Summary
Denne neurale celle dissociationsprotokol er beregnet til prøver med en lav mængde udgangsmateriale og giver en meget levedygtig enkeltcellesuspension til downstream-analyse med valgfri fikserings- og farvningstrin.
Abstract
Denne neurale dissociationsprotokol (en tilpasning af protokollen, der ledsager et kommercielt voksent hjernesociationssæt) optimerer vævsbehandling som forberedelse til detaljeret downstream-analyse såsom flowcytometri eller enkeltcellesekventering. Neural dissociation kan udføres via mekanisk dissociation (såsom anvendelse af filtre, huggeteknikker eller pipettetrituration), enzymatisk fordøjelse eller en kombination heraf. Den delikate karakter af neuronale celler kan komplicere bestræbelserne på at opnå den meget levedygtige, ægte enkeltcellesuspension med minimalt cellulært affald, der kræves til enkeltcelleanalyse. Dataene viser, at denne kombination af automatiseret mekanisk dissociation og enzymatisk fordøjelse konsekvent giver en meget levedygtig (>90%) enkeltcellesuspension, der overvinder de ovennævnte vanskeligheder. Mens et par af trinene kræver manuel fingerfærdighed, mindsker disse trin prøvehåndtering og potentielt celletab. Dette manuskript beskriver hvert trin i processen for at udstyre andre laboratorier til med succes at adskille små mængder neuralt væv som forberedelse til downstream-analyse.
Introduction
Hippocampus blev først beskrevet af en bolognesisk anatom, Giulio Cesare Aranzio, i 1500-tallet1. Ved at navngive denne nyfundne struktur blev Aranzio sandsynligvis inspireret af dens uhyggelige lighed med søhesten af slægten Hippocampus1. Hippocampus er involveret i stressreaktioner, men er kendt for sin rolle i læring og hukommelse. Mere specifikt er hippocampus ansvarlig for kodning og hentning af deklarativ og rumlig hukommelse1.
Hippocampus, eller hippocampus korrekt, er opdelt i CA1 (cornu ammonis), CA2 og CA3 underfelt1. Sammenlignet med resten af nervesystemet har hippocampus flere unikke definerende egenskaber, herunder dets plasticitet og potentiale for igangværende neurogenese2. Neurogenese er processen med spredning og differentiering af neurale stamceller efterfulgt af deres integration i det allerede eksisterende neuronale netværk. Neurogenese er begrænset til den subgranulære zone af dentate gyrus og subventrikulær zone i laterale ventrikler (og de olfaktoriske pærer)3. Mens neurogenese er rigelig i embryogenese, er det en livslang proces 3,4. Som sådan vil denne diskussion fokusere på voksen neurogenese i hippocampus.
De subventrikulære og subgranulære zoner er neurogene nicher, der indeholder ependymale og vaskulære celler samt umodne og modne slægter af neurale stamceller5. Microglia bidrager til disse nicher som immunceller til at regulere neurogenese6. Neurale stamceller er ikke-stamcelleafkom af neurale stamceller7. Tre typer neurale forfædre er til stede i den subventrikulære zone: radiale glia-lignende type B-celler, type C-transitforstærkende forfædre og type A-neuroblaster 3,8. De langsomt opdelende type B neurale stamceller i den subventrikulære zone kan differentiere sig til hurtigt at opdele type C-celler8. Derefter differentieres type C-celler til type A-celler8. Disse neuroblaster migrerer gennem den rostrale migrationsstrøm til den olfaktoriske pære, før de differentieres til interneuroner eller oligodendrocytter9. Disse olfaktoriske pæreinterneuroner er nøglen til olfaktorisk korttidshukommelse og associativ læring, mens oligodendrocytterne myelzinat axoner af corpus callosum9. Størstedelen af voksen neurogenese forekommer i den subgranulære zone af dentate gyrus, hvor radial type 1 og ikke-radiale type 2 neurale forfædre findes3. De fleste neurale stamceller er bestemt til at blive dentate granul neuroner og astrocytter10. Forbundet med gap-kryds danner astrocytter netværk for at modulere plasticitet, synaptisk aktivitet og neuronal excitabilitet5. Som den primære excitatoriske neuron af dentate gyrus giver granulatceller input fra den entorhinale cortex til CA3-regionen11.
Neurale stamcellepopulationer kan isoleres ved hjælp af immunmagnetiske eller immunofluorescerende isolationsstrategier12,13. Neuralt væv er særligt vanskeligt at dissociere; Bestræbelser på at gøre dette resulterer ofte i prøver med dårlig cellelevedygtighed og/ eller undlader at producere den nødvendige enkeltcellesuspension til downstream-analyse. Neural dissociation kan udføres via mekanisk dissociation (såsom brug af filtre, huggeteknikker eller pipettetrituration), enzymatisk fordøjelse eller en kombination af teknikker14,15. I en undersøgelse, der evaluerede neurale dissociationsmetoder, blev levedygtigheden og kvaliteten af manuel mekanisk dissociation ved pipettetrituration versus kombinationer af pipettetrituration og fordøjelse med forskellige enzymer sammenlignet15. Kvaliteten blev bedømt ud fra mængden af celleklumper og DNA eller subcellulært affald i den forberedte suspension15. Suspensioner af gliatumorer, der blev udsat for manuel mekanisk dissociation alene, havde signifikant lavere cellelevedygtighed end behandlinger med dispase eller en kombination af DNase, kollagenase og hyaluronidase15. Volovitz et al. anerkendte variationen i levedygtighed og kvalitet mellem de forskellige metoder og understregede, at utilstrækkelig dissociation kan reducere nøjagtigheden af downstream-analyse15.
I en separat undersøgelse sammenlignede forfatterne over 60 forskellige metoder og kombinationer af dissociation af dyrkede neuronale celler14. Disse metoder omfattede otte forskellige variationer af manuel mekanisk dissociation ved pipettetrituration, en sammenligning af inkubation med fem individuelle enzymer med tre forskellige intervaller og forskellige kombinationer af mekanisk dissociation med enzymatisk fordøjelse eller kombinationen af to enzymer14. Ingen af de mekaniske metoder gav en enkeltcellesuspension14. Fire af enkeltenzymbehandlingerne, ti af de kombinationsenzymatiske behandlinger og fire af kombinationerne af mekanisk dissociation med enzymatisk fordøjelse gav en enkeltcellesuspension14. Enzymatisk fordøjelse med TrypLE efterfulgt af Trypsin-EDTA mest effektivt dissocierede prøver14. I øvrigt havde prøver behandlet med TrypLE og/eller Trypsin-EDTA en tendens til at danne gelatinøse klumper14. Mens denne undersøgelse blev udført på dyrkede celler, taler den om manglerne ved pipettetrituration eller enzymatisk fordøjelse alene.
Side om side-sammenligninger af manuel versus automatiseret mekanisk dissociation mangler. Imidlertid kørte en gruppe flowcytometri for at sammenligne manuel og halvautomatisk mekanisk dissociation af hele musehjerner i forbindelse med kommerciel papain eller trypsin enzymatisk dissociationssæt16. Behandling med dissociatoren gav mere konsekvent levedygtige celler16. Efter dissociation isolerede forfatterne også Prominin-1-celler, neuronale forløberceller og microglia16. For to af de tre isolerede cellepopulationer var renheden af de isolerede celler lidt højere, når prøver blev behandlet med dissociatoren, sammenlignet med manuelt16. Reiß et al. bemærkede, at person-til-person variabilitet i pipetteringsteknik hindrer reproducerbarheden af levedygtigt cellepopulationsudbytte i vævssociation16. Forfatterne konkluderede, at automatiseret mekanisk dissociation standardiserer prøvebehandling16.
Metoden til dissociation, der er skitseret i dette manuskript, er en kombination af fuldautomatisk mekanisk dissociation og enzymatisk fordøjelse ved hjælp af løsninger, der ledsager et kommercielt voksenhjernedistsociationssæt17. I modsætning til standardprotokoller reducerer denne optimerede protokol prøvemanipulation, giver en meget levedygtig enkeltcellesuspension og er beregnet til behandling af minimale mængder startvæv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Eksperimenter blev udført i overensstemmelse med de etiske standarder, der er godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved UAMS. 6 måneder gamle C57Bl6/J-hunmus af vildtypen blev købt og gruppeopmandet (4 mus pr. bur) under en konstant 12 timers lys/mørk cyklus.
1. Fremstilling af reagenser
- Forbered fixerbar levende / død plet lageropløsning. Rekonstituer den fluorescerende plet med 20 μL dimethylsulfoxid (DMSO).
- Pak hætteglasset ind i folie, mærk det som "Rekonstitueret", og opbevar det ved -20 °C i op til seks måneder.
- Forbered en 0,9% saltopløsning med heparin. Fortynd indholdet af et hætteglas med heparinnatrium (10.000 USP-enheder pr. 10 ml) i 1 liter dobbeltdestilleret vand (ddH20).
- Forbered dig nok til ca. 45 ml pr. dyr og opbevar ved 4 °C i op til en uge.
- Lav 1% paraformaldehyd (PFA).
- Opvarm en kogeplade i en stinkhætte til 50 °C. I en mikrobølgeovn opvarmes 100 ml ddH2O i et glasbægerglas til ca. 60 °C. Tilsæt en magnetisk omrøringsstang og overfør til kogepladen.
- I stinkhætten vejes 1 g PFA ud og tilsættes til bægerglasset ddH2O. Tilsæt 0,1125 g NaOH-krystaller og bland, indtil de er opløst (5-10 min).
- Tilsæt 0,4 g NaPO4- monobasisk og bland, indtil det er opløst (2-5 min). Vakuumfiltrer opløsningen og juster pH til 7,4 med HCl og NaOH.
- Afkøl på is eller ved 4 °C i 30 minutter inden opbevaring.
BEMÆRK: Aliquots på 1,5 ml kan opbevares ved -20 °C i et år. Undgå fryse-optøningscyklusser. Hvis opløsningen efter optøning bliver overskyet eller der er dannet et bundfald, bør opløsningen ikke anvendes.
FORSIGTIG: Giftig, brandfarlig. Arbejd altid med PFA under en ventileret hætte iført passende personlige værnemidler.
- Resuspend lyofiliseret enzym A med 1 ml buffer A. Hvirvel ikke opløsningen.
BEMÆRK: Enzym A og Buffer A samt Buffers A, Y og Z er reagenser i det kommercielle Adult Brain Dissociation Kit17. - Opdel enzym P i alikvoter på 50 μL og resuspend enzym A i 10 μL aliquots. I henhold til kitinstruktioner opbevares det ved -20 °C i op til seks måneder. Undgå fryse-optøningscyklusser.
2. Eksperimentets dag
- Bordpladecentrifugen afkøles til 4 °C.
- Anbring Alikvote(r) pfa i køleskabet for gradvis optøning.
- Placer den rekonstituerede levende/døde plet i mørket (f.eks. en skuffe) for at tø op ved stuetemperatur.
- Forbered kvæg serumalbumin (BSA) Buffer. Der tilsættes 0,5 g BSA til 100 ml 1x Dulbeccos phosphatbufrede opløsning uden calcium og magnesium (D-PBS), pH 7,2.
- Tilsæt en omrøringsstang og bland på en røreplade i 30 min. Overfør til 50 ml koniske rør og opbevar ved 4 °C.
BEMÆRK: Brug altid frisklavet BSA-buffer. - Forbered levende/døde pletter, der arbejder fortynding. Tilsæt 1 μL af den rekonstituerede levende/døde pletstækkeopløsning til 360 μL D-PBS, og opbevar den i mørke (f.eks. en skuffe eller kasse) ved stuetemperatur. Der fremstilles 50 μL af arbejdsfortyndingen pr. prøve.
3. Perfusion
- Læg saltopløsningen med heparin på is.
- Tænd for ilt, indstil flowmålerindikatorkuglen på smådyrsbedøvelsesfordampningssystemet til 1 L / min. Sørg for, at der er tilstrækkeligt ilttryk og isofluran.
- Juster fordamperhjulet til 3,5% (til induktion og vedligeholdelse).
- Prim perfusionspumpelinjerne med saltvand/heparinopløsningen. Indstil hastigheden til 6 ml/min.
- Placer musen i induktionskammeret, tænd for udluftningen, og vent flere minutter, indtil musen ikke reagerer. Bekræft tilstrækkelig dybde af anæstesi gennem fravær af pedal tilbagetrækning til skadelig knivspids.
- Placer musen på ryggen på dissektionsbakken med næsen i næsekeglen. Udfør en sekundær bekræftelse af fuld anæstesi gennem fravær af pedal tilbagetrækning til skadelig knivspids. Fastgør alle fire poter til bakken.
- Sprøjt dyrets mave med 20% ethanol.
- Brug tang til at klemme underlivet og løfte huden. Brug en saks til at skære gennem pels og hud til bunden af brystkassen.
- Lav to diagonale snit under brystkassen mod hver skulder.
- Resekter forsigtigt membranen (undgå lungerne og hjertet). Resect brystkassen for at udsætte hjertet.
- Skær forsigtigt bindevæv omkring hjertet.
BEMÆRK: Trin 3.10-3.11 er kritiske; udføre med dygtighed og fingerfærdighed. - Brug saksen til at klippe højre atrium (mørk lap øverst til venstre i hjertet). Sluk for strømmen af isofluran til udluftningsluften.
- Hold hjertet stabilt med tang. Med sommerfuglnålens skråning vendt op, skal du gennembore venstre ventrikel, mens du holder nålen i niveau og parallelt med dyret.
- Hold nålen på plads, tænd pumpen, og perfus mindst 30 ml af saltvand / heparinopløsningen, indtil væsken, der forlader hjertet, er uigennemsigtig og leveren og lungerne blege i farven.
BEMÆRK: Trin 3.13-3.14 er kritiske; udføre med dygtighed og fingerfærdighed. - Sluk for pumpen, fjern nålen, og overfør musen til dissektionsområdet.
4. Dissektion
- Brug en stor kirurgisk saks til at halshugge hovedet.
- Skær pelsen fra bagsiden af hovedet op til øjnene. Skræl huden tilbage for at udsætte kraniet.
- Klip kraniet mellem øjnene. Lav to snit på bagsiden af kraniet, ved 10 og 2 o'clock positionerne, og lav derefter et langt snit (hold spidserne op for at undgå at beskadige hjernen) langs kraniets midterste linje til det oprindelige snit mellem øjnene.
- Brug tang til at skrælle de to halvdele af kraniet væk til siderne. Brug en spatel til at fjerne hjernen og læg den i en 60 mm glas petriskål på is fyldt med kold D-PBS (figur 1).
- Brug en skalpel eller barbermaskine til at adskille hver halvkugle. Fjern derefter de olfaktoriske pærer og cerebellum.
- Brug tang til at fjerne midterhjernen, indtil hippocampus er udsat.
- Fastgør hjernen med tang. Brug et andet sæt tang til forsigtigt at drille hippocampus ud af hver halvkugle og overføre begge hippocampi til et mærket 1,5 ml rør indeholdende koldt D-PBS.
- Prøverøret, der indeholder de to hippocampi fra musen, anbringes på is.
5. Forbered enzymblanding 1 og 2 for hver prøve
BEMÆRK: For volumener større end 2 ml skal du bruge en 10 ml serologisk pipette; for volumener, 200 μL-2 ml, brug en 1000 μL pipette; for volumener, 21-199 μL, brug en 200 μL pipette; for volumener, 2-20 μL, brug en 20 μL pipette; For volumener under 2 μL anvendes en 0-2 μL pipette.
- For hver prøve optøes en alikvote hver af enzym P og enzym A ved stuetemperatur.
- Til enzymblanding 1 kombineres 50 μL enzym P og 1900 μL buffer Z i et mærket C-rør (table of materials).
- For enzymblanding 2 tilsættes 20 μL buffer Y til den optøede 10 μL alikvote af enzym A.
6. Voksen hjerne dissociationsprotokol17
BEMÆRK: Ved arbejde med prøver skal rørene placeres i et rørstativ ved stuetemperatur, mens BSA og D-PBS forbliver på is, medmindre andet er angivet.
- Tænd for dissociatoren.
- Brug tang til at overføre hippocampi-vævsstykkerne til C-røret.
- Overfør 30 μL enzymblanding 2 til C-røret. Drej hætten, indtil spændingen mærkes, og stram derefter, indtil den klikker.
- Anbring C-røret på hovedet i en position af dissociatoren; prøven tildeles statussen Valgt (figur 2). Fastgør varmeapparatet over C-røret.
- Tryk på mappeikonet, vælg mappen Favoritter , rul til og vælg 37C_ABDK_02 program . Klik på OK for at anvende programmet på alle valgte C-rør, og tryk derefter på Start (figur 2).
- Mærk et 50 ml konisk rør pr. Prøve.
- Anbring en 70 μm cellesil på hvert 50 ml konisk rør og våd med 2 ml BSA-buffer.
- Når programmet er afsluttet, skal du fjerne varmelegemet og C-røret fra dissociatoren.
- Der tilsættes 4 ml BSA-buffer til prøven, og blandingen påføres cellesilen på det koniske rør på 50 ml.
- Tilsæt 10 ml D-PBS til C-røret, luk det, og hvirvl opløsningen forsigtigt. Påfør det på cellesilen på det 50 ml koniske rør.
- Kassér cellesilen og C-røret. Centrifugering af suspensionen ved 300 x g i 10 minutter ved 4 °C. Derefter aspirerer og kassér supernatanten.
7. Fjernelse af snavs
- Resuspend pellet med 1550 μL kold D-PBS og overfør suspensionen til et mærket 15 ml konisk rør.
- Tilsæt 450 μL kold snavs Removal Solution og pipette op og ned (ikke hvirvel).
BEMÆRK: Affaldsfjernelsesløsning er et reagens i det kommercielle Voksen Brian Dissociation Kit17. - Overlejr forsigtigt 1 ml kold D-PBS oven på celleophænget, og hold spidsen mod væggen i det koniske rør. Gentag, indtil den samlede overlejring er 2 ml.
BEMÆRK: Dette trin er kritisk; udføre med dygtighed og fingerfærdighed. - Centrifuge ved 3000 x g i 10 min ved 4 °C med fuld acceleration og fuld bremsning.
BEMÆRK: Hvis faserne ikke er tydeligt adskilt, skal du gentage trin 7.2-7.3. Centrifugering en sidste gang ved 1000 x g i 10 minutter ved 4 °C. - Suspensionen skal nu bestå af tre forskellige lag (figur 3). Aspirer det øverste lag. Fej pipettespidsen frem og tilbage for at aspirere det hvide mellemlag. Fjern så meget af mellemlaget som muligt uden at forstyrre det nederste lag.
BEMÆRK: Dette trin er kritisk; udføre med dygtighed og fingerfærdighed. - Tilsæt 2 ml kold D-PBS og pipette op og ned for at blande.
- Centrifuge ved 1000 x g i 10 min ved 4 °C med fuld acceleration og fuld bremsning. Aspirer og kassér supernatanten. Resuspend pelleten i 1 ml BSA-buffer.
BEMÆRK: Celler kan resuspenderes i den relevante buffer og derefter magnetisk mærket og isoleret som forberedelse til enkeltcellesekventering på dette tidspunkt.
8. Antal celler
- Udfør celletælling i henhold til producentens protokol for tilgængelig celletæller (en mulighed er angivet i materialetabellen)
9. Levende / død plet
- Centrifugering af de resterende 900 μL (fra 7,7) ved 1000 x g i 10 minutter ved 4 °C med fuld acceleration og fuld bremsning.
- Mens prøven spinder, skal du mærke et flowrør pr. Prøve og pakke det ind i folie for at begrænse lyseksponeringen.
- Aspirer og kassér supernatanten.
- Genbrug pillen i 50 μL fortyndet levende/død plet (tidligere forberedt).
BEMÆRK: Dette trin skal udføres i omgivelser med svagt lys. Sluk for ovenlys i rummet for at opnå dette. - Overfør hver prøve til det tilsvarende mærkede flowrør og inkuber ved stuetemperatur i 8-10 minutter i mørke (f.eks. En skuffe eller kasse).
- Der tilsættes 500 μL BSA-buffer og centrifuge ved 1000 x g i 10 minutter ved 4 °C med fuld acceleration og fuld bremsning.
- Aspirer og kassér supernatanten.
BEMÆRK: Pillen er muligvis ikke synlig; efterlad en lille mængde buffer bagved for ikke utilsigtet at aspirere pelleten. Celler kan resuspended i den relevante buffer, blokeres og farves med cellespecifikke antistoffer på dette tidspunkt. Se Supplerende fil 1 for eksempelprotokol18.
10. Fiksering (valgfrit)
- Resuspend pelleten i 200 μL af 1% PFA (tidligere forberedt). Inkuber i 15 minutter ved 4 °C.
- Vask ved tilsætning af 500 μL D-PBS og centrifuge ved 300 x g i 10 minutter ved 4 °C.
- Aspirer supernatanten.
BEMÆRK: Pillen er muligvis ikke synlig; efterlad en lille mængde buffer bagved for ikke utilsigtet at aspirere pelleten. - Brug pillen igen i 200 μL D-PBS, og opbevar den ved 4 °C i op til 3 dage.
11. Flowcytometri
- Mærk filterhætterne på de nye rør.
- Ved hjælp af en 1 ml pipette pipette hver prøve på filterhætten.
- Centrifuge kortvarigt ved 200 x g ved 4 °C, hvilket kun tillader centrifugen at nå 200 x g , før kørslen stoppes.
- Fortsæt med at strømme cytometrikerne til downstream-analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Prøver blev behandlet med et flowcytometer på et kerneanlæg, og de resulterende data blev evalueret med en softwarepakke til flowanalyse. Tidligere blev kompensationskontroller analyseret - den levende / døde plet og negativ kontrol. Hvis der anvendes flere fluorokromer, skal der udarbejdes fluorescens minus en (FMO) kontrol og enkeltpletkontrol for hvert antistof. Kompensation for spektral overlapning for de eksperimentelle prøver blev beregnet ud fra de analyserede kontroller. Til identifikation af cellepopulation blev der anvendt en hierarkisk gating-strategi. Den primære port udelukkede snavs i den forreste scatter (cellestørrelse) versus sidespredning (granularitet) plot19,20. Efterfølgende blev de døde celler ekskluderet (figur 4, figur 5, figur 6, supplerende figur 1, supplerende figur 2, supplerende figur 3 og supplerende figur 4). Følgende gate udelukkede celler, der var positive for Myelin Basic Protein (supplerende figur 4). Af de resterende celler blev der skabt tæthedsplotter af celler, der var positive for hver fluorokrom (supplerende figur 4). Hyppigheden af hver neuronal cellepopulation blev beregnet ud fra den tredje port (supplerende figur 4). Prøver, der blev behandlet med manuel mekanisk dissociation21 og enzymatisk fordøjelse, gav en væsentligt lavere population af celler af interesse (Supplerende fil 221, figur 4 og supplerende figur 1). Omvendt returnerede både faste og friske prøver fremstillet via automatiseret mekanisk dissociation og enzymatisk fordøjelse en population af celler af interesse, der var flere gange større (figur 5, figur 6, supplerende figur 2 og supplerende figur 3).
Figur 1: Musehjerne. (A) Korrekt perfuseret. (B) Ikke-perfuseret. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Valgt status i trin 6.4. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Trelags suspension i trin 7.5: Buffer (øverste lag), celleaffald, opløsning til fjernelse af snavs og celler (bundlag). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Repræsentativ analyse af faste prøver behandlet ved hjælp af en kombination af manuel dissociation ved Pasteur pipettetrituration og enzymatisk fordøjelse. Første af to prøver behandlet samtidigt. (A) Procentdel af celler, der er den cellulære population af interesse. (B) Procentdel af den population af interesse, der er levende celler. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Repræsentativ analyse af friske prøver behandlet ved hjælp af en kombination af automatiseret mekanisk dissociation og enzymatisk fordøjelse. Første af to prøver behandlet samtidigt. (A) Procentdel af celler, der er den cellulære population af interesse. (B) Procentdel af den population af interesse, der er levende celler. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Repræsentativ analyse af faste prøver behandlet ved hjælp af en kombination af automatiseret mekanisk dissociation og enzymatisk fordøjelse. Første af to prøver behandlet samtidigt. (A) Procentdel af celler, der er den cellulære population af interesse. (B) Procentdel af den population af interesse, der er levende celler. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 1: Repræsentativ analyse af faste prøver forarbejdet ved hjælp af en kombination af manuel Pasteur pipette trituration dissociation og enzymatisk fordøjelse. Anden af to prøver behandlet samtidigt. (A) Procentdel af celler, der er den cellulære population af interesse. (B) Procentdel af den population af interesse, der er levende celler. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 2: Repræsentativ analyse af friske prøver forarbejdet ved hjælp af en kombination af automatiseret mekanisk dissociation og enzymatisk fordøjelse. Anden af to prøver behandlet samtidigt. (A) Procentdel af celler, der er den cellulære population af interesse. (B) Procentdel af den population af interesse, der er levende celler. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 3: Repræsentativ analyse af faste prøver behandlet ved hjælp af en kombination af automatiseret mekanisk dissociation og enzymatisk fordøjelse. Anden af to prøver behandlet samtidigt. (A) Procentdel af celler, der er den cellulære population af interesse. (B) Procentdel af den population af interesse, der er levende celler. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 4: Repræsentativ analyse af farvede og faste prøver behandlet ved hjælp af en kombination af automatiseret mekanisk dissociation og enzymatisk fordøjelse. (A) Procentdel af celler, der er den cellulære population af interesse. (B) Procentdel af den population af interesse, der er levende celler. (C). MBP-celler . (D). PSA-NCAM+ celler (neuronale precursorceller). (E). ACSA2+ celler (astrocytter). (F). CD31+ celler (Endotel). (G). CD11b+ celler (Microglia). Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 1: Farvningsprotokol. En prøvefarvningsprotokol til immunfarvning af celleoverflademarkører. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 2: Tilpasset manuel mekanisk og enzymatisk dissociationsprotokol. Denne metode er tilpasset fra en tidligere offentliggjort protokol21. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flere trin i denne neurale dissociationsprotokol kræver dygtig teknik og fingerfærdighed -perfusion, supernatant aspiration og fjernelse af myelin. Gennem hele perfusionsprocessen skal de indre organer forblive intakte (bortset fra at fjerne membranen og klippe hjertet); dette inkluderer at undgå hjertets øverste kamre med sommerfuglnålen. Mens mængden af saltvand med heparin, der er nødvendig, varierer, indikerer gennemsigtig væske, der strømmer fra hjertet, at processen er afsluttet. Hjernen skal være helt og korrekt perfuseret, hvorefter den vil fremstå offwhite (figur 1). Med perfusion bliver trinnet til fjernelse af røde blodlegemer fremmed, hvilket eliminerer overskydende manipulation af prøverne, der kan resultere i celletab. Derefter kræver trinnet til fjernelse af snavs en rolig hånd. For at centrifugeringen kan resultere i klart definerede lag efter D-PBS-overlejringen (figur 3), må lagene ikke forstyrres under transit eller under pipettering. Derudover, når man aspirerer de to øverste lag, skal der fjernes nok suspension til at eliminere overdreven celleaffald, mens der stadig efterlades en stor nok prøve bagved. Dette er et vigtigt skridt, da døde celler er mere tilbøjelige til at binde uspecifikt og blive autofluorescerende22,23, hvilket yderligere understreger vigtigheden af at vælge en metode, der konsekvent resulterer i høj cellelevedygtighed. Endelig, når man aspirerer supernatanten, er pelleten muligvis ikke altid synlig. Der skal efterlades en lille mængde resterende supernatant for at sikre, at prøven ikke ved et uheld kasseres.
Der er fordele og ulemper ved at fastgøre prøverne. Ikke alle antistofmarkører er kompatible med fiksering, hvilket begrænser downstream-analysen afhængigt af cellepopulationerne af interesse. Brug af alt for koncentreret PFA eller efterladelse af cellerne i fikseringsmidlet i en længere periode kan også resultere i autofluorescens og falsk-positive aflæsninger og derved forvirre resultaterne24,25. Ved at bruge en 1% PFA-opløsning og minimere eksponeringen af cellerne reduceres sandsynligheden for falsk-positive aflæsninger kraftigt. Da denne procedure er detaljeret og har mange timingvariabler, placerer brugen af friske celler laboratorier under strenge tidsbegrænsninger for at sikre, at cellerne forbliver levedygtige. Fiksering bevarer cellestrukturen til analyse næste dag.
Enkeltcelleanalyse kan give vigtig indsigt i behandlingseffektivitet, cellefunktion og sygdoms- eller behandlingsmekanismer. Eksempler på metoder omfatter enkeltcelle-DNA og RNA-sekventering26,27, cytometri efter flyvetid22,28, flowcytometri og immunhistokemi. Med enkeltcellet mRNA-sekventering kan genekspression på tidspunktet for prøveindsamling give celletypespecifik indsigt26. For eksempel udførte en forskergruppe enkeltcellet RNA-sekventering på D1- og D2-dopaminreceptorer, der udtrykte medium spiny neuron-undertyper fra dorsomedial striatum27. Gruppen omdefinerede transkriptomet af mellemstore spiny neuroner ved at detektere nye subtypespecifikke markørgener og identificere gener, der tidligere og forkert blev rapporteret at være forskelligt udtrykt på grund af manglende enkeltcelleopløsning27. Ho et al. fremhævede potentialet i enkeltcellet RNA-sekventering til at opdage celletypespecifikke lægemiddelmål27. Med enkeltcelle-DNA-sekventering kan ændringer i genekspression beskrives ved at måle DNA- og histonmodifikationer, kromatintilgængelighed og kromatinkonformation26. Ved måling af enkeltkerne-DNA-methylering konstruerede Liu et al. et enkeltcellet DNA-methylomeatlas over 45 musehjerneområder og identificerede 161 neuronale celletyper29. Prøveforberedelse til enkeltcellesekventering er mere indviklet, især isolering af enkeltceller og fjernelse af snavs. Mattei et al. undersøgte effekten af enzymatisk og mekanisk dissociation på transkriptomisk og proteotypeprofilering og bemærkede, at neurale dissociationsmetoder i sagens natur introducerer et niveau af bias30. Flere grupper har bemærket vigtigheden af at arbejde effektivt, dissekere på is og bruge transkriptionshæmmere 26,30,31. Mattei et al. identificerede også berørte gener og proteiner for at informere analyse30. Disse teknikker giver dog stadig detaljeret indsigt i cellulære byggesten, der er uovertruffen af bulk-vævstranskriptomik26,27.
Flowcytometri er et kraftfuldt analytisk værktøj, der samtidig kan identificere og måle parametre for enkeltcellepopulationer ved hjælp af fluorescerende sonder. Nogle anvendelser af flowcytometre inkluderer cellecyklusanalyse, cellesortering, levedygtighed, fænotyping, celleproliferation og funktionelle analyser32,33. De fleste af disse applikationer bruger overfladefarvning på grund af tilgængeligheden af celleoverfladeproteiner. Disse proteiner kan farves for at identificere specifikke cellepopulationer baseret på afstamning, udviklingsstadium og funktion 19,32,33. For eksempel kan prøver overfladefarves for at identificere populationer af astrocytter, endotelceller, neuronale forløberceller og microglia34. En primær fordel ved farvning af overfladeproteiner i levende celler er at være i stand til at sortere cellerne, samtidig med at muligheden for at foretage yderligere downstream-analysebevares 34. Mens overfladefarvningsteknikker er ret standard, er intracellulær farvning en mere delikat procedure. Med intracellulær flowcytometri skal cellerne fastgøres og permeabiliseres inden farvning for at tillade antistoffet at krydse cellemembranen 20,32,33,34. Ideelt set forbliver cellemorfologien intakt; Permeabilisering risikerer imidlertid proteindenaturering, hvilket ville påvirke antistofdetektionen negativt22,34. Nogle metoder til yderligere downstream-analyse er ikke længere en mulighed, når cellerne er fastgjort20. Mens ulemperne ved intracellulær farvning er mere udtalte end overfladefarvning, tillader førstnævnte påvisning og analyse af intracellulære molekyler, der ellers ikke ville være plausible. Derudover kan celleoverflade- og intracellulære farvningsprocedurer kobles til definitivt at identificere visse celletyper eller vurdere yderligere parametre samtidigt 20,28,34.
Der er flere metoder til neural dissociation, der kan bruges til at forberede den enkeltcellesuspension, der kræves til cellulær analyse, selvom de ikke er lige så effektive. Sammenlignet med standardiserede kits og de ovennævnte teknikker er denne særlige metode til neural dissociation beregnet til behandling af små mængder væv, giver en meget levedygtig enkeltcellesuspension (>90%) og strømliner eksperimentet. Med denne protokol er andre laboratorier udstyret til at udføre neural dissociation på en pålidelig og reproducerbar måde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Aimee Rogers for at levere praktisk træning og fortsat produktsupport. Vi takker Dr. Amanda Burke for løbende fejlfinding og afklaring af diskussioner. Vi takker Meredith Joheim og UAMS Science Communication Group for den grammatiske redigering og formatering af dette manuskript. Denne undersøgelse blev understøttet af NIH R25GM083247 og NIH 1R01CA258673 (A.R.A).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 02-682-003 | Basix, assorted color |
| 15 mL Falcon Tubes | Becton Dickinson Labware Europe | 352009 | Polystyrene |
| 25 mL Serological Pipets | Fisher Scientific | 14-955-235 | |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Falcon | 352052 | |
| 500 mL Vacuum Filter/ Storage Bottle System | Corning | 431097 | |
| 70 μm cell strainer | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Adult Brain Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-107-677 | Contains Enzyme P, Buffer Z, Buffer Y, Enzyme A, Buffer A, Debris Removal Solution |
| Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-105 | |
| Anti-ACSA-2-PE-Vio770, mouse, clone REA969 | Miltenyi Biotec | 130-116-246 | |
| Anti-Myelin Basic Protein | Sigma-Aldrich | M3821-100UG | |
| Anti-PSA-NCAM-PE, human, mouse and rat, Clone 2-2B | Miltenyi Biotec | 130-117-394 | |
| BD LSRFortessa | BD | ||
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906-50G | |
| CD11b-VioBlue, mouse, Clone REA592 | Miltenyi Biotec | 130-113-810 | |
| CD31 Antibody | Miltenyi Biotec | 130-111-541 | |
| Ceramic Hot Plate Stirrer | Fisher Scientific | 11-100-100SH | |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Ethanol | Pharmco by Greenfield Global | 111000200 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Fine Scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | Perfusion |
| FlowJo | BD | (v10.7.0) | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Gibco DPBS (1X) | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| Glass Beaker | Fisher Scientific | 02-555-25A | |
| Heparin sodium | Fresenius Kabi | 504011 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher | L34965 | |
| Magnetic Stir Bar | Fisher Scientific | 14-513-51 | |
| Noyes Spring Scissors | Fine Science Tools | 15012-12 | Dissection |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 441244-3KG | Prilled, 95% |
| Pipette tips GP LTS 20 µL 960A/10 | Rainin | 30389270 | |
| Pipette Tips GP LTS 250 µL 960A/10 | Rainin | 30389277 | |
| Pipette tips RT LTS 1000 µL FL 768A/8 | Rainin | 30389213 | |
| Rainin Pipet-Lite XLS (2, 20, 200, 1000 μL) | Rainin | 30386597 | |
| RBXMO FITC XADS | Fisher Scientific | A16167 | |
| Round Ice Bucket with Lid | Fisher Scientific | 07-210-129 | |
| Round-Bottom Tubes with Cell Strainer Cap | Falcon | 100-0087 | |
| S1 Pipet Fillers | ThermoFisher Scientific | 9541 | |
| Spatula & Probe | Fine Science Tools | 10090-13 | Dissection & Perfusion |
| Surflo Winged Infusion Set 23 G x 3/4" | Termuno | SV-23BLK | Butterfly needle |
| Test Tube Rack | Fisher Scientific | 14-809-37 | |
| Thermo Scientific Legend XTR Centrifuge | ThermoFisher | discontinued | Or other standard table top centrifuge |
| Variable-Flow Peristaltic Pump | Fisher Scientific | 13-876-2 | Low-flow model |
| VetFlo Starter Kit for Mice | Kent Scientific | VetFlo-MSEKIT | Anesthesia mask, tubing, induction chamber, charcoal canisters |
| VetFlo Vaporizer Single Channel Anesthesia System | Kent Scientific | VetFlo-1210S | 0.2–4 LPM |
| Vi-CELL XR Cell Viability Analyzer | Beckman Coulter Life Sciences | 731196 | Cell Counting |
| Vi-CELL XR 4 Bags of Sample Vials | Beckman Coulter Life Sciences | 383721 | Cell Counting |
References
- Andersen, P., Morris, R., Amaral, D., Bliss, T., O'Keefe, J. The Hippocampus Book. , Oxford University Press, Inc. (2007).
- Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. Genetic influence on neurogenesis in the dentate gyrus of adult mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 10409-10414 (1997).
- Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. Mechanisms and Functional Implications of Adult Neurogenesis. Cell. 132, 645-660 (2008).
- Kempermann, G., Song, H., Gage, F. H. Neurogenesis in the adult hippocampus. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, 018812 (2015).
- Bond, A. M., Ming, G. L., Song, H. Adult mammalian neural stem cells and neurogenesis: Five decades later. Cell Stem Cell. 17, 385-395 (2015).
- Sato, K. Effects of microglia on neurogenesis. Glia. 63, 1394-1405 (2015).
- Lee, V. M., Scientist, S., Louis, S. A., Reynolds, B. A. Neural stem cells. , Available from: http://www.stemcell.com/media/files/minireview/MR29019-Neural_Stem_Cells.pdf (2015).
- Mu, Y., Lee, S. W., Gage, F. H. Signaling in adult neurogenesis. Current Opinion in Neurobiology. 20, 416-423 (2010).
- Fares, J., Diab, Z. B., Nabha, S., Fares, Y. Neurogenesis in the adult hippocampus: history, regulation, and prospective roles. International Journal of Neuroscience. 129, 598-611 (2018).
- Tosun, M., Semerci, F., Maletic-Savatic, M. Heterogeneity of stem cells in the hippocampus. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1169, 31-53 (2019).
- Abbott, L. C., Nigussie, F. Adult neurogenesis in the mammalian dentate gyrus. Journal of Veterinary Medicine Series C: Anatomia Histologia Embryologia. 49, 3-16 (2020).
- Rodrigues, G. M., Fernandes, T. G., Rodrigues, C. A., Cabral, J. M., Diogo, M. M. Purification of human induced pluripotent stem cell-derived neural precursors using magnetic activated cell sorting. Methods in Molecular Biology. 1283, Clifton, N.J. 137-145 (2015).
- Ko, I. K., Kato, K., Iwata, H. Parallel analysis of multiple surface markers expressed on rat neural stem cells using antibody microarrays. Biomaterials. 26, 4882-4891 (2005).
- Jager, L. D., et al. Effect of enzymatic and mechanical methods of dissociation on neural progenitor cells derived from induced pluripotent stem cells. Advances in Medical Sciences. 61 (1), 78-84 (2017).
- Volovitz, I., et al. A non-aggressive, highly efficient, enzymatic method for dissociation of human brain-tumors and brain-tissues to viable single-cells. BMC Neuroscience. 17, 1-10 (2016).
- Reiß, S., Herzig, I., Schmitz, J., Bosio, A., Pennartz, S. Semi-automated tissue dissociation and preserved epitope integrity optimize immunomagnetic sorting of neural cells. , Available from: www.miltenyibiotec.com (2021).
- Adult brain dissociation kit: mouse and rat. Miltenyi Biotec. , Available from: https://www.miltenyibiotec.com/upload/assets/IM0011920.pdf (2020).
- Cell surface flow cytometry staining protocol. Miltenyi Biotec. , Available from: https://www.miltenyibiotec.com/US-en/applications/all-protocols/cell-surface-flow-cytometry-straining-protocol-pbs-bsa-1-50.html (2021).
- Finak, G., Jiang, W., Gottardo, R. CytoML for cross-platform cytometry data sharing. Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 93, 1189-1196 (2018).
- Turaç, G., et al. Combined flow cytometric analysis of surface and intracellular antigens reveals surface molecule markers of human neuropoiesis. PLoS One. 8, 1-14 (2013).
- Schwarz, J. M. Using fluorescence activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52537 (2015).
- Brummelman, J. application and computational analysis of high-dimensional fluorescent antibody panels for single-cell flow cytometry. Nature Protocols. 14, 1946-1969 (2019).
- Recommended controls for flow cytometry. Abcam. , Available from: https://www.abam.com/protocols/recommended-conntrols-for-flow-cytometry (2021).
- Fixing cells with paraformaldehyde (PFA) for flow cytometry. , Available from: https://flowcytometry.utoronto.ca/wp-content/uploads/2016/02/FixingCells_PFA.pdf (2021).
- Stewart, J. C., Villasmil, M. L., Frampton, M. W. Changes in fluorescence intensity of selected leukocyte surface markers following fixation. Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 71, 379-385 (2007).
- Armand, E. J., Li, J., Xie, F., Luo, C., Mukamel, E. A. Single-cell sequencing of brain cell transcriptomes and epigenomes. Neuron. 109, 11-26 (2021).
- Ho, H., et al. A guide to single-cell transcriptomics in adult rodent brain: The medium spiny neuron transcriptome revisited. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 1-16 (2018).
- Li, L., et al. Novel technologies in studying brain immune response. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 6694566 (2021).
- Liu, H., et al. DNA methylation atlas of the mouse brain at single-cell resolution. bioRxiv. , (2020).
- Mattei, D., et al. Enzymatic dissociation induces transcriptional and proteotype bias in brain cell populations. International Journal of Molecular Sciences. 21, 1-20 (2020).
- Liu, L., et al. Dissociation of microdissected mouse brain tissue for artifact free single-cell RNA sequencing. STAR Protocols. 2 (2), 100590 (2021).
- Delmonte, O. M., Fleisher, T. A. Flow cytometry: Surface markers and beyond. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 143, 528-537 (2019).
- O'Connor, J. E., et al. The relevance of flow cytometry for biochemical analysis. IUBMB Life. 51, 231-239 (2001).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. Journal of Visualized. Experiments. (94), e52241 (2014).
