Summary
Este protocolo de disociación de células neuronales está destinado a muestras con una baja cantidad de material de partida y produce una suspensión unicelular altamente viable para el análisis posterior, con pasos opcionales de fijación y tinción.
Abstract
Este protocolo de disociación neuronal (una adaptación del protocolo que acompaña a un kit comercial de disociación cerebral adulta) optimiza el procesamiento de tejidos en preparación para análisis detallados aguas abajo, como la citometría de flujo o la secuenciación de una sola célula. La disociación neuronal se puede llevar a cabo a través de la disociación mecánica (como el uso de filtros, técnicas de corte o trituración de pipetas), digestión enzimática o una combinación de las mismas. La naturaleza delicada de las células neuronales puede complicar los esfuerzos para obtener la suspensión unicelular verdadera y altamente viable con un mínimo de desechos celulares que se requiere para el análisis de una sola célula. Los datos demuestran que esta combinación de disociación mecánica automatizada y digestión enzimática produce consistentemente una suspensión unicelular altamente viable (>90%), superando las dificultades antes mencionadas. Si bien algunos de los pasos requieren destreza manual, estos pasos disminuyen el manejo de muestras y la posible pérdida de células. Este manuscrito detalla cada paso del proceso para equipar a otros laboratorios para disociar con éxito pequeñas cantidades de tejido neural en preparación para el análisis posterior.
Introduction
El hipocampo fue descrito por primera vez por un anatomista boloñés, Giulio Cesare Aranzio, en la década de 15001. Al nombrar esta nueva estructura, Aranzio probablemente se inspiró en su extraño parecido con el caballito de mar del género Hippocampus1. El hipocampo está involucrado en las respuestas al estrés, pero es ampliamente conocido por su papel en el aprendizaje y la memoria. Más específicamente, el hipocampo es responsable de la codificación y recuperación de la memoria declarativa y espacial1.
El hipocampo, o hipocampo propiamente dicho, se divide en los subcampos CA1 (cornu ammonis), CA2 y CA31. En comparación con el resto del sistema nervioso, el hipocampo tiene varias características definitorias únicas, incluida su plasticidad y potencial para la neurogénesis en curso2. La neurogénesis es el proceso de proliferación y diferenciación de las células madre neurales, seguido de su integración en la red neuronal preexistente. La neurogénesis se restringe a la zona subgranular del giro dentado y a la zona subventricular de los ventrículos laterales (y los bulbos olfativos)3. Si bien la neurogénesis es abundante en la embriogénesis, es un proceso de por vida 3,4. Como tal, esta discusión se centrará en la neurogénesis adulta en el hipocampo.
Las zonas subventricular y subgranular son nichos neurogénicos que contienen células ependimarias y vasculares, así como linajes inmaduros y maduros de células madre neurales5. La microglía contribuye a estos nichos como células inmunes para regular la neurogénesis6. Las células progenitoras neurales son progenies de células no madre de células madre neurales7. Tres tipos de progenitores neurales están presentes en la zona subventricular: células tipo B similares a la glía radial, progenitores amplificadores de tránsito tipo C y neuroblastos tipo A 3,8. Las células progenitoras neurales tipo B que se dividen lentamente en la zona subventricular pueden diferenciarse en células tipo C que se dividen rápidamente8. Posteriormente, las células de tipo C se diferencian en células de tipo A8. Estos neuroblastos migran a través de la corriente migratoria rostral hasta el bulbo olfatorio antes de diferenciarse en interneuronas u oligodendrocitos9. Estas interneuronas del bulbo olfatorio son clave para la memoria olfativa a corto plazo y el aprendizaje asociativo, mientras que los oligodendrocitos mielinizan los axones del cuerpo calloso9. La mayoría de la neurogénesis adulta ocurre en la zona subgranular del giro dentado, donde se encuentran progenitores neurales radiales tipo 1 y no radiales tipo 23. La mayoría de las células progenitoras neurales están destinadas a convertirse en neuronas granulosas dentadas y astrocitos10. Conectados por uniones de brecha, los astrocitos forman redes para modular la plasticidad, la actividad sináptica y la excitabilidad neuronal5. Como neurona excitadora primaria del giro dentado, las células granulares proporcionan entrada desde la corteza entorrinal a la región CA311.
Las poblaciones de células madre neurales pueden aislarse utilizando estrategias de aislamiento inmunomagnético o inmunofluorescente12,13. El tejido neural es particularmente difícil de disociar; los esfuerzos para hacerlo a menudo resultan en muestras con poca viabilidad celular y / o no producen la suspensión de una sola célula necesaria para el análisis posterior. La disociación neuronal se puede realizar a través de la disociación mecánica (como el uso de filtros, técnicas de corte o trituración de pipetas), digestión enzimática o una combinación de técnicas14,15. En un estudio que evaluó los métodos de disociación neural, se comparó la viabilidad y calidad de la disociación mecánica manual por trituración de pipetas versus combinaciones de trituración de pipetas y digestión con diversas enzimas15. La calidad se calificó en función de la cantidad de grupos celulares y ADN o restos subcelulares en la suspensión preparada15. Las suspensiones de tumores gliales sometidos a disociación mecánica manual sola tuvieron una viabilidad celular significativamente menor que los tratamientos con dispasa o una combinación de DNasa, colagenasa e hialuronidasa15. Volovitz et al. reconocieron la variación en viabilidad y calidad entre los diferentes métodos y enfatizaron que una disociación inadecuada puede reducir la precisión del análisis aguas abajo15.
En un estudio separado, los autores compararon más de 60 métodos y combinaciones diferentes de disociación de células neuronales cultivadas14. Estos métodos incluyeron ocho variaciones diferentes de disociación mecánica manual por trituración de pipetas, una comparación de la incubación con cinco enzimas individuales a tres intervalos diferentes y varias combinaciones de disociación mecánica con digestión enzimática o la combinación de dos enzimas14. Ninguno de los métodos mecánicos produjo una suspensión de una sola célula14. Cuatro de los tratamientos de enzima única, diez de los tratamientos enzimáticos combinados y cuatro de las combinaciones de disociación mecánica con digestión enzimática produjeron una suspensión de una sola célula14. La digestión enzimática con TrypLE seguida de las muestras disociadas de Tripsina-EDTA de manera más efectiva14. Por cierto, las muestras tratadas con TrypLE y/o Tripsina-EDTA tendían a formar grupos gelatinosos14. Si bien este estudio se realizó en células cultivadas, habla de las deficiencias de la trituración de pipetas o la digestión enzimática sola.
Faltan comparaciones lado a lado de la disociación mecánica manual versus automatizada. Sin embargo, un grupo ejecutó la citometría de flujo para comparar la disociación mecánica manual y semiautomatizada de cerebros de ratones enteros junto con kits de disociación enzimática de papaína comercial o tripsina16. El procesamiento con el disociador produjo células viables de manera más consistente16. Después de la disociación, los autores también aislaron células prominina-1, células precursoras neuronales y microglia16. Para dos de las tres poblaciones de células aisladas, la pureza de las células aisladas fue ligeramente mayor cuando las muestras se procesaron con el disociador, en comparación con16 manualmente. Reiß et al. señalaron que la variabilidad de persona a persona en la técnica de pipeteo dificulta la reproducibilidad del rendimiento de la población celular viable en la disociación tisular16. Los autores concluyeron que la disociación mecánica automatizada estandariza el procesamiento de muestras16.
El método de disociación descrito en este manuscrito es una combinación de disociación mecánica totalmente automatizada y digestión enzimática, utilizando soluciones que acompañan a un kit comercial de disociación cerebral adulta17. A diferencia de los protocolos estándar, este protocolo optimizado reduce la manipulación de muestras, produce una suspensión unicelular altamente viable y está destinado a procesar cantidades mínimas de tejido de partida.
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Protocol
Los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con los estándares éticos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en UAMS. Se compraron ratones hembra C57Bl6 / J de 6 meses de edad y se alojaron en grupo (4 ratones por jaula) bajo un ciclo constante de luz / oscuridad de 12 h.
1. Preparación de reactivos
- Prepare una solución reparable de material de manchas vivas / muertas. Reconstituir la tinción fluorescente con 20 μL de dimetilsulfóxido (DMSO).
- Envuelva el vial en papel de aluminio, etiquételo como "Reconstituido" y guárdelo a -20 °C durante un máximo de seis meses.
- Prepare una solución salina al 0,9% con heparina. Diluir el contenido de un vial de heparina sódica (10.000 unidades USP por 10 ml) en 1 L de agua doble destilada (ddH2O).
- Prepare lo suficiente para aproximadamente 45 ml por animal y guárdelo a 4 ° C durante un máximo de una semana.
- Haga 1% de paraformaldehído (PFA).
- En una campana extractora de humos, caliente una placa caliente a 50 °C. En un microondas, caliente 100 ml de ddH2O en un vaso de precipitados de vidrio a aproximadamente 60 °C. Agregue una barra de agitación magnética y transfiérala a la placa caliente.
- En la campana de humos, pesar 1 g de PFA y añadir al vaso de precipitados de ddH2O. Añadir 0,1125 g de cristales de NaOH y mezclar hasta que se disuelva (5-10 min).
- Añadir 0,4 g de NaPO4- monobásica y mezclar hasta disolver (2-5 min). Filtre al vacío la solución y ajuste el pH a 7.4 con HCl y NaOH.
- Enfríe sobre hielo o a 4°C durante 30 min antes de almacenar.
NOTA: Las alícuotas de 1,5 ml se pueden almacenar a -20 °C durante un año. Evite los ciclos de congelación-descongelación. Si, después de la descongelación, la solución se vuelve turbia o se ha formado un precipitado, no se debe usar la solución.
PRECAUCIÓN: Tóxico, inflamable. Siempre trabaje con PFA debajo de una capucha ventilada usando el equipo de protección personal adecuado.
- Resuspend enzima liofilizada A con 1 mL de tampón A. No vórtice la solución.
NOTA: La enzima A y el tampón A, así como los tampones A, Y y Z son reactivos en el kit comercial de disociación cerebral para adultos17. - Divida la enzima P en alícuotas de 50 μL y resuspenda la enzima A en alícuotas de 10 μL. Según las instrucciones del kit, conservar a -20 °C durante un máximo de seis meses. Evite los ciclos de congelación-descongelación.
2. Día del experimento
- Enfríe la centrífuga de mesa a 4 °C.
- Coloque la(s) alícuota(s) de PFA en el refrigerador para descongelar gradualmente.
- Coloque la mancha viva/muerta reconstituida en la oscuridad (por ejemplo, un cajón) para descongelarla a temperatura ambiente.
- Preparar el tampón de albúmina sérica bovina (BSA). Añadir 0,5 g de BSA a 100 ml de 1 solución tamponada con fosfato de Dulbecco sin calcio y magnesio (D-PBS), pH 7,2.
- Agregue una barra de agitación y mezcle en un plato de agitación durante 30 minutos. Transferir a tubos cónicos de 50 ml y conservar a 4 °C.
NOTA: Utilice siempre un búfer BSA recién preparado. - Prepare la dilución de trabajo de manchas vivas / muertas. Añadir 1 μL de la solución reconstituida de material de tinción viva/muerta a 360 μL de D-PBS y almacenarla en la oscuridad (por ejemplo, un cajón o una caja) a temperatura ambiente. Preparar 50 μL de la dilución de trabajo por muestra.
3. Perfusión
- Coloque la solución salina con heparina sobre hielo.
- Encienda el oxígeno, ajuste la bola indicadora del medidor de flujo en el sistema de vaporizador de anestesia de animales pequeños a 1 L / min. Asegúrese de que haya una presión de oxígeno e isoflurano adecuadas.
- Ajuste el dial del vaporizador al 3,5% (para inducción y mantenimiento).
- Imprima las líneas de la bomba de perfusión con la solución salina/heparina. Ajuste la velocidad a 6 ml/min.
- Coloque el ratón en la cámara de inducción, encienda el respirador y espere varios minutos hasta que el ratón no responda. Confirme la profundidad suficiente de la anestesia a través de la ausencia de retirada del pedal a pellizco nocivo.
- Coloque el ratón sobre su espalda en la bandeja de disección con la nariz en el cono de la nariz. Realizar una confirmación secundaria de anestesia completa a través de la ausencia de retirada del pedal a pellizco nocivo. Fije las cuatro patas a la bandeja.
- Rocíe el abdomen del animal con etanol al 20%.
- Usando fórceps, pellizque la parte inferior del abdomen y levante la piel. Use tijeras para cortar a través de la piel y la piel hasta la parte inferior de la caja torácica.
- Haga dos incisiones diagonales desde debajo de la caja torácica hacia cada hombro.
- Reseque cuidadosamente el diafragma (evitando los pulmones y el corazón). Reseque la caja torácica para exponer el corazón.
- Corte cuidadosamente cualquier tejido conectivo alrededor del corazón.
NOTA: Los pasos 3.10-3.11 son críticos; realizar con competencia y destreza. - Use las tijeras para sujetar la aurícula derecha (lóbulo oscuro en la parte superior izquierda del corazón). Apague el flujo de isoflurano al respirador.
- Mantenga el corazón firme con fórceps. Con el bisel de la aguja de mariposa hacia arriba, perfore el ventrículo izquierdo mientras mantiene la aguja nivelada y paralela al animal.
- Mantenga la aguja en su lugar, encienda la bomba y perfunda al menos 30 ml de la solución salina/heparina hasta que el líquido que sale del corazón sea opaco y el hígado y los pulmones de color pálido.
NOTA: Los pasos 3.13-3.14 son críticos; realizar con competencia y destreza. - Apague la bomba, retire la aguja y transfiera el ratón al área de disección.
4. Disección
- Usando tijeras quirúrgicas grandes, decapita la cabeza.
- Corta el pelaje desde la parte posterior de la cabeza hasta los ojos. Pelar la piel hacia atrás para exponer el cráneo.
- Recorta el cráneo entre los ojos. Haga dos cortes en la parte posterior del cráneo, en las posiciones de las 10 y las 2 en punto, luego haga un corte largo (mantenga las puntas altas para evitar dañar el cerebro) a lo largo de la línea media sagital del cráneo hasta el corte original entre los ojos.
- Use fórceps para pelar las dos mitades del cráneo hacia los lados. Use una espátula para extraer el cerebro y colóquelo en una placa de Petri de vidrio de 60 mm sobre hielo lleno de D-PBS frío (Figura 1).
- Use un bisturí o una maquinilla de afeitar para separar cada hemisferio. Luego retire los bulbos olfativos y el cerebelo.
- Use fórceps para extraer el mesencéfalo hasta que el hipocampo esté expuesto.
- Asegure el cerebro con fórceps. Usando un segundo juego de fórceps, saque suavemente el hipocampo de cada hemisferio y transfiera ambos hipocampos a un tubo etiquetado de 1.5 ml que contenga D-PBS frío.
- Coloque el tubo de muestra que contiene los dos hipocampos del ratón sobre hielo.
5. Prepare la mezcla de enzimas 1 y 2 para cada muestra
NOTA: Para volúmenes superiores a 2 ml, utilice una pipeta serológica de 10 ml; para volúmenes, 200 μL-2 mL, use una pipeta de 1000 μL; para volúmenes, 21-199 μL, use una pipeta de 200 μL; para volúmenes, 2-20 μL, use una pipeta de 20 μL; para volúmenes inferiores a 2 μL, utilice una pipeta de 0-2 μL.
- Para cada muestra, descongele una alícuota de cada una de las enzimas P y A a temperatura ambiente.
- Para la mezcla de enzimas 1, combine 50 μL de enzima P y 1900 μL de tampón Z en un tubo C etiquetado (Tabla de materiales).
- Para la mezcla de enzimas 2, agregue 20 μL de tampón Y a la alícuota descongelada de 10 μL de la enzima A.
6. Protocolo de disociación cerebral en adultos17
NOTA: Cuando se trabaja con muestras, los tubos deben colocarse en un bastidor de tubos a temperatura ambiente mientras BSA y D-PBS permanecen en hielo a menos que se indique lo contrario.
- Encienda el disociador.
- Use fórceps para transferir las piezas de tejido del hipocampo al tubo C.
- Transfiera 30 μL de la mezcla de enzimas 2 en el tubo C. Gire la tapa hasta que se sienta la tensión, luego apriete hasta que haga clic.
- Coloque el tubo C boca abajo en una posición del disociador; a la muestra se le asignará el estado Seleccionado (Figura 2). Asegure el calentador sobre el tubo C.
- Presione el icono de carpeta, seleccione la carpeta Favoritos , desplácese y seleccione el 37C_ABDK_02 programa. Haga clic en Aceptar para aplicar el programa a todos los tubos C seleccionados, luego toque Inicio (Figura 2).
- Etiquete un tubo cónico de 50 ml por muestra.
- Coloque un colador celular de 70 μm en cada tubo cónico de 50 ml y humedezca con 2 ml de tampón BSA.
- Al finalizar el programa, retire el calentador y el tubo C del disociador.
- Agregue 4 ml de tampón BSA a la muestra y aplique la mezcla al colador celular en el tubo cónico de 50 ml.
- Agregue 10 ml de D-PBS al tubo C, ciérrelo y agite la solución suavemente. Aplíquelo al colador celular en el tubo cónico de 50 ml.
- Deseche el colador celular y el tubo C. Centrifugar la suspensión a 300 x g durante 10 min a 4 °C. Luego, aspira y descarta el sobrenadante.
7. Eliminación de escombros
- Resuspender el pellet con 1550 μL de D-PBS frío y transferir la suspensión a un tubo cónico de 15 ml marcado.
- Agregue 450 μL de solución de eliminación de escombros en frío y pipete hacia arriba y hacia abajo (no vórtice).
NOTA: Debris Removal Solution es un reactivo en el comercial Adult Brian Dissociation Kit17. - Superponga suavemente 1 ml de D-PBS frío sobre la suspensión celular, manteniendo la punta contra la pared del tubo cónico. Repita hasta que la superposición total sea de 2 ml.
NOTA: Este paso es crítico; realizar con competencia y destreza. - Centrífuga a 3000 x g durante 10 min a 4 °C con aceleración completa y freno completo.
NOTA: Si las fases no están claramente separadas, repita los pasos 7.2-7.3. Centrifugar una última vez a 1000 x g durante 10 min a 4 °C. - La suspensión ahora debe consistir en tres capas distintas (Figura 3). Aspira la capa superior. Barre la punta de la pipeta hacia adelante y hacia atrás para aspirar la capa media blanca. Retire la mayor cantidad posible de la capa intermedia sin perturbar la capa inferior.
NOTA: Este paso es crítico; realizar con competencia y destreza. - Agregue 2 ml de D-PBS frío y pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar.
- Centrífuga a 1000 x g durante 10 min a 4 °C con aceleración completa y freno completo. Aspirar y desechar el sobrenadante. Resuspend el pellet en 1 ml de tampón BSA.
NOTA: Las células se pueden resuspendir en el búfer apropiado y luego etiquetarse magnéticamente y aislarse en preparación para la secuenciación de una sola célula en este punto.
8. Recuento de células
- Realice el conteo de celdas según el protocolo del fabricante del contador de celdas disponible (una opción se indica en la Tabla de materiales)
9. Mancha viva/muerta
- Centrifuga los 900 μL restantes (desde 7,7) a 1000 x g durante 10 min a 4 °C con aceleración completa y freno completo.
- Mientras la muestra está girando, etiquete un tubo de flujo por muestra y envuélvalo en papel de aluminio para limitar la exposición a la luz.
- Aspirar y desechar el sobrenadante.
- Resuspendir el pellet en 50 μL de tinción viva/muerta diluida (previamente preparada).
NOTA: Este paso debe realizarse en un entorno con poca luz. Apague las luces superiores de la habitación para lograr esto. - Transfiera cada muestra al tubo de flujo etiquetado correspondiente e incube a temperatura ambiente durante 8-10 minutos en la oscuridad (por ejemplo, un cajón o caja).
- Añadir 500 μL de tampón BSA y centrífuga a 1000 x g durante 10 min a 4 °C con aceleración completa y freno completo.
- Aspirar y desechar el sobrenadante.
NOTA: El pellet puede no ser visible; deje una pequeña cantidad de tampón para no aspirar involuntariamente el pellet. Las células pueden ser resuspendidas en el tampón apropiado, bloqueadas y teñidas con anticuerpos específicos de la célula en este punto. Consulte el archivo complementario 1 para ver el protocolo deejemplo 18.
10. Fijación (opcional)
- Resuspendir el pellet en 200 μL de PFA al 1% (previamente preparado). Incubar durante 15 min a 4 °C.
- Lavar añadiendo 500 μL de D-PBS y centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 °C.
- Aspirar el sobrenadante.
NOTA: El pellet puede no ser visible; deje una pequeña cantidad de tampón para no aspirar involuntariamente el pellet. - Vuelva a suspender el pellet en 200 μL de D-PBS y guárdelo a 4 °C durante un máximo de 3 días.
11. Citometría de flujo
- Etiquete las tapas del filtro en los tubos nuevos.
- Usando una pipeta de 1 ml, pipetee cada muestra en la tapa del filtro.
- Centrifugar brevemente a 200 x g a 4 °C, solo permitiendo que la centrífuga alcance los 200 x g antes de detener la carrera.
- Proceda al núcleo de citometría de flujo para el análisis aguas abajo.
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Representative Results
Las muestras se procesaron con un citómetro de flujo en una instalación central, y los datos resultantes se evaluaron con un paquete de software para el análisis de flujo. Anteriormente, se analizaron los controles de compensación: la mancha viva / muerta y el control negativo. Si se utilizan múltiples fluorocromos, se deben preparar controles de fluorescencia menos uno (FMO) y controles de tinción única para cada anticuerpo. La compensación por superposición espectral para las muestras experimentales se calculó en función de los controles analizados. Para la identificación de la población celular se utilizó una estrategia de cierre jerárquico. La compuerta primaria excluyó los escombros en la gráfica de dispersión hacia adelante (tamaño de la celda) frente a la dispersión lateral (granularidad)19,20. Posteriormente, se excluyeron las células muertas (Figura 4, Figura 5, Figura 6, Figura suplementaria 1, Figura suplementaria 2, Figura suplementaria 3 y Figura suplementaria 4). La siguiente puerta excluyó las células positivas para la proteína básica de mielina (Figura suplementaria 4). De las células restantes, se crearon diagramas de densidad de células positivas para cada fluorocromo (Figura suplementaria 4). La frecuencia de cada población de células neuronales se calculó a partir de la tercera puerta (Figura suplementaria 4). Las muestras que se procesaron con disociación mecánica manual21 y digestión enzimática produjeron una población sustancialmente menor de células de interés (Expediente Suplementario 221, Figura 4 y Figura Suplementaria 1). Por el contrario, tanto las muestras fijas como las frescas preparadas a través de la disociación mecánica automatizada y la digestión enzimática devolvieron una población de células de interés varias veces más grande (Figura 5, Figura 6, Figura suplementaria 2 y Figura suplementaria 3).
Figura 1: Cerebro de ratón. (A) Correctamente perfundido. (B) No perfundido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Estado seleccionado en el paso 6.4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Suspensión de tres capas en el paso 7.5: Búfer (capa superior), restos de celdas, solución de eliminación de escombros y celdas (capa inferior). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Análisis representativo de muestras fijas procesadas mediante una combinación de disociación manual por trituración de pipetas Pasteur y digestión enzimática. Primera de dos muestras procesadas simultáneamente. (A) Porcentaje de células que son la población celular de interés. (B) Porcentaje de la población de interés que son células vivas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Análisis representativo de muestras frescas procesadas mediante una combinación de disociación mecánica automatizada y digestión enzimática. Primera de dos muestras procesadas simultáneamente. (A) Porcentaje de células que son la población celular de interés. (B) Porcentaje de la población de interés que son células vivas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Análisis representativo de muestras fijas procesadas mediante una combinación de disociación mecánica automatizada y digestión enzimática. Primera de dos muestras procesadas simultáneamente. (A) Porcentaje de células que son la población celular de interés. (B) Porcentaje de la población de interés que son células vivas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura suplementaria 1: Análisis representativo de muestras fijas procesadas mediante una combinación de disociación manual de trituración de pipetas Pasteur y digestión enzimática. Segunda de dos muestras procesadas simultáneamente. (A) Porcentaje de células que son la población celular de interés. (B) Porcentaje de la población de interés que son células vivas. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria 2: Análisis representativo de muestras frescas procesadas mediante una combinación de disociación mecánica automatizada y digestión enzimática. Segunda de dos muestras procesadas simultáneamente. (A) Porcentaje de células que son la población celular de interés. (B) Porcentaje de la población de interés que son células vivas. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria 3: Análisis representativo de muestras fijas procesadas utilizando una combinación de disociación mecánica automatizada y digestión enzimática. Segunda de dos muestras procesadas simultáneamente. (A) Porcentaje de células que son la población celular de interés. (B) Porcentaje de la población de interés que son células vivas. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria 4: Análisis representativo de muestras teñidas y fijas procesadas mediante una combinación de disociación mecánica automatizada y digestión enzimática. (A) Porcentaje de células que son la población celular de interés. (B) Porcentaje de la población de interés que son células vivas. (C). MBP- Células. (D). Células PSA-NCAM+ (Células Precursoras Neuronales). (E). Células ACSA2+ (Astrocitos). (F). Células CD31+ (endotelial). (G). Células CD11b+ (Microglia). Haga clic aquí para descargar este archivo.
Expediente complementario 1: Protocolo de tinción. Un protocolo de tinción de muestras para la inmunotinción de marcadores de superficie celular. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Expediente complementario 2: Protocolo de disociación mecánica y enzimática manual adaptado. Este método está adaptado de un protocolo publicado anteriormente21. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Varios pasos en este protocolo de disociación neuronal requieren una técnica competente y destreza: perfusión, aspiración sobrenadante y eliminación de mielina. Durante todo el proceso de perfusión, los órganos internos deben permanecer intactos (aparte de extirpar el diafragma y recortar el corazón); esto incluye evitar las cámaras superiores del corazón con la aguja de mariposa. Si bien la cantidad de solución salina con heparina necesaria varía, el líquido transparente que fluye desde el corazón indica que el proceso está completo. El cerebro debe estar completa y adecuadamente perfundido, momento en el que aparecerá blanquecino (Figura 1). Con la perfusión, el paso de eliminación de glóbulos rojos se vuelve extraño, eliminando el exceso de manipulación de las muestras que puede resultar en la pérdida de células. Posteriormente, el paso de eliminación de escombros requiere una mano firme. Para que la centrifugación dé lugar a capas claramente definidas siguiendo la superposición D-PBS (Figura 3), las capas no deben ser perturbadas en tránsito o durante el pipeteo. Además, al aspirar las dos capas superiores, se debe quitar suficiente suspensión para eliminar los desechos celulares excesivos y dejar una muestra lo suficientemente grande detrás. Este es un paso clave ya que es más probable que las células muertas se unan de manera no específica y se conviertan en autofluorescentes 22,23, enfatizando aún más la importancia de elegir un método que resulte consistentemente en una alta viabilidad celular. Finalmente, al aspirar el sobrenadante, el pellet puede no ser siempre visible. Se debe dejar una pequeña cantidad de sobrenadante residual para garantizar que la muestra no se descarte accidentalmente.
Hay ventajas y desventajas de fijar las muestras. No todos los marcadores de anticuerpos son compatibles con la fijación, lo que limita el análisis posterior en función de las poblaciones celulares de interés. Además, el uso de PFA excesivamente concentrado o dejar las células en el fijador durante un período prolongado de tiempo puede resultar en autofluorescencia y lecturas de falsos positivos, confundiendo así los resultados24,25. Al usar una solución de PFA al 1% y minimizar la exposición de las células, la probabilidad de lecturas de falsos positivos se reduce considerablemente. Como este procedimiento es detallado y tiene muchas variables de tiempo, el uso de células nuevas coloca a los laboratorios bajo estrictas limitaciones de tiempo para garantizar que las células permanezcan viables. La fijación conserva la estructura celular para el análisis al día siguiente.
El análisis de una sola célula puede proporcionar información clave sobre la eficacia del tratamiento, la función celular y la enfermedad o los mecanismos de acción del tratamiento. Los métodos de ejemplo incluyen secuenciación de ADN unicelular y ARN 26,27, citometría por tiempo de vuelo 22,28, citometría de flujo e inmunohistoquímica. Con la secuenciación de ARNm unicelular, la expresión génica en el momento de la recolección de muestras puede proporcionar información específica sobre el tipo de célula26. Por ejemplo, un grupo de investigación realizó la secuenciación de ARN unicelular en receptores de dopamina D1 y D2 que expresan subtipos de neuronas espinosas medianas del estriado dorsomedial27. El grupo redefinió el transcriptoma de las neuronas espinosas medianas mediante la detección de nuevos genes marcadores específicos de subtipos e identificando genes que se informó previa e incorrectamente que se expresaban diferencialmente debido a la falta de resolución de una sola célula27. Ho et al. destacaron el potencial de la secuenciación de ARN unicelular en el descubrimiento de dianas farmacológicas específicas de tipo celular27. Con la secuenciación del ADN unicelular, los cambios en la expresión génica se pueden describir midiendo las modificaciones del ADN y las histonas, la accesibilidad a la cromatina y la conformación de la cromatina26. Al medir la metilación del ADN de un solo núcleo, Liu et al. construyeron un atlas de metiloma de ADN unicelular de 45 regiones cerebrales de ratón e identificaron 161 tipos de células neuronales29. La preparación de muestras para la secuenciación de una sola célula es más intrincada, especialmente el aislamiento de células individuales y la eliminación de escombros. Mattei et al. examinaron el efecto de la disociación enzimática y mecánica sobre el perfil transcriptómico y proteotipo, señalando que los métodos de disociación neuronal introducen inherentemente un nivel de sesgo30. Varios grupos han señalado la importancia de trabajar eficientemente, diseccionar sobre hielo y utilizar inhibidores transcripcionales 26,30,31. Mattei et al. también identificaron genes y proteínas afectadas para informar el análisis30. Sin embargo, estas técnicas aún proporcionan información detallada sobre los bloques de construcción celular que no tienen comparación con la transcriptómica de tejidos a granel26,27.
La citometría de flujo es una poderosa herramienta analítica que puede identificar y medir simultáneamente parámetros de poblaciones unicelulares utilizando sondas fluorescentes. Algunas aplicaciones de los citómetros de flujo incluyen el análisis del ciclo celular, la clasificación celular, la viabilidad, el fenotipado, la proliferación celular y los análisis funcionales32,33. La mayoría de estas aplicaciones utilizan la tinción superficial debido a la accesibilidad de las proteínas de la superficie celular. Estas proteínas se pueden teñir para identificar poblaciones celulares específicas basadas en el linaje, la etapa de desarrollo y la función 19,32,33. Por ejemplo, las muestras se pueden teñir en la superficie para identificar poblaciones de astrocitos, células endoteliales, células precursoras neuronales y microglia34. Una ventaja principal al teñir proteínas de superficie de células vivas es poder clasificar las células mientras se conserva la opción de realizar más análisis aguas abajo34. Si bien las técnicas de tinción superficial son bastante estándar, la tinción intracelular es un procedimiento más delicado. Con la citometría de flujo intracelular, las células deben fijarse y permeabilizarse antes de teñirse para permitir que el anticuerpo atraviese la membrana celular 20,32,33,34. Idealmente, la morfología celular permanecerá intacta; sin embargo, la permeabilización corre el riesgo de desnaturalización de proteínas, lo que afectaría negativamente la detección de anticuerpos22,34. Algunos métodos de análisis posterior ya no son una opción una vez que las células se fijan20. Si bien las desventajas de la tinción intracelular son más pronunciadas que la tinción superficial, la primera permite la detección y el análisis de moléculas intracelulares que de otro modo no serían plausibles. Además, los procedimientos de tinción intracelular y de superficie celular pueden acoplarse para identificar definitivamente ciertos tipos de células o evaluar parámetros adicionales simultáneamente 20,28,34.
Hay varios métodos de disociación neural que se pueden utilizar para preparar la suspensión unicelular requerida para el análisis celular, aunque no son igualmente efectivos. En comparación con los kits estandarizados y las técnicas antes mencionadas, este método particular de disociación neuronal está destinado a procesar pequeñas cantidades de tejido, produce una suspensión unicelular altamente viable (>90%) y agiliza el experimento. Con este protocolo, otros laboratorios están equipados para realizar la disociación neuronal de una manera confiable y reproducible.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Aimee Rogers por proporcionar capacitación práctica y soporte continuo del producto. Agradecemos a la Dra. Amanda Burke por la solución de problemas en curso y las discusiones aclaratorias. Agradecemos a Meredith Joheim y al Grupo de Comunicación Científica de la UAMS por la edición gramatical y el formato de este manuscrito. Este estudio fue apoyado por NIH R25GM083247 y NIH 1R01CA258673 (A.R.A).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 02-682-003 | Basix, assorted color |
| 15 mL Falcon Tubes | Becton Dickinson Labware Europe | 352009 | Polystyrene |
| 25 mL Serological Pipets | Fisher Scientific | 14-955-235 | |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Falcon | 352052 | |
| 500 mL Vacuum Filter/ Storage Bottle System | Corning | 431097 | |
| 70 μm cell strainer | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Adult Brain Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-107-677 | Contains Enzyme P, Buffer Z, Buffer Y, Enzyme A, Buffer A, Debris Removal Solution |
| Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-105 | |
| Anti-ACSA-2-PE-Vio770, mouse, clone REA969 | Miltenyi Biotec | 130-116-246 | |
| Anti-Myelin Basic Protein | Sigma-Aldrich | M3821-100UG | |
| Anti-PSA-NCAM-PE, human, mouse and rat, Clone 2-2B | Miltenyi Biotec | 130-117-394 | |
| BD LSRFortessa | BD | ||
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906-50G | |
| CD11b-VioBlue, mouse, Clone REA592 | Miltenyi Biotec | 130-113-810 | |
| CD31 Antibody | Miltenyi Biotec | 130-111-541 | |
| Ceramic Hot Plate Stirrer | Fisher Scientific | 11-100-100SH | |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Ethanol | Pharmco by Greenfield Global | 111000200 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Fine Scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | Perfusion |
| FlowJo | BD | (v10.7.0) | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Gibco DPBS (1X) | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| Glass Beaker | Fisher Scientific | 02-555-25A | |
| Heparin sodium | Fresenius Kabi | 504011 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher | L34965 | |
| Magnetic Stir Bar | Fisher Scientific | 14-513-51 | |
| Noyes Spring Scissors | Fine Science Tools | 15012-12 | Dissection |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 441244-3KG | Prilled, 95% |
| Pipette tips GP LTS 20 µL 960A/10 | Rainin | 30389270 | |
| Pipette Tips GP LTS 250 µL 960A/10 | Rainin | 30389277 | |
| Pipette tips RT LTS 1000 µL FL 768A/8 | Rainin | 30389213 | |
| Rainin Pipet-Lite XLS (2, 20, 200, 1000 μL) | Rainin | 30386597 | |
| RBXMO FITC XADS | Fisher Scientific | A16167 | |
| Round Ice Bucket with Lid | Fisher Scientific | 07-210-129 | |
| Round-Bottom Tubes with Cell Strainer Cap | Falcon | 100-0087 | |
| S1 Pipet Fillers | ThermoFisher Scientific | 9541 | |
| Spatula & Probe | Fine Science Tools | 10090-13 | Dissection & Perfusion |
| Surflo Winged Infusion Set 23 G x 3/4" | Termuno | SV-23BLK | Butterfly needle |
| Test Tube Rack | Fisher Scientific | 14-809-37 | |
| Thermo Scientific Legend XTR Centrifuge | ThermoFisher | discontinued | Or other standard table top centrifuge |
| Variable-Flow Peristaltic Pump | Fisher Scientific | 13-876-2 | Low-flow model |
| VetFlo Starter Kit for Mice | Kent Scientific | VetFlo-MSEKIT | Anesthesia mask, tubing, induction chamber, charcoal canisters |
| VetFlo Vaporizer Single Channel Anesthesia System | Kent Scientific | VetFlo-1210S | 0.2–4 LPM |
| Vi-CELL XR Cell Viability Analyzer | Beckman Coulter Life Sciences | 731196 | Cell Counting |
| Vi-CELL XR 4 Bags of Sample Vials | Beckman Coulter Life Sciences | 383721 | Cell Counting |
References
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