Summary
פרוטוקול דיסוציאציה של תאים עצביים זה מיועד לדגימות עם כמות נמוכה של חומר התחלתי ומניב תרחיף חד-תאי בר-קיימא ביותר לניתוח במורד הזרם, עם שלבי קיבוע וצביעה אופציונליים.
Abstract
פרוטוקול דיסוציאציה עצבית זה (התאמה של הפרוטוקול המלווה בערכת דיסוציאציה מסחרית של המוח הבוגר) מייעל את עיבוד הרקמות כהכנה לניתוח מפורט במורד הזרם כגון ציטומטריה של זרימה או ריצוף של תא בודד. דיסוציאציה עצבית יכולה להתבצע באמצעות דיסוציאציה מכנית (כגון שימוש במסננים, טכניקות חיתוך או טריטורציה של פיפטה), עיכול אנזימטי או שילוב שלהם. האופי העדין של תאי העצב יכול לסבך את המאמצים להשיג את ההשעיה החד-תאית האמיתית, בעלת הכדאיות הגבוהה ביותר, עם פסולת תאית מינימלית הנדרשת לניתוח של תאים בודדים. הנתונים מראים כי שילוב זה של דיסוציאציה מכנית אוטומטית ועיכול אנזימטי מניב באופן עקבי תרחיף חד-תאי בר-קיימא ביותר (>90%), תוך התגברות על הקשיים הנ"ל. בעוד שכמה מהשלבים דורשים מיומנות ידנית, שלבים אלה מפחיתים את הטיפול בדגימות ואת אובדן התא הפוטנציאלי. כתב יד זה מפרט כל שלב בתהליך כדי לצייד מעבדות אחרות כדי לנתק בהצלחה כמויות קטנות של רקמות עצביות כהכנה לניתוח במורד הזרם.
Introduction
ההיפוקמפוס תואר לראשונה על ידי אנטומיסט בולונזי, ג'וליו צ'זארה ארנציו, בשנות ה-1500 שלהמאה ה-15. במתן שם למבנה החדש הזה, ארנציו ככל הנראה קיבל השראה מהדמיון המובהק שלו לסוסון הים של הסוג היפוקמפוס1. ההיפוקמפוס מעורב בתגובות עקה אך ידוע בתפקידו בלמידה ובזיכרון. ליתר דיוק, ההיפוקמפוס אחראי על קידוד ואחזור של זיכרון הצהרתי ומרחבי1.
ההיפוקמפוס, או ההיפוקמפוס עצמו, מחולק לתת-שדות CA1 (cornu ammonis), CA2 ו-CA31. בהשוואה לשאר מערכת העצבים, להיפוקמפוס יש מספר מאפיינים מגדירים ייחודיים, כולל הפלסטיות שלו והפוטנציאל לנוירוגנזה מתמשכת2. נוירוגנזה היא תהליך ההתפשטות וההתמיינות של תאי גזע עצביים, ולאחר מכן השתלבותם ברשת העצבית הקיימת. נוירוגנזה מוגבלת לאזור התת-גרנולרי של הג'ירוס המשונן ולאזור התת-חדרי של החדרים הצדדיים (ונורות חוש הריח)3. בעוד שנוירוגנזה נפוצה באמבריוגנזה, זהו תהליך לכל החיים 3,4. ככזה, דיון זה יתמקד בנוירוגנזה של מבוגרים בהיפוקמפוס.
האזורים התת-חדריים והתת-גרנולאריים הם נישות נוירוגניות המכילות תאים אפנדימליים וסקולריים, כמו גם שושלות לא בוגרות ובשלות של תאי גזע עצביים5. מיקרוגליה תורמת לנישות אלה כתאי מערכת החיסון לווסת את הנוירוגנזה6. תאי אב עצביים הם צאצאים של תאי גזע עצבייםשאינם תאי מערכתם של תאי גזע עצביים 7. שלושה סוגים של אבות עצביים נמצאים באזור התת-חדרי: תאים דמויי גליה רדיאליים מסוג B, אבות מגבירי מעבר מסוג C ונוירובלסטים מסוג A 3,8. תאי האב העצביים מסוג B המתחלקים באיטיות באזור התת-חדרי יכולים להתמיין לתאים מסוג C המתחלקים במהירות8. לאחר מכן, תאים מסוג C מתמיינים לתאים מסוג A8. נוירובלסטים אלה נודדים דרך הזרם הנודד הרוסטרלי אל נורת חוש הריח לפני שהם מתמיינים לאינטרנאורונים או לאוליגודנדרוציטים9. פקעות חוש הריח האלה הן המפתח לזיכרון לטווח קצר של חוש הריח, וללמידה אסוציאטיבית, בעוד שהאוליגודנדרוציטים מיאלינטים אקסונים של קורפוס קלוסום9. רוב הנוירוגנזה הבוגרת מתרחשת באזור התת-גרנולרי של הפיתול המשונן, שם נמצאים אבות עצביים רדיאליים מסוג 1 ו-nonradial Type 23. רוב תאי האב העצביים מיועדים להפוך לנוירונים גרגיריים משוננים ואסטרוציטים10. מחוברים על ידי צמתים מרווחים, אסטרוציטים יוצרים רשתות כדי לווסת את הפלסטיות, הפעילות הסינפטית וההתרגשות העצבית5. כנוירון המעורר העיקרי של הפיתול המשונן, תאי גרגירים מספקים קלט מקליפת המוח האנטורינלית לאזור CA311.
ניתן לבודד אוכלוסיות תאי גזע עצביים באמצעות אסטרטגיות בידוד אימונומגנטיות או אימונופלואורסצנטיות12,13. רקמה עצבית קשה במיוחד לניתוק; מאמצים לעשות זאת גורמים לעתים קרובות לדגימות עם כדאיות תאית ירודה ו/או לא מצליחים לייצר את ההשעיה החד-תאית הדרושה לניתוח במורד הזרם. דיסוציאציה עצבית יכולה להתבצע באמצעות דיסוציאציה מכנית (כגון שימוש במסננים, טכניקות חיתוך או טריטורציה של פיפטה), עיכול אנזימטי, או שילוב של טכניקות14,15. במחקר שהעריך שיטות דיסוציאציה עצבית, הכדאיות והאיכות של דיסוציאציה מכנית ידנית על ידי טריטורציה פיפטה לעומת שילובים של טריטורציה פיפטה ועיכול עם אנזימים שונים הושוו15. האיכות דורגה על סמך כמות גושי התאים והדנ"א או הפסולת התת-תאית בתרחיף המוכן15. השעיות של גידולי גליה שהיו נתונים לדיסוציאציה מכנית ידנית בלבד היו בעלות יכולת נמוכה משמעותית של התאים בהשוואה לטיפולים עם דיספוזה או שילוב של DNase, collagenase ו-hyaluronidase15. Volovitz et al. הכירו בשונות הכדאיות והאיכות בין השיטות השונות והדגישו כי דיסוציאציה לא מספקת עלולה להפחית את הדיוק של ניתוח במורד הזרם15.
במחקר נפרד, המחברים השוו יותר מ-60 שיטות ושילובים שונים של דיסוציאציה של תאי עצב בתרבית14. שיטות אלה כללו שמונה וריאציות שונות של דיסוציאציה מכנית ידנית על ידי טריטורציה של פיפטה, השוואה של דגירה עם חמישה אנזימים בודדים בשלושה מרווחי זמן שונים, ושילובים שונים של דיסוציאציה מכנית עם עיכול אנזימטי או שילוב של שני אנזימים14. אף אחת מהשיטות המכניות לא הניבה השעיה חד-תאית14. ארבעה מהטיפולים באנזים יחיד, עשרה מהטיפולים האנזימטיים המשולבים וארבעה מהשילובים של דיסוציאציה מכנית עם עיכול אנזימטי הניבו תרחיף חד-תאי14. עיכול אנזימטי עם TripLE ואחריו Tripsin-EDTA ביעילות היעילה ביותר ניתוק דגימות14. אגב, דגימות שטופלו ב-TrypLE ו/או ב-Trypsin-EDTA נטו ליצור גושים ג'לטיניים14. בעוד שמחקר זה בוצע על תאים בתרבית, הוא מדבר על החסרונות של טריטורציה פיפטה או עיכול אנזימטי בלבד.
חסרות השוואות זו לצד זו של דיסוציאציה מכנית ידנית לעומת אוטומציה. עם זאת, קבוצה אחת הפעילה ציטומטריית זרימה כדי להשוות דיסוציאציה מכנית ידנית ואוטומטית למחצה של מוחות עכברים שלמים בשילוב עם ערכות דיסוציאציה אנזימטיות מסחריות של פפאין או טריפסין16. עיבוד עם הדיסוציאטור הניב באופן עקבי יותר תאים בני קיימא16. בעקבות הדיסוציאציה, החוקרים בודדו גם תאי פרומינין-1, תאים מקדימים עצביים ומיקרוגליה16. עבור שתיים מתוך שלוש אוכלוסיות התאים המבודדים, טוהר התאים המבודדים היה מעט גבוה יותר כאשר הדגימות עובדו עם הדיסוציאטור, בהשוואהל-16 באופן ידני. Reiß et al. ציינו כי השתנות מאדם לאדם בטכניקת הצינורות מעכבת את יכולת השכפול של תפוקת אוכלוסיית התאים בת-קיימא בדיסוציאציה של רקמות16. החוקרים הגיעו למסקנה כי דיסוציאציה מכנית אוטומטית מתקננת עיבוד דגימות16.
שיטת הדיסוציאציה המתוארת בכתב יד זה היא שילוב של דיסוציאציה מכנית אוטומטית לחלוטין ועיכול אנזימטי, תוך שימוש בתמיסות המלוות בערכת דיסוציאציה מסחרית של המוח הבוגר17. בניגוד לפרוטוקולים סטנדרטיים, פרוטוקול מותאם זה מפחית מניפולציה של דגימות, מניב תרחיף חד-תאי בר-קיימא ביותר ומיועד לעיבוד כמויות מינימליות של רקמת התחלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הניסויים נערכו בהתאם לסטנדרטים האתיים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת UAMS. נקבה בת 6 חודשים C57Bl6/J של עכברים מסוג בר נרכשו ושוכנו בקבוצות (4 עכברים לכלוב) תחת מחזור קבוע של 12 שעות של אור/חושך.
1. הכנת ריאגנטים
- הכינו תמיסת מלאי כתמים חיים/מתים הניתנת לתיקון. שחזרו את הכתם הפלואורסצנטי עם 20 μL של דימתיל סולפוקסיד (DMSO).
- עטפו את הבקבוקון בנייר כסף, תייגו אותו כ-"Reconstituted", ואחסנו אותו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך עד שישה חודשים.
- מכינים תמיסת מלח של 0.9% עם הפרין. דיללו את תכולתו של בקבוקון אחד של נתרן הפרין (10,000 יחידות USP לכל 10 מ"ל) ב-1 ליטר של מים מזוקקים כפולים (ddH2O).
- הכן מספיק עבור כ 45 מ"ל לכל חיה ולאחסן ב 4 ° C למשך עד שבוע.
- הפוך 1% paraformaldehyde (PFA).
- במכסה אדים, מחממים צלחת חמה ל-50 מעלות צלזיוס. במיקרוגל, מחממים 100 מ"ל של ddH2O בכוס זכוכית לכ-60 מעלות צלזיוס. הוסיפו מוט ערבוב מגנטי והעבירו לפלטה החמה.
- במכסה האדים, שוקלים 1 גרם של PFA ומוסיפים לכוס של ddH2O. מוסיפים 0.1125 גרם של גבישי NaOH ומערבבים עד להמסה (5-10 דקות).
- מוסיפים 0.4 גרם של NaPO4- מונובאסי ומערבבים עד להמסה (2-5 דקות). ואקום מסנן את התמיסה והתאים את ה-pH ל-7.4 עם HCl ו-NaOH.
- מצננים על קרח או בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפני האחסון.
הערה: ניתן לאחסן Aliquots של 1.5 מ"ל בטמפרטורה של -20 °C (75 °F) למשך שנה אחת. הימנעו ממחזורי הפשרה בהקפאה. אם, לאחר ההפשרה, התמיסה הופכת לעכורה או שנוצר משקע, אין להשתמש בתמיסה.
אזהרה: רעיל, דליק. תמיד לעבוד עם PFA מתחת למכסה מנוע מאוורר כשהוא לובש ציוד מגן אישי מתאים.
- אנזים ליופילי A עם 1 מ"ל של חיץ A. אל תסובבו את הפתרון.
הערה: אנזים A ו-Buffer A, כמו גם Buffers A, Y ו-Z, הם ריאגנטים בערכת הדיסוציאציה המסחרית של המוח למבוגרים17. - מחלקים את אנזים P לאליקוטים של 50 μL ומחזירים את אנזים A ל-10 μL aliquots. לפי הוראות הערכה, יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך עד שישה חודשים. הימנעו ממחזורי הפשרה בהקפאה.
2. יום הניסוי
- מצנן את הצנטריפוגה השולחנית ל-4 מעלות צלזיוס.
- יש להניח את ה-aliquot(ים) של PFA במקרר להפשרה הדרגתית.
- הניחו את הכתם החי/מת המשוחזר בחושך (למשל, מגירה) כדי להפשיר בטמפרטורת החדר.
- מכינים את מאגר אלבומין בסרום בקר (BSA). הוסיפו 0.5 גרם של BSA ל-100 מ"ל של תמיסה 1x של דולבקו עם מאגר פוספט ללא סידן ומגנזיום (D-PBS), pH 7.2.
- מוסיפים מוט ערבוב ומערבבים על צלחת ערבוב למשך 30 דקות. מעבירים לצינורות חרוטיים של 50 מ"ל ומאחסנים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
הערה: השתמש תמיד במאגר BSA שהוכן טרי. - הכינו דילול עבודה של כתם חי/מת. הוסיפו 1 μL של תמיסת מלאי הכתמים החיים/מתים המשוחזרת ל-360 μL D-PBS ואחסנו אותה בחושך (למשל, מגירה או קופסה) בטמפרטורת החדר. הכן 50 μL של דילול העבודה לכל מדגם.
3. פרפוזיה
- מניחים את תמיסת המלח עם הפרין על הקרח.
- הפעל חמצן, הגדר את כדור מחוון מד הזרימה במערכת אידוי הרדמה של בעלי חיים קטנים ל-1 ליטר לדקה. ודא שיש לחץ חמצן ואיזופלורן מספיקים.
- התאם את חוגת מכשיר האידוי ל-3.5% (לצורך אינדוקציה ותחזוקה).
- הקדמו את קווי משאבת הזלוף בעזרת תמיסת המלח/הפרין. הגדר את המהירות ל- 6 מ"ל לדקה.
- הניחו את העכבר בתא האינדוקציה, הפעילו את מכשיר הנשימה והמתינו מספר דקות עד שהעכבר לא מגיב. לאשר עומק מספיק של הרדמה באמצעות היעדר נסיגה דוושה לצביטה מזיקה.
- הניחו את העכבר על גבו על מגש הנתיחה עם אפו בקונוס האף. בצע אישור משני של הרדמה מלאה באמצעות היעדר נסיגה מדוושה לצביטה מזיקה. הצמידו את כל ארבע כפות הרגליים למגש.
- מרססים את בטנה של החיה ב-20% אתנול.
- באמצעות מלקחיים, לצבוט את הבטן התחתונה ולהרים את העור. השתמש במספריים כדי לחתוך דרך פרווה ועור לתחתית בית החזה.
- בצע שני חתכים אלכסוניים מתחת לכל צלעות לכיוון כל כתף.
- בזהירות לנתח את הסרעפת (הימנעות הריאות והלב). נתחו את הצלעות כדי לחשוף את הלב.
- נתקו בזהירות כל רקמת חיבור סביב הלב.
הערה: שלבים 3.10-3.11 הם קריטיים; לבצע במיומנות ובמיומנות. - השתמש במספריים כדי לחתוך את האטריום הימני (אונה כהה בפינה השמאלית העליונה של הלב). כבה את זרימת האיזופלורן לנשימה.
- החזיקו את הלב יציב עם מלקחיים. כאשר שיפוע מחט הפרפר פונה כלפי מעלה, חודרים את החדר השמאלי תוך שמירה על מפלס המחט ומקביל לחיה.
- החזיקו את המחט במקומה, הפעילו את המשאבה והניחו לפחות 30 מ"ל של תמיסת המלח/הפרין עד שהנוזל היוצא מהלב אטום וצבע הכבד והריאות מחווירים בצבעם.
הערה: שלבים 3.13-3.14 הם קריטיים; לבצע במיומנות ובמיומנות. - כבה את המשאבה, הסר את המחט והעביר את העכבר לאזור הנתיחה.
4. דיסקציה
- באמצעות מספריים כירורגיים גדולים, ערפו את הראש.
- חותכים את הפרווה מהחלק האחורי של הראש עד לעיניים. מקלפים את העור בחזרה כדי לחשוף את הגולגולת.
- גזרו את הגולגולת בין העיניים. בצע שני חתכים בחלק האחורי של הגולגולת, בתנוחות השעה 10 ו-2, ולאחר מכן בצע חתך אחד ארוך (שמור על קצוות למעלה כדי למנוע פגיעה במוח) לאורך הקו האמצעי של הגולגולת עד לחתך המקורי בין העיניים.
- השתמשו במלקחיים כדי לקלף את שני חצאי הגולגולת לצדדים. השתמשו במרית כדי להסיר את המוח ולהכניס אותו לתוך צלחת פטרי מזכוכית בקוטר 60 מ"מ על קרח מלא ב-D-PBS קר (איור 1).
- השתמש באזמל או סכין גילוח כדי להפריד כל חצי כדור. לאחר מכן להסיר את נורות חוש הריח ואת המוח הקטן.
- השתמש במלקחיים כדי להסיר את המוח האמצעי עד שההיפוקמפוס נחשף.
- אבטח את המוח באמצעות מלקחיים. באמצעות קבוצה שנייה של מלקחיים, מקניטים בעדינות את ההיפוקמפוס מכל חצי כדור, ומעבירים את שני ההיפוקמפי לצינור 1.5 מ"ל המסומן 1.5 מ"ל המכיל D-PBS קר.
- הניחו את צינור הדגימה המכיל את שני ההיפוקמפי מהעכבר על הקרח.
5. הכינו תערובת אנזימים 1 ו-2 לכל דגימה
הערה: עבור נפחים הגדולים מ-2 מ"ל, השתמש בפיפטה סרולוגית של 10 מ"ל; עבור נפחים, 200 μL-2 מ"ל, להשתמש פיפטה 1000 μL; עבור נפחים, 21-199 μL, להשתמש פיפטה 200 μL; עבור נפחים, 2-20 μL, להשתמש פיפטה 20 μL; עבור נפחים מתחת ל-2 μL, השתמש בפיפטה של 0-2 μL.
- עבור כל דגימה, הפשירו אליקוט אחד לכל אחד מאנזים P ואנזים A בטמפרטורת החדר.
- עבור תערובת אנזימים 1, שלבו 50 μL של אנזים P ו-1900 μL של Buffer Z בצינור C המסומן (טבלת חומרים).
- עבור תערובת אנזימים 2, הוסיפו 20 μL של Buffer Y ל-10 μL המופשרים של אנזים A.
6. פרוטוקול דיסוציאציה מוחית למבוגרים17
הערה: בעת עבודה עם דגימות, יש למקם צינורות במדף צינורות בטמפרטורת החדר בעוד BSA ו- D-PBS נשארים על קרח אלא אם כן צוין אחרת.
- הפעל את הדיסוציאטור.
- השתמש במלקחיים כדי להעביר את חלקי הרקמה של ההיפוקמפי לצינור C.
- מעבירים 30 μL של תערובת אנזימים 2 לתוך צינור C. סובבו את המכסה עד שהמתח מורגש, ואז התהדקו עד שהוא לוחץ.
- מקם את צינור C הפוך למצב של הדיסוציאטור; לדוגמה יוקצה המצב 'נבחר' (איור 2). אבטחו את התנור מעל צינור C.
- הקש על סמל התיקיה, בחר תיקיית מועדפים , גלול אל ובחר את התוכנית 37C_ABDK_02 . לחץ על אישור כדי להחיל את התוכנית על כל צינורות C שנבחרו, ולאחר מכן הקש על התחל (איור 2).
- סמן צינור חרוטי אחד של 50 מ"ל לכל דגימה.
- הניחו מסננת של 70 מיקרומטר על כל צינור חרוטי של 50 מ"ל ורטובה עם 2 מ"ל של חיץ BSA.
- עם סיום התוכנית, הסר את התנור ואת צינור C מן dissociator.
- הוסף 4 מ"ל של חיץ BSA לדגימה והחיל את התערובת על מסננת התא על הצינור החרוטי 50 מ"ל.
- מוסיפים 10 מ"ל של D-PBS לצינור C, סוגרים אותו ומסובבים את התמיסה בעדינות. יש למרוח אותו על מסננת התאים על הצינור החרוטי 50 מ"ל.
- יש להשליך את מסננת התא ואת צינור C. צנטריפוגה את המתלים ב 300 x g למשך 10 דקות ב 4 °C (64 °F). לאחר מכן, שאפו והשליכו את הסופרנאטנט.
7. פינוי פסולת
- בצעו החייאה של הכדור עם 1550 μL של D-PBS קר והעבירו את המתלים לצינור חרוטי מסומן של 15 מ"ל.
- הוסיפו 450 μL של תמיסת הסרת פסולת קרה ופיפטה למעלה ולמטה (אין מערבולת).
הערה: פתרון להסרת פסולת הוא מגיב בערכת הדיסוציאציה של בריאן למבוגרים המסחרית17. - שכבו בעדינות 1 מ"ל של D-PBS קר על גבי מתלה התא, והשאירו את הקצה על דופן הצינור החרוטי. חזור על הפעולה עד שהשכבה הכוללת תהיה 2 מ"ל.
הערה: שלב זה הוא קריטי; לבצע במיומנות ובמיומנות. - צנטריפוגה ב 3000 x g במשך 10 דקות ב 4 ° C עם האצה מלאה ובלם מלא.
הערה: אם השלבים אינם מופרדים בבירור, חזור על שלבים 7.2-7.3. צנטריפוגה בפעם האחרונה ב 1000 x g במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. - המתלים צריכים כעת להיות מורכבים משלוש שכבות נפרדות (איור 3). שאפו לשכבה העליונה ביותר. יש לטאטא את קצה הפיפטה קדימה ואחורה כדי לשאוף לשכבת האמצע הלבנה. הסר כמה שיותר מהשכבה האמצעית מבלי להפריע לשכבה התחתונה ביותר.
הערה: שלב זה הוא קריטי; לבצע במיומנות ובמיומנות. - הוסיפו 2 מ"ל של D-PBS קר ופיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב.
- צנטריפוגה ב 1000 x g במשך 10 דקות ב 4 ° C עם האצה מלאה בלם מלא. לשאוף ולהשליך את ה-supernatant. החזירו את הכדור ב-1 מ"ל של חיץ BSA.
הערה: ניתן לבצע שימוש חוזר בתאים במאגר המתאים ולאחר מכן לתייג ולבודד אותם באופן מגנטי כהכנה לריצוף של תא יחיד בשלב זה.
8. ספירת תאים
- בצע ספירת תאים בהתאם לפרוטוקול היצרן של מונה התאים הזמין (אפשרות אחת מצוינת בטבלת החומרים)
9. כתם חי/מת
- צנטריפוגה 900 μL הנותרים (מ 7.7) ב 1000 x g במשך 10 דקות ב 4 °C עם תאוצה מלאה בלם מלא.
- בזמן שהדגימה מסתובבת, סמן צינור זרימה אחד לכל דגימה ועטף אותו בנייר כסף כדי להגביל את החשיפה לאור.
- לשאוף ולהשליך את ה-supernatant.
- בצעו החייאה של הכדור ב-50 μL של כתם חי/מת מדולל (שהוכן בעבר).
הערה: שלב זה אמור להתבצע בתאורה חלשה. כבה את אורות החדר העיליים כדי להשיג זאת. - מעבירים כל דגימה לצינור הזרימה המסומן המתאים ומדגרים בטמפרטורת החדר למשך 8-10 דקות בחושך (למשל, מגירה או קופסה).
- הוסף 500 μL של בופר BSA וצנטריפוגה ב 1000 x g למשך 10 דקות ב 4 °C עם האצה מלאה ובלם מלא.
- לשאוף ולהשליך את ה-supernatant.
הערה: ייתכן שהכדור לא יהיה גלוי; להשאיר כמות קטנה של חיץ מאחור כדי לא לשאוף בלי כוונה את הכדור. ניתן לבצע שימוש חוזר בתאים במאגר המתאים, להיחסם ולהכתים אותם בנוגדנים ספציפיים לתאים בשלב זה. ראה קובץ משלים 1 לפרוטוקול לדוגמה18.
10. קיבוע (אופציונלי)
- בצעו החייאה של הכדור ב-200 μL של 1% PFA (שהוכן בעבר). אינקובציה למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
- לשטוף על ידי הוספת 500 μL של D-PBS וצנטריפוגה ב 300 x g במשך 10 דקות ב 4 °C (64 °F).
- לשאוף את הסופרנאטנט.
הערה: ייתכן שהכדור לא יהיה גלוי; להשאיר כמות קטנה של חיץ מאחור כדי לא לשאוף בלי כוונה את הכדור. - בצעו החייאה של הכדור ב-200 μL של D-PBS ואחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד 3 ימים.
11. ציטומטריית זרימה
- סמן את מכסי המסנן בצינורות החדשים.
- באמצעות פיפטה של 1 מ"ל, פיפטה כל דגימה על מכסה המסנן.
- צנטריפוגה לזמן קצר ב 200 x g ב 4 ° C, רק מאפשר צנטריפוגה להגיע 200 x g לפני עצירת הריצה.
- המשך לזרימה של ליבת ציטומטריה לניתוח במורד הזרם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הדגימות עובדו באמצעות ציטומטר זרימה במתקן ליבה, והנתונים שהתקבלו הוערכו באמצעות חבילת תוכנה לניתוח זרימה. בעבר נותחו בקרות פיצויים - הכתם החי/מת והשליטה השלילית. אם נעשה שימוש במספר פלואורוכרומים, יש להכין בקרות פלואורסצנטיות מינוס אחת (FMO) ובקרות של כתם יחיד עבור כל נוגדן. הפיצוי על החפיפה הספקטרלית של דגימות הניסוי חושב על סמך הפקדים שנותחו. לצורך זיהוי אוכלוסיית התאים, נעשה שימוש באסטרטגיית גידור היררכית. השער הראשי לא כלל פסולת בחלקת הפיזור הקדמי (גודל התא) לעומת הפיזור הצדדי (גרעיניות)19,20. לאחר מכן, התאים המתים לא נכללו (איור 4, איור 5, איור 6, איור משלים 1, איור משלים 2, איור משלים 3 ואיור משלים 4). השער הבא לא כלל תאים חיוביים לחלבון בסיסי של מיאלין (איור משלים 4). מבין התאים הנותרים, נוצרו חלקות צפיפות של תאים חיוביים לכל פלואורוכרום (איור משלים 4). התדירות של כל אוכלוסיית תאי עצב חושבה מתוך השער השלישי (איור משלים 4). דגימות שעובדו באמצעות דיסוציאציה מכנית ידנית21 ועיכול אנזימטי הניבו אוכלוסייה נמוכה משמעותית של תאים בעלי עניין (קובץ משלים 221, איור 4 ואיור משלים 1). לעומת זאת, הן דגימות קבועות והן דגימות טריות שהוכנו באמצעות דיסוציאציה מכנית אוטומטית ועיכול אנזימטי החזירו אוכלוסייה של תאים בעלי עניין גדולה פי כמה (איור 5, איור 6, איור משלים 2 ואיור משלים 3).
איור 1: מוח העכבר. (ב) לא חדור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: סטטוס נבחר בשלב 6.4. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: תרחיף תלת-שכבתי בשלב 7.5: מאגר (שכבה עליונה), פסולת תאים, תמיסה להסרת פסולת ותאים (שכבה תחתונה). לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ניתוח מייצג של דגימות קבועות שעובדו באמצעות שילוב של דיסוציאציה ידנית על ידי טריטורציה של פסטר פיפטה ועיכול אנזימטי. הראשונה מבין שתי דגימות מעובדות בו זמנית. (A) אחוז התאים שהם האוכלוסייה התאית המעניינת. (B) אחוז מאוכלוסיית בעלי העניין שהם תאים חיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: ניתוח מייצג של דגימות טריות שעובדו באמצעות שילוב של דיסוציאציה מכנית אוטומטית ועיכול אנזימטי. הראשונה מבין שתי דגימות מעובדות בו זמנית. (A) אחוז התאים שהם האוכלוסייה התאית המעניינת. (B) אחוז מאוכלוסיית בעלי העניין שהם תאים חיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 6: ניתוח מייצג של דגימות קבועות שעובדו באמצעות שילוב של דיסוציאציה מכנית אוטומטית ועיכול אנזימטי. הראשונה מבין שתי דגימות מעובדות בו זמנית. (A) אחוז התאים שהם האוכלוסייה התאית המעניינת. (B) אחוז מאוכלוסיית בעלי העניין שהם תאים חיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור משלים 1: ניתוח מייצג של דגימות קבועות שעובדו באמצעות שילוב של דיסוציאציה ידנית של טריטורציה של פסטר פיפטה ועיכול אנזימטי. השנייה מבין שתי דגימות שעובדו בו זמנית. (A) אחוז התאים שהם האוכלוסייה התאית המעניינת. (B) אחוז מאוכלוסיית בעלי העניין שהם תאים חיים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים 2: ניתוח מייצג של דגימות טריות שעובדו באמצעות שילוב של דיסוציאציה מכנית אוטומטית ועיכול אנזימטי. השנייה מבין שתי דגימות שעובדו בו זמנית. (A) אחוז התאים שהם האוכלוסייה התאית המעניינת. (B) אחוז מאוכלוסיית בעלי העניין שהם תאים חיים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים 3: ניתוח מייצג של דגימות קבועות שעובדו באמצעות שילוב של דיסוציאציה מכנית אוטומטית ועיכול אנזימטי. השנייה מבין שתי דגימות שעובדו בו זמנית. (A) אחוז התאים שהם האוכלוסייה התאית המעניינת. (B) אחוז מאוכלוסיית בעלי העניין שהם תאים חיים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים 4: ניתוח מייצג של דגימות מוכתמות וקבועות המעובדות באמצעות שילוב של דיסוציאציה מכנית אוטומטית ועיכול אנזימטי. (A) אחוז התאים שהם האוכלוסייה התאית המעניינת. (B) אחוז מאוכלוסיית בעלי העניין שהם תאים חיים. (C). MBP- תאים. (D). תאי PSA-NCAM+ (תאים מקדימים עצביים). (E). תאי ACSA2+ (אסטרוציטים). (F). תאי CD31+ (אנדותל). (G). CD11b+ תאים (Microglia). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 1: פרוטוקול צביעה. פרוטוקול צביעת דגימה לתפיסת חיסון של סמני פני השטח של התא. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 2: פרוטוקול דיסוציאציה מכנית ואנזימטית מותאם. שיטה זו מותאמת מפרוטוקול21 שפורסם בעבר. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מספר שלבים בפרוטוקול דיסוציאציה עצבית זו דורשים טכניקה מיומנת ומיומנות – פרפוזיה, שאיפה סופרנאטית והסרת מיאלין. לאורך כל תהליך הזלוף, האיברים הפנימיים חייבים להישאר שלמים (מלבד הסרת הסרעפת וגזירת הלב); זה כולל הימנעות מהחדרים העליונים של הלב עם מחט הפרפר. בעוד שכמות המלח עם הפרין הדרושה משתנה, נוזל שקוף הזורם מהלב מעיד על כך שהתהליך הושלם. המוח חייב להיות חדור לחלוטין ונכון, ואז הוא ייראה מחוץ ללבן (איור 1). עם זלוף, שלב הסרת תאי הדם האדומים הופך להיות חיצוני, ומבטל מניפולציה עודפת של הדגימות שיכולה לגרום לאובדן תאים. לאחר מכן, שלב הסרת הפסולת דורש יד יציבה. כדי שהצנטריפוגה תיצור שכבות מוגדרות בבירור בעקבות שכבת-העל של D-PBS (איור 3), אין להפריע לשכבות במעבר או בזמן הצינורות. בנוסף, כאשר שואפים את שתי השכבות העליונות, יש להסיר מספיק תרחיף כדי למנוע פסולת תאים מוגזמת ועדיין להשאיר מאחור דגימה גדולה מספיק. זהו צעד מפתח מכיוון שתאים מתים נוטים יותר להיקשר באופן לא ספציפי ולהפוך לאוטו-פלואורסצנטיים22,23, מה שמדגיש עוד יותר את החשיבות של בחירת שיטה שמביאה באופן עקבי לכדאיות גבוהה של התא. לבסוף, כאשר שואפים לסופרנטנט, הכדור לא תמיד נראה לעין. יש להשאיר כמות קטנה של שאריות של חומר-על שיורי כדי להבטיח שהדגימה לא תושלך בטעות.
ישנם יתרונות וחסרונות לתיקון הדוגמאות. לא כל סמני הנוגדנים תואמים לקיבוע, ומגבילים את הניתוח במורד הזרם בהתאם לאוכלוסיות התאים המעניינות. כמו כן, שימוש ב-PFA מרוכז יתר על המידה או השארת התאים במתקן למשך פרק זמן ממושך יכולים לגרום לפלפולציה אוטומטית ולקריאות חיוביות כוזבות, ובכך לבלבל את התוצאות 24,25. על ידי שימוש בתמיסת PFA של 1% ומזעור החשיפה של התאים, הסבירות לקריאות חיוביות כוזבות מצטמצמת מאוד. מכיוון שהליך זה מפורט וכולל משתני תזמון רבים, השימוש בתאים טריים מציב את המעבדות תחת אילוצי זמן קפדניים כדי להבטיח שהתאים יישארו בני קיימא. קיבוע משמר את מבנה התא לניתוח למחרת.
ניתוח של תאים בודדים יכול לספק תובנות מרכזיות לגבי יעילות הטיפול, תפקוד התאים ומנגנוני הפעולה של מחלות או טיפולים. שיטות לדוגמה כוללות ריצוף דנ"א חד-תאי ורנ"א 26,27, ציטומטריה לפי זמן טיסה 22,28, ציטומטריה של זרימה ואימונוהיסטוכימיה. עם ריצוף mRNA של תא יחיד, ביטוי גנים בזמן איסוף הדגימה יכול לספק תובנות ספציפיות לסוג התא26. לדוגמה, קבוצת מחקר ביצעה ריצוף RNA חד-תאי על קולטני דופמין D1 ו-D2 המבטאים תתי-סוגים של תאי עצב קוצניים בינוניים מסטריאטוםדורסומדיאלי 27. הקבוצה הגדירה מחדש את השעתוק של נוירונים קוצניים בינוניים על ידי זיהוי גנים חדשים של סמנים ספציפיים לתת-סוג וזיהוי גנים שדווחו בעבר ובאופן שגוי כמבוטאים באופן דיפרנציאלי בשל היעדר רזולוציה של תא יחיד27. Ho et al. הדגישו את הפוטנציאל של ריצוף RNA חד-תאי בגילוי מטרות תרופה ספציפיות לסוג התא27. באמצעות ריצוף דנ"א חד-תאי, ניתן לתאר שינויים בביטוי גנים על ידי מדידת שינויים בדנ"א ובהיסטון, נגישות כרומטין וקונפורמיזציה של כרומטין26. במדידת מתילציה של דנ"א של גרעין יחיד, ליו ואחרים בנו אטלס מתילום של דנ"א חד-תאי של 45 אזורי מוח של עכברים וזיהו 161 סוגי תאים עצביים29. הכנת דגימות לריצוף חד-תאי מורכבת יותר, במיוחד בידוד של תאים בודדים ופינוי פסולת. Mattei et al. בחנו את ההשפעה של דיסוציאציה אנזימטית ומכנית על פרופילי תעתיק ופרוטאוטיפים, וציינו כי שיטות דיסוציאציה עצביות מציגות מטבען רמה של הטיה30. מספר קבוצות ציינו את החשיבות של עבודה יעילה, ניתוח על קרח ושימוש במעכבי שעתוק 26,30,31. Mattei et al. זיהו גם גנים וחלבונים מושפעים כדי ליידע את הניתוח30. עם זאת, טכניקות אלה עדיין מספקות תובנות מפורטות על אבני בניין תאיות שאין להן מתחרות בתעתיקשל רקמות בתפזורת 26,27.
ציטומטריית זרימה היא כלי אנליטי רב עוצמה שיכול לזהות ולמדוד בו זמנית פרמטרים של אוכלוסיות חד-תאיות באמצעות בדיקות פלואורסצנטיות. יישומים מסוימים של ציטומטרים של זרימה כוללים ניתוח מחזורי תאים, מיון תאים, כדאיות, פנוטיפ, התפשטות תאים וניתוחים פונקציונליים32,33. רוב היישומים הללו משתמשים בצביעת פני השטח בשל הנגישות של חלבוני פני השטח של התא. חלבונים אלה יכולים להיות מוכתמים כדי לזהות אוכלוסיות תאים ספציפיות המבוססות על שושלת, שלב התפתחותי ותפקוד 19,32,33. לדוגמה, דגימות יכולות להיות מוכתמות על פני השטח כדי לזהות אוכלוסיות של אסטרוציטים, תאי אנדותל, תאים מקדימים עצביים ומיקרוגליה34. יתרון עיקרי בעת צביעת חלבוני פני השטח של תאים חיים הוא היכולת למיין את התאים תוך שמירה על האפשרות לבצע ניתוח נוסף במורד הזרם34. בעוד שטכניקות צביעת פני השטח הן סטנדרטיות למדי, צביעה תוך תאית היא הליך עדין יותר. עם ציטומטריה של זרימה תוך-תאית, התאים חייבים להיות קבועים ומחלחלים לפני הכתם כדי לאפשר לנוגדן לחצות את קרום התא 20,32,33,34. באופן אידיאלי, המורפולוגיה של התא תישאר שלמה; עם זאת, חדירה מסתכנת בדנטורציה של חלבונים, אשר תשפיע לרעה על זיהוי נוגדנים 22,34. שיטות מסוימות של ניתוח נוסף במורד הזרם אינן מהוות עוד אפשרות לאחר שהתאים קבועים20. בעוד שהחסרונות של צביעה תוך-תאית בולטים יותר מכתמים על פני השטח, הראשון מאפשר זיהוי וניתוח של מולקולות תוך-תאיות שאחרת לא היו מתקבלות על הדעת. בנוסף, ניתן להצמיד את נהלי הכתם של פני התאים והתוך-תאיים כדי לזהות באופן סופי סוגי תאים מסוימים או להעריך פרמטרים נוספים בו-זמנית 20,28,34.
ישנן מספר שיטות של דיסוציאציה עצבית שניתן להשתמש בהן כדי להכין את ההשעיה החד-תאית הנדרשת לניתוח תאי, אם כי הן אינן יעילות באותה מידה. בהשוואה לערכות סטנדרטיות ולטכניקות הנ"ל, שיטה מסוימת זו של דיסוציאציה עצבית מיועדת לעיבוד כמויות קטנות של רקמות, מניבה תרחיף חד-תאי בר-קיימא (>90%), ומייעלת את הניסוי. עם פרוטוקול זה, מעבדות אחרות מצוידות לבצע דיסוציאציה עצבית באופן אמין וניתן לשחזור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים לאיימי רוג'רס על מתן הדרכה מעשית ותמיכה מתמשכת במוצרים. אנו מודים לד"ר אמנדה בורק על פתרון הבעיות וההבהרה המתמשכים של הדיונים. אנו מודים למרדית יוהיים ולקבוצת התקשורת המדעית של UAMS על העריכה והעיצוב הדקדוקיים של כתב יד זה. מחקר זה נתמך על ידי NIH R25GM083247 ו- NIH 1R01CA258673 (A.R.A).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 02-682-003 | Basix, assorted color |
| 15 mL Falcon Tubes | Becton Dickinson Labware Europe | 352009 | Polystyrene |
| 25 mL Serological Pipets | Fisher Scientific | 14-955-235 | |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Falcon | 352052 | |
| 500 mL Vacuum Filter/ Storage Bottle System | Corning | 431097 | |
| 70 μm cell strainer | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Adult Brain Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-107-677 | Contains Enzyme P, Buffer Z, Buffer Y, Enzyme A, Buffer A, Debris Removal Solution |
| Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-105 | |
| Anti-ACSA-2-PE-Vio770, mouse, clone REA969 | Miltenyi Biotec | 130-116-246 | |
| Anti-Myelin Basic Protein | Sigma-Aldrich | M3821-100UG | |
| Anti-PSA-NCAM-PE, human, mouse and rat, Clone 2-2B | Miltenyi Biotec | 130-117-394 | |
| BD LSRFortessa | BD | ||
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906-50G | |
| CD11b-VioBlue, mouse, Clone REA592 | Miltenyi Biotec | 130-113-810 | |
| CD31 Antibody | Miltenyi Biotec | 130-111-541 | |
| Ceramic Hot Plate Stirrer | Fisher Scientific | 11-100-100SH | |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Ethanol | Pharmco by Greenfield Global | 111000200 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Fine Scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | Perfusion |
| FlowJo | BD | (v10.7.0) | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Gibco DPBS (1X) | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| Glass Beaker | Fisher Scientific | 02-555-25A | |
| Heparin sodium | Fresenius Kabi | 504011 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher | L34965 | |
| Magnetic Stir Bar | Fisher Scientific | 14-513-51 | |
| Noyes Spring Scissors | Fine Science Tools | 15012-12 | Dissection |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 441244-3KG | Prilled, 95% |
| Pipette tips GP LTS 20 µL 960A/10 | Rainin | 30389270 | |
| Pipette Tips GP LTS 250 µL 960A/10 | Rainin | 30389277 | |
| Pipette tips RT LTS 1000 µL FL 768A/8 | Rainin | 30389213 | |
| Rainin Pipet-Lite XLS (2, 20, 200, 1000 μL) | Rainin | 30386597 | |
| RBXMO FITC XADS | Fisher Scientific | A16167 | |
| Round Ice Bucket with Lid | Fisher Scientific | 07-210-129 | |
| Round-Bottom Tubes with Cell Strainer Cap | Falcon | 100-0087 | |
| S1 Pipet Fillers | ThermoFisher Scientific | 9541 | |
| Spatula & Probe | Fine Science Tools | 10090-13 | Dissection & Perfusion |
| Surflo Winged Infusion Set 23 G x 3/4" | Termuno | SV-23BLK | Butterfly needle |
| Test Tube Rack | Fisher Scientific | 14-809-37 | |
| Thermo Scientific Legend XTR Centrifuge | ThermoFisher | discontinued | Or other standard table top centrifuge |
| Variable-Flow Peristaltic Pump | Fisher Scientific | 13-876-2 | Low-flow model |
| VetFlo Starter Kit for Mice | Kent Scientific | VetFlo-MSEKIT | Anesthesia mask, tubing, induction chamber, charcoal canisters |
| VetFlo Vaporizer Single Channel Anesthesia System | Kent Scientific | VetFlo-1210S | 0.2–4 LPM |
| Vi-CELL XR Cell Viability Analyzer | Beckman Coulter Life Sciences | 731196 | Cell Counting |
| Vi-CELL XR 4 Bags of Sample Vials | Beckman Coulter Life Sciences | 383721 | Cell Counting |
References
- Andersen, P., Morris, R., Amaral, D., Bliss, T., O'Keefe, J. The Hippocampus Book. , Oxford University Press, Inc. (2007).
- Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. Genetic influence on neurogenesis in the dentate gyrus of adult mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 10409-10414 (1997).
- Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. Mechanisms and Functional Implications of Adult Neurogenesis. Cell. 132, 645-660 (2008).
- Kempermann, G., Song, H., Gage, F. H. Neurogenesis in the adult hippocampus. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, 018812 (2015).
- Bond, A. M., Ming, G. L., Song, H. Adult mammalian neural stem cells and neurogenesis: Five decades later. Cell Stem Cell. 17, 385-395 (2015).
- Sato, K. Effects of microglia on neurogenesis. Glia. 63, 1394-1405 (2015).
- Lee, V. M., Scientist, S., Louis, S. A., Reynolds, B. A. Neural stem cells. , Available from: http://www.stemcell.com/media/files/minireview/MR29019-Neural_Stem_Cells.pdf (2015).
- Mu, Y., Lee, S. W., Gage, F. H. Signaling in adult neurogenesis. Current Opinion in Neurobiology. 20, 416-423 (2010).
- Fares, J., Diab, Z. B., Nabha, S., Fares, Y. Neurogenesis in the adult hippocampus: history, regulation, and prospective roles. International Journal of Neuroscience. 129, 598-611 (2018).
- Tosun, M., Semerci, F., Maletic-Savatic, M. Heterogeneity of stem cells in the hippocampus. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1169, 31-53 (2019).
- Abbott, L. C., Nigussie, F. Adult neurogenesis in the mammalian dentate gyrus. Journal of Veterinary Medicine Series C: Anatomia Histologia Embryologia. 49, 3-16 (2020).
- Rodrigues, G. M., Fernandes, T. G., Rodrigues, C. A., Cabral, J. M., Diogo, M. M. Purification of human induced pluripotent stem cell-derived neural precursors using magnetic activated cell sorting. Methods in Molecular Biology. 1283, Clifton, N.J. 137-145 (2015).
- Ko, I. K., Kato, K., Iwata, H. Parallel analysis of multiple surface markers expressed on rat neural stem cells using antibody microarrays. Biomaterials. 26, 4882-4891 (2005).
- Jager, L. D., et al. Effect of enzymatic and mechanical methods of dissociation on neural progenitor cells derived from induced pluripotent stem cells. Advances in Medical Sciences. 61 (1), 78-84 (2017).
- Volovitz, I., et al. A non-aggressive, highly efficient, enzymatic method for dissociation of human brain-tumors and brain-tissues to viable single-cells. BMC Neuroscience. 17, 1-10 (2016).
- Reiß, S., Herzig, I., Schmitz, J., Bosio, A., Pennartz, S. Semi-automated tissue dissociation and preserved epitope integrity optimize immunomagnetic sorting of neural cells. , Available from: www.miltenyibiotec.com (2021).
- Adult brain dissociation kit: mouse and rat. Miltenyi Biotec. , Available from: https://www.miltenyibiotec.com/upload/assets/IM0011920.pdf (2020).
- Cell surface flow cytometry staining protocol. Miltenyi Biotec. , Available from: https://www.miltenyibiotec.com/US-en/applications/all-protocols/cell-surface-flow-cytometry-straining-protocol-pbs-bsa-1-50.html (2021).
- Finak, G., Jiang, W., Gottardo, R. CytoML for cross-platform cytometry data sharing. Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 93, 1189-1196 (2018).
- Turaç, G., et al. Combined flow cytometric analysis of surface and intracellular antigens reveals surface molecule markers of human neuropoiesis. PLoS One. 8, 1-14 (2013).
- Schwarz, J. M. Using fluorescence activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52537 (2015).
- Brummelman, J. application and computational analysis of high-dimensional fluorescent antibody panels for single-cell flow cytometry. Nature Protocols. 14, 1946-1969 (2019).
- Recommended controls for flow cytometry. Abcam. , Available from: https://www.abam.com/protocols/recommended-conntrols-for-flow-cytometry (2021).
- Fixing cells with paraformaldehyde (PFA) for flow cytometry. , Available from: https://flowcytometry.utoronto.ca/wp-content/uploads/2016/02/FixingCells_PFA.pdf (2021).
- Stewart, J. C., Villasmil, M. L., Frampton, M. W. Changes in fluorescence intensity of selected leukocyte surface markers following fixation. Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 71, 379-385 (2007).
- Armand, E. J., Li, J., Xie, F., Luo, C., Mukamel, E. A. Single-cell sequencing of brain cell transcriptomes and epigenomes. Neuron. 109, 11-26 (2021).
- Ho, H., et al. A guide to single-cell transcriptomics in adult rodent brain: The medium spiny neuron transcriptome revisited. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 1-16 (2018).
- Li, L., et al. Novel technologies in studying brain immune response. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 6694566 (2021).
- Liu, H., et al. DNA methylation atlas of the mouse brain at single-cell resolution. bioRxiv. , (2020).
- Mattei, D., et al. Enzymatic dissociation induces transcriptional and proteotype bias in brain cell populations. International Journal of Molecular Sciences. 21, 1-20 (2020).
- Liu, L., et al. Dissociation of microdissected mouse brain tissue for artifact free single-cell RNA sequencing. STAR Protocols. 2 (2), 100590 (2021).
- Delmonte, O. M., Fleisher, T. A. Flow cytometry: Surface markers and beyond. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 143, 528-537 (2019).
- O'Connor, J. E., et al. The relevance of flow cytometry for biochemical analysis. IUBMB Life. 51, 231-239 (2001).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. Journal of Visualized. Experiments. (94), e52241 (2014).
