रिकल्स (और घ्राण बल्ब) के सबवेंट्रिकुलर क्षेत्र के उप-ग्रेन्युलर क्षेत्र तक सीमित है। जबकि न्यूरोजेनेसिस भ्रूणजनन में प्रचुर मात्रा में है, यह एक आजीवन प्रक्रियाहै 3,4। जैसे, यह चर्चा हिप्पोकैम्पस में वयस्क न्यूरोजेनेसिस पर ध्यान केंद्रित करेगी।

सबवेंट्रिकुलर और सबग्रेन्युलर ज़ोन न्यूरोजेनिक niches होते हैं जिनमें ependymal और संवहनी कोशिकाएं होती हैं, साथ ही तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के अपरिपक्व और परिपक्व वंशहोते हैं। माइक्रोग्लिया न्यूरोजेनेसिस 6 को विनियमित करने के लिए प्रतिरक्षा कोशिकाओं के रूप में इन niches में योगदान देताहै। तंत्रिका पूर्वज कोशिकाएं तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के नॉनस्टेम सेल संतान हैं। सबवेंट्रिकुलर ज़ोन में तीन प्रकार के तंत्रिका पूर्वज मौजूद होते हैं: रेडियल ग्लिया-जैसे टाइप बी कोशिकाएं, टाइप सी ट्रांजिट-एम्प्लिफाइंग पूर्वज, और टाइप ए न्यूरोब्लास्ट्स 3,8। सबवेंट्रिकुलर ज़ोन में धीरे-धीरे विभाजित प्रकार बी तंत्रिका पूर्वज कोशिकाएं तेजी से विभाजित टाइप सी कोशिकाओं में अंतर कर सकतीहैं। इसके बाद, टाइप सी कोशिकाएं टाइप ए कोशिकाओं8 में अंतर करती हैं। ये न्यूरोब्लास्ट्स रोस्ट्रल प्रवासी धारा के माध्यम से घ्राण बल्ब में स्थानांतरित हो जाते हैं, इससे पहले कि इंटरन्यूरॉन्स या ओलिगोडेंड्रोसाइट्स 9 में अंतरकिया जा सके। ये घ्राण बल्ब इंटरन्यूरॉन्स घ्राण अल्पकालिक स्मृति, और साहचर्य सीखने के लिए महत्वपूर्ण हैं, जबकि ओलिगोडेंड्रोसाइट्स कॉर्पस कैलोसम9 के अक्षतंतुओं को माइलिनेट करते हैं। वयस्क न्यूरोजेनेसिस का बहुमत डेंटेट गाइरस के उप-ग्रेन्युलर क्षेत्र में होता है, जहां रेडियल टाइप 1 और नॉनरेडियल टाइप 2 तंत्रिका पूर्वज पाए जाते हैं। अधिकांश तंत्रिका पूर्वज कोशिकाएं डेंटेट ग्रेन्युल न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स बनने के लिए नियत हैं। गैप जंक्शनों से जुड़े, एस्ट्रोसाइट्स प्लास्टिसिटी, सिनैप्टिक गतिविधि और न्यूरोनल उत्तेजना को संशोधित करने के लिए नेटवर्क बनातेहैं। Dentate gyrus के प्राथमिक उत्तेजक न्यूरॉन के रूप में, ग्रेन्युल कोशिकाएं CA3 क्षेत्र11 को एंटोरिनल कॉर्टेक्स से इनपुट प्रदान करती हैं।

तंत्रिका स्टेम सेल आबादी को इम्युनोमैग्नेटिक या इम्युनोफ्लोरोसेंट अलगाव रणनीतियों12,13 का उपयोग करके अलग किया जा सकता है। तंत्रिका ऊतक को अलग करना विशेष रूप से मुश्किल है; ऐसा करने के प्रयासों के परिणामस्वरूप अक्सर खराब सेल व्यवहार्यता वाले नमूने होते हैं और / या डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए आवश्यक एकल-सेल निलंबन का उत्पादन करने में विफल रहते हैं। तंत्रिका पृथक्करण को यांत्रिक पृथक्करण के माध्यम से आयोजित किया जा सकता है (जैसे कि फिल्टर, चॉपिंग तकनीक, या पिपेट ट्राइटुरेशन का उपयोग करना), एंजाइमेटिक पाचन, यातकनीकों का संयोजन 14,15। तंत्रिका पृथक्करण विधियों का मूल्यांकन करने वाले एक अध्ययन में, विभिन्न एंजाइमों के साथ पिपेट ट्राइटुरेशन और पाचन के संयोजन बनाम पिपेट ट्राइटुरेशन द्वारा मैनुअल यांत्रिकपृथक्करण की व्यवहार्यता और गुणवत्ता की तुलना की गई थी। गुणवत्ता को तैयार निलंबन15 में सेल clumps और डीएनए या उपकोशिकीय मलबे की मात्रा के आधार पर वर्गीकृत किया गया था। अकेले मैनुअल यांत्रिक पृथक्करण के अधीन ग्लियाल ट्यूमर के निलंबन में डिस्पेज़ के साथ उपचार या डीएनएस, कोलेजेनेस और हाइलूरोनिडेज़15 के संयोजन की तुलना में काफी कम सेल व्यवहार्यता थी। Volovitz et al. ने विभिन्न तरीकों के बीच व्यवहार्यता और गुणवत्ता में भिन्नता को स्वीकार किया और जोर देकर कहा कि अपर्याप्त पृथक्करण डाउनस्ट्रीम विश्लेषण15 की सटीकता को कम कर सकता है।

एक अलग अध्ययन में, लेखकों ने 60 से अधिक विभिन्न तरीकों और सुसंस्कृत न्यूरोनल कोशिकाओं के पृथक्करण केसंयोजनों की तुलना की। इन विधियों में पिपेट ट्राइटुरेशन द्वारा मैनुअल यांत्रिक पृथक्करण के आठ अलग-अलग रूप शामिल थे, तीन अलग-अलग अंतरालों पर पांच व्यक्तिगत एंजाइमों के साथ इनक्यूबेशन की तुलना, और एंजाइमेटिक पाचन या दो एंजाइमों के संयोजन के साथ यांत्रिक पृथक्करण के विभिन्न संयोजन14। यांत्रिक विधियों में से कोई भी एकल-सेल निलंबन14 उत्पन्न नहीं करता है। एकल एंजाइम उपचारों में से चार, संयोजन एंजाइमेटिक उपचारों में से दस, और एंजाइमेटिक पाचन के साथ यांत्रिक पृथक्करण के संयोजनों में से चार ने एकल-कोशिका निलंबन14 उत्पन्न किया। TrypLE के साथ एंजाइमेटिक पाचन ट्रिप्सिन-ईडीटीए के बाद सबसे प्रभावी ढंग से अलग किए गए नमूने14। संयोग से, TrypLE और / या ट्रिप्सिन-ईडीटीए के साथ इलाज किए गए नमूने जिलेटिनस clumps14 बनाने के लिए प्रवृत्त होते हैं। जबकि यह अध्ययन सुसंस्कृत कोशिकाओं पर किया गया था, यह अकेले पिपेट ट्राइटुरेशन या एंजाइमेटिक पाचन की कमियों से बात करता है।

मैनुअल बनाम स्वचालित यांत्रिक पृथक्करण की साइड-बाय-साइड तुलना की कमी है। हालांकि, एक समूह ने वाणिज्यिक पपेन या ट्रिप्सिन एंजाइमेटिक पृथक्करण किट16 के साथ संयोजन के रूप में पूरे माउस दिमाग के मैनुअल और अर्ध-स्वचालित यांत्रिक पृथक्करण की तुलना करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री चलाया। पृथक्करणकर्ता के साथ प्रसंस्करण अधिक लगातार व्यवहार्य कोशिकाओं16 उपज. पृथक्करण के बाद, लेखकों ने प्रोमिनिन -1 कोशिकाओं, न्यूरोनल अग्रदूत कोशिकाओं और माइक्रोग्लिया16 को भी अलग कर दिया। तीन अलग-थलग सेल आबादी में से दो के लिए, अलग-थलग कोशिकाओं की शुद्धता थोड़ी अधिक थी जब नमूनों को मैन्युअल रूप से16 की तुलना में पृथक्करणकर्ता के साथ संसाधित किया गया था। Reiç et al. ने नोट किया कि पिपेटिंग तकनीक में व्यक्ति-से-व्यक्ति परिवर्तनशीलता ऊतक पृथक्करण16 में व्यवहार्य सेल जनसंख्या उपज की पुनरुत्पादकता में बाधा डालती है। लेखकों ने निष्कर्ष निकाला कि स्वचालित यांत्रिक पृथक्करण नमूना प्रसंस्करण16 को मानकीकृत करता है।

इस पांडुलिपि में उल्लिखित पृथक्करण की विधि पूरी तरह से स्वचालित यांत्रिक पृथक्करण और एंजाइमेटिक पाचन का एक संयोजन है, जो एक वाणिज्यिक वयस्क मस्तिष्क पृथक्करण किट17 के साथ समाधान का उपयोग करता है। मानक प्रोटोकॉल के विपरीत, यह अनुकूलित प्रोटोकॉल नमूना हेरफेर को कम करता है, एक अत्यधिक व्यवहार्य एकल-सेल निलंबन उत्पन्न करता है, और शुरुआती ऊतक की न्यूनतम मात्रा को संसाधित करने के लिए अभिप्रेत है।

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Protocol

प्रयोगों को यूएएमएस में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित नैतिक मानकों के अनुसार आयोजित किया गया था। 6 महीने की मादा C57Bl6 / J जंगली प्रकार के चूहों को खरीदा गया था और समूह-रखा गया था (पिंजरे में 4 चूहे) एक निरंतर 12 घंटे प्रकाश / अंधेरे चक्र के तहत।

1. अभिकर्मकों की तैयारी

  1. फिक्सेबल लाइव / डेड स्टेन स्टॉक समाधान तैयार करें। डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) के 20 μL के साथ फ्लोरोसेंट दाग का पुनर्गठन करें।
  2. पन्नी में शीशी लपेटें, इसे "पुनर्गठित" के रूप में लेबल करें, और इसे छह महीने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. हेपरिन के साथ एक 0.9% खारा समाधान तैयार करें। डबल-आसुत पानी (डीडीएच2ओ) के 1 एल में हेपरिन सोडियम (10,000 यूएसपी इकाइयां प्रति 10 एमएल) की एक शीशी की सामग्री को पतला करें।
  4. प्रति जानवर लगभग 45 मिलीलीटर के लिए पर्याप्त तैयार करें और एक सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  5. 1% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) बनाएं।
    1. एक धुएं के हुड में, एक गर्म प्लेट को 50 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें। एक माइक्रोवेव में, एक कांच के बीकर में लगभग 60 डिग्री सेल्सियस तक 100 मिलीलीटर ddH2O गर्म करें। एक चुंबकीय हलचल पट्टी जोड़ें और गर्म प्लेट के लिए स्थानांतरण।
    2. धुएं के हुड में, पीएफए के 1 ग्राम का वजन करें और डीडीएच2ओ के बीकर में जोड़ें एनएओएच क्रिस्टल के 0.1125 ग्राम जोड़ें और भंग होने तक मिश्रण करें (5-10 मिनट)।
    3. NaPO 4- मोनोबेसिक के0.4 ग्राम जोड़ें और भंग (2-5 मिनट) तक मिश्रण करें। वैक्यूम समाधान फ़िल्टर और HCl और NaOH के साथ 7.4 करने के लिए पीएच समायोजित करें।
    4. भंडारण से पहले 30 मिनट के लिए बर्फ पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा करें।
      नोट: 1.5 मिलीलीटर के एलीकोट को एक वर्ष के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। फ्रीज-thaw चक्र से बचें। यदि, पिघलने के बाद, समाधान बादल हो जाता है या एक अवक्षेप बन गया है, तो समाधान का उपयोग नहीं किया जाना चाहिए।
      सावधानी: विषाक्त, ज्वलनशील. हमेशा उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहने हुए हवादार हुड के तहत पीएफए के साथ काम करें।
  6. बफर ए के 1 मिलीलीटर के साथ लाइओफिलाइज्ड एंजाइम ए को फिर से निलंबित किया गया। समाधान को घुमाएं नहीं।
    नोट: एंजाइम ए और बफर ए के साथ-साथ बफर ए, वाई, और जेड वाणिज्यिक वयस्क मस्तिष्क पृथक्करण किट17 में अभिकर्मक हैं।
  7. एंजाइम P को 50 μL के एलीकोट में विभाजित करें और एंजाइम A को 10 μL ऐलीकोट में पुन: निलंबित करें। प्रति किट निर्देश, छह महीने तक के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। फ्रीज-thaw चक्र से बचें।

2. प्रयोग के दिन

  1. टेबलटॉप सेंट्रीफ्यूज को 4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें।
  2. धीरे-धीरे पिघलने के लिए फ्रिज में पीएफए के ऐलीकोट (एस) रखें।
  3. कमरे के तापमान पर पिघलने के लिए पुनर्गठित लाइव / मृत दाग को अंधेरे (जैसे, एक दराज) में रखें।
  4. गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) बफर तैयार करें। कैल्शियम और मैग्नीशियम (डी-पीबीएस), पीएच 7.2 के बिना 1x Dulbecco के फॉस्फेट-बफ़र्ड समाधान के 100 मिलीलीटर के लिए बीएसए के 0.5 ग्राम जोड़ें।
  5. एक हलचल बार जोड़ें और 30 मिनट के लिए एक हलचल प्लेट पर मिश्रण। 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों में स्थानांतरित करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: हमेशा ताजा तैयार बीएसए बफर का उपयोग करें।
  6. लाइव / मृत दाग काम कमजोर पड़ने तैयार करें। पुनर्गठित लाइव / डेड स्टेन स्टॉक समाधान के 1 μL को 360 μL D-PBS में जोड़ें और इसे कमरे के तापमान पर अंधेरे (जैसे, एक दराज या बॉक्स) में स्टोर करें। प्रति नमूना काम कमजोर पड़ने के 50 μL तैयार करें।

3. परफ्यूजन

  1. बर्फ पर हेपरिन के साथ खारा समाधान रखें।
  2. ऑक्सीजन को चालू करें, छोटे पशु संज्ञाहरण vaporizer प्रणाली पर फ्लोमीटर संकेतक गेंद को 1 एल / मिनट पर सेट करें। सुनिश्चित करें कि पर्याप्त ऑक्सीजन दबाव और आइसोफ्लुरेन है।
  3. Vaporizer डायल को 3.5% (प्रेरण और रखरखाव के लिए) पर समायोजित करें।
  4. खारा / हेपरिन समाधान के साथ परफ्यूजन पंप लाइनों को प्राइम करें। गति को 6 mL/min पर सेट करें।
  5. माउस को प्रेरण कक्ष में रखें, श्वास को चालू करें, और माउस के अनुत्तरदायी होने तक कई मिनट प्रतीक्षा करें। हानिकारक चुटकी के लिए पेडल वापसी की अनुपस्थिति के माध्यम से संज्ञाहरण की पर्याप्त गहराई की पुष्टि करें।
  6. नाक शंकु में अपनी नाक के साथ विच्छेदन ट्रे पर अपनी पीठ पर माउस को रखें। हानिकारक चुटकी के लिए पेडल वापसी की अनुपस्थिति के माध्यम से पूर्ण एनेस्थेटाइजेशन की एक माध्यमिक पुष्टि करें। ट्रे के लिए सभी चार पंजे पिन.
  7. 20% इथेनॉल के साथ जानवर के पेट स्प्रे।
  8. संदंश का उपयोग करके, पेट के निचले हिस्से को चुटकी लें और त्वचा को उठाएं। फर और त्वचा के माध्यम से रिबकेज के नीचे तक काटने के लिए कैंची का उपयोग करें।
  9. प्रत्येक कंधे की ओर रिबकेज के नीचे से दो विकर्ण चीरों बनाओ।
  10. डायाफ्राम को ध्यान से उच्छेदित करें (फेफड़ों और हृदय से बचना)। दिल को बेनकाब करने के लिए रिबकेज को उच्छेदन करें।
  11. ध्यान से दिल के चारों ओर किसी भी संयोजी ऊतक को अलग करें।
    नोट:: चरण 3.10-3.11 महत्वपूर्ण हैं; दक्षता और निपुणता के साथ प्रदर्शन करते हैं।
  12. सही आलिंद (दिल के ऊपरी बाईं ओर अंधेरे लोब) को क्लिप करने के लिए कैंची का उपयोग करें। सांस के लिए isoflurane के प्रवाह को बंद कर दें।
  13. संदंश के साथ दिल को स्थिर रखें। तितली सुई के बेवेल के साथ, सुई के स्तर और जानवर के समानांतर रखते हुए बाएं वेंट्रिकल को छेदें।
  14. सुई को जगह में रखें, पंप को चालू करें, और कम से कम 30 मिलीलीटर खारा / हेपरिन समाधान को तब तक फैलाएं जब तक कि दिल को छोड़ने वाला तरल पदार्थ अपारदर्शी न हो और जिगर और फेफड़े रंग में पीला न हो जाएं।
    नोट:: चरण 3.13-3.14 महत्वपूर्ण हैं; दक्षता और निपुणता के साथ प्रदर्शन करते हैं।
  15. पंप को बंद करें, सुई को हटा दें, और माउस को विच्छेदन क्षेत्र में स्थानांतरित करें।

4. विच्छेदन

  1. बड़े सर्जिकल कैंची का उपयोग करके, सिर को डिकैपिटेट करें।
  2. सिर के पीछे से आंखों तक फर काटें। खोपड़ी को उजागर करने के लिए त्वचा को वापस छील लें।
  3. आंखों के बीच खोपड़ी क्लिप। खोपड़ी के पीछे दो कटौती करें, 10 और 2 बजे की स्थिति में, फिर एक लंबा कट बनाएं (मस्तिष्क को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए टिप्स रखें) खोपड़ी की मिडसैगिटल लाइन के साथ आंखों के बीच मूल कटौती के लिए।
  4. खोपड़ी के दो हिस्सों को किनारों तक छीलने के लिए संदंश का उपयोग करें। मस्तिष्क को हटाने के लिए एक स्पैटुला का उपयोग करें और इसे ठंडे डी-पीबीएस (चित्रा 1) से भरे बर्फ पर 60 मिमी ग्लास पेट्री डिश में रखें।
  5. प्रत्येक गोलार्ध को अलग करने के लिए एक स्केलपेल या रेजर का उपयोग करें। फिर घ्राण बल्ब और सेरिबैलम को हटा दें।
  6. हिप्पोकैम्पस के उजागर होने तक मिडब्रेन को हटाने के लिए संदंश का उपयोग करें।
  7. संदंश के साथ मस्तिष्क को सुरक्षित करें। संदंश के दूसरे सेट का उपयोग करके, धीरे-धीरे हिप्पोकैम्पस को प्रत्येक गोलार्ध से बाहर निकालते हैं, और दोनों हिप्पोकैम्पी को ठंडे डी-पीबीएस युक्त लेबल वाले लेबल वाले 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करते हैं।
  8. माउस से दो हिप्पोकैम्पी युक्त नमूना ट्यूब को बर्फ पर रखें।

5. प्रत्येक नमूने के लिए एंजाइम मिक्स 1 और 2 तैयार करें

नोट:: 2 mL से अधिक वॉल्यूम के लिए, एक 10 mL serologic पिपेट का उपयोग करें; वॉल्यूम के लिए, 200 μL-2 mL, एक 1000 μL पिपेट का उपयोग करें; वॉल्यूम के लिए, 21-199 μL, एक 200 μL पिपेट का उपयोग करें; वॉल्यूम के लिए, 2-20 μL, एक 20 μL पिपेट का उपयोग करें; 2 μL के तहत वॉल्यूम के लिए, एक 0-2 μL पिपेट का उपयोग करें।

  1. प्रत्येक नमूने के लिए, कमरे के तापमान पर एंजाइम पी और एंजाइम ए के प्रत्येक एक एलीकोट को पिघलाएं।
  2. एंजाइम मिश्रण 1 के लिए, एक लेबल सी ट्यूब (सामग्री की तालिका) में एंजाइम पी के 50 μL और बफर Z के 1900 μL को संयोजित करें।
  3. एंजाइम मिश्रण 2 के लिए, एंजाइम ए के पिघले हुए 10 μL ऐलीकोट में बफर वाई के 20 μL जोड़ें।

6. वयस्क मस्तिष्क पृथक्करण प्रोटोकॉल17

नोट: नमूनों के साथ काम करते समय, ट्यूबों को कमरे के तापमान पर एक ट्यूब रैक में रखा जाना चाहिए जबकि बीएसए और डी-पीबीएस बर्फ पर रहते हैं जब तक कि अन्यथा नोट न किया जाए।

  1. dissociator पर स्विच करें।
  2. हिप्पोकैम्पी ऊतक के टुकड़ों को सी ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए संदंश का उपयोग करें।
  3. सी ट्यूब में एंजाइम मिश्रण 2 के 30 μL स्थानांतरण. कैप को तब तक मोड़ें जब तक तनाव महसूस न हो जाए, फिर तब तक कसें जब तक कि यह क्लिक न हो जाए।
  4. सी ट्यूब को वियोजनकर्ता की स्थिति में उल्टा रखें; नमूना चयनित स्थिति (चित्र2) असाइन किया जाएगा। सी ट्यूब पर हीटर को सुरक्षित करें।
  5. फ़ोल्डर आइकन दबाएँ, पसंद फ़ोल्डर का चयन करें, स्क्रॉल करें और 37C_ABDK_02 प्रोग्राम का चयन करें। सभी चयनित सी ट्यूबों पर प्रोग्राम को लागू करने के लिए ओके पर क्लिक करें, फिर स्टार्ट (चित्रा 2) पर टैप करें।
  6. प्रति नमूना एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब लेबल.
  7. प्रत्येक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब पर एक 70 μm सेल छलनी रखें और बीएसए बफर के 2 एमएल के साथ गीला करें।
  8. कार्यक्रम के पूरा होने पर, हीटर और सी ट्यूब को पृथक्करणकर्ता से हटा दें।
  9. नमूने के लिए बीएसए बफर के 4 एमएल जोड़ें और 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब पर सेल छलनी के लिए मिश्रण लागू करें।
  10. सी ट्यूब में डी-पीबीएस के 10 मिलीलीटर जोड़ें, इसे बंद करें, और समाधान को धीरे से घुमाएं। इसे 50 मिली शंक्वाकार ट्यूब पर सेल छलनी पर लागू करें।
  11. सेल छलनी और सी ट्यूब को छोड़ दें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 x g पर निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें। फिर, एस्पिरेट करें और supernatant को छोड़ दें।

7. मलबा हटाने

  1. ठंड डी-पीबीएस के 1550 μL के साथ गोली resuspend और एक लेबल 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के लिए निलंबन हस्तांतरण.
  2. ठंडा मलबा हटाने समाधान के 450 μL जोड़ें और पिपेट ऊपर और नीचे (भंवर नहीं है).
    नोट: मलबे हटाने समाधान वाणिज्यिक वयस्क ब्रायन पृथक्करण किट17 में एक अभिकर्मक है।
  3. धीरे से सेल निलंबन के शीर्ष पर ठंडे डी-पीबीएस के 1 एमएल ओवरले, शंक्वाकार ट्यूब की दीवार के खिलाफ टिप रखते हुए। कुल ओवरले 2 मिलीलीटर होने तक दोहराएं।
    नोट:: यह चरण महत्वपूर्ण है; दक्षता और निपुणता के साथ प्रदर्शन करते हैं।
  4. पूर्ण त्वरण और पूर्ण ब्रेक के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 3000 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
    नोट:: यदि चरणों को स्पष्ट रूप से अलग नहीं किया गया है, तो चरण 7.2-7.3 दोहराएँ। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 1000 x g पर एक अंतिम समय सेंट्रीफ्यूज करें।
  5. निलंबन में अब तीन अलग-अलग परतें होनी चाहिए (चित्रा 3)। सबसे ऊपरी परत को एस्पिरेट करें। सफेद मध्य परत aspirate करने के लिए पिपेट टिप आगे और पीछे स्वीप. सबसे नीचे की परत को परेशान किए बिना जितना संभव हो उतना मध्य परत निकालें।
    नोट:: यह चरण महत्वपूर्ण है; दक्षता और निपुणता के साथ प्रदर्शन करते हैं।
  6. मिश्रण करने के लिए 2 मिलीलीटर ठंडा डी-पीबीएस और पिपेट ऊपर और नीचे जोड़ें।
  7. पूर्ण त्वरण और पूर्ण ब्रेक के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 1000 x g पर सेंट्रीफ्यूज। एस्पिरेट करें और supernatant को छोड़ दें। बीएसए बफर के 1 मिलीलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें।
    नोट: कोशिकाओं को उचित बफर में फिर से निलंबित किया जा सकता है, फिर चुंबकीय रूप से लेबल किया जा सकता है और इस बिंदु पर एकल-सेल अनुक्रमण की तैयारी में अलग किया जा सकता है।

8. सेल गिनती

  1. उपलब्ध सेल काउंटर के निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार सेल गिनती करें (सामग्री की तालिका में एक विकल्प नोट किया गया है)

9. जीवित / मृत दाग

  1. पूर्ण त्वरण और पूर्ण ब्रेक के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 1000 x g पर शेष 900 μL (7.7 से) को सेंट्रीफ्यूज करें।
  2. जबकि नमूना कताई कर रहा है, प्रति नमूना एक प्रवाह ट्यूब लेबल करें और प्रकाश जोखिम को सीमित करने के लिए इसे पन्नी में लपेटें।
  3. एस्पिरेट करें और supernatant को छोड़ दें।
  4. पतला जीवित / मृत दाग (पहले से तैयार) के 50 μL में गोली को फिर से निलंबित करें।
    नोट:: यह चरण एक कम-प्रकाश सेटिंग में किया जाना चाहिए। इसे प्राप्त करने के लिए ओवरहेड रूम लाइट्स को बंद कर दें।
  5. प्रत्येक नमूने को संबंधित लेबल प्रवाह ट्यूब में स्थानांतरित करें और अंधेरे में 8-10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें (उदाहरण के लिए, एक दराज या बॉक्स)।
  6. पूर्ण त्वरण और पूर्ण ब्रेक के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 1000 x g पर BSA बफर और सेंट्रीफ्यूज के 500 μL जोड़ें।
  7. एस्पिरेट करें और supernatant को छोड़ दें।
    नोट: गोली दिखाई नहीं दे सकता है; पीछे बफर की एक छोटी राशि छोड़ दें ताकि अनजाने में गोली को एस्पिरेट न किया जा सके। कोशिकाओं को उचित बफर में पुन: निलंबित किया जा सकता है, अवरुद्ध किया जा सकता है, और इस बिंदु पर सेल-विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ दाग दिया जा सकता है। नमूना प्रोटोकॉल18 के लिए पूरक फ़ाइल 1 देखें।

10. निर्धारण (वैकल्पिक)

  1. 1% पीएफए (पहले से तैयार) के 200 μL में गोली को फिर से निलंबित कर दिया। 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 x g पर 300 x g पर 500 μL D-PBS और centrifuge के 500 μL जोड़कर धोएं।
  3. Supernatant aspirate.
    नोट: गोली दिखाई नहीं दे सकता है; पीछे बफर की एक छोटी राशि छोड़ दें ताकि अनजाने में गोली को एस्पिरेट न किया जा सके।
  4. डी-पीबीएस के 200 μL में गोली को फिर से निलंबित करें और 3 दिनों तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

11. प्रवाह cytometry

  1. नई ट्यूबों पर फ़िल्टर कैप्स लेबल करें.
  2. एक 1 एमएल पिपेट का उपयोग करते हुए, फ़िल्टर कैप पर प्रत्येक नमूने को पिपेट करें।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 200 x g पर संक्षेप में सेंट्रीफ्यूज, केवल रन को रोकने से पहले सेंट्रीफ्यूज को 200 x g तक पहुंचने की अनुमति देता है।
  4. डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए प्रवाह साइटोमेट्री कोर के लिए आगे बढ़ें।

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Representative Results

नमूनों को एक कोर सुविधा में एक प्रवाह साइटोमीटर के साथ संसाधित किया गया था, और परिणामस्वरूप डेटा का मूल्यांकन प्रवाह विश्लेषण के लिए एक सॉफ्टवेयर पैकेज के साथ किया गया था। पहले, मुआवजे के नियंत्रण का विश्लेषण किया गया था- जीवित / मृत दाग और नकारात्मक नियंत्रण। यदि कई फ्लोरोक्रोम का उपयोग किया जाता है, तो प्रतिदीप्ति माइनस वन (एफएमओ) नियंत्रण और एकल-दाग नियंत्रण प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए तैयार किया जाना चाहिए। प्रयोगात्मक नमूनों के लिए वर्णक्रमीय ओवरलैप के लिए मुआवजे की गणना विश्लेषण किए गए नियंत्रणों के आधार पर की गई थी। सेल जनसंख्या पहचान के लिए, एक पदानुक्रमित गेटिंग रणनीति का उपयोग किया गया था। प्राथमिक गेट ने आगे स्कैटर (सेल आकार) बनाम साइड स्कैटर (ग्रैन्युलैरिटी) प्लॉट19,20 में मलबे को बाहर रखा। इसके बाद, मृत कोशिकाओं को बाहर रखा गया (चित्रा 4, चित्रा 5, चित्रा 6, पूरक चित्रा 1, पूरक चित्रा 2, पूरक चित्रा 3, और पूरक चित्रा 4)। निम्नलिखित गेट माइलिन बेसिक प्रोटीन (पूरक चित्रा 4) के लिए सकारात्मक कोशिकाओं को बाहर रखा। शेष कोशिकाओं में से, प्रत्येक फ्लोरोक्रोम के लिए सकारात्मक कोशिकाओं के घनत्व भूखंड बनाए गए थे (पूरक चित्र4)। प्रत्येक न्यूरोनल सेल आबादी की आवृत्ति की गणना तीसरे गेट से बाहर की गई थी (पूरक चित्रा 4)। मैनुअल यांत्रिक पृथक्करण21 और एंजाइमेटिक पाचन के साथ संसाधित किए गए नमूनों ने ब्याज की कोशिकाओं की काफी कम आबादी प्राप्त की (पूरक फ़ाइल 2 21, चित्रा 4, और पूरक चित्रा 1)। इसके विपरीत, स्वचालित यांत्रिक पृथक्करण और एंजाइमेटिक पाचन के माध्यम से तैयार किए गए निश्चित और ताजा दोनों नमूनों ने ब्याज की कोशिकाओं की आबादी को कई गुना बड़ा कर दिया (चित्रा 5, चित्रा 6, पूरक चित्रा 2, और पूरक चित्रा 3)।

Figure 1
चित्र 1: माउस मस्तिष्क. (ए) ठीक से perfused. (b) गैर-perfused. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: चरण 6.4 में चयनित स्थिति. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: चरण 7.5 में त्रि-स्तरित निलंबन: बफ़र (शीर्ष परत), सेल मलबे, मलबे को हटाने का समाधान, और कोशिकाएं (निचली परत). कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: पाश्चर पिपेट trituration और एंजाइमेटिक पाचन द्वारा मैनुअल पृथक्करण के एक संयोजन का उपयोग कर संसाधित निश्चित नमूनों का प्रतिनिधि विश्लेषण। दो नमूनों में से पहला एक साथ संसाधित किया जाता है। (ए) कोशिकाओं का प्रतिशत जो ब्याज की सेलुलर आबादी हैं। (b) ब्याज की आबादी का प्रतिशत जो जीवित कोशिकाएं हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: स्वचालित यांत्रिक पृथक्करण और एंजाइमेटिक पाचन के संयोजन का उपयोग करके संसाधित ताजा नमूनों का प्रतिनिधि विश्लेषण। दो नमूनों में से पहला एक साथ संसाधित किया जाता है। (ए) कोशिकाओं का प्रतिशत जो ब्याज की सेलुलर आबादी हैं। (b) ब्याज की आबादी का प्रतिशत जो जीवित कोशिकाएं हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: स्वचालित यांत्रिक पृथक्करण और एंजाइमेटिक पाचन के संयोजन का उपयोग करके संसाधित किए गए निश्चित नमूनों का प्रतिनिधि विश्लेषण। दो नमूनों में से पहला एक साथ संसाधित किया जाता है। (ए) कोशिकाओं का प्रतिशत जो ब्याज की सेलुलर आबादी हैं। (b) ब्याज की आबादी का प्रतिशत जो जीवित कोशिकाएं हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 1: मैनुअल पाश्चर पिपेट trituration पृथक्करण और एंजाइमेटिक पाचन के संयोजन का उपयोग कर संसाधित निश्चित नमूनों का प्रतिनिधि विश्लेषण। एक साथ संसाधित दो नमूनों में से दूसरा। (ए) कोशिकाओं का प्रतिशत जो ब्याज की सेलुलर आबादी हैं। (b) ब्याज की आबादी का प्रतिशत जो जीवित कोशिकाएं हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक चित्रा 2: स्वचालित यांत्रिक पृथक्करण और एंजाइमेटिक पाचन के संयोजन का उपयोग करके संसाधित ताजा नमूनों का प्रतिनिधि विश्लेषण। एक साथ संसाधित दो नमूनों में से दूसरा। (ए) कोशिकाओं का प्रतिशत जो ब्याज की सेलुलर आबादी हैं। (b) ब्याज की आबादी का प्रतिशत जो जीवित कोशिकाएं हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक चित्रा 3: स्वचालित यांत्रिक पृथक्करण और एंजाइमेटिक पाचन के संयोजन का उपयोग करके संसाधित किए गए निश्चित नमूनों का प्रतिनिधि विश्लेषण। एक साथ संसाधित दो नमूनों में से दूसरा। (ए) कोशिकाओं का प्रतिशत जो ब्याज की सेलुलर आबादी हैं। (b) ब्याज की आबादी का प्रतिशत जो जीवित कोशिकाएं हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक चित्रा 4: स्वचालित यांत्रिक पृथक्करण और एंजाइमेटिक पाचन के संयोजन का उपयोग करके संसाधित दाग और निश्चित नमूनों का प्रतिनिधि विश्लेषण। (ए) कोशिकाओं का प्रतिशत जो ब्याज की सेलुलर आबादी हैं। (b) ब्याज की आबादी का प्रतिशत जो जीवित कोशिकाएं हैं। (C) MBP- कोशिकाएं। (D) PSA-NCAM+ कोशिकाएं (Neuronal Precursor Cells) (ई) एसीएसए 2 + कोशिकाएं (एस्ट्रोसाइट्स)। (एफ) सीडी 31 + कोशिकाएं (एंडोथेलियल)। (जी) CD11b + कोशिकाओं (Microglia). कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 1: धुंधला प्रोटोकॉल. सेल सतह मार्करों के immunostaining के लिए एक नमूना धुंधला प्रोटोकॉल. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 2: अनुकूलित मैनुअल यांत्रिक और एंजाइमेटिक पृथक्करण प्रोटोकॉल। यह विधि पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल21 से अनुकूलित है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

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Discussion

इस तंत्रिका पृथक्करण प्रोटोकॉल में कई चरणों में कुशल तकनीक और निपुणता-परफ्यूजन, supernatant आकांक्षा, और माइलिन हटाने की आवश्यकता होती है। परफ्यूजन प्रक्रिया के दौरान, आंतरिक अंगों को बरकरार रहना चाहिए (डायाफ्राम को हटाने और दिल को काटने के अलावा); इसमें तितली सुई के साथ दिल के ऊपरी कक्षों से बचना शामिल है। जबकि हेपरिन के साथ खारा की मात्रा अलग-अलग होती है, हृदय से बहने वाला पारदर्शी तरल पदार्थ इंगित करता है कि प्रक्रिया पूरी हो गई है। मस्तिष्क को पूरी तरह से और ठीक से perfused होना चाहिए, जिस बिंदु पर यह ऑफ-व्हाइट दिखाई देगा (चित्रा 1)। परफ्यूजन के साथ, लाल रक्त कोशिका हटाने का कदम बाहरी हो जाता है, जिससे नमूनों के अतिरिक्त हेरफेर को समाप्त कर दिया जाता है जिसके परिणामस्वरूप कोशिका हानि हो सकती है। इसके बाद, मलबे को हटाने के चरण को एक स्थिर हाथ की आवश्यकता होती है। डी-पीबीएस ओवरले (चित्रा 3) के बाद स्पष्ट रूप से परिभाषित परतों के परिणामस्वरूप सेंट्रीफ्यूजेशन के लिए, परतों को पारगमन में या पिपेटिंग करते समय परेशान नहीं किया जाना चाहिए। इसके अतिरिक्त, शीर्ष दो परतों को एस्पिरेट करते समय, अत्यधिक सेल मलबे को खत्म करने के लिए पर्याप्त निलंबन को हटा दिया जाना चाहिए, जबकि अभी भी एक बड़े पर्याप्त नमूने को पीछे छोड़ दिया जाना चाहिए। यह एक महत्वपूर्ण कदम है क्योंकि मृत कोशिकाओं को गैर-विशिष्ट रूप से बांधने औरऑटोफ्लोरोसेंट 22,23 बनने की अधिक संभावना है, आगे एक विधि चुनने के महत्व पर जोर दिया जाता है जो लगातार उच्च सेल व्यवहार्यता में परिणाम देता है। अंत में, जब supernatant aspirating, गोली हमेशा दिखाई नहीं दे सकता है. अवशिष्ट supernatant की एक छोटी राशि को यह सुनिश्चित करने के लिए छोड़ दिया जाना चाहिए कि नमूना गलती से छोड़ नहीं दिया गया है।

नमूनों को ठीक करने के फायदे और नुकसान हैं। सभी एंटीबॉडी मार्कर निर्धारण के साथ संगत नहीं हैं, ब्याज की कोशिका आबादी के आधार पर डाउनस्ट्रीम विश्लेषण को सीमित करते हैं। इसके अलावा, अत्यधिक केंद्रित पीएफए का उपयोग करना या समय की विस्तारित अवधि के लिए फिक्सेटिव में कोशिकाओं को छोड़ने के परिणामस्वरूप ऑटोफ्लोरेसेंस और झूठी-सकारात्मक रीडिंग हो सकती है, जिससे परिणाम24,25 भ्रमित हो सकते हैं। 1% पीएफए समाधान का उपयोग करके और कोशिकाओं के जोखिम को कम करने से, झूठी-सकारात्मक रीडिंग की संभावना बहुत कम हो जाती है। चूंकि यह प्रक्रिया विस्तृत है और इसमें कई समय चर हैं, ताजा कोशिकाओं का उपयोग करके प्रयोगशालाओं को यह सुनिश्चित करने के लिए सख्त समय की कमी के तहत रखा जाता है कि कोशिकाएं व्यवहार्य बनी रहें। निर्धारण अगले दिन के विश्लेषण के लिए सेल संरचना को संरक्षित करता है।

एकल-सेल विश्लेषण उपचार प्रभावकारिता, सेल फ़ंक्शन, और रोग या कार्रवाई के उपचार तंत्र में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है। उदाहरण विधियों में एकल-कोशिका डीएनए और आरएनए अनुक्रमण26,27, टाइम-ऑफ-फ्लाइट22,28 द्वारा साइटोमेट्री, फ्लो साइटोमेट्री और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री शामिल हैं। एकल-सेल एमआरएनए अनुक्रमण के साथ, नमूना संग्रह के समय जीन अभिव्यक्ति सेल-प्रकार-विशिष्ट अंतर्दृष्टिप्रदान कर सकती है। उदाहरण के लिए, एक शोध समूह ने डी 1 और डी 2 डोपामाइन रिसेप्टर्स पर एकल-सेल आरएनए अनुक्रमण किया, जो डोरसोमेडियल स्ट्रिएटम27 से मध्यम स्पिनी न्यूरॉन उपप्रकारों को व्यक्त करता है। समूह ने उपन्यास उपप्रकार-विशिष्ट मार्कर जीन का पता लगाकर और जीन की पहचान करके मध्यम स्पिनी न्यूरॉन्स के ट्रांसक्रिप्टोम को फिर से परिभाषित किया, जिन्हें पहले और गलत तरीके से एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन27 की कमी के कारण अलग-अलग रूप से व्यक्त करने की सूचना दी गई थी। हो एट अल ने सेल प्रकार-विशिष्टदवा लक्ष्यों की खोज में एकल-सेल आरएनए अनुक्रमण की क्षमता पर प्रकाश डाला। एकल-कोशिका डीएनए अनुक्रमण के साथ, जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन को डीएनए और हिस्टोन संशोधनों, क्रोमैटिन पहुंच और क्रोमैटिन संरचना26 को मापकर वर्णित किया जा सकता है। एकल नाभिक डीएनए मिथाइलेशन को मापने में, लियू एट अल ने 45 माउस मस्तिष्क क्षेत्रों के एक एकल-सेल डीएनए मेथिलोम एटलस का निर्माण किया और 161 न्यूरोनल सेलप्रकारों की पहचान की। एकल-सेल अनुक्रमण के लिए नमूना तैयारी अधिक जटिल है, विशेष रूप से एकल-कोशिकाओं और मलबे को हटाने का अलगाव। Mattei et al. ने ट्रांसक्रिप्टोमिक और प्रोटियोटाइप प्रोफाइलिंग पर एंजाइमेटिक और यांत्रिक पृथक्करण के प्रभाव की जांच की, यह देखते हुए कि तंत्रिका पृथक्करण विधियां स्वाभाविक रूप से पूर्वाग्रह30 के स्तर को पेश करती हैं। कई समूहों ने कुशलतापूर्वक काम करने, बर्फ पर विच्छेदन करने और ट्रांसक्रिप्शनल अवरोधकों 26,30,31 का उपयोग करने के महत्व को नोट किया है। Mattei et al. ने विश्लेषण30 को सूचित करने के लिए प्रभावित जीन और प्रोटीन की भी पहचान की। हालांकि, ये तकनीकें अभी भी सेलुलर बिल्डिंग ब्लॉकों में विस्तृत अंतर्दृष्टि प्रदान करती हैं जो थोक-ऊतक ट्रांसक्रिप्टोमिक्स26,27 द्वारा बेजोड़ हैं।

फ्लो साइटोमेट्री एक शक्तिशाली विश्लेषणात्मक उपकरण है जो एक साथ फ्लोरोसेंट जांच का उपयोग करके एकल-सेल आबादी के मापदंडों की पहचान और माप सकता है। प्रवाह साइटोमीटर के कुछ अनुप्रयोगों में सेल चक्र विश्लेषण, सेल सॉर्टिंग, व्यवहार्यता, फेनोटाइपिंग, सेल प्रसार और कार्यात्मक विश्लेषण32,33 शामिल हैं। इनमें से अधिकांश अनुप्रयोग सेल सतह प्रोटीन की पहुंच के कारण सतह के दाग का उपयोग करते हैं। इन प्रोटीनों को वंश, विकास के चरण और कार्य19,32,33 के आधार पर विशिष्ट सेल आबादी की पहचान करने के लिए दाग दिया जा सकता है। उदाहरण के लिए, एस्ट्रोसाइट्स, एंडोथेलियल कोशिकाओं, न्यूरोनल अग्रदूत कोशिकाओं और माइक्रोग्लिया34 की आबादी की पहचान करने के लिए नमूनों को सतह पर दाग दिया जा सकता है। एक प्राथमिक लाभ जब जीवित कोशिकाओं की सतह प्रोटीन धुंधला कोशिकाओं को क्रमबद्ध करने में सक्षम किया जा रहा है, जबकि आगे डाउनस्ट्रीम विश्लेषण34 का संचालन करने के विकल्प को बनाए रखने में सक्षम है। जबकि सतह धुंधला तकनीक काफी मानक हैं, इंट्रासेल्युलर धुंधला एक अधिक नाजुक प्रक्रिया है। इंट्रासेल्युलर फ्लो साइटोमेट्री के साथ, एंटीबॉडी को सेल झिल्ली 20,32,33,34 को पार करने की अनुमति देने के लिए धुंधला होने से पहले कोशिकाओं को तय और permeabilized किया जाना चाहिए। आदर्श रूप से, सेल आकृति विज्ञान बरकरार रहेगा; हालांकि, permeabilization प्रोटीन denaturation जोखिम, जो नकारात्मक एंटीबॉडी का पता लगाने22,34 प्रभाव होगा. आगे डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के कुछ तरीके अब एक विकल्प नहीं हैं एक बार कोशिकाओं को20 तय कर रहे हैं। जबकि इंट्रासेल्युलर स्टेनिंग के लिए डाउनसाइड्स सतह के दाग की तुलना में अधिक स्पष्ट होते हैं, पूर्व इंट्रासेल्युलर अणुओं का पता लगाने और विश्लेषण करने की अनुमति देता है जो अन्यथा प्रशंसनीय नहीं होंगे। इसके अतिरिक्त, सेल सतह और इंट्रासेल्युलर स्टेनिंग प्रक्रियाओं को निश्चित रूप से कुछ सेल प्रकारों की पहचान करने या अतिरिक्त मापदंडों का आकलन करने के लिए युग्मित किया जा सकता है 20,28,34।

तंत्रिका पृथक्करण के कई तरीके हैं जिनका उपयोग सेलुलर विश्लेषण के लिए आवश्यक एकल-सेल निलंबन को तैयार करने के लिए किया जा सकता है, हालांकि वे समान रूप से प्रभावी नहीं हैं। मानकीकृत किट और उपर्युक्त तकनीकों की तुलना में, तंत्रिका पृथक्करण की यह विशेष विधि ऊतक की छोटी मात्रा को संसाधित करने के लिए है, एक अत्यधिक व्यवहार्य एकल-सेल निलंबन (>90%) उत्पन्न करती है, और प्रयोग को सुव्यवस्थित करती है। इस प्रोटोकॉल के साथ, अन्य प्रयोगशालाएं एक विश्वसनीय और पुन: प्रस्तुत करने योग्य तरीके से तंत्रिका पृथक्करण करने के लिए सुसज्जित हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम Aimee रोजर्स को हाथों पर प्रशिक्षण और निरंतर उत्पाद समर्थन प्रदान करने के लिए धन्यवाद देते हैं। हम चल रहे समस्या निवारण और स्पष्ट चर्चाओं के लिए डॉ अमांडा बर्क को धन्यवाद देते हैं। हम इस पांडुलिपि के व्याकरणिक संपादन और स्वरूपण के लिए मेरेडिथ जोहेम और यूएएमएस विज्ञान संचार समूह को धन्यवाद देते हैं। इस अध्ययन को NIH R25GM083247 और NIH 1R01CA258673 (A.R.A. ) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Fisher Scientific 02-682-003 Basix, assorted color
15 mL Falcon Tubes Becton Dickinson Labware Europe 352009 Polystyrene
25 mL Serological Pipets Fisher Scientific 14-955-235
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube Falcon 352052
500 mL Vacuum Filter/ Storage Bottle System Corning 431097
70 μm cell strainer Fisher Scientific 08-771-2
Adult Brain Dissociation Kit Miltenyi Biotec  130-107-677 Contains Enzyme P, Buffer Z, Buffer Y, Enzyme A, Buffer A, Debris Removal Solution
Aluminum Foil Fisher Scientific 01-213-105
Anti-ACSA-2-PE-Vio770, mouse, clone REA969 Miltenyi Biotec 130-116-246
Anti-Myelin Basic Protein Sigma-Aldrich M3821-100UG
Anti-PSA-NCAM-PE, human, mouse and rat, Clone 2-2B Miltenyi Biotec 130-117-394
BD LSRFortessa BD
BSA Sigma-Aldrich A7906-50G
CD11b-VioBlue, mouse, Clone REA592 Miltenyi Biotec 130-113-810
CD31 Antibody Miltenyi Biotec 130-111-541
Ceramic Hot Plate Stirrer Fisher Scientific 11-100-100SH
Dimethyl Sulfoxide Fisher Scientific BP231-100
Ethanol Pharmco by Greenfield Global 111000200
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-432-22
Fine Scissors - Sharp Fine Science Tools 14060-09 Perfusion
FlowJo BD (v10.7.0)
gentleMACS C Tubes Miltenyi Biotec 130-093-237
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters Miltenyi Biotec 130-096-427
Gibco DPBS (1X) ThermoFisher Scientific 14190144
Glass Beaker Fisher Scientific 02-555-25A
Heparin sodium Fresenius Kabi 504011
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit ThermoFisher L34965
Magnetic Stir Bar Fisher Scientific 14-513-51
Noyes Spring Scissors Fine Science Tools 15012-12 Dissection
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 441244-3KG Prilled, 95%
Pipette tips GP LTS 20 µL 960A/10 Rainin 30389270
Pipette Tips GP LTS 250 µL 960A/10 Rainin 30389277
Pipette tips RT LTS 1000 µL FL 768A/8 Rainin 30389213
Rainin Pipet-Lite XLS (2, 20, 200, 1000 μL) Rainin 30386597
RBXMO FITC XADS Fisher Scientific A16167
Round Ice Bucket with Lid Fisher Scientific 07-210-129
Round-Bottom Tubes with Cell Strainer Cap Falcon 100-0087
S1 Pipet Fillers ThermoFisher Scientific 9541
Spatula & Probe Fine Science Tools 10090-13 Dissection & Perfusion
Surflo Winged Infusion Set 23 G x 3/4" Termuno SV-23BLK Butterfly needle
Test Tube Rack Fisher Scientific 14-809-37
Thermo Scientific Legend XTR Centrifuge ThermoFisher discontinued Or other standard table top centrifuge
Variable-Flow Peristaltic Pump Fisher Scientific 13-876-2 Low-flow model
VetFlo Starter Kit for Mice Kent Scientific VetFlo-MSEKIT Anesthesia mask, tubing, induction chamber, charcoal canisters
VetFlo Vaporizer Single Channel Anesthesia System Kent Scientific VetFlo-1210S 0.2–4 LPM
Vi-CELL XR Cell Viability Analyzer Beckman Coulter Life Sciences 731196 Cell Counting
Vi-CELL XR 4 Bags of Sample Vials Beckman Coulter Life Sciences 383721 Cell Counting

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 176
माउस मस्तिष्क हिप्पोकैम्पस ऊतक के संयुक्त यांत्रिक और एंजाइमेटिक पृथक्करण
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Trujillo, M., McElroy, T., Brown, T., Simmons, P., Ntagwabira, F., Allen, A. R. Combined Mechanical and Enzymatic Dissociation of Mouse Brain Hippocampal Tissue. J. Vis. Exp. (176), e63007, doi:10.3791/63007 (2021).

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