Summary
Ce protocole de dissociation des cellules neurales est destiné aux échantillons avec une faible quantité de matière première et donne une suspension unicellulaire hautement viable pour l’analyse en aval, avec des étapes de fixation et de coloration facultatives.
Abstract
Ce protocole de dissociation neuronale (une adaptation du protocole accompagnant un kit commercial de dissociation du cerveau adulte) optimise le traitement des tissus en préparation d’une analyse détaillée en aval telle que la cytométrie en flux ou le séquençage unicellulaire. La dissociation neuronale peut être réalisée par dissociation mécanique (comme l’utilisation de filtres, de techniques de hachage ou de trituration par pipette), la digestion enzymatique ou une combinaison de ceux-ci. La nature délicate des cellules neuronales peut compliquer les efforts pour obtenir la véritable suspension unicellulaire hautement viable avec un minimum de débris cellulaires nécessaires à l’analyse unicellulaire. Les données démontrent que cette combinaison de dissociation mécanique automatisée et de digestion enzymatique donne systématiquement une suspension unicellulaire hautement viable (>90%), surmontant les difficultés susmentionnées. Bien que quelques-unes des étapes nécessitent une dextérité manuelle, ces étapes réduisent la manipulation des échantillons et la perte potentielle de cellules. Ce manuscrit détaille chaque étape du processus pour équiper d’autres laboratoires afin de dissocier avec succès de petites quantités de tissu neural en préparation d’une analyse en aval.
Introduction
L’hippocampe a été décrit pour la première fois par un anatomiste bolognais, Giulio Cesare Aranzio, dans les années 15001. En nommant cette nouvelle structure, Aranzio s’est probablement inspiré de sa ressemblance étrange avec l’hippocampe du genre Hippocampe1. L’hippocampe est impliqué dans les réponses au stress, mais est largement connu pour son rôle dans l’apprentissage et la mémoire. Plus précisément, l’hippocampe est responsable de l’encodage et de la récupération de la mémoire déclarative et spatiale1.
L’hippocampe, ou hippocampe proprement dit, est divisé en sous-champs CA1 (cornu ammonis), CA2 et CA31. Comparé au reste du système nerveux, l’hippocampe présente plusieurs caractéristiques déterminantes uniques, notamment sa plasticité et son potentiel de neurogenèse en cours2. La neurogenèse est le processus de prolifération et de différenciation des cellules souches neurales, suivi de leur intégration dans le réseau neuronal préexistant. La neurogenèse est limitée à la zone sous-granulaire du gyrus denté et à la zone sous-ventriculaire des ventricules latéraux (et des bulbes olfactifs)3. Bien que la neurogenèse soit abondante dans l’embryogenèse, il s’agit d’un processus qui dure toute la vie 3,4. En tant que tel, cette discussion se concentrera sur la neurogenèse adulte dans l’hippocampe.
Les zones sous-ventriculaires et sous-granulaires sont des niches neurogènes contenant des cellules épendymaires et vasculaires, ainsi que des lignées immatures et matures de cellules souches neurales5. Les microglies contribuent à ces niches en tant que cellules immunitaires pour réguler la neurogenèse6. Les cellules progénitrices neurales sont des descendants de cellules souches neurales7. Trois types de progéniteurs neuronaux sont présents dans la zone sous-ventriculaire : les cellules radiales de type B de type glie, les progéniteurs amplificateurs de transit de type C et les neuroblastes de type A 3,8. Les cellules progénitrices neurales de type B qui se divisent lentement dans la zone sous-ventriculaire peuvent se différencier en cellules de type C8 qui se divisent rapidement. Par la suite, les cellules de type C se différencient en cellules de type A8. Ces neuroblastes migrent à travers le flux migratoire rostral vers le bulbe olfactif avant de se différencier en interneurones ou oligodendrocytes9. Ces interneurones du bulbe olfactif sont la clé de la mémoire olfactive à court terme et de l’apprentissage associatif, tandis que les oligodendrocytes myélisent les axones du corps calleux9. La majorité de la neurogenèse adulte se produit dans la zone sous-granulaire du gyrus denté, où se trouvent les progéniteurs neuronaux radiaux de type 1 et non radicaux de type 23. La plupart des cellules progénitrices neurales sont destinées à devenir des neurones granulaires dentés et des astrocytes10. Reliés par des jonctions lacunaires, les astrocytes forment des réseaux pour moduler la plasticité, l’activité synaptique et l’excitabilité neuronale5. En tant que neurone excitateur primaire du gyrus denté, les cellules granulaires fournissent une entrée du cortex entorhinal à la région CA311.
Les populations de cellules souches neurales peuvent être isolées à l’aide de stratégies d’isolement immunomagnétiques ou immunofluorescentes12,13. Le tissu neural est particulièrement difficile à dissocier; les efforts déployés pour ce faire aboutissent souvent à des échantillons dont la viabilité cellulaire est médiocre et/ou ne parviennent pas à produire la suspension unicellulaire nécessaire pour l’analyse en aval. La dissociation neuronale peut être réalisée par dissociation mécanique (comme l’utilisation de filtres, de techniques de hachage ou de trituration par pipette), la digestion enzymatique ou une combinaison de techniques14,15. Dans une étude évaluant les méthodes de dissociation neuronale, la viabilité et la qualité de la dissociation mécanique manuelle par trituration pipette par rapport aux combinaisons de trituration pipette et de digestion avec diverses enzymes ont été comparées15. La qualité a été classée en fonction de la quantité d’amas cellulaires et d’ADN ou de débris subcellulaires dans la suspension préparée15. Les suspensions de tumeurs gliales soumises à une dissociation mécanique manuelle seule avaient une viabilité cellulaire significativement plus faible que les traitements par dispase ou une combinaison de DNase, de collagénase et de hyaluronidase15. Volovitz et coll. ont reconnu la variation de la viabilité et de la qualité entre les différentes méthodes et ont souligné qu’une dissociation inadéquate peut réduire la précision de l’analyse en aval15.
Dans une étude distincte, les auteurs ont comparé plus de 60 méthodes et combinaisons différentes de dissociation de cellules neuronales cultivées14. Ces méthodes comprenaient huit variantes différentes de la dissociation mécanique manuelle par trituration pipette, une comparaison de l’incubation avec cinq enzymes individuelles à trois intervalles différents et diverses combinaisons de dissociation mécanique avec digestion enzymatique ou combinaison de deux enzymes14. Aucune des méthodes mécaniques n’a donné une suspension monocellulaire14. Quatre des traitements enzymatiques simples, dix des traitements enzymatiques combinés et quatre des combinaisons de dissociation mécanique avec digestion enzymatique ont donné une suspension unicellulaire14. La digestion enzymatique avec TrypLE suivie de Trypsine-EDTA a le plus efficacement dissocié les échantillons14. Incidemment, les échantillons traités avec du TrypLE et/ou de la Trypsine-EDTA avaient tendance à former des amas gélatineux14. Bien que cette étude ait été réalisée sur des cellules cultivées, elle parle des lacunes de la trituration pipette ou de la digestion enzymatique seule.
Les comparaisons côte à côte de la dissociation mécanique manuelle et automatisée font défaut. Cependant, un groupe a effectué une cytométrie en flux pour comparer la dissociation mécanique manuelle et semi-automatisée de cerveaux entiers de souris en conjonction avec des kits commerciaux de dissociation enzymatique de papaïne ou de trypsine16. Le traitement avec le dissociateur a donné des cellules viables de manière plus cohérente16. Après la dissociation, les auteurs ont également isolé des cellules Prominin-1, des cellules précurseurs neuronales et des microglies16. Pour deux des trois populations de cellules isolées, la pureté des cellules isolées était légèrement plus élevée lorsque les échantillons étaient traités avec le dissociateur, par rapport à16 manuellement. Reiß et al. ont noté que la variabilité d’une personne à l’autre dans la technique de pipetage entrave la reproductibilité du rendement viable de la population cellulaire dans la dissociation tissulaire16. Les auteurs ont conclu que la dissociation mécanique automatisée normalise le traitement des échantillons16.
La méthode de dissociation décrite dans ce manuscrit est une combinaison de dissociation mécanique entièrement automatisée et de digestion enzymatique, en utilisant des solutions accompagnant un kit commercial de dissociation cérébrale adulte17. Contrairement aux protocoles standard, ce protocole optimisé réduit la manipulation des échantillons, produit une suspension unicellulaire hautement viable et est destiné au traitement de quantités minimales de tissu de départ.
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Protocol
Les expériences ont été menées conformément aux normes éthiques approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’UAMS. Des souris femelles de type sauvage C57Bl6/J âgées de 6 mois ont été achetées et logées en groupe (4 souris par cage) sous un cycle clair/sombre constant de 12 h.
1. Préparation des réactifs
- Préparez une solution réparable de taches vivantes/mortes. Reconstituer la coloration fluorescente avec 20 μL de diméthylsulfoxyde (DMSO).
- Enveloppez le flacon dans du papier d’aluminium, étiquetez-le comme « reconstitué » et conservez-le à -20 °C pendant six mois au maximum.
- Préparez une solution saline à 0,9% avec de l’héparine. Diluer le contenu d’un flacon d’héparine sodique (10 000 unités USP pour 10 mL) dans 1 L d’eau double distillée (ddH2O).
- Préparer suffisamment pour environ 45 mL par animal et conserver à 4 °C jusqu’à une semaine.
- Produire 1% de paraformaldéhyde (PFA).
- Dans une hotte, chauffer une plaque chauffante à 50 °C. Au micro-ondes, chauffer 100 mL de ddH2O dans un bécher en verre à environ 60 °C. Ajouter une barre d’agitation magnétique et transférer sur la plaque chauffante.
- Dans la hotte, peser 1 g de PFA et ajouter au bécher de ddH2O. Ajouter 0,1125 g de cristaux de NaOH et mélanger jusqu’à dissolution (5-10 min).
- Ajouter 0,4 g de NaPO4- monobasique et mélanger jusqu’à dissolution (2-5 min). Filtrez la solution sous vide et ajustez le pH à 7,4 avec HCl et NaOH.
- Laisser refroidir sur de la glace ou à 4°C pendant 30 min avant de conserver.
REMARQUE: Les aliquotes de 1,5 mL peuvent être conservées à -20 °C pendant un an. Évitez les cycles de gel-dégel. Si, après décongélation, la solution devient trouble ou si un précipité s’est formé, la solution ne doit pas être utilisée.
ATTENTION : Toxique, inflammable. Travaillez toujours avec pfa sous une hotte ventilée en portant un équipement de protection individuelle approprié.
- Remettre en suspension l’enzyme A lyophilisée avec 1 mL de tampon A. Ne pas vortex la solution.
REMARQUE: L’enzyme A et le tampon A ainsi que les tampons A, Y et Z sont des réactifs dans le kit commercial de dissociation cérébrale adulte17. - Diviser l’enzyme P en aliquotes de 50 μL et remettre en suspension l’enzyme A en aliquotes de 10 μL. Selon les instructions du kit, conserver à -20 °C jusqu’à six mois. Évitez les cycles de gel-dégel.
2. Journée d’expérimentation
- Refroidir la centrifugeuse de table à 4 °C.
- Placez la ou les aliquotes de PFA dans le réfrigérateur pour une décongélation progressive.
- Placez la tache vivante ou morte reconstituée dans l’obscurité (p. ex., un tiroir) pour la décongeler à température ambiante.
- Préparez le tampon d’albumine sérique bovine (BSA). Ajouter 0,5 g de BSA à 100 mL de 1x solution tamponnée au phosphate de Dulbecco sans calcium ni magnésium (D-PBS), pH 7,2.
- Ajouter une barre de remuage et mélanger sur une plaque à remuer pendant 30 min. Transférer dans des tubes coniques de 50 mL et conserver à 4 °C.
REMARQUE: Utilisez toujours un tampon BSA fraîchement préparé. - Préparer la dilution de travail des taches vivantes/mortes. Ajouter 1 μL de la solution reconstituée de taches vivantes/mortes à 360 μL de D-PBS et les conserver dans l’obscurité (p. ex. un tiroir ou une boîte) à température ambiante. Préparer 50 μL de la dilution de travail par échantillon.
3. Perfusion
- Placer la solution saline avec de l’héparine sur de la glace.
- Allumez l’oxygène, réglez la boule d’indicateur du débitmètre sur le système de vaporisateur d’anesthésie pour petits animaux à 1 L / min. Assurez-vous qu’il y a une pression d’oxygène et de l’isoflurane adéquates.
- Réglez le cadran du vaporisateur à 3,5 % (pour l’induction et l’entretien).
- Amorcer les conduites de la pompe de perfusion avec la solution saline/héparine. Réglez la vitesse sur 6 mL/min.
- Placez la souris dans la chambre d’induction, allumez le respirateur et attendez plusieurs minutes jusqu’à ce que la souris ne réponde plus. Confirmer une profondeur d’anesthésie suffisante grâce à l’absence de retrait de la pédale au pincement nocif.
- Placez la souris sur le dos sur le plateau de dissection avec son nez dans le cône de nez. Effectuer une confirmation secondaire de l’anesthésie complète par l’absence de retrait de la pédale au pincement nocif. Épinglez les quatre pattes au plateau.
- Vaporisez l’abdomen de l’animal avec 20% d’éthanol.
- À l’aide d’une pince, pincez le bas-ventre et soulevez la peau. Utilisez des ciseaux pour couper à travers la fourrure et la peau jusqu’au bas de la cage thoracique.
- Faites deux incisions diagonales sous la cage thoracique vers chaque épaule.
- Réséquez soigneusement le diaphragme (en évitant les poumons et le cœur). Réséquez la cage thoracique pour exposer le cœur.
- Coupez soigneusement tout tissu conjonctif autour du cœur.
REMARQUE : Les étapes 3.10 à 3.11 sont essentielles ; performer avec compétence et dextérité. - Utilisez les ciseaux pour couper l’oreillette droite (lobe sombre en haut à gauche du cœur). Éteignez le flux d’isoflurane vers le respirateur.
- Maintenez le cœur stable avec des pinces. Avec le biseau de l’aiguille papillon tourné vers le haut, percez le ventricule gauche tout en gardant l’aiguille à niveau et parallèle à l’animal.
- Maintenez l’aiguille en place, allumez la pompe et perfuser au moins 30 mL de la solution saline / héparine jusqu’à ce que le liquide quittant le cœur soit opaque et que le foie et les poumons soient de couleur pâle.
REMARQUE : Les étapes 3.13 à 3.14 sont essentielles; performer avec compétence et dextérité. - Éteignez la pompe, retirez l’aiguille et transférez la souris dans la zone de dissection.
4. Dissection
- À l’aide de gros ciseaux chirurgicaux, décapitez la tête.
- Coupez la fourrure de l’arrière de la tête jusqu’aux yeux. Pelez la peau pour exposer le crâne.
- Coupez le crâne entre les yeux. Faites deux coupes à l’arrière du crâne, aux positions de 10 et 2 heures, puis faites une longue coupe (gardez les pointes vers le haut pour éviter d’endommager le cerveau) le long de la ligne mi-saclastique du crâne jusqu’à la coupe originale entre les yeux.
- Utilisez des pinces pour décoller les deux moitiés du crâne sur les côtés. Utilisez une spatule pour retirer le cerveau et placez-le dans une boîte de Petri en verre de 60 mm sur de la glace remplie de D-PBS froid (Figure 1).
- Utilisez un scalpel ou un rasoir pour séparer chaque hémisphère. Retirez ensuite les bulbes olfactifs et le cervelet.
- Utilisez une pince pour retirer le mésencéphale jusqu’à ce que l’hippocampe soit exposé.
- Sécurisez le cerveau avec une pince. À l’aide d’une deuxième pince, taquinez doucement l’hippocampe hors de chaque hémisphère et transférez les deux hippocampes dans un tube étiqueté de 1,5 mL contenant du D-PBS froid.
- Placez le tube d’échantillonnage contenant les deux hippocampes de la souris sur de la glace.
5. Préparer le mélange d’enzymes 1 et 2 pour chaque échantillon
REMARQUE : Pour les volumes supérieurs à 2 mL, utiliser une pipette sérologique de 10 mL; pour les volumes, 200 μL-2 mL, utiliser une pipette de 1000 μL; pour les volumes, 21-199 μL, utilisez une pipette de 200 μL; pour les volumes, 2-20 μL, utilisez une pipette de 20 μL; pour les volumes inférieurs à 2 μL, utilisez une pipette de 0 à 2 μL.
- Pour chaque échantillon, décongeler une aliquote de l’enzyme P et de l’enzyme A à température ambiante.
- Pour le mélange d’enzymes 1, combiner 50 μL d’enzyme P et 1900 μL de tampon Z dans un tube C étiqueté (Tableau des matériaux).
- Pour le mélange d’enzymes 2, ajouter 20 μL de tampon Y à l’aliquote décongelée de 10 μL de l’enzyme A.
6. Protocole de dissociation cérébrale adulte17
REMARQUE: Lorsque vous travaillez avec des échantillons, les tubes doivent être placés dans un rack à tubes à température ambiante pendant que BSA et D-PBS restent sur la glace, sauf indication contraire.
- Allumez le dissociateur.
- Utilisez des pinces pour transférer les morceaux de tissu de l’hippocampe dans le tube C.
- Transférer 30 μL du mélange enzymatique 2 dans le tube C. Tournez le capuchon jusqu’à ce que la tension se fasse sentir, puis serrez jusqu’à ce qu’il clique.
- Placez le tube C à l’envers dans une position du dissociateur; l’échantillon se verra attribuer l’état Sélectionné (Figure 2). Fixez l’appareil de chauffage sur le tube C.
- Appuyez sur l’icône du dossier, sélectionnez le dossier Favoris, faites défiler jusqu’au programme 37C_ABDK_02 et sélectionnez-le. Cliquez sur OK pour appliquer le programme à tous les tubes C sélectionnés, puis appuyez sur Démarrer (Figure 2).
- Étiquetez un tube conique de 50 mL par échantillon.
- Placez une passoire cellulaire de 70 μm sur chaque tube conique de 50 mL et mouillez avec 2 mL de tampon BSA.
- À la fin du programme, retirez le chauffage et le tube C du dissociateur.
- Ajouter 4 mL de tampon BSA à l’échantillon et appliquer le mélange sur la passoire cellulaire sur le tube conique de 50 mL.
- Ajouter 10 mL de D-PBS au tube C, le fermer et faire tourbillonner doucement la solution. Appliquez-le sur la passoire cellulaire sur le tube conique de 50 mL.
- Jetez la passoire cellulaire et le tube C. Centrifuger la suspension à 300 x g pendant 10 min à 4 °C. Ensuite, aspirez et jetez le surnageant.
7. Enlèvement des débris
- Remettre en suspension la pastille avec 1550 μL de D-PBS froid et transférer la suspension dans un tube conique étiqueté de 15 mL.
- Ajouter 450 μL de solution froide d’élimination des débris et pipeter de haut en bas (ne pas vortex).
REMARQUE: La solution d’élimination des débris est un réactif dans le kit de dissociation Brian17 pour adultes commercial. - Superposez doucement 1 mL de D-PBS froid sur le dessus de la suspension cellulaire, en gardant la pointe contre la paroi du tube conique. Répétez l’opération jusqu’à ce que la superposition totale soit de 2 mL.
REMARQUE: Cette étape est critique; performer avec compétence et dextérité. - Centrifuger à 3000 x g pendant 10 min à 4 °C avec accélération complète et freinage complet.
REMARQUE: Si les phases ne sont pas clairement séparées, répétez les étapes 7.2 à 7.3. Centrifuger une dernière fois à 1000 x g pendant 10 min à 4 °C. - La suspension doit maintenant être composée de trois couches distinctes (figure 3). Aspirer la couche supérieure. Balayez la pointe de la pipette d’avant en arrière pour aspirer la couche intermédiaire blanche. Retirez autant que possible la couche intermédiaire sans perturber la couche inférieure.
REMARQUE: Cette étape est critique; performer avec compétence et dextérité. - Ajouter 2 mL de D-PBS froid et pipeter de haut en bas pour mélanger.
- Centrifuger à 1000 x g pendant 10 min à 4 °C avec accélération complète et freinage complet. Aspirer et jeter le surnageant. Remettre en suspension la pastille dans 1 mL de tampon BSA.
REMARQUE: Les cellules peuvent être remises en suspension dans le tampon approprié, puis marquées magnétiquement et isolées en préparation du séquençage unicellulaire à ce stade.
8. Nombre de cellules
- Effectuer le comptage des cellules conformément au protocole du fabricant du compteur de cellules disponibles (une option est indiquée dans le tableau des matériaux)
9. Tache vivante/morte
- Centrifuger les 900 μL restants (à partir de 7,7) à 1000 x g pendant 10 min à 4 °C à pleine accélération et freinage complet.
- Pendant que l’échantillon tourne, étiquetez un tube d’écoulement par échantillon et enveloppez-le dans du papier d’aluminium pour limiter l’exposition à la lumière.
- Aspirer et jeter le surnageant.
- Remettre la pastille dans 50 μL de teinture vivante/morte diluée (préalablement préparée).
REMARQUE: Cette étape doit être effectuée dans un réglage de faible luminosité. Éteignez les lumières de la pièce pour y parvenir. - Transférer chaque échantillon dans le tube d’écoulement étiqueté correspondant et incuber à température ambiante pendant 8 à 10 minutes dans l’obscurité (par exemple, un tiroir ou une boîte).
- Ajouter 500 μL de tampon BSA et centrifuger à 1000 x g pendant 10 min à 4 °C à pleine accélération et freinage complet.
- Aspirer et jeter le surnageant.
REMARQUE: La pastille peut ne pas être visible; laisser une petite quantité de tampon derrière afin de ne pas aspirer involontairement la pastille. Les cellules peuvent être remises en suspension dans le tampon approprié, bloquées et colorées avec des anticorps spécifiques à la cellule à ce stade. Voir le fichier supplémentaire 1 pour l’exemple de protocole18.
10. Fixation (facultatif)
- Remettre en suspension la pastille dans 200 μL de PFA à 1 % (préalablement préparée). Incuber pendant 15 min à 4 °C.
- Laver en ajoutant 500 μL de D-PBS et centrifuger à 300 x g pendant 10 min à 4 °C.
- Aspirer le surnageant.
REMARQUE: La pastille peut ne pas être visible; laisser une petite quantité de tampon derrière afin de ne pas aspirer involontairement la pastille. - Remettre la pastille dans 200 μL de D-PBS et la conserver à 4 °C jusqu’à 3 jours.
11. Cytométrie en flux
- Étiquetez les capuchons filtrants sur les nouveaux tubes.
- À l’aide d’une pipette de 1 mL, pipettez chaque échantillon sur le capuchon du filtre.
- Centrifuger brièvement à 200 x g à 4 °C, en ne permettant à la centrifugeuse d’atteindre que 200 x g avant d’arrêter la course.
- Passez au noyau de cytométrie en flux pour l’analyse en aval.
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Representative Results
Les échantillons ont été traités avec un cytomètre en flux dans une installation centrale, et les données résultantes ont été évaluées à l’aide d’un progiciel d’analyse en flux. Auparavant, les contrôles de compensation étaient analysés - la tache vivante / morte et le contrôle négatif. Si plusieurs fluorochromes sont utilisés, des témoins de fluorescence moins un (FMO) et des témoins à coloration unique doivent être préparés pour chaque anticorps. La compensation du chevauchement spectral pour les échantillons expérimentaux a été calculée en fonction des témoins analysés. Pour l’identification de la population cellulaire, une stratégie de contrôle hiérarchique a été utilisée. La porte primaire excluait les débris dans le diagramme de dispersion avant (taille de la cellule) par rapport au diagramme de dispersion latérale (granularité)19,20. Par la suite, les cellules mortes ont été exclues (figure 4, figure 5, figure 6, figure supplémentaire 1, figure supplémentaire 2, figure supplémentaire 3 et figure supplémentaire 4). La porte suivante excluait les cellules positives pour la protéine de base de myéline (figure supplémentaire 4). Parmi les cellules restantes, des diagrammes de densité de cellules positives pour chaque fluorochrome ont été créés (figure supplémentaire 4). La fréquence de chaque population de cellules neuronales a été calculée à partir de la troisième porte (figure supplémentaire 4). Les échantillons qui ont été traités avec dissociation mécanique manuelle21 et digestion enzymatique ont donné une population considérablement plus faible de cellules d’intérêt (fichier supplémentaire 221, figure 4 et figure supplémentaire 1). Inversement, les échantillons fixes et frais préparés par dissociation mécanique automatisée et digestion enzymatique ont renvoyé une population de cellules d’intérêt plusieurs fois plus grande (Figure 5, Figure 6, Figure supplémentaire 2 et Figure supplémentaire 3).
Figure 1 : Cerveau de souris. (A) Perfusé correctement. B) Non perfusé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : État sélectionné à l’étape 6.4. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Suspension à trois couches à l’étape 7.5 : Tampon (couche supérieure), débris cellulaires, solution d’enlèvement des débris et cellules (couche inférieure). Veuillez cliquer ici pour afficher une version plus grande de cette figure.
Figure 4 : Analyse représentative d’échantillons fixes traités à l’aide d’une combinaison de dissociation manuelle par trituration de la pipette Pasteur et digestion enzymatique. Premier des deux échantillons traités simultanément. (A) Pourcentage de cellules qui constituent la population cellulaire d’intérêt. (B) Pourcentage de la population d’intérêt qui sont des cellules vivantes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Analyse représentative d’échantillons frais traités à l’aide d’une combinaison de dissociation mécanique automatisée et de digestion enzymatique. Premier des deux échantillons traités simultanément. (A) Pourcentage de cellules qui constituent la population cellulaire d’intérêt. (B) Pourcentage de la population d’intérêt qui sont des cellules vivantes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Analyse représentative d’échantillons fixes traités à l’aide d’une combinaison de dissociation mécanique automatisée et de digestion enzymatique. Premier des deux échantillons traités simultanément. (A) Pourcentage de cellules qui constituent la population cellulaire d’intérêt. (B) Pourcentage de la population d’intérêt qui sont des cellules vivantes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure supplémentaire 1 : Analyse représentative d’échantillons fixes traités à l’aide d’une combinaison de dissociation manuelle de la trituration de la pipette Pasteur et de digestion enzymatique. Deuxième de deux échantillons traités simultanément. (A) Pourcentage de cellules qui constituent la population cellulaire d’intérêt. (B) Pourcentage de la population d’intérêt qui sont des cellules vivantes. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 2 : Analyse représentative d’échantillons frais traités à l’aide d’une combinaison de dissociation mécanique automatisée et de digestion enzymatique. Deuxième de deux échantillons traités simultanément. (A) Pourcentage de cellules qui constituent la population cellulaire d’intérêt. (B) Pourcentage de la population d’intérêt qui sont des cellules vivantes. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 3 : Analyse représentative d’échantillons fixes traités à l’aide d’une combinaison de dissociation mécanique automatisée et de digestion enzymatique. Deuxième de deux échantillons traités simultanément. (A) Pourcentage de cellules qui constituent la population cellulaire d’intérêt. (B) Pourcentage de la population d’intérêt qui sont des cellules vivantes. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 4 : Analyse représentative d’échantillons colorés et fixes traités à l’aide d’une combinaison de dissociation mécanique automatisée et de digestion enzymatique. (A) Pourcentage de cellules qui constituent la population cellulaire d’intérêt. (B) Pourcentage de la population d’intérêt qui sont des cellules vivantes. (C). MBP- Cellules. (D). Cellules PSA-NCAM+ (cellules précurseurs neuronales). (E). Cellules ACSA2+ (Astrocytes). (F). Cellules CD31+ (endothéliales). (G). Cellules CD11b+ (Microglie). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Fichier supplémentaire 1 : Protocole de coloration. Un protocole de coloration d’échantillon pour l’immunocoloration des marqueurs de surface cellulaire. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Fichier supplémentaire 2 : Protocole manuel de dissociation mécanique et enzymatique adapté. Cette méthode est adaptée d’un protocole21 publié précédemment. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Plusieurs étapes de ce protocole de dissociation neurale nécessitent une technique compétente et une dextérité - perfusion, aspiration de surnageant et élimination de la myéline. Tout au long du processus de perfusion, les organes internes doivent rester intacts (en plus de retirer le diaphragme et de couper le cœur); cela inclut d’éviter les cavités supérieures du cœur avec l’aiguille papillon. Bien que la quantité de solution saline avec héparine nécessaire varie, le liquide transparent qui s’écoule du cœur indique que le processus est terminé. Le cerveau doit être complètement et correctement perfusé, auquel cas il apparaîtra blanc cassé (Figure 1). Avec la perfusion, l’étape d’élimination des globules rouges devient superflue, éliminant ainsi la manipulation excessive des échantillons qui peut entraîner une perte de cellules. Par la suite, l’étape d’enlèvement des débris nécessite une main ferme. Pour que la centrifugation aboutisse à des couches clairement définies suivant la superposition D-PBS (Figure 3), les couches ne doivent pas être perturbées en transit ou pendant le pipetage. De plus, lors de l’aspiration des deux couches supérieures, une suspension suffisante doit être retirée pour éliminer les débris cellulaires excessifs tout en laissant un échantillon suffisamment grand. Il s’agit d’une étape clé car les cellules mortes sont plus susceptibles de se lier de manière non spécifique et de devenir autofluorescentes 22,23, soulignant davantage l’importance de choisir une méthode qui se traduit systématiquement par une viabilité cellulaire élevée. Enfin, lors de l’aspiration du surnageant, la pastille peut ne pas toujours être visible. Une petite quantité de surnageant résiduel doit être laissée pour s’assurer que l’échantillon n’est pas jeté accidentellement.
Il y a des avantages et des inconvénients à réparer les échantillons. Tous les marqueurs d’anticorps ne sont pas compatibles avec la fixation, ce qui limite l’analyse en aval en fonction des populations cellulaires d’intérêt. En outre, l’utilisation de PFA trop concentré ou le fait de laisser les cellules dans le fixateur pendant une période prolongée peut entraîner une autofluorescence et des lectures faussement positives, confondant ainsi les résultats24,25. En utilisant une solution de PFA à 1% et en minimisant l’exposition des cellules, la probabilité de lectures faussement positives est considérablement réduite. Comme cette procédure est détaillée et comporte de nombreuses variables temporelles, l’utilisation de cellules fraîches place les laboratoires sous des contraintes de temps strictes pour s’assurer que les cellules restent viables. La fixation préserve la structure cellulaire pour l’analyse du lendemain.
L’analyse unicellulaire peut fournir des informations clés sur l’efficacité du traitement, la fonction cellulaire et la maladie ou les mécanismes d’action du traitement. Les exemples de méthodes comprennent le séquençage de l’ADN et de l’ARN unicellulaire 26,27, la cytométrie par temps de vol22,28, la cytométrie en flux et l’immunohistochimie. Avec le séquençage de l’ARNm unicellulaire, l’expression des gènes au moment de la collecte de l’échantillon peut fournir des informations spécifiques au type de cellule26. Par exemple, un groupe de recherche a effectué un séquençage de l’ARN unicellulaire sur les récepteurs dopaminergiques D1 et D2 exprimant des sous-types de neurones épineux moyens à partir du striatum dorsomédian27. Le groupe a redéfini le transcriptome des neurones épineux moyens en détectant de nouveaux gènes marqueurs spécifiques à un sous-type et en identifiant les gènes qui ont été précédemment et incorrectement rapportés comme étant exprimés différemment en raison d’un manque de résolution unicellulaire27. Ho et al. ont souligné le potentiel du séquençage de l’ARN unicellulaire dans la découverte de cibles médicamenteuses spécifiques au type cellulaire27. Avec le séquençage de l’ADN unicellulaire, les changements dans l’expression des gènes peuvent être décrits en mesurant les modifications de l’ADN et des histones, l’accessibilité de la chromatine et la conformation de la chromatine26. En mesurant la méthylation de l’ADN d’un seul noyau, Liu et al. ont construit un atlas du méthylome de l’ADN unicellulaire de 45 régions cérébrales de souris et ont identifié 161 types de cellules neuronales29. La préparation des échantillons pour le séquençage unicellulaire est plus complexe, en particulier l’isolement des cellules individuelles et l’élimination des débris. Mattei et al. ont examiné l’effet de la dissociation enzymatique et mécanique sur le profilage transcriptomique et protéotypique, notant que les méthodes de dissociation neuronale introduisent intrinsèquement un niveau de biais30. Plusieurs groupes ont noté l’importance de travailler efficacement, de disséquer sur la glace et d’utiliserdes inhibiteurs transcriptionnels 26,30,31. Mattei et al. ont également identifié des gènes et des protéines affectés pour éclairer l’analyse30. Cependant, ces techniques fournissent toujours des informations détaillées sur les blocs de construction cellulaires qui ne sont pas égalés par la transcriptomique des tissus en vrac26,27.
La cytométrie en flux est un puissant outil d’analyse qui permet d’identifier et de mesurer simultanément les paramètres des populations unicellulaires à l’aide de sondes fluorescentes. Certaines applications des cytomètres en flux comprennent l’analyse du cycle cellulaire, le tri cellulaire, la viabilité, le phénotypage, la prolifération cellulaire et les analyses fonctionnelles32,33. La plupart de ces applications utilisent la coloration de surface en raison de l’accessibilité des protéines de surface cellulaire. Ces protéines peuvent être colorées pour identifier des populations cellulaires spécifiques en fonction de la lignée, du stade de développement et de la fonction 19,32,33. Par exemple, les échantillons peuvent être colorés en surface pour identifier les populations d’astrocytes, de cellules endothéliales, de cellules précurseurs neuronales et de microglies34. L’un des principaux avantages lors de la coloration des protéines de surface des cellules vivantes est de pouvoir trier les cellules tout en conservant la possibilité de mener une analyse plus approfondie en aval34. Alors que les techniques de coloration de surface sont assez standard, la coloration intracellulaire est une procédure plus délicate. Avec la cytométrie en flux intracellulaire, les cellules doivent être fixées et perméabilisées avant la coloration pour permettre à l’anticorps de traverser la membrane cellulaire 20,32,33,34. Idéalement, la morphologie cellulaire restera intacte; cependant, la perméabilisation risque la dénaturation des protéines, ce qui aurait un impact négatif sur la détection des anticorps22,34. Certaines méthodes d’analyse en aval ne sont plus une option une fois que les cellules sont fixées20. Alors que les inconvénients de la coloration intracellulaire sont plus prononcés que la coloration de surface, la première permet la détection et l’analyse de molécules intracellulaires qui ne seraient autrement pas plausibles. De plus, les procédures de coloration de la surface cellulaire et intracellulaire peuvent être couplées pour identifier définitivement certains types de cellules ou évaluer simultanément des paramètres supplémentaires 20,28,34.
Il existe plusieurs méthodes de dissociation neurale qui peuvent être utilisées pour préparer la suspension unicellulaire nécessaire à l’analyse cellulaire, bien qu’elles ne soient pas aussi efficaces. Par rapport aux kits standardisés et aux techniques susmentionnées, cette méthode particulière de dissociation neurale est destinée au traitement de petites quantités de tissus, donne une suspension unicellulaire hautement viable (>90%) et rationalise l’expérience. Avec ce protocole, d’autres laboratoires sont équipés pour effectuer une dissociation neuronale de manière fiable et reproductible.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions Aimee Rogers d’avoir fourni une formation pratique et un soutien continu aux produits. Nous remercions la Dre Amanda Burke d’avoir continuellement résolu les questions et clarifié les discussions. Nous remercions Meredith Joheim et le groupe de communication scientifique de l’UAMS pour l’édition grammaticale et la mise en forme de ce manuscrit. Cette étude a été soutenue par NIH R25GM083247 et NIH 1R01CA258673 (A.R.A).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 02-682-003 | Basix, assorted color |
| 15 mL Falcon Tubes | Becton Dickinson Labware Europe | 352009 | Polystyrene |
| 25 mL Serological Pipets | Fisher Scientific | 14-955-235 | |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Falcon | 352052 | |
| 500 mL Vacuum Filter/ Storage Bottle System | Corning | 431097 | |
| 70 μm cell strainer | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Adult Brain Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-107-677 | Contains Enzyme P, Buffer Z, Buffer Y, Enzyme A, Buffer A, Debris Removal Solution |
| Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-105 | |
| Anti-ACSA-2-PE-Vio770, mouse, clone REA969 | Miltenyi Biotec | 130-116-246 | |
| Anti-Myelin Basic Protein | Sigma-Aldrich | M3821-100UG | |
| Anti-PSA-NCAM-PE, human, mouse and rat, Clone 2-2B | Miltenyi Biotec | 130-117-394 | |
| BD LSRFortessa | BD | ||
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906-50G | |
| CD11b-VioBlue, mouse, Clone REA592 | Miltenyi Biotec | 130-113-810 | |
| CD31 Antibody | Miltenyi Biotec | 130-111-541 | |
| Ceramic Hot Plate Stirrer | Fisher Scientific | 11-100-100SH | |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Ethanol | Pharmco by Greenfield Global | 111000200 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Fine Scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | Perfusion |
| FlowJo | BD | (v10.7.0) | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Gibco DPBS (1X) | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| Glass Beaker | Fisher Scientific | 02-555-25A | |
| Heparin sodium | Fresenius Kabi | 504011 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher | L34965 | |
| Magnetic Stir Bar | Fisher Scientific | 14-513-51 | |
| Noyes Spring Scissors | Fine Science Tools | 15012-12 | Dissection |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 441244-3KG | Prilled, 95% |
| Pipette tips GP LTS 20 µL 960A/10 | Rainin | 30389270 | |
| Pipette Tips GP LTS 250 µL 960A/10 | Rainin | 30389277 | |
| Pipette tips RT LTS 1000 µL FL 768A/8 | Rainin | 30389213 | |
| Rainin Pipet-Lite XLS (2, 20, 200, 1000 μL) | Rainin | 30386597 | |
| RBXMO FITC XADS | Fisher Scientific | A16167 | |
| Round Ice Bucket with Lid | Fisher Scientific | 07-210-129 | |
| Round-Bottom Tubes with Cell Strainer Cap | Falcon | 100-0087 | |
| S1 Pipet Fillers | ThermoFisher Scientific | 9541 | |
| Spatula & Probe | Fine Science Tools | 10090-13 | Dissection & Perfusion |
| Surflo Winged Infusion Set 23 G x 3/4" | Termuno | SV-23BLK | Butterfly needle |
| Test Tube Rack | Fisher Scientific | 14-809-37 | |
| Thermo Scientific Legend XTR Centrifuge | ThermoFisher | discontinued | Or other standard table top centrifuge |
| Variable-Flow Peristaltic Pump | Fisher Scientific | 13-876-2 | Low-flow model |
| VetFlo Starter Kit for Mice | Kent Scientific | VetFlo-MSEKIT | Anesthesia mask, tubing, induction chamber, charcoal canisters |
| VetFlo Vaporizer Single Channel Anesthesia System | Kent Scientific | VetFlo-1210S | 0.2–4 LPM |
| Vi-CELL XR Cell Viability Analyzer | Beckman Coulter Life Sciences | 731196 | Cell Counting |
| Vi-CELL XR 4 Bags of Sample Vials | Beckman Coulter Life Sciences | 383721 | Cell Counting |
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